Оптичка широкопојасна ултрасонографија појединих ћелија | научни извештаји

Оптичка широкопојасна ултрасонографија појединих ћелија | научни извештаји

Anonim

Субјекти

  • Биосензори
  • Ћелијско снимање

Апстрактан

Механика ћелија игра кључну улогу у неколико основних биолошких процеса, као што су миграција, пролиферација, диференцијација и морфогенеза ткива. Поред тога, многа болесна стања ћелије су у корелацији са измењеном ћелијском механиком, као у случају прогресије рака. За то постоји велико интересовање за методе које могу мапирати механичка својства с резолуцијом потцелије. Овде смо показали инвертирани импулсни опто-акустички микроскоп (иПОМ) који ради у опсегу од 10 до 100 ГХз. Ове фреквенције омогућавају квантитативно мапирање ћелијских структура танких као 10 нм и разрешавање фибриларних детаља ћелија. Користећи овај неинвазивни свеоптички систем, стварамо слике високе резолуције на основу механичких својстава као контрастних механизама, и можемо приметити крутост и пријањање појединих миграционих матичних ћелија. Ова техника треба да омогући пренос дијагностичких и сликовних способности ултразвучног снимања на једноћелијску скалу, чиме се отварају нови путеви за ћелијску биологију и биоматеријалне науке.

Увод

Чврстоћа и чврстоћа адхезије ћелија препознати су као кључни играчи у многим основним процесима, попут механо-трансдукције 1, морфогенезе 2, покретљивости 3, 4 и прогресије дегенеративних болести 5, 6 . Постојећи модалитети који могу својства пресликати резолуцијом подћелије користе контактне сонде, укључујући атомску силу микроскопију 7 и нанопипету под притиском 8, или наноструктурне подлоге као дводимензионални низ контактних сонди 9, 10, 11 . Оваква анализа може да омета нормалне ћелијске функције 12 и захтева сложено моделирање интеракције ћелија-сонда, ометано допринос ћелијске структуре, као што је плазма мембрана 13 .

Као неинвазивна алтернатива модалитетима заснованим на контактима, ултразвучне технике нуде временски решено мапирање механичких својстава ткива. У класичној ултрасонографији, ултразвучни пулс се шаље у тело. Овај пулс одражава се од интерфејса између ткива са контрастним акустичким импеданцијама и преноси информације о крутости, вискозности и топографији ткива. Коришћењем пиезо-електричних претварача у контакту са ткивом за генерисање и детекцију звучних таласа добијају се типичне носеће фреквенције од 10 МХз, нудећи сублимиметријску резолуцију. Скенирање акустичке микроскопије 14 користи акустичну сочиву да фокусира звук до тачке која је ограничена на дифракцију. На собној температури је проширио фреквенцијски опсег до ~ 2 ГХз, нудећи уобичајене резолуције од ~ 0, 7 µм користећи воду као спојни медиј 15, 16, 17 . У криогеним условима достигнуте су фреквенције високе од 15 ГХз у течном хелијуму под притиском, нудећи бочну резолуцију ~ 15 нм за металне узорке 18 . У појединачним ћелијама акустичка микроскопија је омогућила мерење механичких својстава на 1 ГХз са аксијалном резолуцијом 3 µм 19 и процену њихове адхезије. Али чак је и на овим фреквенцијама тешко разликовати фину структуру ћелије, посебно у танким пределима као што је ламела.

1984. развијена је временски разлучена опто-акустичка техника названа пицосекундни ултразвук (ПУ) 20 која може да примењује фреквенције до неколико ТХз захваљујући термоеластичној експанзији индукованој апсорпцијом фемтосекундних ласерских импулса. Слично као и Бриллоуин спектроскопија, ПУ користи распршивање светлости акустичним таласима за испитивање механичких својстава медијума. Међутим, супротно Бриллоуиновој спектроскопији 21, ПУ користи оптичко узорковање како би постигла мерења која су временски решена и тако испитала дубинску топографију узорка 22 . Штавише, ПУ користи предности контролисане емисије акустичних таласа за појачавање распршења светлости, омогућавајући тако проучавање мањих запремине. Премоштавање акустичке микроскопије и ПУ, акустичка сочива са високим нумеричким отвором 23 у комбинацији са Фабри-Перот шупљином 24, недавно је развијена за стварање нове врсте акустичког микроскопа који нуди 100 нм бочне резолуције на собној температури.

Првенствено посвећена истраживању танких чврстих филмова, способност ПУ да се бави важним питањима у једноћелијској биологији убрзо је била предвиђена 25, а прве примене на биљним ћелијама недавно су развијене 26, 27 . На основу ове технологије, овде представљамо најсавременију ултрасонографију на фреквенцијама до ~ 100 ГХз за испитивање ћелијских структура танких као 10 нм и да разрешимо фибриларне детаље ћелија.

Користили смо методу која подсећа на медицинске удараљке, у којој додиривањем површине тела откривамо његову подлогу. Мат звук указује на присуство масе, док звук високог звука указује на шупља подручја. Да бисмо илустровали способност предоџбе о механичким својствима појединих ћелија, узгајали смо људске мезенхимске матичне ћелије (хМСЦ, види Методе) на 300 нм фолију од титанијума, подупрт прозирним сафирним прозором (сл. 1). Користили смо ПУ за генерирање и откривање пицосекундних акустичних импулса помоћу оптичких пумпи и импулса импулса фокусираних на дну металног филма (види Слику 1 и методе). Захваљујући термоеластичкој претворби на интерфејсу титанијум-сафир, апсорпција фемтосекунди импулса пумпе емитиране из првог ласера ​​покреће широкопојасни акустични импулс, са спектром који се шири до 100 ГХз. Акустични импулс се шири кроз метални филм и рефлектује се са ћелије титанијума, читајући механичка својства посматране ћелије. Када се након рефлексије досегне до дна филма од титанијума, пулс акустичког напрезања надгледају импулси оптичке сонде које емитују други ласер помоћу еласто-оптичке спреге (видети Методе). Овај поступак је еквивалентан ГХз удараљкама на дну металног филма за процену механичких својстава ћелије култивисане на супротној страни, у наносилу.

Image

Поглед са стране на обрнути импулсни опто-акустички микроскоп (иПОМ). Користили смо два ласера ​​са нешто различитом брзином понављања да бисмо генерисали широкопојасне акустичне таласе и детектовали одјеке у Ти претварачу оптичким узорковањем.

Слика пуне величине

Иако је механизам генерисања упоредив са оним који се користи за МХз фото-акустички снимци 28, овде смо га имплементирали са много вишим акустичким фреквенцијама, а метални филм смо користили као фотоакустички претварач да не би дошло до директног упијања светлости у ћелију. Због своје велике дифузности, носећи слој сафира делује као хладњак, а филм од титанијума је довољно густ да обезбеђује да ћелија остане термички изолована (видети методе) 29 . Овај кључни дизајн претварача осигурава да ниједно ласерско зрачење не досегне врх титановог филма, остављајући ћелију неометану и изоловану од ласерског загревања. Супротно техникама заснованим на контактима 7, 8, овај оптички приступ је бесконтактан и неинвазиван.

Ова поставка делује као обрнути импулсни опто-акустички микроскоп (иПОМ), посебно погодан за даљинско истраживање ћелија које се придржавају дна посуде за културу. Пречник тачке оптичке сонде поставља бочну акустичну резолуцију, упоредиву са конвенционалним техникама оптичког снимања ограниченим дифракцијом. Са садашњом ласерском таласном дужином, 1030 нм и објективним увећањем сочива, × 50 (НА 0.8), пречник тачке сонде је ≈ 2 µм (на 1 / е). Бочна резолуција може се побољшати повећањем нумеричке бленде или смањењем таласне дужине ласера. Пошто су слике формиране коефицијентом звучне рефлексије на интерфејсу ћелија-метал, техника не решава дубинску структуру ћелија. Коефицијент звучне рефлексије зависи од механичких својстава ћелије испитиваних на удаљености редоследа акустичне таласне дужине, обично од 50 до 200 нм у фреквенцијском опсегу који смо користили. Поред тога, осетљивост на механичку резонанцу ћелије омогућава мапирање дебљина ћелије до 10 нм, као што је детаљније доле. Такве дебљине су 100 пута мање од оних доступних акустичком микроскопијом у ћелијама 19 . Могућности иПОМ-а високе резолуције омогућавају проучавање структуре појединих ћелија и интеракција ћелија-супстрат.

Комбиновали смо иПОМ са конвенционалним оптичким микроскопом да бисмо омогућили истовремено осветљавање белог светла и флуоресцентно осматрање одозго (слика 2). За илустрацију, изабрали смо нуклеарну област и ламелиподијум типичне поларизоване ћелије током миграције (доњи и горњи квадрат на слици 2, респективно). Слика белог светла са слике одозго (Сл. 2а) сугерише да је висина ћелије максимална у нуклеарној регији и да се драматично смањује на периферним границама. Флуоресцентна слика (Сл. 2б) открива присуство актина (зелени), винкулина (црвени) и ДНК (плави). Снопи актинских филамената, који се називају и влакна стреса, појављују се као јарко зелене пруге окомите на ивице ћелије. Један крај сваког стресног влакна се испреплиће у актинов кортекс у близини језгре 30 . Други крај је повезан са местом лепљења на спољној ивици ламелиподијума који обезбеђује локално сидрење на подлози 31 . Спајање стресног влакна са супстратом ствара контрактилну структуру која се непрекидно ревидира како би се омогућило померање ћелије у покрету налик на траку 32 . Ова сложена машина је кључна за темељне ћелијске процесе који укључују покретљивост или промене у облику ћелије, као што су миграција, пролиферација или морфогенеза 32, 33 .

Image

(а), слика белог светла одозго. (б), флуоресцентна слика која приказује актин (зелена), винкулин (црвена) и нуклеус (плава). Подручја скенирана помоћу иПОМ-а означена су квадратима. Линија скале: 20 µм .

Слика пуне величине

Скенирали смо узорак помоћу иПОМ-а у дводимензионалном растерском узорку како бисмо произвели временски разрешене акустичне слике нуклеарне регије и ламелиподијума (означене квадратима на слици 2) са кораком од 1 µм . Реализовали смо асинхроно оптичко узорковање користећи два фемтосекундна ласера ​​са закључаним режимом, са нешто другачијим фреквенцијама понављања 34, 35 . На тај начин смо добили брзи уређај за снимање (неколико секунди по пикселу) за снимање акустичне ширења у Ти претворнику са резолуцијом од 1 пс и великом фреквенцијском опсегом 36 . Онлине филмови 1 и 2 приказују необрађене акустичне податке добијене брзином слике од 1000 слика / нс испод језгре и ламелиподијума. На слици 3а и 3б приказани су непрерађени снимци филмова у језгру и у ламелиподијуму при 123 и 115 пс, респективно. Врло висок звучни контраст открива структуру језгра, актинску мрежу и ситне детаље сложености места лепљења на ивици ламелиподијума.

Image

Сирове акустичне слике нуклеарног региона (лево) и ламелиподијум (десно) снимљене у тренуцима 123 и 115 пс. Линија скале: 10 µм .

Слика пуне величине

Да бисмо прегледали допринос ових структура, анализирали смо садржај фреквенције рефлектираних акустичних импулса. Развили смо вишесатну анализу временских фреквенција на основу таласне трансформације пролазног акустичког сигнала. Нормализовали смо амплитуду импулса на његову вредност у голим регионима титанијума да бисмо добили коефицијент звучне рефлексије Р ац и извукли акустички контраст (види Методе). Нацртали смо Р ац на 10, 30 и 85 ГХз у нуклеарној регији (Сл. 4, леви ступац) и у ламелиподијуму (Сл. 4, десни ступац). Када је Р ац ~ 1 преко целе ширине опсега (црвенкаста подручја), све се фреквенције одражавају подједнако. Настављајући аналогију са медицинским удараљкама, ово је еквивалентно фреквентно богатом, високом звуку, откривајући шупља подручја у којима је сондиран голи титан. Супротно томе, Р ац <1 одговара мат звуку где су високе фреквенције пригушене, што указује да је ћелија сондирана.

Image

Слике нуклеарног региона (леви стуб) и ламелилиподијума (десни ступац). У првом реду приказане су слике беле светлости за поређење. Следећи редови приказују акустичне слике снимљене на 10, 30 и 85 ГХз, респективно. Скала је идентична на свим сликама (трака скале од 10 µм ). Врло висок звучни контраст омогућава да се јасно примете контура ћелије, структура нуклеуса и фини детаљи фибриларног ламелиподијума. Варијација коефицијента звучне рефлексије Р ац са фреквенцијом омогућава анализу контаката на наноселеру. На примјер, подручја А и Б означена на слици од 30 ГХз означавају подручја слабог и доброг контакта (види текст).

Слика пуне величине

На 10 ГХз, нуклеарна област је јасно видљива, као и влакнаста структура ламелиподијума. На 30 ГХз ивице ћелије су добро дефинисане, а периферни слојеви показују богат контрастни образац који открива присуство места лепљења. На 85 ГХз акустички контраст унутар ћелије опада, али контура ћелије се још увек јасно опажа. Контраст у акустичким сликама на датој фреквенцији одговара просторним варијацијама импеданце ћелије. На пример, слика ламелиподијума на 30 ГХз показује да је у коре коре актина близу језгра површина А, Р ац ~ 0, 65, док је у ламели подручје Б, Р ац ~ 0, 85. Ово указује да актински кортекс има већу акустичку импедансу, тј. Тврђу је (или гушће) од влакнастих ламела, као што је већ примећено акустичком микроскопијом 14 . Међутим, фреквентна зависност акустичког контраста указује на то да постоје и други механизми. Да бисмо разумели ову фреквенцијску зависност, предлажемо мултиконтрастну анализу која открива доприносе смањене дебљине ћелије у периферним регионима и везивања ћелија-метал.

Поређење акустичких слика на различитим фреквенцијама открива тамноплава подручја акустичних слика која се појављују само у врло уским распонима фреквенција. Заправо када дебљина ћелије постане упоредива са акустичном таласном дужином, акустични талас који утиче на Ти-ћелијски интерфејс активира акустичну резонанцу ћелије. У овом случају се побољшава акустични пренос у ћелију, изазивајући јасне падове коефицијента рефлексије Р ац на резонантној фреквенцији. То је приказано на слици 5ц. Што је ћелија тања, то је већа фреквенција резонанције. На 10 ГХз, око језгра су видљиве резонанције. Како се фреквенција повећава, резонанције се премештају према тањим ивицама ћелије, као што се види и на акустичној слици од 30 ГХз, откривајући подручја танка чак 10 нм. Ове резолуције омогућавају мапирање механичких својстава тањих подручја ћелије (види Додатне информације) које нису доступне другим техникама.

Image

Коефицијент звучне рефлексије Р ац за типичне интерфејсе ћелија титана. (а), савршен контакт дебеле ћелије:

Image
не зависи од ф . (б), несавршен контакт дебеле ћелије: Р ац се повећава од
Image
до 1 са повећањем ф . (ц), Савршени контакт танке ћелије: Р ац показује умове на резонантним фреквенцијама ћелије и тежи ка
Image
на високим фреквенцијама.

Слика пуне величине

Слабе контактне силе између ћелије и носећег супстрата могу проузроковати дисперзију фреквенције на наноцрној скали 37 . Равнотежа између адхезивних и одбојних сила формира бунар потенцијалне енергије по јединици површине,

Image
, и одржава ћелију у равнотежном положају. Акустички талас који утиче на сучеље омета ову равнотежу и ћелија се појављује као повезана са слојем титанијума опругом без масе, крутости по јединици дужине,
Image
38 . Као последица тога, интерфејс индукује фреквенциону зависност звука Р рефлексије (Сл. 5б), и понаша се као акустички танак слој импеданције З и = К / 2 πф . Ово је посебно видљиво на ламелиподијуму када се упоређују акустичне слике снимљене на 30 и 85 ГХз. У коре коре актина, површина А, Р ац расте са 0, 65 на 30 ГХз на 0, 8 на 85 ГХз, што указује на лош контакт између ћелије и Ти. Супротно томе, у области фибрила, подручје Б, Р ац остаје константно између 30 и 85 ГХз, што указује на интимни контакт (Сл. 5а). Разматрање ове фреквенцијске зависности омогућава мапирање интерфацијалне крутости К (види Додатне информације). Овај контраст крутости је јасно повезан са наносуском архитектуром адхезивних комплекса ћелије.

Закључно, демонстрирали смо нову микроскопску методу засновану на рефлексији акустичних таласа генерисаних ГХз на интерфејсу ћелија-метал. Ова техника омогућава испитивање механике адхезивних ћелија на суб-микрон скали без контакта са ћелијом. Посебна снага наше технике је примена кратких акустичних импулса који омогућавају сондирање ћелије у фреквенцијском опсегу 10–100 ГХз. Овисност о фреквенцији омогућава приступ дебљини и механичким својствима ћелије, као и крутости интерфејса на наноцелу. Показали смо методу мигрирања хМСЦ-а и показали да акустичне слике могу открити структуру језгра, ситне детаље актинске мреже и адхезивне шаре, засноване на еластичним својствима као механизмима контраста.

Ова способност иПОМ-а да опажа на више скала и са вишеструким контрастима влакнаста структура ћелије и места адхезије требало би да омогући процену крутости појединих снопова актина и мапирање чврстоће адхезије на сваком месту лепљења. Због тога, иПОМ испуњава значајан јаз између техника заснованих на контактима које истражују механичка својства у просеку у целој ћелији и техника сликања које процењују оптичка својства на скали подцелије. Због тога би иПОМ требало да се покаже као моћан алат за испитивање покретљивости ћелија, морфогенезе и механосеносензирања. Поред тога, ова техника је неинвазивна и показује потенцијал за обављање снимања у реалном времену механичких својстава живих ћелија. Флилијација стварања слике медицинском ултразвуком наговештава могућност преношења дијагностичких и сликовних примена ултразвучног снимања на једноцелијску скали.

Методе

ГХз ултрасонографија

Конвенционалне ПУ технике ослањају се на фазу механичког превођења ради контроле временског кашњења између импулса возова синхроне пумпе и сонде и на тај начин обављати мерења временски разрешена. Овај дизајн резултира дугим временима аквизиције (од десетина минута до неколико сати по пикселу) и захтева сложену манипулацију ласерским сноповима који спречавају његову употребу у практичним физиолошким условима. Као алтернатива механички контролираним кашњењима, имплементирали смо асинхроно оптичко узорковање користећи два фемтосекундна ласера ​​са закључаним режимом, са нешто различитим фреквенцијама понављања 39 .

Експериментална поставка описана је на слици 1. Користимо компактни двоосни осцилатор (т-Пулсе Дуо, Амплитудес Системес, Француска) који садржи две диодне пумпе са пасивно закључаним Иб: КИВ ласерским шупљинама. Ласери емитују возове импулса у трајању од ~ 400 фс. Главни пумпа, са фреквенцијом понављања ф м = 50 МХз, користи се као пумпа. Сваки импулс пумпе (таласна дужина 1040 нм) апсорбује се у Ти у близини интерфејса сафир-Ти на растојању упоредивом са оптичком дубином коже ~ 15 нм. Уследила ултрабрза топлотна дилатација покреће уздужни кохерентно-фононски импулс, широког спектра који се протеже до ~ 100 ГХз.

Акустични импулзи деформације детектирају се помоћу оптичких импулса сонде које емитује подређени ласер (таласна дужина 1028 нм) акустично-оптичким спајањем. Пошто је оптичка дубина коже код Ти мања од растојања на коме пролази импулсни звучни напон, ~ 140 нм (видети Додатне информације), измерена оптичка рефлексија је директно пропорционална звучном напрезању 40 . Подређени ласер има фреквенцију понављања ф с = ф м + Δ ф која се благо помакне за Δ ф = 500 Хз да би се добила временски разлучена оптичка одбојност у 1 / Δ ф = 2 мс. Прецизна синхронизација подређене фреквенције понављања омогућава истраживање временског прозора 1 / ф м = 20 нс са резолуцијом ≈ 1 пс, што је спектрални опсег који се протеже до 1 ТХз са 50 МХз резолуцијом. Висока осетљивост овог уређаја омогућава откривање релативних разлика у оптичкој рефлексији од 10 до 5 са пропусношћу од 8 пиксела / мин.

Коексијална пумпа ниске енергије (енергија 0, 2 нЈ) и сонде (20 пЈ) зраке су фокусирани кроз сафирну плочу на сучељу сафир-Ти помоћу објектива × 50 објектива на тачке пречника ~ 2 µм (на 1 / е) . У овој конфигурацији ниједно ласерско светло не досеже Ти-ћелијски интерфејс, што овај приступ чини потпуно неинвазивним 29 . Ламеллиподијум и језгро ћелије приказују се одвојено на растерски начин на површини од 60 × 60 µм 2 . Имајте на уму да са мањом ласерском таласном дужином, као што је 400 нм, лако се постиже комерцијалним ласерима и циљем са већим нумеричким отвором, бочна резолуција би могла бити чак 200 нм.

Дизајн опто-акустичког претварача

Сваки импулс пумпе апсорбује се на дну металног слоја на дубини која је упоредива са оптичком дубином коже ~ 15 нм 41 . Електрони кондукционог опсега су побуђени и дифузионирају се на дубини од ~ 2 нм током термализације са решетком 29 . Дебљина претварача је дизајнирана тако да ти прегревани електрони не дођу до горње Ти површине на којој се ћелије узгајају. Топлина се затим шири у већем обиму у већини Ти филма и сафирне подлоге на временском размаку од наносекунде. Супстрат сафирног супстрата изабран је због своје оптичке прозирности на ласерској таласној дужини, због ниског акустичко-оптичког спајања, спречавајући еластичне таласе који шире у сафиру да ометају оптичку рефлективност, и због своје високе топлотне дифузности која делује као хладњак. Топлотни таласи не досежу Ти горњу површину, држећи ћелију термички изолирану од ласерског загревања.

Таласна анализа

Да бисмо истражили варијације амплитуде акустичних одјека кроз ћелију као функцију фреквенције, вршимо анализу временске фреквенције. Таласна трансформација је савршен алат за анализу временског пулса различитог облика. У нашој конфигурацији, облик одјека зависи од звучног рефлексије на хетерогеном сучељу са малом међуфазном крутошћу. Измерјену промену оптичке рефлексије δР ( т ) савијамо са Морлет-овим таласом 29 . Ми дефинишемо амплитуду рефлектираног акустичног импулса на централној фреквенцији таласа као максимум дистрибуције енергије. Овај једноставан поступак даје амплитуду рефлексираног акустичног импулса на фреквенцијама од 10 до 85 ГХз. Испод овог распона први импулс почиње да се преклапа са другим импулсом који се два пута одразио на Ти-ћелијском интерфејсу, с обзиром на дебљину ~ 300 нм Ти филма. Преко 85 ГХз, однос сигнал-шум спречава јасну идентификацију пулса. Да бисмо само посматрали допринос ћелије фреквенцијској зависности, нормализујемо енергетски спектар добијен на сваком положају помоћу енергетског спектра акустичног импулса рефлексијеног у огољеном Ти региону (у просеку у неколико тачака). Ова нормализација даје коефицијент звучне рефлексије Р ац ( ф ).

Ћелијска култура и реагенси

Примарне људске мезенхимске матичне ћелије (коштана срж) (Лонза, Швајцарска) узгајане су у минималном есенцијалном медијуму (Алпха-МЕМ, Гибцо) са додатком 10% (вол / вол) ФБС, 1% пеницилина / стрептомицина и инкубиране у влажној атмосфери која садржи 5% (вол / вол) ЦО на 37 ° Ц. Све ћелије су коришћене при малим бројевима пролаза (пролаз 4 до 8). Ћелије су субфлуфлу култивиране и посадјене са 10 4 ћелије / цм2. После 24 сата културе, ћелије на површинама су фиксиране 30 мин у 4% параформалдехид / ПБС на 4 ° Ц. После фиксације, ћелије су се пермеализовале у 1% Тритон Кс-100 у ПБС-у током 15 мин. Актин и винкулин су визуелизовани третирањем ћелија 1 сат на 37 ° Ц са 1% (вол / вол) фалоидин-ФИТЦ (Сигма) и мишјим моноклонским анти-винкулином (Инвитроген), респективно. Ћелије су потом инкубиране 30 минута на собној температури са Ф (аб) 2 фрагментом коњугираног Ф (аб) 2 зелишта антимусом (Х + Л) са Алека Флуор 588. Ћелијска језгра су супротстављена у 20 нг / мЛ ДАПИ током 10 минута на собној температури. Слике су произведене помоћу епифлуоресцентног микроскопа Леица ДМ5500Б и софтвера МетаМорпх. Слике су снимљене при увећању × 40.

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Додатне информације

    Додатне информације

Видео

  1. 1.

    Додатне информације

    Филм 1

  2. 2

    Додатне информације

    Филм 2

Коментари

Подношењем коментара пристајете да се придржавате наших Услова и Смерница заједнице. Ако нађете нешто злоупотребно или то није у складу са нашим условима или смерницама, означите то као непримерено.