Анализа броја копија хромосома у леукемијским ћелијама на различитим платформама микроаркија | леукемија

Анализа броја копија хромосома у леукемијским ћелијама на различитим платформама микроаркија | леукемија

Anonim

Промјене у броју копија хромозома или промјене броја копија (ЦНА) често су очите у геному карцинома и могу резултирати амплификацијом онкогена или брисањем гена који супресори тумора. 1 Такви се ЦНА крећу у величини од читавог хромозома до неколико килобазних парова, при чему се многе мање промене могу препознати конвенционалном компаративном геномском хибридизацијом на бази бактеријских вештачких хромозома (ЦГХ), која има резолуцију неколико стотина килобазних парова. 2 Ово ограничење је недавно превазиђено прилагођавањем микрорашената олигонуклеотида високе густине који су првобитно развијени за типизацију полиморфизама са једним нуклеотидом (СНП) на процену ЦНА. 3 Софистицирани софтвер за такву анализу, укључујући дЦхип (//биосун1.харвард.еду/цомплаб/дцхип) и ЦНАГ (//ввв.геноме.умин.јп/ЦНАГ.хтмл), сада је доступан на мрежи.

Иако СНП-типизирани низови са високом густином омогућавају одређивање ЦНА-ова у резолуцији од 47 000 хуманих транскрипата и нашироко се користе за профилисање гена експресије. Већина секвенци сонде на низу циљани су на ексоне који одговарају 3 'непреведеној области сваког транскрипта. Иако, колико смо свесни, није било извештаја о коришћењу овог микрорачуна за процену ЦНА или ЦГХ, ми смо закључили да ХГУ133П2 може бити корисна платформа за процену ЦНА-а, јер су (1) секвенце цДНА једна од најважнијих ажуриране и свеобухватне информације о људском геному и (2) вредности броја копија могу се директно израчунати за сваки ген. Надаље, било би лако упоредити број копија и ниво експресије датог гена кроз засебну хибридизацију геномске ДНК и мРНА са низом. У ту сврху модификовали смо протокол за обележавање и хибридизацију геномске ДНК, обезбеђен од стране Аффиметрик (допунске информације).

Да бисмо испитали верност ЦНА анализе помоћу ХГУ133П2 матрице, прво смо издвојили геномску ДНК из мононуклеарних ћелија (МНЦ) периферне крви од здравог доброг мушкарца (кариотип: 46, КСИ) и здравог добровољца (кариотип: 46, КСКС) . Геномска ДНК је такође изолована из ћелије људске леукемије (КЦЛ22) са трисомијом 8 плус т (9; 22) и из трансформисаних људских Б ћелија са кариотипом од 48, КСКСКСКС или од 47, КСИ, + 21 (обе из Цориелл ћелије Спремишта, //ццр.цориелл.орг). ДНК је фрагментирана третманом са ДНазом И, обележена крајњим детектонуклеотидима коњугованим у биотину и подвргнута хибридизацији са низом ХГУ133П2. Прво смо изабрали 26 354 сета сонди који су давали поуздане сигнале - оне који су примили позив „Пресент“ од оперативног софтвера ГенеЦхип (ГЦОС, Аффиметрик) и имали јачину сигнала од .01.0 - у контролном експерименту са нормалним мушким геномом. Ова група је садржавала 960 сета сонди који су пресликани на Кс хромозом. Интензитет сигнала ових скупа сонди специфичних за Кс хромозоме у експерименту са нормалним женским геномом (46, КСКС) су нормализовани интензитетима одговарајућих сета сонди у подацима за 46, КСИ. Средња ± сд вредност ових омјера КСКС / КСИ за скупове сонди специфичних за Кс хромозому била је 2, 07 ± 1, 19 (слика 1а) и на тај начин се подударала са предвиђеном вриједношћу 2. Интензитет ових скупова сонди за Б ћелије са кариотипом 48, КСКСКСКС су такође нормализовани од оних за 46, КСИ, дајући средњу вредност ± сд за омјере КСКСКСКС / КСИ од 3, 34 ± 1, 52.

Image

Поређење интензитета сигнала специфичног за хромозоме добијено ХГУ133П2 анализом геномске ДНК изоловане из различитих узорака. ( а ) Поређење интензитета сигнала за Кс хромозом. Геномска ДНК је прочишћена из МНЦ периферне крви од мушког (КСИ) или женског (КСКС) волонтера, као и из трансформисаних Б ћелија са кариотипом од 48, КСКСКСКС. ДНК је подвргнута амплификацији целог генома са РЕПЛИ-г китом (Киаген, Валенциа, ЦА, УСА), а производи за амплификацију (100 μг) су дигестирани, обележени биотином и подвргнути хибридизацији са микрорезом ХГУ133П2. Интензитети сигнала скупа сонде специфични за Кс хромозом за женску добровољку или Б ћелије су нормализовани интензитетима одговарајућих сета сонде за мушки добровољац и одређене су средње вредности + сд. Детаљан протокол за ЦГХ анализу са ХГУ133П2 описан је у Додатним информацијама. ( б ) Поређење интензитета сигнала за хромозом 1 или 8. Геномска ДНК ћелија КЦЛ22 подвргнута је хибридизацији са ХГУ133П2. Интензитет сигнала сета сонде специфичан за хромозом (Цхр) 1 или 8 нормализован је интензитетом одговарајућих сета сонде за мушки добровољац и одређене су средње вредности + сд. ( ц ) Упоређивање интензитета сигнала за хромозом 21. Геномска ДНК трансформисаних Б ћелија са кариотипом од 47, КСИ, + 21 (+21) подвргнута је хибридизацији са ХГУ133П2. Интензитети сигнала сетова сонди за хромозоме 21 за ове ћелије, као и за КЦЛ22, женску добровољку и Б ћелије са кариотипом 48, КСКСКСКС, нормализовани су интензитетима одговарајућих сетова сонди за мушког добровољца, и одређене су средње вредности + сд.

Слика пуне величине

Да бисмо додатно испитали линеарност података интензитета сигнала, упоредили смо сигнале хибридизације скупа сонди који су пресликани на хромозом 1 или 8 између КЦЛ22 ћелијске линије и мушке контроле (слика 1б). Средња вредност ± сд омјера интензитета сигнала (КЦЛ22 / КСИ) за скупове сонде на хромосому 8 (1, 47 ± 0, 516) добро се поклапала са предвиђеном вриједношћу 1, 5, док је за скуп сонди на хромосому 1 (без абнормалности у КЦЛ22) је био близу 1, 0 (1, 01 ± 0, 360).

Затим смо упоредили интензитет сигнала сета сонде који су мапирани на хромозом 21 између Б ћелија са кариотипом 47, КСИ, + 21, који садрже три копије хромозома 21, и осталим узорцима, који садрже две копије овог хромозом (Слика 1ц). Средњи ± сд интензитета сигнала у односу на мушку контролу за ћелије са трисомијом 21 (1, 52 ± 0, 40) био је значајно већи ( П <1, 32 × 10-29, Студентов т- тест) од оног за женску контролу (1, 13 ± 0, 36), за Б ћелије са 48, КСКСКСКС (1, 00 ± 0, 28) или за КЦЛ22 (1, 11 ± 0, 41); није било значајне разлике између вредности за женску контролу, за 48, КСКСКСКС и за КЦЛ22.

Затим смо прегледали ЦНА у леукемијским експлозијама коришћењем ХГУ133П2 платформе и упоредили резултате са подацима добијеним са комерцијално доступним олигонуклеотидним ЦГХ микрорезуром (хумани геном 44А (ЦГХ44А); Агилент, САД), који садржи> 40 000 60-нуклеотида олигомери који покривају људски геном са средњом резолуцијом од 35 кбп. ЦД34-позитивна прогениторна (леукемична) фракција и ЦД34-негативна диференцирана (контролна) фракција изоловани су из коштане сржи 23 пацијента са леукемијом (допунска табела 1). Такође смо били у могућности да изолимо МНЦ из коштане сржи четири пацијента са леукемијом у потпуној ремисији (идентификациони број пацијента 4, 6, 10 и 13), па смо за ове особе упоредили фракцију ЦД34 + добијену пре хемотерапије ЦД34 - фракција добијена током потпуне ремисије. Иако је анализа ЦНА са ХГУ133П2 платформом проведена за све испитанике, експерименти са ЦГХ44А платформом су проведени за 16 пацијената (ИД бр. 4–49).

За анализу са ХГУ133П2, геномска ДНК изолована из леукемичке и контролне фракције сваког пацијента подвргнута је хибридизацији са низом засебно, а однос леукемичке фракције / контролне фракције интензитета сигнала је израчунат за сваки сет сонде. За анализу са ЦГХ44А, геномска ДНК леукемијске и контролне фракције сваког пацијента обележена је Ци5 и Ци3, односно мешана је пре хибридизације са низом. Да бисмо потврдили податке ЦГХ44А, извршили смо експеримент за замену боја за сваки пацијент. Утицај спољашњих сонди на ЦГХ анализу је минимизиран трансформацијом интензитета сваког сигнала са покретним прозором ширине 1 Мбп уз коришћење софтвера ЦГХ Аналитицс 3.1.8 (Агилент). Поред тога, добитак или губитак броја хромозома на датим локусима сматран је значајним само ако је з-оцена 4 за одговарајућу позицију вас1.0. ЦНА-ове које је ЦГХ идентификовала сматрали смо поузданим само ако су оригинални експерименти и експерименти замене бојама показали супротне промене свака са з -сцоре од 0, 01.

Добијени ЦНА подаци били су врло слични између експеримената ХГУ133П2 и ЦГХ44А. Девет (∼ 39%) од 23 пацијента са леукемијом показало је константан број копија од 2 за све хромозоме (подаци нису приказани). Ови резултати су потврђени и за бр. 4, 5 и 6 хибридизацијом одговарајуће геномске ДНК на Аффиметрик 100К СНП типизацију (подаци нису приказани). Преостали пацијенти су манифестовали ЦНА различитих величина. На пример, и анализе ХГУ133П2 и ЦГХ44А откриле су добитак целокупног дугачког крака хромозома 1 и губитак кратког сегмента 9к33.1 код бр. 29 (слика 2а). ЦНА идентификовани у пацијенту бр. 29 оба низа нису откривени клиничким кариотипизацијом (експлозије пацијента су означене као 46, КСКС).

Image

Процена ЦНА код пацијената са леукемијом применом микроГрадова ХГУ133П2 и ЦГХ44А. ( а ) Процена пацијента бр. 29. ЦД34 + и ЦД34 - фракције су изоловане из коштане сржи употребом моноклонског антитела повезаног са магнетном перлом на ЦД34 (ЦД34 МицроБеадс) и МИДИ-МАЦС ћелијског одвајања колона (обе из Милтении Биотец, Аубурн, ЦА, САД) . За ЦГХ44А анализу, геномска ДНК је изолована из ЦД34 + и ЦД34 - фракција и обележена Ци5 и Ци3, респективно; обележени узорци су затим мешани и подвргнути хибридизацији са низом. 5 Извршен је и експеримент са разменом боја, и изворни (плаве линије) и размени боја (црвене линије) приказани су ЦГХ Аналитиком 3.1.8 (горњи панели) у складу са људским хромозомским подацима. Региони са з -сцоре 1.0 су означени бочним шипкама и засјењењем (одговарајућим бојама). Подаци за хромозом 1 и 9 приказани су увећани на доњим панелима. За ХГУ133П2 анализу, геномска ДНК изолована из фракција ЦД34 + и ЦД34 подвргнута је хибридизацији са низом засебно, а интензитети сигнала за прву фракцију су нормализовани од стране оне за последњу. Региони са з -сцоре 1.0 приказани су бочним шипкама и плавим сенчењем. Сви подаци добијени с низовима ЦГХ44А и ХГУ133П2 доступни су на веб локацији Гене Екпрессион Омнибус (ГЕО) (//ввв.нцби.нлм.них.гов/гео) под приступним бројевима ГСЕ4659 и ГСЕ4602. ( б ) Процена пацијента бр. 43. Подаци о интензитету сигнала за пацијента бр. 43 су добијени као у ( а ), а резултати за хромозом 8 приказани су увећани у доњем панелу.

Слика пуне величине

За пацијента бр. 43, и ХГУ133П2 и ЦГХ44А анализе откриле су брисања 5к, 7к, 9к и 16, добитак од 19к и исти образац сложених промена броја копија у 8п и хромозому 17 (Слика 2б). Опет, клиничка кариотипизација овог пацијента (46, КСИ) није успела да открије ове различите промене.

Да бисмо потврдили ЦНА који су идентификовани и ХГУ133П2 и ЦГХ44А, измерили смо број копија хромозома у ЦД34 + фракцијама пацијената са леукемијом употребом квантитативне анализе у ланцу реакције полимеразе (ПЦР) у реалном времену. Број копија хромозома одређених ПЦР био је врло сличан ономе одређеном низовима за хромозоме 1 и 9к код пацијента бр. 29 и за 8п код пацијента бр. 43 (слика 3а).

Image

Потврда микрорачунских података квантитативним ПЦР-ом и утицајем броја ДНК копије на ниво експресије гена. ( а ) Потврђивање података о микрорачуну помоћу ПЦР-а. Количина ДНК на назначеним хромосомским позицијама за ЦД34 + фракције пацијентских носа 29 и 43 одређена је ПЦР у реалном времену и изражена у односу на ДНК која одговара глицерралдехид-3-фосфат дехидрогенази гена. Подаци су упоређени са бројем хромозома одређеним анализама ЦГХ44А и ХГУ133П2. Секвенце ПЦР прајмера дате су у Додатним информацијама. ( б ) Утицај броја копије ДНК на ниво експресије гена. Однос ДНК леукемичне фракције / контролне фракције израчунато је за сваку сонду постављену на хромозому 7, а испитивани узорци су подвргнути хијерархијској анализи кластера на основу таквих профила односа сирове ДНК. Свака колона одговара засебном узорку, а сваки ред скупу сонде чији је омјер ДНК леукемичне фракције / контролне фракције обојен у складу с назначеном скалом. Скупови сонди су поредани према њиховом физичком положају у хромозому 7 од врха до дна. мРНА је изолована из ЦД34 + фракције 22 пацијента са леукемијом, а обиље специфичних транскрипата квантитативно је анализирано низом ХГУ133П2, као што је претходно описано. 6 Ниво експресије гена на пределу дуге руке хромозома 7 је упоређен између појединаца са или без брисања региона. ИД бројеви пацијената са губитком броја примерака хромосома у региону приказани су зеленом бојом. Сви подаци о низу за квантитацију мРНА доступни су на веб локацији ГЕО под приступним бројем ГСЕ4608. ( ц ) Однос ДНК леукемичке фракције / контролне фракције израчунато је за сваку сонду постављену на хромозому 8, а предметно стабло је конструисано као у ( б ). Скупови сонди су поредани према њиховом физичком положају у хромозому 8 од врха до дна. Ниво експресије гена на дугом краку хромозома 8 упоређиван је између појединаца са или без 8к +. ИД бројеви пацијената са повећањем броја примерака хромосома у региону приказани су црвеном бојом.

Слика пуне величине

Такође смо припремили једноланчану цДНА из ЦД34 + фракција свих испитаника, осим пацијента бр. 72 (РНА довољног квалитета није могла да се добије од овог пацијента), и подвргла је хибридизацији са ХГУ133П2 да би се квантизирала количина сваког транскрипта циљаног низом. С обзиром да су делови хромозома 7к често избрисани код пацијената са леукемијом, упоређивали смо нивое експресије гена у избрисаним регионима између појединаца са или без 7к− (Слика 3б). Нивои експресије гена на 7к били су значајно нижи код пацијената са 7к− (пацијенти бр. 28, 43, 44, 60, 61, 70 и 73) него код оних без њега (18, 1 ± 79, 5 наспрам 23, 3 ± 87, 6 У, средња вредност ± сд; П = 0, 014, т- тест).

Поред тога, такође смо испитали да ли повећање броја примерака хромосома утиче на ниво експресије гена пресликаних на хромозоме. Као што је приказано на слици 3ц, + 8к је примећен обично код пет пацијената (ИД бр. 43, 59, 70, 71 и 72). Квантитација мРНА за гене мапиране на 8к регион открила је да је ниво експресије таквих гена био већи код појединаца са + 8к него код оних без њега (42, 8 ± 147, 3 насупрот 34, 7 ± 114, 9; П = 0, 022, т- тест).

Ови подаци указују да број копија хромозома утиче на одговарајући ниво експресије гена; међутим, с обзиром на релативно велики сд у сваком скупу података, други фактори (на пример, епигенетске промене или интеракције са факторима транскрипције) вероватно имају значајан утицај на транскрипцијске активности. У складу са овом појмом, количина геномске ДНК није значајно повезана са количином мРНА за читаву колекцију сонди на ХГУ133П2 (Пеарсонов коефицијент корелације ( р ) = 6, 48 × 10 -4, П = 0, 881).

Интензитет флуоресцентног сигнала за одређени ген (скуп сонде) представљен на ХГУ133П2 низу израчунава се од интензитета 11 сонди дизајнираних за сваки ген. С обзиром да је физичка удаљеност између неких од ових сонди> 10 кбп у геному, мала појачања или брисања генома могу се не препознати код ХГУ133П2. Ипак, наши подаци су показали да је ХГУ133П2 потенцијално користан за квантизацију броја копија хромосома на генски оријентисан начин. Оба система ХГУ133П2 и ЦГХ44А имају високу резолуцију, откривајући, на пример, хомозиготну делецију малог подручја хромозома 9 који садржи ЦДКН2А и ЦДКН2Б у геному пацијента бр. 9 (подаци нису приказани). Доступност различитих платформи за ЦНА процену омогућиће увид у различите аспекте генома структурних аномалија повезаних са хематолошким малигнитетима.

Приступања

ГенБанк / ЕМБЛ / ДДБЈ

  • ГСЕ4602
  • ГСЕ4608
  • ГСЕ4659

Додатне информације

Ворд документи

  1. 1.

    Допунске методе

  2. 2

    Допунска табела 1

    Додатне информације прате рад на веб локацији Леукемиа (//ввв.натуре.цом/леу)