Анордрин елиминира споредне ефекте тамоксифена без промене своје антитуморске активности | научни извештаји

Анордрин елиминира споредне ефекте тамоксифена без промене своје антитуморске активности | научни извештаји

Anonim

Субјекти

  • Карцином дојке
  • Откривање и развој лекова

Апстрактан

Тамоксифен се даје код рака дојке позитивних на естрогенске рецепторе (ЕР + ), али може да индукује рак ендометрија материце и безалкохолну болест масне јетре (НАФЛД). Оно што је посебно важно, десет година лечења тамоксифеном има већи заштитни ефекат против ЕР + карцинома дојке од пет година таквог лечења. Тамоксифен је такође одобрен од ФДА као хемопревентивно средство за оне који се сматрају високим ризиком за развој карцинома дојке. Нежељени ефекти представљају велику забринутост због ових проширених метода примене тамоксифена. У овом истраживању открили смо да је анордрин, који се у Кини продаје као лек против неплодности, инхибирао митозу епитела ендометрија ћелија изазваних тамоксифеном и НАФЛД у мишјој матерници и јетри као антиестрогено и естрогено средство. Поред тога, у поређењу са тамоксифеном, анордиол, активни метаболит анордрина, слабо је везан за домен везања лиганда за ЕР-α. Анордрин није регулисао класични нуклеарни пут естрогена; на тај начин, није утицао на анти-туморску активност тамоксифена код голих мишева. Узето заједно, ови подаци сугеришу да би анордрин могао елиминисати нежељене ефекте тамоксифена без утицаја на његову анти-туморску активност.

Увод

Тамоксифен је био први лек који је одобрио ФДА за пацијенте са карциномом дојке са позитивно израженим рецепторима за естроген (ЕР) 1 . Међутим, тамоксифен такође изазива нуспојаве, као што су карцином ендометрија материце и безалкохолна болест масне јетре (НАФЛД). Такође се може развити и стеатохепатитис, посебно код жена са прекомерном тежином које се дају тамоксифеном. Оно што је посебно важно, за жене са карциномом позитивним на ЕР (ЕР + ), настављање лечења тамоксифеном до 10 година, уместо да престане са 5 година, производи даље смањење рецидива и смртности, посебно после 10. године. Тамоксифен је такође прво хемопревентивно средство одобрено од ФДА за особе које се сматрају високим ризиком за развој карцинома дојке 3 . Будући да су пацијенти морали давати тамоксифен више од 10 година, нежељени ефекти су били озбиљна брига. Претходне студије о молекуларном механизму нуспојава изазваних таксиксифеном резултирале су откривањем класичних нуклеарних путева естрогена и мембранских инструмената естрогена (МИЕС) који су модулирани мембранским рецепторима естрогена везаним за мембрану, сироти Г-протеин повезаним естрогенски рецептор 30 (ГПЕР1) и ЕР-α – 36 4, 5, 6 . Међутим, када су истраживачи проучавали физиолошке функције ГПЕР1 и ЕР- α- 36 , открили су да промена експресије ГПЕР1 у ћелијама такође утиче на ендогену експресију ЕР- α -36 и обрнуто 7, што сугерише да остаје нејасно да ли је тамоксифен модулација ЕР активност и нуспојаве су регулисани ГПЕР1 и / или ЕР-α-36 8, 9 . Да бисмо елиминисали споредне ефекте изазване тамоксифеном и разумели физиолошке функције ГПЕР1 и ЕР-α-36, прегледали смо селективне модулаторе рецептора естрогена, који су, у поређењу са тамоксифеном, клинички вршили супротно естрогену активност у МИЕС. Тада смо открили да анордрин и тамоксифен могу супротно модулирати МОЈЕ.

Анордрин / анордиол је синтетисан помоћу андрогена. Занимљиво је да се анордрин / анордиол специфично веже за ЕР, а не за андрогене или прогестинске рецепторе (АР или ПР) и не такмичи се са 3 Х-означеним кортикостероном за везивање за протеине у серуму 10 . Као специфични антагонист рецептора естрогена на матерници, анордрин се продаје као лек против неплодности под робном марком АФ-53 у Кини од 1976. У овој студији открили смо да анордрин и тамоксифен делују супротно естрогеним ефектима да модулишу физиолошку функцију МОЈЕ у мишјој материци и јетри. Комбинована примена тамоксифена са анордрином може елиминисати нежељене ефекте тамоксифена без утицаја на његову анти-туморску активност код голих мишева.

Резултати

Анордрин инхибирао митозу епителних ћелија ендометрија изазваних тамоксифеном у мишјој матерници

Пошто тамоксифен индукује митозу епителијских ћелија ендометрија (ЕЕЦ), као естрогено средство 4, 5, 6, 11, сматра се механизмом карцинома материце изазваног тамоксифеном. Естрогена изазвана митозом ЕЕЦ потребна је за имплантацију ембриона 11 . Анордрин инхибира имплантацију ембриона да би изазвао његове контрацепцијске ефекте 12 . Ове клиничке индикације сугеришу да би анордрин и тамоксифен могли супротно модификовати пролиферацију ЕЕЗ. Хранили смо нормалне мишеве дрогом у храни. Количина тамоксифена и анордрина одређена је у зависности од њихових клиничких доза и просечне количине дневног уноса хране од стране мишева. Након две недеље, мишеви су жртвовани и њихова матерница је сакупљена. Дванаест материца мишева из сваке групе било је фиксирано параформалдехидом. Обојење хематоксилином и еозином (Х&Е) парафинских пресека матернице открило је да 3 мг анордрина (АНО) по килограму хране (3 мг / кг) и 45 мг тамоксифена (ТАМ) по килограму хране (45 мг / кг) повећају дебљину ЕЕЗ (Сл. 1а и б, ТАМ (зелена трака), АНО (жута трака)); међутим, митотички ЕЕЦ није настао у групи анордрина (АНО) (Сл. 1а, АНО). Овај резултат сугерише да је анордрин изазвао хипертрофију ЕЕЦ-а, а не митозу. У групи тамоксифен + анордрин (ТАМ + АНО), мишеви су третирани са 45 мг тамоксифена (ТАМ) + 1, 5–4, 5 мг анордрина (АНО) по килограму хране. У дози од 3 мг анордрина, дебљина ЕЕЗ-а је остала слична оној у контролној групи (празна) (слике 1а и б, ТАМ + АНО (плава трака) наспрам празног (црна трака)). Ови резултати су показали да анордрин инхибира митозу изазвану тамоксифеном, тамоксифен инхибира ЕЕЕ и хипертрофију материце, а комбинована примена тамоксифена са анордрином враћа ЕГ у нормалу, што сугерише да су анордрин и тамоксифен извршили супротан ефекат у ЕЕЗ мишју материцу. Поред фенотипа ЕЕЦ, анордрин и тамоксифен су такође извршили супротан ефекат у модулацији хипертрофије мишје материце (СИ. Сл. 2).

Image

( а ) Х&Е одељења уграђена у парафин (40к увећања) ЕЕЦ-а из материце мишева који су две недеље лечени лековима. ТАМ или АНО: мишеви су третирани само тамоксифеном (ТАМ) или анордрином (АНО). ТАМ + АНО мишеви третирани су комбинацијом тамоксифена и анордрина. Празни мишеви су третирани носачем. ( б ) Статистичка анализа висине ЕЕЦ (μм), измерена на одељцима обојеним Х&Е а. Плава трака: мишевима су примењени тамоксифен (ТАМ) + анордрин (АНО) (ТАМ + АНО) у назначеним дозама. Н = 2 × 6. ** значи П <0, 01. ( ц ) Анордрин инхибира пролиферацију ћелије Хец1А индуковану тамоксифеном. ТАМ или АНО: ХецлА ћелије су третиране са 4 µМ тамоксифеном (ТАМ) или 4 µМ анордрином (АНО). ТАМ + АНО: ХецлА ћелије су третиране са 4 µМ тамоксифен + 4 µМ анордрин. Празне, ХецлА ћелије су третиране носачем. Н = 3 × 3; ** значи П <0, 01. ( д ) Х&Е бојење мишева ЕГ из ОВКС мишева. ( е ) Статистичка анализа висине ЕЕЦ (μм), мерено одсецима обојеним са Х и Е д. Обављена су два независна експеримента са укупно дванаест мишева за сваку дозу под истим условима; ** значи П <0, 01.

Слика пуне величине

Хец1А је ћелија рака материце ендометрија материце (хЕЦЦ), која експримира само ЕР-α-36, а не ЕР-α-66 13 . Тамоксифен је стимулисао пролиферацију ћелије ХецлА преко МИЕС, као агонист ЕР-α-36 13 . Да би се проверило да ли анордрин може инхибирати пролиферацију ћелија карцинома ендометрија стимулисаног тамоксифеном, ћелије Хец1А су ин витро лечене са тамоксифеном (ТАМ) или анордрином (АНО) или тамоксифеном + анордрином (ТАМ + АНО), а затим смо рачунали број живих ХецлА ћелија и нормализовано у празно (носач) (Сл. 1ц). Резултат је потврдио да тамоксифен (ТАМ) стимулише пролиферацију Хец1А (Сл. 1ц, ТАМ (зелена трака) према празној (црна трака)). Анордрин (АНО) је имао супротан ефекат да инхибира пролиферацију Хец1А стимулисану тамоксифеном (ТАМ) (Сл. 1ц, ТАМ + АНО (плава трака) насупрот ТАМ (зелена трака)), сугеришући да анордрин може бити ЕР-α-36 антагонист за инхибицију инхибирања пролиферације ћелија карцинома ендометрија изазваног тамоксифеном.

Да би се проценила инхибиција анордринске ЕГ митозе изазване тамоксифеном, као антиестрогени ефекат у мишјој материци, оваријектомизовани мишеви (ОВКС) третирани су анордрином (3 мг / кг) и тамоксифеном (45 мг / кг) уносом хране током 2 недеље . Дванаест материца мишева из сваке групе било је фиксирано параформалдехидом. Х&Е одсеци ОВКС мишева мишева показали су да анордрин (АНО) и тамоксифен (ТАМ) индукују хипертрофију и митозу ЕЕЗ-а, као естрогених узрочника, (Сл. 1д, АНО, ТАМ). Повећана дебљина ЕЕЦ је била изложена и у анордринској (АНО) и тамоксифенској (ТАМ) групи (Сл. 1д и е, АНО (жута трака), ТАМ (зелена трака)). Важно је да се дебљина ЕЕЗ у групи од 45 мг тамоксифена + 3 мг анордрина (ТАМ + АНО) смањила на упоредиву висину као у лажној групи (Сл. 1е, ТАМ + АНО (плава трака) наспрам ТАМ (зелена бар) или АНО (жута трака)). Фенотип ЕГ Х&Е одсека у тамоксифен + анордрину (ТАМ + АНО) групи био је сличан лажној групи (Сл. 1д, ТАМ + АНО, лаж). Ови подаци сугеришу да су анордрин и тамоксифен имали супротан естрогени ефекат на мишју материцу. Поред тога, анордрин је спречио атрофију материце код ОВКС мишева (СИ1 слика 3). Тамоксифен је инхибирао превенцију атрофије материце под истим условима тестирања (СИ1 слика 3), сугеришући да су анордрин и тамоксифен извршили супротан естрогени утицај на мишју материцу и додатно појачали да анордрин и тамоксифен могу да показују супротан естрогени ефекат на ЕЕЦ мишје материце.

Анордрин инхибира НАФЛД изазван тамоксифеном у јетри мишева

Тамоксифен повећава садржај јетрених масти инхибирајући улогу естрогена у одржавању хомеостазе липида 14 . Хиордрофични фенотип изазван анордрином у мишјем ЕЕЗ, што имплицира да анордрин може да регулише метаболизам као естрогени агенс (Сл. 1д, АНО). Тамоксифен инхибира хипертрофију индуковану анордрином (Сл. 1д, ТАМ + АНО против АНО), сугеришући да тамоксифен и анордрин супротно модулирају метаболички ефекат естрогена. Затим смо поставили хипотезу да анордрин може инхибирати НАФЛД изазван тамоксифеном у мишјој јетри. Мишеви који су били стари 7–8 недеља хранили су се дрогом у храни 109 дана. Најмање дванаест јетри сакупљено је из експерименталних група. Дванаест комада јетре мишева из сваке групе фиксирано је параформалдехидом, а парафински одсеци су припремљени за Х&Е бојење. Поред тога, 30–50 мг комада јетреног ткива инкубирано је у раствору за екстракцију липида и 0, 5 мл физиолошког раствора соли. Количина укупног холестерола (ТЦ) и триглицерида (ТГ) у органској фази је затим измерена коришћењем комплета за испитивање ТЦ и ТГ, респективно. Анализа Х&Е обојених одсека јетре открила је да је у поређењу са Бланк (без лека у храни) дошло до пораста НАФЛД синдрома у групи тамоксифена (ТАМ) (ТАМ; храњено 45 мг тамоксифена по килограму хране (45 мг / кг) )), (Сл. 2а и б, ТАМ (зелена трака) против празног (црна трака)). Ступањ НАФЛД је значајно повећан у ћелијама јетре које су биле близу капиларних судова (Сл. 2ц и д). Поред тога, у поређењу са празном бојом, нивои ТГ јетре такође су порасли у групи тамоксифена (ТАМ), (Сл. 2б, ТАМ (зелена трака) наспрам Бланк (црна трака)). Супротан ефекат откривен је у групи са анордрином (АНО је хранио 3 мг анордрина по килограму хране (3 мг / кг)) (Сл. 2а и б, АНО (жута трака)). Важно је да анордрин може преокренути НАФЛД синдром изазван тамоксифеном и смањити садржај ТГ у јетри индукован од 45 мг / кг тамоксифена на начин који зависи од дозе (Сл. 2б, ТАМ + АНО група (плава трака) вс ТАМ (зелена трака) или АНО ( жута трака)). Није било значајних разлика у нивоу уноса хране и нивоа ТЦ у јетри међу групама (СИ1, слика 4). Ови подаци сугерирају да би анордрин ин виво могао инхибирати НАФЛД-индуциран таксиксифеном и јетрени ТГ фенотип.

Image

( а ) Х&Е оделци уграђени у парафин (40к увећања) нормалне мишје јетре која се лековима лечила 109 дана. ТАМ или АНО: мишеви су третирани само тамоксифеном или анордрином. ТАМ + АНО мишеви третирани су комбинацијом тамоксифена и анордрина. Празно, у храну није додат никакав лек. ( б ) Статистичка анализа садржаја триглицерида јетре (ТГ), као у ( а ); Н = 12; ** значи П <0, 01. ( ц ) Најгори синдром НАФЛД приказан је близу капиларног суда у мишјој јетри. ( д ) Статистичка анализа квадрата масне површине као у ( ц ); Н = 2 × 6; ** значи П <0, 01. ( е ) Х&Е бојење јетрених одсека ОВКС мишева. ( ф ) Статистичка анализа садржаја триглицерида у јетри (ТГ), као у ( е ). ** и *** значе П <0, 01 и П <0, 001: два независна експеримента са укупно дванаест одсека, за сваку временску тачку, под истим условима.

Слика пуне величине

Да бисмо проценили анордринску модулацију садржаја ТГ у јетри као естрогени ефекат, смањили смо производњу естрогена коришћењем ОВКС мишева. Мишеви су били храњени дрогом у храни током два месеца. Слиједећи исту методу као на слици 2а, примијетили смо да анордрин као и Е2 спречавају садржај ТГ у јетри на начин овисан о дози у ОВКС мишевима (слике 2е и ф, АНО (жута трака)). У поређењу са скупином тамоксифена (ТАМ) или анордрина (АНО), садржај ТГ у јетри био је значајно обрнут у групи тамоксифена + анордрина (ТАМ + АНО) (Слика 2ф, ТАМ + АНО (плава трака) у односу на ТАМ (зелена трака ) или АНО (жута трака)). Ови подаци сугерирају да анордрин може побољшати метаболизам ТГ у јетри као естрогени агенс.

Анордрин не утиче на тамоксифенску активност ЕР + резистенцију на карцином дојке код гола

Претходно Мехта и др . идентификовала су два комплекса за везивање естрогена, названа 4 С и 8 С, према њиховој брзини седиментације ултрацентрифугације у материци цитосола мишева. Анордиол, нетерификовани и активни метаболит анордрина, преферирано се везује за 8С комплекс. Супротно томе, тамоксифен се веже за комплексе 4 С и 8 С који вежу естроген 10 . Важно је да естроген регулише биолошке функције помоћу две методе: класичним нуклеарним путем естрогена и мембранским путем естрогена (МИЕС) 4, 5, 6 . Преференцијално везивање анордрина за један цитосолни комплекс материце који веже естроген сугерира да анордин може само модулирати један естрогени пут. Тамоксифен и естроген могу модулирати и класични нуклеарни пут естрогена и МИЕС. Затим смо проценили да ли је анордрин играо улогу у класичном нуклеарном путу модулације естрогена. Пошто селективни агонист ЕР-β није био тако погодан као Е2 и као ЕР-α селективни агонист за посредовање пролиферације матернице ендометрија 15, тестирали смо само афинитет везивања анордиола за ЕР-α. ЕР-α-46 је ефикасна трансформација транскрипције изолирана лигандом ЕР-α 16, 17 . ЕР-α-46 је експримиран у Е. цоли и пречишћен коришћењем куглица глутатиона. Афинитет везивања анордиола, тамоксифена и Е2 за фузијски протеин ЕР-α-46 је упоређен коришћењем 3- Х-Е2-такмичарског теста. Резултати су показали да 50 нМ анордиол не може инхибирати везивање 0, 5 нМ3 Х-Е2 на 1 μг ЕР-α-46; међутим, иста концентрација тамоксифена или Е2 блокира> 60% везивања између 3 Х-Е2 и ЕР-α-46 (Сл. 3а, АНО (жута трака) насупрот ТАМ (зелена трака) или Е2 (црвена трака) )). Међутим, 40 нМ анордиола (АНО), као и Е2 и тамоксифен, укључујући његове активне метаболите (4хидрокситамоксифен (4ХТАМ) и ендоксифен (ЕНД)) инхибира везивање 0, 5 нМ 3 Х-Е2 за ЕР-α-36 пролазно експримирано у ХЕК293 ћелијама (Сл. 3б, СИ1, слика 5), сугеришући да се анордиол веже преферирано на ЕР-α-36, као и на 8 С комплекс матерничног цитосола, а затим модулира МИЕС.

Image

( а ) Горња плоча: Проценат 3 Х-Е2 се везује за ГСТ-ЕР-α-46 надметан Е2 или ТАМ (тамоксифен) или АНО (анордиол) да би се нормализовао само са 3 Х-Е2 (празно), након одузимања ДПМ од 3 Х-Е2 од једнаке моларне количине ГСТ протеина у зрнцима Н = 3 × 3; *** значи П <0, 001; Доњи панел: СДС-ПАГЕ праћено Цоомассие Блуе Р250 обојењем како би се показао ГСТ и ГСТ-ЕР-α-46 фузијски протеин након пречишћавања помоћу глутационских куглица. ( б ) Горња плоча: Проценат 3 Х-Е2 се везује за ЕР-α-36 надметан од АНО (анордиол) да би се нормализовао само са 3 Х-Е2 (празно), након одузимања ДПМ од 3 Х-Е2 од једнака количина укупног ћелијског протеина; Н = 3 × 3; *** значи П <0, 001; Доњи панел: СДС-ПАГЕ праћен Вестерн блот-ом како би се приказала експресија ЕР-α-36 векторским и ЕР-α-36 плазмидом након 24 сата пролазне трансфекције. ( ц ) Молекуларна структура андрогена наспрам Е2 и Анордиола (АНО) против Динордиола (ДИН). ( д ) Горња плоча: Проценат 3 Х-Е2 се везује за ЕР-α-46 надмерен анордиолом (АНО) и динордиолом (ДИН) да би се нормализовао само са 3 Х-Е2 (празно), након одузимања ДПМ од 3Х -Е2 из једнаке количине укупног бактеријског протеина. Н = 3 × 3; ** значи П <0, 01; Доњи панел: СДС-ПАГЕ праћен Вестерн блот-ом како би се показала експресија ЕР-α-46 у сировом Е. цоли лизату. ( е ) Експресија протеина Бцл-2 у ћелијама МЦФ-7, детектована западним блотманом, регулише се естрогеном и тамоксифеном након 48 х. Горњи гел показује експресију Бцл-2 у МЦФ-7 ћелијама третираним 7, 5 µМ тамоксифена (ТАМ) или 7, 5 µМ анордрина (АНО), или ДМСО (празно, БЛК), како је процењено западним блотирањем коришћењем анти-Бцл-2 антитијела (без ПР-а: без тел. црвеног; ЦС: огољени угљен; ФБС: фетални говеђи серум). Доњи гел показује западну мрљу за актин ради потврђивања једнаког оптерећења протеина. ( ф ) Ксенографт МЦФ-7 ћелија код голих мишева који су третирани носачем (Бланк), тамоксифен (ТАМ) и тамоксифен + анордрин (ТАМ + АНО). ( г ) Статистичка анализа МЦФ-7 масе ксенографта голих мишева, као у ( ф ). Обављена су два независна експеримента. За статистичку анализу у свакој групи мерено је више од девет туморске масе под истим условима. * значи П <0, 05.

Слика пуне величине

Пошто андроген садржи метилну групу (Ц19) на месту Ц10, уместо водоника на истом месту естрогена (Е2) (слика 3ц), андроген се веже за андрогени рецептор (АР), али се не веже за ЕР. Андрогени се користе за синтезу анордрина / анордиола. Занимљиво је да се анордрин / анордиол специфично веже за ЕР, а не за андрогене или прогестинске рецепторе (АР или ПР) и не такмичи се са 3 Х-означеним кортикостероном за везивање за протеине у серуму 10 . Ови подаци сугерирају да је метилна група (Ц19) на месту Ц10 анордрина кључна група, која блокира везивање анордиола за домен везивања лиганда (ЛБД) ЕР. Затим смо синтетизовали динордиол (ДИН) користећи естроген (Сл. 3ц). Афинитет везивања анордиола (АНО) и динордиола (ДИН) са ЕР-α-46 показао је да је Ц19 група анордиола (АНО) пресудна за везивање анордиола на ЕР-α ЛБД (сл. 3д, АНО (жута трака) ) насупрот ДИН-у (смеђа трака)), сугерирајући да се анордиол не може везати за ЕР-α у цитосолу и не регулише класични пут нуклеарног естрогена.

Познато је да је Бцл-2 кључни члан протеина анти-апоптотичке породице. Његова прекомерна експресија повезана је са многим врстама карцинома код људи. Бцл2 промотор садржи секвенцу елемената одговора естрогена (ЕРЕ). Због тога је ниво експресије бцл2 мРНА у ћелијама МЦФ-7 позитивно регулисан Е2 и инхибиран тамоксифеном класичним нуклеарним путем естрогена 18 . У овој студији, наша открића су показала да је експресија протеина Бцл-2 појачана медијумом за културу који садржи естроген у поређењу са оним који садржи фетални серум говеђег меса (ФБС) који је лишен угљеном (ЦС) (Сл. 3е, БЛК (Празно))., лечење 7, 5 µМ тамоксифена (ТАМ) инхибира експресију Бцл-2 (Нормални ФБС, Сл. 3е; ТАМ против БЛК), док на Бцл-2 експресију није утицао третман са 7, 5 µМ анордрина (АНО) (Нормални ФБС, Сл. 3е; АНО против БЛК) Важно је да ни 7, 5 µМ тамоксифен (ТАМ), ни 7, 5 µМ анордрин (АНО) не утичу на експресију Бцл-2 у ћелијама култивисаним у медијуму без естрогена (ЦС ФБС у ЕМеновој средини без фенола (без ПР) ; Сл. 3е, ТАМ; АНО) Ови резултати су додатно ојачали наш закључак да анордрин није био укључен у класични нуклеарни пут регулације естрогена и сугерисали су да анордрин не може утицати на активност тамоксифена да инхибира раст ЕР + карцинома дојке.

Анордрин не модулира експресију гена рака класичним нуклеарним путем естрогена и неће утицати на активност тамоксифена да инхибира раст ЕР + карцинома дојке. Следеће смо тестирали антитуморску активност тамоксифена који садржи анордрин ин виво . ЕР + ћелије рака дојке, МЦФ-7, коришћене су као модел ксенографта код женских голих мишева 19 . Суспензија од 1 × 10 7 ћелија у 100 μЛ 1кДПБС са матрикселом убризгана је СЦ у мишеве. Тумори су узгајани све док просечна запремина тумора није достигла 0, 1–0, 2 цм3. Дозе тамоксифена одређене су у зависности од реф. 19, а резултати су приказани на сликама 1 и 2. Затим су голи мишеви примењени свакодневно интрагастричном ињекцијом у трајању од 3 недеље са вехиклом или 6 мг тамоксифена (ТАМ) по килограму телесне масе, или истом количином тамоксифена (ТАМ) + 0, 4 мг анордрина (АНО). У поређењу са возилом (Празан), тамоксифен (ТАМ) је значајно инхибирао МЦФ-7 ксенографт (Сл. 3ф и г, Там (зелена трака) вс Бланк (црна трака)). МЦФ-7 ксенографт у групи тамоксифен + анордрин (ТАМ + АНО) показао је сличну масу као и мишеви из ТАМ групе (Сл. 3 г, ТАМ (зелена трака) насупрот ТАМ + АНО (плава трака)), сугеришући да је анордрин учинио не утиче на тамоксифенску активност ЕР + резистенцију на карцином дојке ин виво .

Дискусија

Познато је да имплантација ембриона захтева пролиферацију ЕЕ изазване Е2 путем ЕР-ова. Селективни агонист ЕР-β и Г1, ГПЕР1 селективни агонист, нису били тако погодни као селективни агонисти Е2 и ЕР-α да посредују естрогени ефекат у материци мишева 15, 20 . Ни тамоксифен ни Е2 нису изазвали пролиферацију ЕЕЗ код мишева ЕР-αКО 11 . ГПЕР1 КО мишеви су показали упоредиву плодност са мишевима дивљег типа 20, сугеришући да Е2 регулација пролиферације ЕЕЦ захтева ЕР-α, али не и ЕР-β и ГПЕР1.

Анордрин је пласиран као контрацепцијски лек, јер је специфични ЕР антагонист на материци 9, 12, што указује да је анордрин антагонист ЕР-α. За три варијанте ЕР-α, ЕР-α-66, -46 и -36, пријављено је да регулишу класични нуклеарни пут естрогена и МИЕС 5, 6, 7, 17, 21 . Варијанте ЕР-α-66 и -46 су ефективни транскрипциони изоформи регулисани лигандом ЕР-α 16, 17, који регулишу транскрипцију РНА класичним нуклеарним путем 9 естрогена. Бцл2 промотор садржи ЕРЕ секвенцу. Ниво експресије бцл2 мРНА у ћелијама МЦФ-7 позитивно је регулисан Е2 и инхибиран тамоксифеном класичним нуклеарним путем естрогена 18 . Тренутни резултати показали су да се анордрин везао на ЕР-α46 слабо у поређењу са Е2 и тамоксифеном, и да је Е2 појачао експресију Бцл-2; тамоксифем инхибира експресију Бцл-2; анордрин није регулисао експресију Бцл-2 под истим условима у МЦФ-7 ћелијама. Ови резултати показали су да је тамоксифен антагонист класичног нуклеарног пута естрогена да испољава анти-ЕР-α позитивни ефекат тумора и да анордрин није регулисао класични нуклеарни пут естрогена. Стога анордрин није утицао на антитуморско деловање тамоксифена.

ЕР-α-36 је лишен и домена трансактивације АФ-1 и АФ-2 ЕР-α-66 и активности Е2-модулиране интринзичне транскрипције РНА 8, 21 ; нађено је да је претежно плазма мембрана повезана ЕР-α (мЕР-α) варијанта да претвара Е2 посредоване МИЕС 5, 6, 7, 8, 21 . Хец1А је ћелија карцинома хуманог материце (хЕЦЦ), која позитивно изражава ЕР-α-36, али не и ЕР-α-66 13 . Тамоксифен је стимулисао пролиферацију Хец1А као агониста ЕР-α-36 13 ; клинички индуковао хумани карцином ендометрија и мишеву ЕЕЦ митозе као естрогено средство 11 ; и да је тамоксифен као и Е2 изазвао ЕЕЦ митозу на начин који је зависио од ЕР-α, али независно од класичног нуклеарног пута ЕР-α 11 . Ови подаци сугеришу да је тамоксифен агонист мЕР-α и / или ЕР-α-36. Тренутни резултати показали су да је анордрин инхибирао ЕГ-митозу изазвану таксиксифеном и пролиферацију хЕЦЦ, што сугерише да анордрин делује као антагонист мЕР-α и / или ЕР-α-36 да испољава своје антиестрогене и антифертилне ефекте у матерници. Будући да су наши подаци показали да су таксиксифен и анордрин извршили супротне ефекте на митозу матернице ЕЕЦ и пролиферацију хуманог ЕЦЦ-а, анордрин може елиминисати карцином материце изазван таксиксифеном.

Поред тога, тренутни подаци открили су да је анордрин стимулисао хипертрофични фенотип у ЕЕ мишевима матернице и инхибирао накупљање ТГ у јетри ОВКС мишева као естрогеног агенса, што сугерише да је анордрин естрогени агенс МИЕС да модулира ТГ метаболит у јетри. Претходна студија сугерисала је да тамоксифен повећава садржај јетрене масти инхибирајући улогу естрогена у одржавању хомеостазе липида 14 . Тренутни подаци открили су да анордрин инхибира накупљање ТГ изазваног тамоксифеном у јетри миша, што сугерише да анордрин може елиминисати НАФЛД изазван тамоксифеном. Узето заједно, закључујемо да анордрин може елиминисати нежељене ефекте тамоксифена без утицаја на његову активност резистенције на карцином дојке. Овај закључак ће бити додатно потврђен у студији клиничког испитивања.

Методе

Материјали

Е2 и андроген су купљени од компаније Окахата Традинг Цо., Лтд. (Шангај, Кина). Детаљна метода синтезе анордрина и динордила претходно је објављена [Јоурнал оф Университи оф Сицхуан (Медицал Сциенце Едитион), 1976, 109–114]. Сва једињења су потврђена коришћењем 1Х и 13Ц НМР спектра. Јиан Ванг великодушно је пружио стандард анордрин. Чистоћа синтетисаног анордрина је верификована коришћењем Агилент 1100 ХПЛЦ са Антхане Ц18 колоном. Укратко, анордрин је растворен у 100% метанолу у концентрацији од 0, 1 мг / л, а 10 μл раствора анордрина је стављено у колону на 30 ° Ц. Анордрин је затим елуиран са ~ 88% [ацетонитрила] коришћењем класификованог програма елуције са смешом вода / ацетонитрил (1: 1) и 100% ацетонитрил са протоком од 1 мл / мин. Анордрин који је био чист од 98% детектиран је на таласној таласној дужини од 208 нм.

Фетални говеђи серум (ФБС) је купљен од компаније ГИБЦО (10099141; произведено у Аустралији). Е2, тамоксифен и изофлавон (МПГ УСП степен) су добијени од компаније Окахата Традинг Цо., Лтд. (Схангхаи, Кина). Сва једињења су растворена у ДМСО пре употребе. Ами-93Г миша купљена је од компаније Тропхиц Анимал Феед Хигх-Тецх Цо., Лтд, Нантонг, Кина. Одсеци за Х&Е добијени су од компаније БК Анимал Модел, Инц. (Схангхаи Цхина). Хемикалије укључујући 4-хидрокситамоксифен и ендоксифен су купљене од Сигме или Аладдина, осим ако није другачије наведено. ТГ (Цат # Е1013) и ТЦ (Цат # Е1015) сетови за тестирање купљени су од компаније Приме Ген Тецхнологиес, ​​Инц., и Нањинг Јианцхенг Биоинжењеринг Институте. Бцл-2 (Цат # 51-1513ГР) антитело је набављено од БД Биосциенцес (УСА). ЕР-α антитело (Цат # 8644) и актин (Цат # 4970 с) су набављени од Целл Сигналинг Тецхнологи (Данверс, МА САД). 3 Х-Е2 и рестрикциони ензими су купљени од ПеркинЕлмер и Такара Био Инц, респективно.

Конструкција плазмида и експресија, пречишћавање и карактеризација протеина коришћењем ЛЦ-МС / МС

ЕР-α-46 и ЕР-α-36 су клонирани у пЕТ-28 и пГЕКС-6П-1 користећи Ецо РИ и Ксхо И локације. Производња фузијских протеина Хис- или ГСТ-ЕР је индукована коришћењем 0, 1 µМ ИПТГ, а протеини су експримирани у Е. цоли на 25 ° Ц током 3 сата. Затим су сакупљене бактерије, а ГСТ фузиони протеина су пречишћени према упутствима произвођача (ГЕ). Пречишћени протеини су елуирани из ГСХ-куглица користећи 1 × пуфер за узорке на 100 ° Ц током 5 мин, а супернатанти су раздвојени на 10% гелова коришћењем СДС-ПАГЕ. Гелови су обојени Цоомассие блуе-Р250, а количина ГСТ-ЕР-α-46 је одређена коришћењем НИХ Имаге Ј софтвера користећи ГСТ као стандард. Након тога, траке које одговарају ГСТ-ЕР-α-46 су одцепљене од гела и окарактерисане коришћењем ЛЦ-МС / МС. Хумане ЕР-α цДНА су набављене од гена ИР (Кина, Цхангсха) и субклониране у пЕГФП-Н1 векторе (Цлонтецх). ПЦР прајмери ​​су дизајнирани из хумане ЕР-α-36 цДНА секвенце у НЦБИ.

Ћелијска култура, трансфекција, индукција МЦФ-7 стабилне ћелијске линије и тест пролиферације ћелије Хец1А

МЦФ-7, Хец1А и ХЕК-293 ћелије су узгајане у складу са протоколима који препоручује АТЦЦ. Трансфекција ћелија изведена је коришћењем Липофецтамине 2000 (Инвитроген) према упутствима произвођача. Експресија ГФП фузијског протеина потврђена је Вестерн блоттингом. Испитивање пролиферације ХецлА ћелија извршено је рачунањем броја живих ХецлА ћелија после инокулације током 6 дана. Укратко, 5 × 10 3 ХецлА ћелије које садрже лекове у медију од 0, 5 мл инокулиране су у плоче са 24 јажице. Медијум је размењиван једном трећег дана од дана иницијације. У шестом дану, Хец1А ћелије су трипсин и обојене од стране трипано плаве боје (Цат # Т8154, Сигма). Број живих ћелија се броји помоћу бројача ћелија.

Припрема зечјег поликлонског антитела против ЕР-α-36

Зечја поликлонска анти-ЕР-α-36 антитела припремљена су прилагођеном услугом компаније ГЛ Биоцхем Лтд. (Шангај, Кина). Тачно након реф. 21, Ц-терминални пептид ЕР-α-36 синтетизован је и повезан са хемоцијанином као антигеном, а затим је повишено антитело ЕР-α-36.

Афинитет везивања за лек-ЕР-α и 3 такмичења за надметање лека Х-Е2

Испитивања су изведена као реф. 7 и 13 са кратком модификацијом. Пречишћени ГСТ-ЕР-α-46 је спојен на зрнца глутатиона у ТЕ пуферу (50 мМ Трис [пХ 8, 0], 10 мМ ЕДТА, 20 мМ п-Меркаптоетанол. Лекови и 3 Х-Е2 су додани у 1 мл раствора протеина и инкубирати на 4 ° Ц током 2 сата. Куглице су испране два пута помоћу ТЕ пуфера и пребачене у сцинтилационе бочице. Количина везаног 3 Х-Е2 је измерена помоћу ГМ мерача.

ЕР-α36 се пролазно експримира у ћелијама ХЕК293 користећи ЕР-α36 цДНА плазмид. Након 24 сата трансфекције, ћелије су суспендоване у ТЕ-глицерол пуферу (10% глицерол, 50 мМ Трис [пХ 8.0], 10 мМ ЕДТА, 20 мМ п-Меркаптоетанол. После центрифугирања на 500 г током 3 мин, лекови и 3Х -Е2 је додан у 1 мл супернатанта (5 мг / мл) и инкубиран на 4 ° Ц током 2 сата. Супернатант је центрифугиран на 30 крпм у току 90 минута. Пелет је пренесен у сцинтилациону бочицу да би се бројио везан 3 Х -Е2.

Његов обележени ЕР-α-46 изражен је у Е. цоли и лизиран у 1кПБС који садржи 10 мМ ЕДТА, 20 мМ β-Меркаптоетанол. Затим је 1 мл сировог лизата који садржи 10 мг укупног протеина помешан са лековима и 3 Х-Е2 током 2 сата. Затим је 30 мг Норит А [Иммунометрицс ЛТД, Лондон], суспендовано у 100 μл 0, 3% раствора декстрана-0, 1 М натријум-фосфата [Иммунометрицс ЛТД, Лондон], додато у реакциони раствор на леду током 15 мин. После центрифугирања на 4 ° Ц током 12 мин, 500 μл супернатанта је пребачено у сцинтилационе бочице како би се пребројала количина везаног 3 Х-Е2. Везан 3 Х-Е2 је израчунат након одузимања ДПМ 3 Х-Е2 од једнаке количине укупног протеина који је бактерија трансформисала помоћу вектора.

Екстракција ћелијских лизата, мерење укупне концентрације протеина и Вестерн блоттинг

Ћелије су скупљене и лизиране у РИПА пуферу или 1 × ДПБС који садржи 1% Тритон Кс-100 и коктел инхибитора протеазе (Сигма). Укупна концентрација протеина је затим измерена коришћењем бојења Био-Рад протеина. Вестерн блотирање је изведено према стандардним протоколима користећи нитроцелулозне мембране (Миллипоре) са семодричним преносом Био-Рад.

Животиње

ИЦР и голи мишеви сојева купљени су од фирме Схангхаи БК Анимал Модел Инц. Лтд., Кина. Експериментални протокол на животињама одобрио је Одбор за животињску етику Шангајског института за планирано истраживање родитељства (СИППР уредба # 2015–13), у складу са 588. уредбом покуса на животињама коју је кинеска влада издала у 2011. Сви експерименти на животињама изведени су у складу са ревизија Одбора за етику животиња СИППР.

Изградња ОВКС модела мишева и примјена лекова

Јајници 7 - 8 недељних ИЦР мишева (БК Анимал Модел, Инц. Схангхаи) изрезани су хируршки. После 3 дана или 2 месеца, лекови су давани свакодневно користећи ињекције желудачног тракта или мешане са храном и храњени мишевима. Дозирање 45 мг тамоксифена по килограму хране или 0, 5, 1, 1, 5, 2, 3, 4, 5, 9 мг анордрина по килограму хране или смеше ова два лека је примењено мишевима. Количина лекова у храни дизајнирана је у зависности од уноса хране мишевима дневно. Свакодневни унос дроге у храну сличан је уносу лекова уз свакодневне ињекције у желудачни тракт. Мишеви су храњени АИН-93Г (празан) или АИН-93Г помешан са лековима током 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 и 15 недеља, а затим су жртвовани. Ткива су била замрзнута на -80 ° Ц или уграђена у парафин ради сечења.

Стварање ксенографта МЦФ-7 тумора код женских голих мишева

Мишевима старим пет недеља давали су се два пута недељно по 1 мг Е2 по кг телесне масе. После недељне примене Е2, суспензија од 1 × 10 7 МЦФ-7 ћелија у 100 μЛ 1кДПБС са 100 μл матриксела убризгана је СЦ у голе женске мишеве. Тумори су узгајани све док просечна запремина тумора није достигла 0, 1–0, 2 цм3. Голи мишеви су давани свакодневно током 3 недеље носачем или 6 мг тамоксифена по килограму телесне масе, или истој количини тамоксифена плус 0, 4 мг анордрина. Мишеви су жртвовани. Измерена је маса тумора.

Припрема и анализа парафинских пресека и бојања Х&Е

Мишја ткива су скупљена и фиксирана коришћењем 4% формалдехида у 1 × ДПБС (Солар Биосциенце & Тецхнологи, Пекинг, Кина). Парафински одсеци су припремљени и Х&Е бојење је затим извршено према стандардним протоколима у ГЛП лабораторији компаније БК Анимал Модел, Инц. Парафин је уклоњен са јетрених секција три пута испирањем ксилоном, а ксилен је уклоњен користећи 100%, 95% и 75% алкохола узастопно. За припрему антигена, одсеци су инкубирани 2 мин са 0, 01 М натријум-цитратним пуфером (пХ 6, 0) на 95 ° Ц и испрани користећи 1 × ПБС три пута по 5 мин. Одјељци су затим инкубирани у 1 × ПБС који садржи 3% Х202 на 5-10 минута на собној температури и испран помоћу 1 × ПБС током 5 минута. Масно подручје јетрених Х&Е пресека тестирано је коришћењем НИХ имаге Ј софтвера.

Мерење ТЦ и ТГ у јетри и серуму мишева

Узорци јетре мишића (30–50 мг) су сакупљени и хомогенизовани у 1 мл смеше хлороформ: метанол (2: 1), а затим екстраховани помоћу 0, 5 мл ддХ20. Органска фаза је пренета у нове епрувете и остављена да се осуши у ваздух и садржај ТЦ и ТГ мерени су помоћу прибора, према упутствима произвођача. Грешка је елиминисана помоћу интерне контроле.

Статистичка анализа

Најмање два понављања су извршена за сваку дозу лека, укључујући вехикл (Празан) у свим експериментима. Више од девет ткива или тумора мишева коришћено је за статистичку анализу у свим експериментима на животињама. Сви подаци су представљени као средња вредност ± СД. Звездице указују на значајне разлике, израчунато помоћу двоструког т- теста ученика. Вредност П <0, 05 је дефинисана као значајна. Најмање три понављања коришћена су за све статистичке анализе.

Додатне Информације

Како цитирати овај чланак: Гу, В. ет ал . Анордрин елиминира нежељене ефекте Тамоксифена без промјене његове антитуморске активности. Сци. Реп. 7, 43940; дои: 10.1038 / среп43940 (2017).

Напомена издавача: Спрингер Натуре остаје неутралан с обзиром на тврдње о надлежности у објављеним мапама и институционалној припадности.

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Додатне информације

Коментари

Подношењем коментара пристајете да се придржавате наших Услова и Смерница заједнице. Ако нађете нешто злоупотребно или то није у складу са нашим условима или смерницама, означите то као непримерено.