Апое2 појачава неуропротекцију против алзхеимерове болести кроз више молекуларних механизама | молекуларна психијатрија

Апое2 појачава неуропротекцију против алзхеимерове болести кроз више молекуларних механизама | молекуларна психијатрија

Anonim

Субјекти

  • Алцхајмерова болест
  • Биомаркери
  • Молекуларна неурознаност

Апстрактан

Уобичајена варијанта гена АПОЕ2 је неуропротективна против Алзхеимерове болести (АД) и смањује ризик за готово 50%. Међутим, механизми помоћу којих АПОЕ2 пружа неуропротекцију углавном су непознати. Овде смо показали да обиље протеина АпоЕ у корти хуманог постмортема следи образац који зависи од изоформе (Е2> Е3> Е4). Такође смо идентификовали јединствени транскрипциони профил низводног тока одређен микрорезом и који је карактеризиран смањењем транскрипата везаним за дугорочно потенцирање (ЛТП) и урегулацијом транскрипата изванстаничне матрице (ЕЦМ) / интегрина повезаних у Е2 случајевима и потврдио овај налаз на нивоу протеина помоћу демонстрирајући пораст ЕЦМ колагена и ламинина. Ин виво студије здравих старијих појединаца показале су јединствен и повољан потпис биомаркер-а у Е2 носачима. АПОЕ2 је такође за половину смањио ризик од благог когнитивног оштећења АД конверзије. Наши налази сугерирају да обиље протеина АпоЕ2, заједно с његовом неспособношћу да се веже за ЛДЛР, могу дјеловати на повећање клиренса амилоид-бета (Аб). Поред тога, повећана ЕЦМ и смањена експресија повезана са ЛТП резултира смањеном излучивањем Аб-а и / или ексцитотоксичношћу која зависи од активности, и тако такође промовише неуропротекцију.

Увод

АПОЕ ген је триален на два СНП-а у свом егзону 4 (рс429358, рс7412), што доводи до аминокиселинских супституција аргинином или цистеином на позицијама 112 и 158. Е2 одговара Цис / Цис, Е3 до Цис112 / Арг158, а Е4 до Арг / Арг. 1, 2 Иако је Е4 главна варијанта генетског ризика за касни почетак АД (ОР = 3, 81), варијанта Е2 је неуропротективна и смањује ризик за АД за готово 50% (ОР = 0, 54) у поређењу са референтном варијантом Е3. 3, 4 Учесталост алела АПОЕ2 у општој популацији Кавказа је око 8%. Супротно томе, АПОЕ2 може бити скромно повезан са церебралном амилоидном ангиопатијом и недоследно је повезан са ризиком за неколико других неуролошких болести. 5, 6, 7, 8, 9 АПОЕ2 хомозиготичност повезана је са хиперлипопротеинемијом типа ИИИ. 5, 10 Ипак, АПОЕ2 је повезан са смањеном кардиоваскуларном болешћу и већом дуговечношћу. 11, 12, 13, 14

АпоЕ се експримира првенствено у астроцитима и испоручује холестерол и остале липиде неуронима кроз породицу липопротеина ниске густине (укључујући ЛДЛР, ЛРП1, ВЛДЛР и АпоЕР2). 15, 16 Неколико карактеристика Е2 изоформе разликује је од изо3 Е3 и Е4. Они укључују драматично смањено везивање за ЛДЛР у поређењу са Е3 и Е4 и конформациону стабилност у поређењу са Е4. 2, 17 АПОЕ изоформе различито регулишу производе прераде протеина амилоидног прекурсора. 18, 19 Сматра се да су неки амилоид-бета (Аб) пептиди, на пример, Абл-42, одцепљени од протеина прекурсора амилоида, токсични и могу да имају кључну улогу у АД неуродегенерацији. Е2 и Е3 се вежу за Аб с већим афинитетом него Е4, па тако изоформе могу различито регулисати клиренс Аб путем неурона, микроглија или доводу крвно-мождане баријере (БББ). 20, 21, 22

Упркос потенцијалном значају АПОЕ2, нису постојала свеобухватна истраживања о његовим молекуларним својствима, утицају низводно на биолошке путеве, модулацији параметара функције мозга и неуродијагностичком утицају. Овде ћемо испитати ова питања помоћу молекуларних техника за процену нивоа мРНА и протеина Е2 у поређењу са Е3 и Е4 у постмортем неокортексу, испитати транскрипциони профил случајева носилаца Е2, утврдити је ли Е2 потпис присутан у комбинованим биомаркер и когнитивним анализама код здравих старијих појединаца, и последње, испитајте ефекте Е2 на неуродијагностици у контексту МЦИ у АД конверзију.

материјали и методе

Студија 1

Узорци људског мозга

Свеже смрзнуто људско ткиво добивено је из Националне филијале за клиничке поремећаје менталног здравља, ГЦАПП, Одељење за неуропатологију. За све молекуларне студије, проучавали смо млађе случајеве (који су умрли 60 година или мање) и укључили 5 АПОЕ2, 13 АПОЕ3 / Е3 и 13 АПОЕ4 носача (од којих су два били Е4 хомозиготи). Демографске карактеристике посмртних случајева налазе се у допунској табели 1. Сви узорци су подвргнути неуропатолошком прегледу, укључујући и биелсцховски обојење сребром, ради стварања густине плака и заплета, васкуларних инфаркта и других неуродегенеративних стања; били су без дијагнозе АД и ЦВД патологије. За сваки случај, урушили смо резултате испитивања из ткива добијеног из две кортикалне регије (БА 1/2/3 и БА 21). Као што је примећено, ниједан случај није имао дијагностику АД неуропатологије АД. Даљњи детаљи о узорцима могу се наћи у Цонејеро-Голдберг ет ал. 23 ДНК из можданог ткива горе наведених случајева коришћено је за генотипизацију. 16 Генотипске групе АПОЕ нису се значајно разликовале у демографским или променљивим квалитетима ткива као што је приказано у Додатној табели 1.

РТ-кПЦР

РТ-кПЦР реакције су изведене у термичком цикличком АБИ Присм 7900ХТ за одређивање ΔΔЦт као што је претходно описано. 23

Иммуноассаис

Детаљније информације о методама сакупљања супернатанта и Вестерн блотирању налазе се у Додатним методама. Вестерн Блоттинг . Мрље су испитиване зечјим анти-АпоЕ (Х-223) поликлонским антителом (разблажење 1: 400 в / в) и мишјим анти-п-актин моноклонским антителом (разблажење 1: 2000 в / в) (Санта Цруз Биотецхнологи, ЦА, САД ). Детекција је рађена помоћу побољшане хемилуминисценције (ЕЦЛ, ГЕ Хеалтхцаре Лифе Сциенцес, Питтсбургх, ПА, САД). Интензитет сигнала квантификован је коришћењем НИХ ИмагеЈ софтвера. Процењивали смо ниво протеина изоформних АпоЕ (на 34–39 кДа) и проценили протеолитичке фрагменте (на 17–22 кДа), у мери у којој су присутни / одсутни. ЕЛИСА. Нивои АПОЕ у човеку у мозгу су мерени помоћу АПОЕ ЕЛИСА специфичне за људе (МБЛ Интернатионал, Вобурн, МА, САД) у складу са упутствима произвођача. Разблажени хомогенати су покренути у три примерка и откривени су користећи Пан-АПОЕ антитело у ТЕЦАН Гениос Про Мицроплате Реадер-у. Сва АПОЕ мерења су нормализована на укупни протеин у мозгу хомогената; Вредности ЕЛИСА изражене су као нг мл -1 .

Статистички приступ

Користили смо аналитичку стратегију која је испитивала разлике у АПОЕ генотипима у ГЛМ оквиру (САС Проц ГЛМ) са референтним молекулама / генским производима који служе као коваријати према потреби, а затим су планирани контрасти у којима су узорци Е2 упоређени са узорцима Е3 и узорцима Е4. Користећи податке западног блота, такође смо анализирали број случајева који су показали протеолитичке фрагменте и упоредили дистрибуцију Фисхеровим тестом по генотипним групама. Овде и другде у извештају проучавали смо случајеве Е2 / Е3 (у даљем тексту Е2), Е3 / Е3 (у даљем тексту Е3) и Е4 носаче (у даљем тексту Е4) на људским узорцима или људима. Случајеви Е2 / Е4 су искључени. Случајеви Е3 / Е3 сматрани су референтном варијантом (као према конвенцији) за потребе ове студије.

Студија 2

Узорци људског мозга

Као што је горе детаљно, с изузетком што смо укључили 11 додатних случајева Е3. Ови случајеви нису показали суштински различит квалитет ткива или демографију од случајева наведених у Додатној табели 1. У овом експерименту смо користили само ткиво из БА 21.

Мицроарраи Платформ

Коришћена је платформа ВГ6 БеадЦхип низ (Иллумина, Сан Диего, ЦА, САД), који су генерисали профиле експресије целог генома за шест узорака паралелно на једној матрици.

Предобрада и анализа података

Подаци су претходно обрађени помоћу БеадСтудио софтвера (Иллумина). Техничке реплике истог узорка су просечене након што је утврђено да су корелације између реплика константно врло високе (> 0, 98). Идентификовали смо гене који су различито експримирани између две класе (АПОЕ3-носачи / АПОЕ2-носачи) рачунајући АНОВА блокирану по старости и полу. За ограничавање броја лажно позитивних налаза кориштен је строг праг значаја. Упоређујући АПОЕ3 / Е2 типове, такође смо контролисали старост и пол пацијента.

РТ-кПЦР

За одабране гене који показују различиту експресију између случајева АПОЕ2 и АПОЕ3, створена је синтеза цДНА за сваки узорак, а ми смо одредили ΔΔЦт и значај пријављених разлика у контроли случајева.

Иммуноассаи (Вестерн Блоттинг)

За ламинин и колаген ВИ, мрљице су испитиване зечјим анти-ламинин-поликлонским антителом (разблажење 1: 500 в / в; Сигма-Алдрицх, Ст Лоуис, МО, САД) и зечјим анти-колагеним ВИ поликлонским антителом (1: 1000 в / в разблаживање; Абцам, Цамбридге, МА, САД). Више информација је у додатним методама.

Студија 3

Методе које се користе у АДНИ-у, укључујући одабир предмета, анализе биомаркера, параметре слике и когнитивно тестирање могу се наћи на веб локацији АДНИ и у нашем претходном раду. 24 Предмети. Користили смо 197 испитаника који су испунили АДНИ критеријуме за укључивање ХЦ-а. 17 АПОЕ генотип био је доступан у бази података АДНИ. Двадесет и четири субјекта су били Е2 (укључујући 1 хомозигота), 107 су били носачи Е3 / Е3, а 47 су били носачи Е4 (укључујући 3 хомозиготе). За кластерску анализу, у коју су укључени само испитаници чији су когнитивни и подаци о биомаркерима комплетирани, седамнаест субјеката су били Е2, 61 су били Е3 / Е3с и 21 су били носачи Е4.

Когнитивни тестови

Анализирали смо податке са следећих тестова: ВМС-Р кашњење логичке меморије; Резултат пробног теста вербалног учења аудиторног 5, оцена одлагања (слободно опозив), стазе б.

Биомаркери

Структурни МРИ. Користили смо Далеову полуаутоматску методу (ФрееСурфер) за одређивање дебљине кортика (средњи темпорални режањ), волумена хипокампала, енторхиналне дебљине и укупне запремине мозга. 24 ЦСФ Аб1–42 и Тау. Испитали смо ЦСФ Абета и укупни ниво тау и фосфо тау у здравим контролним узорцима АДНИ који су прикупљени на почетку ('УПЕННБИОМК'). Концентрације су трансформисане за анализу.

Статистички приступи

Прво смо спровели поступке засноване на ГЛМ како бисмо утврдили да ли су разлике међу АПОЕ групама генотипа биле на почетној основи. Затим смо спровели ненадзирану анализу кластера (ПРОЦ ЦЛУСТЕР метода = АВЕ у САС-у) коју смо сматрали централном за идентификацију Е2 'потписа', односно присуство кластера случајева (субјеката) на основу когнитивног и биомаркер нивоа и профила . АПОЕ генотип је искључен из ових анализа, тако да се кластери могу објединити независно од генетских информација. Након идентификације кластера, тада смо испитали да ли један кластер садржи непропорционалан број Е2 носача са Кс2 .

Студија 4

Субјекти

Узорак АДНИ аМЦИ од 310 пацијената праћен је више од 4 године. Критеријуми за МЦИ су исти као што је дефинисао Петерсен и изложени у Ледуц ет ал. 17 Петнаест пацијената су били носачи алела АПОЕ2, 128 пацијената су били хомо3готи Е3 и 167 су били носачи АПОЕ4 (укључујући 41 Е4 хомозиготе). Демографске и волуметријске променљиве мозга наведене су у Додатној Табели 7.

Статистички приступи

Користили смо Цок пропорционалну регресију опасности (ХР) да бисмо утврдили јединствени мултипликативни ефекат разлика у генотипима (то јест, „повећање јединице“) на стопу опасности (конверзија из МЦИ у АД).

Резултати

Студија 1. Молекуларна својства АпоЕ изоформи

мРНА и нивои протеина

Ниво протеина може пружити прозор за делимично разумевање заштитних ефеката, јер ниво АпоЕ протеина може бити важна одредница ефикасног и робусног транспорта липида, за који се сматра да је неопходан за синаптички раст, преуређивање и поправак и за уклањање Аб-а. 17, 25 Такође се сугерише да се фрагменти протеина различито цепају међу изоформама неурона, а токсичне последице низводно, укључујући дисфункцију митохондрија, најчешће у АПОЕ4. Ниви и фрагментација протеина 26, 27 нису испитивани у узорцима кортикалних постмортемских узорака код људи. Супротно томе, у људској плазми постоје добро поновљене разлике у нивоу протеина, тако да су Е2> Е3> Е4 (на пример, Соарес и др. 28 ).

Прво смо покушали да утврдимо да ли су разлике у генотипу АПОЕ у експресији мРНА присутне у људском постмортем кортексу. Затим смо испитали ниво протеина и склоност фрагментацији као функцији АПОЕ генотипа у овим узорцима (види Додатну табелу 1 за демографију и квалитет ткива случајева). Код трансгених мишева са уништеним варијантама људског АПОЕ гена, разлике између нивоа изо2 Е2, Е3 и Е4 мРНА нису нађене. 29, 30

мРНА Екпрессион

Користећи РТ-кПЦР, упоредили смо АпоЕ експресију у три групе генотипа (Е2 / Е3, Е3 / Е3, Е4 носачи), и нисмо пронашли значајне разлике у вези са изоформом.

Иммуноассаис

Користећи поликлонално антитело за АпоЕ, упоредили смо нивое протеина Е2, Е3 и Е4 случајева и идентификовали три опсега по западном блоту: опсег 1 на 39-кДа, опсег 2 на 37-кДа и опсег 3 на 34-кДа (Слика 1а ). Сматра се да бенд са највећом молекуларном тежином (опсег 1) одражава снажно сиалилирани АпоЕ; Сматра се да 34 кДа АпоЕ одражава аутохтоне врсте. 31 Такође смо идентификовали 17–22 кДа АпоЕ који одражава фрагменте протеина (Слика 1б). Укупни протеин се значајно разликовао међу генотипним групама (Е2> Е3> Е4) као што је описано на слици 1ц. Разлике су биле највеће у матичном АпоЕ и лагано сиалилираном опсегу (подаци нису приказани). Помоћу ЕЛИСА-е, укупна разлика у нивоу протеина међу АПОЕ генотипским групама приближила се значају (Слика 1д). Стопе фрагментације на основу Вестерн блот-а нису се разликовале по генотиповима Фисхер-овим тачним тестом. Нумерички је Е2 имао најмањи удио фрагмената (види Додатну табелу 2).

Image

Ниво АпоЕ протеина у људском мозгу од АПОЕ2, АПОЕ3 и АПОЕ4 носача. ( а ) Вестерн блот анализа показала је експресију протеина АпоЕ у људском мозгу из АПОЕ2, АПОЕ3 и АПОЕ4 носача у две области мозга: БА 1/2/3 и БА 21 користећи поликлонално антитело за АпоЕ (Х-223). Примећени су имунореактивни 34-кДа нативни АпоЕ и 37-кДа и 39-кДа сиалилирани АпоЕ (АпоЕс и АпоЕ2с) опсези код Е2, Е3 и Е4 носача. ( б ) АпоЕ фрагменти људског кортекса у нормалним контролним мозговима. Примећени су имунореактивни 34-кДа нативни АпоЕ и 37-кДа и 39-кДа сиалилирани АпоЕ (АпоЕс и АпоЕ2с) заједно са фрагментом од 17 кДа коришћењем поликлоналног антитела за АпоЕ (Х-223). ( ц ) Упоређени су нивои протеина Е2, Е3 и Е4 у можданом ткиву. За поликлонални имунолошки тест који мери разлике у АпоЕ протеину, ГЛМ анализа коваријанције (АНЦОВА) (исправљен бета-актин) са планираним контрастима показала је укупну значајну разлику међу генотипним групама која је била значајна ( Ф 2, 1, 1 = 6, 44, П = 0, 005) за комбиноване опсеге. Контраст Е2-Е3 био је на нивоу тренда по значајности ( Ф = 3, 50, П = 0, 07); контраст Е2-Е4 је био значајан ( Ф = 8, 52, П = 0, 007). ( д ) Помоћу ЕЛИСА-е постојала је разлика у нивоу тренда међу АпоЕ изоформама ( Ф 2, 1, 1 = 2, 67, П = 0, 08). У планираним контрастима разлика Е2-Е3 била је значајна ( Ф = 4, 17, П = 0, 05); разлика Е2-Е4 била је значајна на нивоу тренда ( Ф = 2, 82, П = 0, 10). ( е ) Разлике у ефектним величинама (Цохенов д) за РТ-кПЦР (за које нису утврђене разлике у генотипу), поликлоналне и ЕЛИСА вредности за разлике Е2 у односу на Е3 и разлике између Е2 и Е4.

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Ефект Величине

За мРНА, величине ефеката за контрасте Е2-Е3 и Е2-Е4 су биле мале као што је приказано на слици 1е. За мере поликлоналне мере протеина, величине ефекта приказане на слици 1е биле су велике у контрастима Е2-Е3 и Е2-Е4. За контрасте на основу ЕЛИСА-е, величине ефеката су биле средње за контрасте Е2-Е3 и Е2-Е4 као на слици 1е.

Резиме

Открили смо неусклађеност нивоа експресије мРНА и нивоа протеина у АПОЕ контрастима генотипа. Иако се нивои експресије мРНА нису разликовали, нивои протеина су били виши у случајевима Е2, што сугерише да је изоформа релативно неоспорна на пост-транслационе модификације и у складу са неколико студија ин виво и ин витро које су имплицирале разлике у протеолитичкој разградњи изоформи. 2, 17 Конкретно, у неколико студија АПОЕ циљаних замена (ТР) трансгених мишева, ниво експресије мРНА се није разликовао међу АПОЕ варијантама, али ниво протеина је био најнижи у Е4 и највиши код Е2 мишева. 29, 30 Експерименти потискивања импулса у ћелијским културама добијеним од астроцита показали су појачану деградацију ново синтетизованог Е4 протеина. 29 повезане са овим разликама код АД трансгеничних мишева биле су разлике у оптерећењу амилоида мозга, тако да су Е2 мишеви имали најнижи ниво амилоида, а Е4 мишеви највиши ниво. Стога, овај образац налаза у мозгу човека с великом верношћу рекапитулише неколико трансгених студија на животињама користећи људски АПОЕ ТР.

Студија 2. Транскрипционо профилирање АПОЕ2 у људској коре

Да бисмо испитали последице АПОЕ2 на транскрипт, спровели смо микроредну студију која је упоређивала профиле транскрипције Е2 и Е3 случајева носача у људском постмортем кортексу. Колико нам је познато, није било претходних студија у овој области. Желели смо да идентификујемо кључне биолошке путеве који вјероватно могу пружити неуропротекцију или побољшати функцију неурона.

Групно поређење профила транскрипције

Идентификовали смо 131 транскрипт који се значајно разликовао (при П <0, 001) између АПОЕ2 и АПОЕ3-носача користећи АНОВА за фиксне ефекте у БРБ анализном пакету. Велики део ових појединачних транскрипата (73%) регулисан је код носилаца Е2 у односу на носаче Е3. Резултати су наведени у Додатној Табели 3.

Хијерархијско групирање промјена у изразима које је идентификовала АНОВА

Само за хијерархијско групирање искључили смо 16 ЛОЦ гена, 43 ЕСТс и 6 отворених оквира за читање који су информатички идентификовани из људског транскрипта, остављајући укупно 66 транскрипата за даљу анализу, од којих је 41 било регулирано.

Као што је приказано на слици топлотне мапе (слика 2), хијерархијско групирање промене израза изведених из ових транскрипата показало је групу од четири случаја у групи АПОЕ2. АПОЕ3 група је показала мање изражен образац транскрипцијске регулације и регулације.

Image

Карта топлотне енергије која приказује надолазеће и доле прописе за сваки случај појединачно за 66 транскрипата који су анализом варијанце (АНОВА) идентификовани као значајни (сви П с <0, 001). Транскрипти су на оси и, а случајеви груписани према сличности са својим комшијама налазе се на оси к. Интензитети трупаца приказани су у обојеним ћелијама. Црвене ћелије показују релативно јаку регулацију у БА 21 (темпорални кортекс); док зелене ћелије указују на супротно. Четрдесет и једна транскрипта увећана је у носачима Е2 у поређењу са Е3 носачима; 25 транскрипата је регулисано.

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

ЦипА

Поред тога, на основу недавног рада 32 идентификовања циклофилина А (ЦипА) као важног посредника интегритета БББ и различито модулираног од АпоЕ изоформама, испитали смо његов израз пост хоц . Открили смо да је ЦипА мРНА редукована у групи Е2 носача ( П = 0, 01), у складу са мишљењем да је Е2 повезан са робуснијим очистом Аб на периваскулатури. 33

Анализа пута биолошких и сигналних путова

Два кјотска пута идентификована су помоћу ЛС / КС и Ефрон-Тибсхирани-јевог ГСА теста помоћу П- вредности П <0, 005: дугорочно потенцирање (ЛТП) и интеракција изванстаничног матрикса (ЕЦМ) -рецептора. 34, 35 Гени унутар ових путева наведени су у Додатним Табелама 4 (аб).

РТ-кПЦР

Испитали смо транскрипте повезане са ЛТП (ХОМЕР2 и ДЛГ2) и ЕЦМ (ЦОЛ6А1, ЛАМЦ1, ИТГБ1) помоћу РТ-кПЦР. Резултати микрорачуна потврдили смо РТ-кПЦР у четири гена (ХОМЕР2, ДЛГ2, ЦОЛ6А1, ЛАМЦ1, сви П с <0, 05 од т- теста). Погледајте допунску табелу 5 за промене набора и поређење сонде микрорачуна са подацима РТ-кПЦР и допунске резултате за кратак преглед предметних молекула.

Да бисмо додатно продужили ове резултате, такође смо спровели студије Вестерн блот-а како бисмо утврдили нивое одабраних ЕЦМ протеина повезаних у Е2 групи. Користећи поликлонално антитело за ламинин, открили смо изузетно значајно повећање нивоа протеина у Е2 групи у супротности са Е3 групом. Користећи поликлонал за колаген ВИ, такође смо открили веома значајно повећање нивоа протеина у Е2 групи. Детаљи анализа су у Додатним методама и Додатној Слици 1 (аб).

Резиме

Поред више појединачних транскрипата који су се разликовали између Е2 и Е3 група, идентификовали смо два пута која могу заштитити неуроне у Е2 групи. Укључили су ЛТП и ЕЦМ. Случајеви Е2 имали су нижи ниво експресије транскрипата повезаних са ЛТП. То је у складу са претходним радом на АПОЕ ТР мишевима који су показали да носачи Е2 показују смањени ЛТП у поређењу са другим АПОЕ генотипима. 36 Због налаза хиперметаболизма у чворовима такозване мождане мреже, одлагања Аб зависног од активности и ексцитотоксичности, смањења активности повезаних са ЛТП-ом 37, 38, 39 могу бити заштитна у контексту Е2. Слично томе, недавно истраживање показало је да мождана активност може бити повезана са неуродегенерацијом двоструког ланца ДНА и да се таква дегенерација погоршала у присуству Абете. 40 Смањење активности такође може да умањи ову врсту неуродегенеративног процеса. Штавише, наши налази ЕЦМ-интегрираних регулација у носачима Е2 служе као механизам за смањење активности. Повећање ЕЦМ смањује пластичност, можда нарочито утицајем на покретљивост АМПА рецептора, што је кључно за рану фазу ЛТП. 41, 42 Као што је примећено, у случају да се Аб излучује на начин зависан од активности, смањени ЛТП може да смањи ниво Аб. Поред тога, пораст ЕЦМ-а („перинеуралне мреже“) у синапсама смањује стварање заметки ин ситу . 43

Други неуропротективни механизам може укључивати наш налаз снижене експресије ЦипА; Сматра се да би смањење овог броја имало позитивне последице за уклањање Аб-а широм БББ-а. 33 Повећање колагена и ламинина у ЕЦМ-у (као што је утврђено у претходним експериментима са протеинима) такође може промовисати интегритет БББ-а. 44

Занимљиво је да се путеви нису преклапали са сигналним путевима и биолошким процесима повезаним са Е4 у нашој ранијој студији микрораста. 23 Стога сугеришемо да путеви ка неуродегенерацији и неурозаштити нису само обрнути једни према другима.

Студија 3. Профил биомаркера АПОЕ2

Хтели смо да утврдимо да ли носачи Е2 имају бољу неурокогнитију и повољније профиле биомаркера. 45, 46, 47, 48, 49, 50 Користили смо јавну базу података АДНИ због великих узорака здравих контрола (ХЦ) (просечна старост 75 година), АПОЕ карактеризације, разумног броја Е2 / Е3 носача у ХЦ групи у у складу са фреквенцијама алелних популација и широким распоном когнитивних маркера и биомаркера прикупљених на једноличан и перспективан начин.

Разлике генотипа у биомаркерима

Прво смо упоредили АПОЕ групе генотипа на панелу биомаркера. Значајне разлике биле су присутне за ЦСФ Аб1–42, п-тау и средњу темпоралну дебљину кортикала (Табела 1). Величине ефеката су биле велике до умерене (Слика 3а). Није било значајних разлика за когнитивне маркере (Табела 1); величине ефеката су углавном биле мале (слика 3б).

Табела пуне величине

Image

Биомаркер профил АПОЕ2: разлике међу генотипима за ЦСФ Аб, ЦСФ п-тау, когнитивне мере и анализа кластера. ( а ) Значајне разлике биле су присутне међу генотипима за ЦСФ Аб ( П <0, 0001). Планирани контрасти показали су да је група Е2 имала значајно виши ниво ЦСФ Аб у односу на групу Е3 и групу Е4. Значајне разлике су такође биле присутне међу генотипима за ЦСФ п-тау ( П = 0, 02). Планирани контрасти показали су да је група Е2 имала значајно ниже нивое пФ-тау-а ЦСФ у односу на групу Е3 и групу Е4. Значајне разлике биле су присутне међу генотипима за средњу темпоралну дебљину кортика ( П = 0, 04). Планирани контрасти показали су да је група Е2 имала значајно веће дебљине од групе Е3 и групе Е4. Разлике међу генотипним групама нису биле присутне за хипокампус ( П > 0, 10), енторхинални кортекс (подаци нису приказани) и укупни тау (подаци нису приказани). Биомаркерови ЕС за горе описане контрасте били су веома велики за Аб1–42 и велики за п-тау. У тим случајевима, као и за средњу темпоралну кортикалну дебљину, Е2 је имао предност. ( б ) Значајне разлике међу генотипним групама за когнитивне мере, укључујући ММСЕ, одложено опозив епизодне меморије и брзину прављења трагова нису биле присутне. ЕЗ за ове мјере за контрасте Е2-Е3 и Е2-Е4 обично су биле мале, иако су углавном погодовале Е2. ( ц ) Кластер анализа здравих старијих појединаца користила је биомаркер и когнитивне податке, али извршена је независно од АПОЕ генотипа. Добио је робусно и стабилно решење од три кластера користећи методе Просечне растојања (ЦЦЦ = 1, 71). Дендограм приказује итерације у поступку здруживања. Кластер 2 је садржао највећи проценат случајева АПОЕ2 и имао је повољан биомаркерски профил који је карактерисао п-тау са ниским ЦСФ-ом, висок ЦСФ Аб1–42 и незнатно бољом когницијом (подаци нису приказани) у односу на друга два кластера. Аб, амилоид-бета.

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Следеће смо спровели анализу кластера. У комбинованом панелу когнитивних и биомаркера идентификовали смо робусно решење које указује на присуство три кластера (критеријум кубног групирања = 1, 71, Р2 = 0, 65, процијењени р 2 = 0, 61, псеудо- Ф = 89, 00). Девет случајева било је у кластеру 1, 59 у кластеру 2, а 31 у кластеру 3 (слика 3ц). Као што је примећено, генотип АПОЕ није коришћен као кластер варијабла. Затим смо испитивали сваки агрегат како бисмо утврдили колики је удио случајева Е2, Е3 и Е4. Феноровим тачним тестом генотипови су неједнако распоређени (види допунску табелу 6). Кластер 2 имао је највећи удио Е2 генотипова (15/17), а најмањи Е4 генотипова (5/21). Такође смо прегледали З -сцоре профиле кластера (засноване на великим средствима / варијанци здраве контролне групе). Кластер 2 обухватао је скоро сваки случај Е2, већину случајева Е3 и релативно мали број случајева Е4 и био је повезан са повољним профилом биомаркера (висок Аб, низак п-тау, повећана дебљина средњег темпоралног кортика, скромно већи когнитивни резултати) у поређењу са кластери 1 и 3.

Резиме

АПОЕ2 је био повезан са драматично повећаним ЦСФ Аб-ом и нижим п-тау-ом. У моделима неуродегенерације, ниски ЦСФ Аб сматра се раним „предклиничким“ показатељем повећаног ризика за патогенезу АД. 51 У принципу, високи Аб повезан са статусом Е2 треба да буде повезан са смањеним ризиком. АПОЕ2 је такође смањио п-тау (али не и т-тау), што сугерише да је имао специфичну улогу у смањењу фосфорилације треонина 181. Потпис Е2 је идентификован и изведен независно од генотипа у неподржаваној анализи кластера код здравих старијих особа. Кластер 2, који је садржао већину Е2 носача, одражавао је ин виво верзију изузетног старења и заштитни профил који је прилично различит од МЦИ у ризику или АД профила биомаркера описаних у овом узорку и у другом раду. 24, 52

Студија 4. АПОЕ2 и ризик од конверзије МЦИ у АД

Затим смо покушали да утврдимо да ли је генотип Е2 имао клиничке и неуродијагностичке последице. Иако је познато да Е2 смањује вероватноћу инцидента АД, није познато да ли Е2 може одложити или смањити ризик од деменције, чак и код особа које имају дијагностификовано оштећење амнестичне меморије (то јест, амнестични МЦИ). Испитали смо удео случајева Е2 у МЦИ према АД претварачима и неконвертерима (за разлику од генотипова Е3 и Е4) у узорку АДНИ у анализама регресије Цок регресије током четверогодишњег периода.

Цок регресијске анализе

Током праћења, 3 (20%) МЦИ Е2 носача, 46 (35, 9%) МЦИ Е3 и 96 (57, 5%) МЦИ Е4 носача су нецензурирани (развијен АД). Средње време праћења у месецима за МЦИ АПОЕ Е2 носаче који су развили АД износило је 34, 18 (распон 24, 31–41, 36; сд = 8, 84), за хомозиготе МЦИ АПОЕ Е3 18, 59 (распон 5, 75–42, 25; сд = 9, 38) и за МЦИ Носачи АПОЕ Е4 су били 20, 29 (распон 5, 98–52, 63; сд = 10, 84).

Припремљени су Цок ХР модели за процену ризика конверзије из МЦИ у АД према статусу АПОЕ генотипа. Кривуље преживљавања вероватноће за конверзију у АД у свакој од три групе АПОЕ приказане су на слици 4. У моделу је АПОЕ3 имао више од 2 × опасности претворбе по јединици времена у поређењу са АПОЕ2, док је АПОЕ4 имао скоро 4 × опасност

Image

Кривке преживљавања засноване на АПОЕ-у Цок ХР показују да су носачи Е2 имали приближно 0, 50 вероватноће конверзије у АД у поређењу са случајевима Е3 и 0, 25 вероватноће у поређењу са случајевима Е4. За модел је глобално значење било Кс 2 = 17, 04, П = 0, 0001. ХР за Е2 према Е3 био је 2, 12, П = 0, 17; Интервал поузданости од 95% (ЦИ) 0, 66–6, 81. За Е2 према Е4, ХР је био 3, 95, П = 0, 02; 95% ЦИ 1, 25–12, 47.АД, Алзхеимерова болест; ХР, регресија опасности.

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Дискусија

Спровели смо више експеримената како бисмо показали да молекуларна својства АпоЕ2 имају заштитне ефекте на биомаркере и неуродијагностику релевантну за АД. О главним налазима разговарамо редом.

Прво, нивои експресије мРНА од АпоЕ нису се разликовали, али нивои протеина су се разликовали међу АпоЕ изоформама, при чему је Е2 најзаступљенији. Ово заузврат сугерише присуство различитих пост-транслацијских модификација. Постоји довољно доказа да, иако је Е4 посебно подложан протеолитичком цепању и деградацији, 10, 53 Е2 може бити релативно отпоран на деградацију као што је утврђено у конформацијској рачунарској студији, ТР проучавању миша, и сада, нашим налазима у људском мозгу.

Открили смо разлике у транскрипцијском профилу у постмортем људском кортексу између Е2 и Е3 носача у више појединачних транскрипата и путова. Последњи налази показали су да су транскрипти повезани са ЛТП-ом смањени, док су транскрипти повезани са ЕЦМ-ом, укључујући интеграле, регулисани у Е2 носачима. Уколико је излучивање Аб зависно од активности, смањење ЛТП може смањити ослобађање и, закључивањем, могућност агрегације. 39, 54 Повећање транскрипата и протеина повезаних са ЕЦМ смањује појаве пластичности (повезане са ЛТП) и одржава интегритет БББ, 'профил' предлаже смањење продукције / таложења Аб или таложења или ексцитотоксичности зависних од активности и у контексту дендритичке кичме размак и стабилност, релативна синаптичка ефикасност.

АПОЕ је модулирало неколико биомаркера, при чему су носиоци Е2 показали 'потпис' карактеристичан за виши ниво ЦСФ Аб, већу дебљину кортикалне дебљине средњег темпоралног режња и нижи ниво п-тау у анализи кластера. Когнитивне разлике међу генотипима биле су скромне и безначајне у овој групи. Овај профил је у складу са моделом у којем је Е2 посебно заштитни од неуродегенерације Алзхеимерове врсте, али није генерално про-когнитиван.

Е2 је такође имао утицаја на неуродијагностичком нивоу. Драматично је смањио број појединаца са МЦИ који су прешли у АД. Дакле, чак и у групи са документованим оштећењем меморије (амнестични МЦИ), даљи функционални и когнитивни пад је успорен или спречен присуством Е2.

На основу наших студија, предлажемо да обилнији протеин АпоЕ2, у комбинацији са његовом познатом неспособношћу да се веже за ЛДЛР, има импликације на његову способност чишћења Аб на повољан начин. Ниво протеина може бити важан у покретању неуропротекције, јер виши нивои АпоЕ2 изоформе могу бити повезани са већом испоруком холестерола АПОЕ рецепторима и можда, што је још важније, повећавају вероватноћу интеракција са и накнадним чишћењем Аб. У мозгу се ЛДЛР налазе на неуронима и глији и учествују у већем делу везивања за АПОЕ, док су ЛРП1 веома изражени на спољним зидовима крвних жила. 15, 55 Иако се везивање АпоЕ2 на ЛДЛР драматично смањује, његово везивање за остале липидне рецепторе ниске густине (укључујући ЛРП1) не утиче. Будући да АпоЕ2 не може транспортирати врсту Аб до ћелијских ЛДЛР-а, гдје би могао бити ендоцитозиран неефикасно или доказано токсичан, чини се да вјероватно различито преноси Аб на БББ и тамо се веже на ЛРП1 рецепторе, пружајући тако робуснији Аб очистљивост, као што је приказано у Деане ет ал. 21

Укратко, АпоЕ2 може имати плеиотропне ефекте на више заштитних сигналних путева. Докази указују да неколико основних молекуларних својстава АпоЕ2 изоформе, укључујући висок ниво протеина у поређењу са другим изоформама као што је овде приказано и његову неспособност да се веже за ЛДЛР, могу омогућити снажнију интеракцију са Аб и / или ефикасан очишћавање Аб кроз церебралну васкулатуру . Транскрипциони профил носача АПОЕ2 у кортексу карактерисан је смањењем експресије молекула повезаних са ЛТП-ом, можда смањујући ексцитотоксичне лезије или производњу Аб-а зависног од активности. Истодобне регулације повезане са ЕЦМ / интегрином, снижавање регулације ЦипА и повећање протеина колагена ВИ и ламинина такође могу смањити пластичност зависну од активности, смањити тагацију и / или даље одржати интегритет БББ. Молекуларна својства АпоЕ2 имају необичне, али интерпретативне последице на неуробехевиоралном / неуродијагностичком нивоу. АПОЕ2 генотип је био повезан са повољним профилом биомаркера у здравим старијим контролама, укључујући висок ЦСФ Аб и подједнако смањени п-тау, али не и општи пораст когниције. Овај потпис вероватно смањује ризик од АД; и као што је овде приказано, смањени ризик конверзије МЦИ у АД у Е2 носаче. Надаље, показали смо да високи нивои АпоЕ2 изоформе нису неповољни у погледу мождане функције и могу бити од користи. Сматрамо да наш скуп запажања има важне импликације на платформу за откривање дрога на бази Е2 и разумевање индивидуалних варијација когнитивног старења.

Додатне информације

Ворд документи

  1. 1.

    Додатне информације

    Додатне информације прате рад на веб локацији Молекуларна психијатрија (//ввв.натуре.цом/мп)