Вирус борне болести поседује нф-ћаб инхибиторну секвенцу у гену нуклеопротеина | научни извештаји

Вирус борне болести поседује нф-ћаб инхибиторну секвенцу у гену нуклеопротеина | научни извештаји

Anonim

Субјекти

  • Урођен имунитет
  • Вирална евазија имуне
  • Интеракције вирус - домаћин

Апстрактан

Вирус Борне болести (БДВ) има несегментирани РН геном негативног ланца и изазива упорну инфекцију код многих животињских врста. Претходна студија показала је да се активација ИκБ киназе (ИКК) / НФ-κБ путање смањује БДВ инфекцијом чак и у ћелијама које исказују конститутивно активни мутантни ИКК. Овај резултат сугерише да БДВ директно омета ИКК / НФ-κБ стазу. Да бисмо расветлили механизам инхибиције НФ-κБ активације БДВ инфекцијом, процијенили смо унакрсни разговор између БДВ инфекције и НФ-κБ путање. Користећи вишеструку ЕМ за анализу избацивања мотива, открили смо да нуклеопротеини БДВ (БДВ-Н) и НФ-κБ1 имају заједнички мотив сличан анкирину. Када су ћелије ТХП1-ЦД14 претходно третиране идентификованим пептидом, активирана је НФ-κБ активација лигандима рецепторских рецептора. 20С тест протеасома показао је да БДВ-Н и БДВ-Н изведени пептид инхибирају прераду НФ-κБ1 п105 у п50. Даље, тестови имунопреципитације показали су да БДВ-Н узајамно делује са НФ-κБ1, али не и са НФ-κБ2, који нема заједнички мотив са БДВ-Н. Ови резултати сугерирају да БДВ-Н инхибира НФ-κБ1 обраду 20С протеасомом путем анкирин-сличног пептидног низа, што резултира сузбијањем ИКК / НФ-кББ активације пута. Овај инхибиторни ефекат БДВ на индукцију имунолошког имунитета домаћина може да донесе користи против упорне БДВ инфекције.

Увод

Вирус болести Борне припада реду Мононегавиралес и поседује несегментирани, РН геном с негативним ланцем . Карактеристична својства овог вируса укључују широк спектар домаћина код кичмењака 1, 2, 3 и његову способност да успостави постојану инфекцију у ћелијском језгру 4, 5, 6 . БДВ геном кодира 6 гена у следећим редоследима од 3 до 5: нуклеопротеин (Н), фосфопротеин (П), Кс, матрични протеин (М), гликопротеин (Г) и протеин полимеразе (Л) 7, 8, 9 . М протеин подвлачи вирусну овојницу 10, 11, а Г протеин посредује улазак вируса у ћелије домаћина 12, 13, 14 . Н, П и Л протеини формирају полимеразни комплекс и врше улогу у транскрипцији и репликацији вирусног генома 15, 16, 17 .

Највјероватније, захваљујући градијенту иницијације транскрипције 8 'до 5', Н протеин је најбројнији вирусни протеин у акутно инфицираним ћелијама 18 и животињама 19 ; такође је доминантна мета хуморских 20 и имунолошких реакција посредованих ЦД8 + -Т-ћелијама 21 . У већини заражених ћелија, Н протеин је концентрисан у фабрикама репликације вируса у језгру 22 ; међутим, способан је за нуклеоцитоплазматско пропадање због сигнала нуклеарног извоза као и сигнала нуклеарне локализације 23 . Ова својства чине Н снажним кандидатом за вирусни ген који утиче на ћелије домаћина, укључујући урођени имунитет.

Када је ћелија заражена вирусом, рецептори за препознавање образаца (ПРР) брзо осећају не-само нуклеинске киселине и протеине, што доводи до активирања антивирусног урођеног имуног одговора 24 . Показало се да је једна кључна компонента овог одговора, интерферон типа И, инхибирао БДВ инфекцију у великом броју експерименталних система 25, 26 . С обзиром на широк спектар ћелија у којима БДВ ефикасно успоставља упорну инфекцију, није изненађујуће да је развио многе стратегије за избегавање покретања ПРР-а као и за прекид њихових сигналних каскада. БДВ модификује термини свог РНА генома на начин да избегава препознавање по урођеном цитоплазматском рецептору РИГ-И 27, 28 . Поред тога, БДВ може инхибирати МАВС, молекул важан за активирање фактора транскрипције, укључујући ИРФ3 и 7, након ангажовања ПРР 29 . Коначно, БДВ инхибира ТБК-1, киназу потребну за фосфорилацију ИРФ3 и 7, што им омогућава да уђу у језгро за преписивање интерферона и других урођених имуних ефектора 30 . Дакле, БДВ избегава или делује на урођени имуни одговор на више нивоа. Урођени имуни путеви често су сувишни и делимично се преклапају; на тај начин, БДВ може користити додатне непознате механизме за темељну антагонизацију одговора домаћина. На пример, БДВ је инхибирана конститутивном активацијом НФ-κБ 31, али нису идентификовани БДВ протеини који у интеракцију са овим молекулом.

НФ-κБ је фактор транскрипције који учествује у имунолошкој индукцији, ембрионалном развоју и пролиферацији ћелија као одговор на различите ванћелијске подражаје 32, 33 . Породица НФ-κБ се састоји од пет гена, НФ-κБ1, НФ-κБ2, РелА, РелБ и ц-Рел, који формирају хомо- или хетеро-димере у цитоплазми 34, 35 . Када се активира сигнални пут НФ-κБ, ИκБ, који је инхибиторни фактор НФ-κБ, фосфорилира се ИκБ киназом (ИКК) и деградира 20С протеасом 36 . Овај поступак ослобађа НФ-κБ за транслокацију у језгро, где се понаша као транскрипциони фактор 32, 33 . Када се ћелије које експримирају конститутивно активну ИКК стимулишу тетрадеканоил порбол ацетатом, моћан стимуланс НФ-κБ сигналног пута, активација НФ-κБ је нижа у ћелијама инфицираним БДВ него у моцк ћелијама. Ова разлика сугерира да БДВ инфекција сузбија ИКК / НФ-κБ сигнални пут низводно од ИКК 31 .

Да бисмо боље разумели како БДВ измиче урођеном имунитету и успоставља упорну инфекцију, прво смо потврдили да БДВ сузбија активацију НФ-κБ, а затим је имао за циљ да утврди механизам којим то чини. Раније је објављено да одређени пептиди који продирају у ћелију са мотивима секвенци заједнички са специфичним генима породице НФ-κБ могу конкурентно инхибирати НФ-κБ сигнални пут 37, 38, 39 . Надаље, вирусни пептид изведен из протеина вацциниа вируса А46 (ВИПЕР) инхибира сигнални пут толи-рецептора 4 (ТЛР4), који такође посредује трансдукцију сигнала користећи НФ-κБ везивањем на ББ петљу Толл / интерлеукин-1 рецептора. (ТИР) домене рецептора и адаптера, чиме се прекида интеракција између рецептора и адаптера 40, 41 . Тако смо претражили БДВ протеине за мотиве који се деле са протеинима породице НФ-κБ, са циљем да идентификујемо НФ-κБ инхибиторне пептидне секвенце да разјаснимо механизам којим БДВ сузбија НФ-κБ активацију.

Овде показујемо да БДВ-Н дели мотив сличан анкинину са НФ-κБ1. У ћелијама овај пептид-БДВ-Н инхибира НФ-κБ сигнални пут. Инхибиторни пептид изведен из БДВ-Н показује други механизам који БДВ користи да превазиђе урођени имунитет и успостави упорну инфекцију.

Резултати

БДВ инфекција инхибира активацију НФ-κБ

Да бисмо прво проценили обновљивост претходних података којима БДВ сузбија обраду и активацију НФ-κБ током инфекције 31, користили смо ћелије ТХП1-ЦД14 42 . Ове ћелије експримирају лучану алкалну фосфатазу (СЕАП) под контролом промотора који активира НФ-κБ. ТХП1-ЦД14 ћелије су инфициране рБДВ П / М-ГФП 43, а резултирајућа СЕАП активност је мерена у 12 х до 2 недеље након инфекције. Активност СЕАП у супернатанту културе није било значајно повишена изнад нивоа од моцк-инфицираних ћелија у било ком тренутку током 2 недеље (Слика 1А), што сугерише недостатак препознатљиве НФ-κБ активације индуковане БДВ инфекцијом у ћелијама ТХП1-ЦД14. Супротно томе, додавање позитивне контроле, ТЛР1 / 2 агониста Пам3ЦСК4, у концентрацији од 100 нг / мл током 24 сата довело је до лако детектабилне производње СЕАП. Ови подаци могу указивати на то да БДВ избегава препознавање од ПРР-а који сигнализирају кроз НФ-κБ или, алтернативно, да БДВ могу бити препознати по таквим ПРР-овима, али њихово сигнализирање је прекинуто пре активирања НФ-κБ. Да бисмо разликовали ове алтернативе, покушали смо активирати НФ-κБ у ћелијама инфицираним БДВ-ом помоћу Пам3ЦСК4. БДВ-инфициране ћелије излучују мање СЕАП-а од матичних ћелија када се активирају с Пам3ЦСК4 (Слика 1Б), што сугерише да ћелије инфициране БДВ-ом активно сузбијају сигнализацију НФ-κБ. Да бисмо проценили да ли активација НФ-κБ има штетан утицај на репликацију вируса, активирали смо НФ-κБ користећи Пам3ЦСК4 у културама ћелија ТХП1-ЦД14 које су биле изложене БДВ 7 дана раније. Четрдесет осам сати након стимулације, измерили смо степен инфекције одређивањем процента ћелија које експримирају ГФП. Активација НФ-κБ са Пам3ЦСК4 резултирала је значајно мањим бројем БДВ-инфицираних ћелија у култури (Слика 1Ц). Ови подаци су у складу са претходним извештајем 31 и указују на то да БДВ инфекција инхибира НФ-κБ активацију, што у супротном може смањити репликацију БДВ.

Image

(А) ТХП1-ЦД14 ћелије су инфициране рБДВ П / М-ГФП без ћелија код мноштва инфекције од 0, 1, а резултирајући супернатанти су сакупљени. СЕАП активност је одређена у назначеним временским тачкама (Н = 3). (Б) ТХП1-ЦД14 ћелије заражене рБДВ П / М-ГФП су стимулисане са 100 нг / мл ТЛР1 / 2 лиганда (Пам3ЦСК4). 48 сати након стимулације, мерене су ГФП-позитивне ћелије помоћу цитометра заснованог на слици. Траке грешака представљају стандардно одступање средње вриједности (Н = 3). **: П = 0, 00474 (једноструки т-тест) (Ц) ТХП1-ЦД14 ћелије заражене рБДВ П / М-ГФП су стимулисане са 100 нг / мл ТЛР1 / 2 лиганда (Пам3ЦСК4). СЕАП активности супернаната одређиване су 24 сата после стимулације. Траке грешака представљају стандардно одступање средње вриједности (Н = 3). **: П = 0, 00761 (једноструки т-тест)

Слика пуне величине

Инхибиција НФ-кБ активације пептидом добијеним из БДВ-Н

На основу ранијих извештаја да пептиди који поседују заједничке мотиве секвенце са специфичним генима породице НФ-κБ конкурентно инхибирају НФ-κБ сигнализацију 37, 38, 39 и да ВИПЕР изведен из вируса вакциније А46 протеин инхибира ТЛР4 сигнализацију 40, 41, прегледали смо да ли имамо заједничке мотиве између БДВ гени и људска НФ-κБ породица да идентификују могуће механизме који стоје на основу посматране инхибиције НФ-κБ активације у ћелијама инфицираним БДВ-ом. У ту сврху смо користили Мултипле ЕМ за уклањање мотива (МЕМЕ) анализу, алат за откривање уобичајених мотива у низовима аминокиселина који користи ММ алгоритам 44, 45 . Открили смо неколико заједничких мотива (Табела 1). Усредсредили смо се на мотив који се дели између БДВ-Н и НФ-κБ1, јер су дужина мотивске секвенце (16 аминокиселина) и локализација мотива (анкирин поновљени домен НФ-κБ1 32, 33 ; изложени домен БДВ- Н тетрамер и мономер 46 ) сугерисали су да може имати биолошки релевантан ефекат (слике 2А и Б).

Табела пуне величине

Image

(А) Шематски дијаграм НФ-κБ1 и БДВ-Н. (Б) Кристалографска структура БДВ-Н тетрамера и мономера (Протеин Датабанк # 1Н93). Жуте линије означавају ИПБН. (Ц) Инхибицијски ефекат вирусног пептида на НФ-κБ активацију. ТХП1-ЦД14 ћелије су претходно третиране са 100 µг / мл вирусног пептида изведеног из БДВ-Н, негативног контролног пептида (ЦП7) или позитивног контролног пептида (ВИПЕР) и стимулисаних са пет ТЛР лиганда. 24 сата након стимулације, мерене су СЕАП активности у супернатантима. Траке грешака представљају стандардно одступање средње вриједности (Н = 3).

Слика пуне величине

Да би се проценио инхибиторни ефекат идентификованог мотива у БДВ-Н на активацију НФ-кБ, ћелије ТХП1-ЦД14 инкубиране су са 100 µг / мл вирусног пептида спојеног са пептидом који продире у ћелију (девет остатака аргинина) на Ц- термин за 4 х. Затим смо стимулисали ћелије са пет различитих ТЛР лиганда, за које се зна да активирају НФ-κБ, предвиђајући да ће директна интеракција БДВ-Н пептида са НФ-κБ блокирати производњу СЕАП-а без обзира на укључени пут узводног пута. Заиста, 24 сата након стимулације ТЛР лигандима, активирање НФ-кБ од стране свих лиганда значајно је потиснуто у ћелијама претходно третираним вирусним пептидима изведеним из БДВ-Н ( П = 0, 00168 за ТЛР1 / 2; П = 0, 01198 за ТЛР4; П = 0, 00090 за ТЛР2 / 6; П = 0, 00862 за ТЛР2; П = 0, 01337 за ТЛР7 / 8), као и са позитивном контролом ВИПЕР ( П = 0, 00084 за ТЛР1 / 2; П = 0, 00823 за ТЛР4; П = 0, 00131 за ТЛР2 / 6; П = 0, 00203 за ТЛР2; П = 0, 00646 за ТЛР7 / 8) (Слика 2Ц). Супротно томе, сигнализацију НФ-κБ су високо активирали сви ТЛР агонисти у ћелијама претходно третираним контролним пептидом ЦП7. Ови подаци сугеришу да идентификовани вирусни пептид инхибира НФ-κБ активацију. Стога овај пептид називамо инхибицијским пептидом изведеним из БДВ-Н (ИПБН).

БДВ-Н и пептид добивен из БДВ-Н смањују обраду НФ-κБ1 помоћу 20С протеасома

Анкинин поновљени домен НФ-κБ1 потискује његову активност транскрипције. По активирању пута НФ-κБ, НФ-κБ1 се фосфорилира, што промовише прераду анкиринског Ц-терминалног региона који садржи понављајући слој 20С протеасомом и ствара помак у молекуларној тежини са 105 на 50 36 . Хипотетирали смо да ИПБН, а можда и нетакнут БДВ-Н, може инхибирати НФ-κБ сигнализацију спречавањем ове обраде. Да бисмо утврдили да ли ИПБН утиче на прераду НФ-κБ1 п105 у п50, извели смо ин витро тест протеасома 20С помоћу ИПБН и рекомбинантних БДВ-Н и НФ-κБ1 пречишћених афинитета, као што је претходно објављено 36 . Као што је приказано на слици 3, када је НФ-кБ1 инкубиран са контролним пептидом, а затим и са 20С протеасомом, п105 је значајно смањен, што потврђује обраду НФ-κБ1 20С протеасомом. Ова обрада може бити ефикасно блокирана коришћењем коктела са инхибитором протеазе. Рекомбинантни БДВ-Н и ИПБН сузбили су обраду п105 једнако ефикасно као и инхибитор протеазе ( П = 0, 03401 за БДВ-Н; П = 0, 03904 за ИПБН; П = 0, 04556 за инхибитор протеазе) (слике 3А и Б). Ови подаци сугерирају да БДВ-Н и ИПБН инхибирају активирање НФ-κБ спречавањем обраде НФ-κБ1 20С протеасомом, омогућавајући необрађеном НФ-κБ1 да делује као ИκБ 37, 38, инхибиторни фактор НФ-κБ.

Image

(А) протеин НФ-кБ1 и протеин БДВ-Н, вирусни пептид изведен из БДВ-Н или 1Кс комплетног коктела инхибитора протеазе, инкубиран је 1 х протеасомом 20С на 37 ° Ц током 1 х. Да би се открио п105 облик НФ-κБ1, извршен је СДС-ПАГЕ и западни блот са анти-ФЛАГ М2 моноклонским антителом. БДВ-Н је откривен коришћењем анти-ХА моноклонског антитела. Плочице пуне дужине приказане су на Додатној слици 2. (Б) Интензитети п105 опсега су квантификовани помоћу ИмагеЈ. Израчунана је релативна количина излаза п105 у поређењу са улазом п105. Траке грешака представљају стандардно одступање средње вриједности (Н = 3).

Слика пуне величине

ИПБН секвенца је неопходна за интеракцију БДВ-Н са НФ-κБ1

Наше истраживање смо фокусирали на БДВ-Н ген, јер он садржи пептид сличан домену анкириног понављања НФ-κБ. Овај пептид сам може да инхибира НФ-κБ сигнализацију; међутим, нетакнути протеин БДВ-Н такође инхибира обраду НФ-κБ1. Стога смо утврдили да ли је нетакнути БДВ-Н у интеракцији са НФ-кБ1 користећи тест имунопреципитације. Лизати из ћелија које експримирају ХА-означени БДВ-Н и ФЛАГ-означени НФ-κБ1 или ФЛАГ-означени НФ-κБ2 су мешани током 30 минута на 4 ° Ц, а мешани ћелијски лизати су имунопреципитирани анти-ФЛАГ антителом (СИГМА) . Као што је приказано на слици 4А, БДВ-Н је ко-имунопреципитиран са НФ-κБ1, али не и са НФ-κБ2, који не дели заједнички мотив са БДВ-Н. Овај резултат указује да БДВ-Н специфично интерактивно дјелује са НФ-κБ1. Занимљиво је да смо открили да супституција аланина или брисање ИПБН секвенце аминокиселина у БДВ-Н није утицала на ко-имунопреципитацију са НФ-κБ1 (Слика 4Б). Имајте на уму да повећано својство везивања Л8А мутанта на НФ-κБ1 може бити последица његовог формирања лабавог тетрамера аланинском заменом. У ствари, мутант Л8А има четири промене аминокиселина у остацима укљученим у олигомеризацију БДВ-Н, док Ф8А садржи само једну промену 46 . Дакле, идентификована секвенца мотива неопходна је за интеракцију БДВ-Н са НФ-κБ1, што сугерише да БДВ-Н у интеракцији са НФ-κБ1 преко додатних домена који нису очигледни на нивоу сличности мотива.

Image

(А) Лизати из ћелија које експримирају ХА-означени БДВ-Н су помешани са лизатима из ћелија које су трансфициране са ФЛАГ-означеним НФ-κБ1 или ФЛАГ-означеним НФ-κБ2 током 30 минута на 4 ° Ц. Мешане ћелијске лизате су затим имунопреципитиране анти-ФЛАГ М2 моноклонским антителом користећи Протеин Г Динабеадс. Извршен је СДС-ПАГЕ и западни блот са анти-ХА моноклонским антителом и анти-ФЛАГ М2 моноклонским антителом. Плочице пуне дужине приказане су на допунској слици 3. (Б) лизати из ћелија које експримирају ХА-означену БДВ-Н или ХА-означену супституцију ИПБН-аланином у првих 8 (Ф8А) или последњих 8 (Л8А) аминокиселина или -делеција мутанти (Δмотиф) БДВ-Н су мешани са лизатима из ћелија и трансфектирани 30 минута на 4 ° Ц са ФЛАГ-означеним НФ-кБ1. Мешани ћелијски лизати су затим подвргнути ИП тесту са анти-ФЛАГ М2 моноклонским антителом користећи Протеин Г Динабеадс. Плочице у пуној дужини представљене су на Додатној слици 4.

Слика пуне величине

Дискусија

Домен анкириног понављања НФ-κБ1 веже се за Рел регион хомологије, што доводи до сузбијања активности фактора транскрипције (Слика 2А). Фосфорилација НФ-кБ1 (п105) путем трансдукционог сигнала индукује прерадбу домена анкинриног понављања протеасомима 20С и 26С, а зрели п50 ствара активност транскрипционог фактора 36, 47 . Ова студија је открила да БДВ има својство анкирина сличног НФ-κБ1 у свом Н гену. Овај пептид и нетакнути БДВ-Н инхибирају обраду НФ-κБ1 од п105 до п50 протеасомом 20С, сузбијајући активацију НФ-κБ. Тренутно је нејасно како БДВ-Н сузбија НФ-κБ1 обраду 20С протеасомом. Међутим, приметили смо директну интеракцију између БДВ-Н и НФ-κБ1. Поред тога, сам БДВ-Н није разграђен протеасомом 20С, што сугерише да не делује као украс за обраду НФ-κБ1. ИПБН секвенца није нужно потребна за интеракцију између БДВ-Н и НФ-κБ1 (Слика 4Б), што указује да је најмање један други домен унутар Н потребан за посредовање у овој интеракцији. Заједно, наши подаци сугерирају да би непосредна близина БДВ-Н до НФ-κБ1 могла бити важна за ефикасне инхибиторне ефекте БДВ-Н на активацију НФ-κБ. Наша радна хипотеза је да постављање БДВ-Н на НФ-κБ1 може опонашати дужи домен за анкирин који понавља да има супресивни ефекат на НФ-κБ1 обраду 47 . Структурна анализа показује да је мотив сличан анкирину изложен БДВ-Н тетрамеру и мономеру 46, у складу са овом хипотезом (Слика 2Б). Међутим, наш извештај има неколико ограничења. У почетку нисмо успели да откријемо зрели п50 у тесту протеазома 20С, због неуспеха у пречишћавању рекомбинантног протеина НФ-кБ1 обележеном на Н-терминусу, поред слабе реактивности анти-п50 антитела. Такође нисмо били у могућности да тестирамо да ли БДВ-Н у интеракцији са НФ-κБ у зараженим ћелијама и да спасимо рекомбинантни БДВ, који нема ИПБН. Даље, пошто интеракција БДВ-Н са НФ-κБ1 није строго зависна од идентификованог пептида, још увек истражујемо стратегије за прекид ове интеракције уз одржавање других критичних виролошких функција Н, што би нам омогућило да дефинитивно проценимо релевантност ова интеракција са БДВ инфекцијом и упорношћу. Сада покушавамо да спасимо серијске мутанте БДВ путем аланинске супституције у ИПБН-у. Потребна је даља истрага да би се разјаснио детаљан механизам инхибицијског дејства БДВ-Н и ИПБН на НФ-κБ1.

Успешно смо идентификовали дељени мотив између БДВ-Н и НФ-κБ1 помоћу МЕМЕ анализе, која је веб сервер за откривање заједничких мотива у секвенцијама ДНК или протеина путем ММ алгоритма, што је продужетак технике максимизације очекивања 44, 45 . Откривено је да је идентификовани мотив добро очуван и у БДВ и у нуклеопротеинима птичје борне вируса. У 202 секвенце доступне у ГенБанк-у у тренутку подношења, само две конзервативне промене (М187В и Г199А) биле су присутне на више од 15%. Заиста, пептид генерисан из идентификованог мотива ефикасно је потиснуо НФ-κБ активацију, што указује да је МЕМЕ анализа корисно средство у потрази за антагонизираним мотивима вирусног протеина за домаћинске гене. Поред ИПБН-а, открили смо и да В протеин вируса против ошиљака дели мотив са ТИР доменима адаптера који индукује интерферон-β (ТРИФ), који индукује адаптер-молекуле (ТРАМ) и примарну мијелоидну диференцијацију - одговор гена 88 (МиД88) -адаптор (МАЛ), који су адаптер протеини у сигналном путу ТЛР 48 . Идентификовани вирусни пептид (ДРВЦНПМЦ), који се стопио са пептидом који продире у ћелију на Ц-крају, показао је инхибиторне ефекте на неке од сигналних путева ТЛР (Слика С1; П = 0, 00105 за ТЛР1 / 2; П = 0, 10236 за ТЛР4; П = 0, 00475 за ТЛР2 / 6; П = 0, 00111 за ТЛР2; П = 0, 00596 за ТЛР7 / 8). Ови подаци такође снажно подржавају корисност ове стратегије.

Други занимљив налаз ове студије је да је ВИПЕР пептид који смо изабрали као позитивна контрола инхибирао НФ-κБ сигнализацију кроз све испитиване ТЛР агонисте, као што је раније објављено да је специфичан за ТЛР4 пут 40, 41 . Ипак, верујемо да су наши резултати валидни и сугеришу претходно непризнату ширину инхибиције ВИПЕР-а. Као што је приказано на слици 2, контролни пептид није инхибирао сигнализацију од било ког тестираног агониста. Идентификовани пептид из В протеина вируса против орези није инхибирао НФ-κБ сигнализацију од стране ТЛР4 агониста и имао је приближно половину инхибицијског дејства било ИПБН, било ВИПЕР на друге путеве (слика С1). Заједно са подацима о контролном пептиду, овај резултат аргументира системску пристраност ка пан-инхибицији у нашем експерименталном систему.

БДВ антагонизује имунолошке функције урођене од домаћина на више начина: геномска РНА БДВ избегава препознавање РИГ-И током обраде 5 ' терминија 27, 49 ; БДВ-П делује против експресије киназе 1 (ТБК-1) зависне од НФ-κБ активатора која везује активатор, делујући као компетитивни инхибитор ТБК-1 30 ; и БДВ-Кс инхибира митохондријску антивирусну сигнализацију апоптозу изазвану протеином 29 . Показујући први пут да БДВ комуницира са и инхибира НФ-κБ, фактор транскрипције који користе многи урођени имуни путеви за преношење сигнала у језгро, ова студија даје кључни увид у то како БДВ може успоставити своју карактеристичну перзистентну инфекцију у ћелији језгро.

Укратко, идентификовали смо вирусни пептид који дели мотиве са и инхибира НФ-κБ, потврђујући употребу алата МЕМЕ у ове сврхе. Овај пептид и други пептиди идентификовани на овај начин могу се показати корисним као фармаколошка средства. ИПБН инхибира НФ-κБ, који се истражује као терапија за многе болести, као што су рак, астма и мишићна дистрофија 32, 50 . Надаље, овај резултат даје почетну тачку за сецирање интеракција вируса вирус / домаћин. Будуће студије интеракције БДВ-Н / НФ-κБ оправдане су за боље разумевање стратегија које користе борнавируси, који инфицирају домаћине краљежњака милионима година 51, како би се супротставили урођеном имунитету.

Методе

Ћелије, вирус и пептиди

ТХП1-ЦД14 ћелије (ИнвивоГен, Сан Дијего, Калифорнија, САД) одржаване су у медијуму Росвелл Парк Мемориал Институте 1640 (СИГМА-АЛДРИЦХ Јапан, Токио, Јапан) са 10% феталним серумом телета (ФЦС), 1Кс раствором пеницилин-стрептомицина (Вако, Осака, Јапан), 200 µг / мл Зеоцин ™ (Лифе Тецхнологиес Јапан, Токио, Јапан), 250 µг / мл Г418 (ИнвивоГен), и 100 µг / мл Нормоцина (ИнвивоГен). 293Т ћелије и Веро ћелије заражене БДВ-ом узгајане су у Дулбеццовом модификованом Еагле-овом минималном есенцијалном медијуму (Лифе Тецхнологиес Јапан) са 10% ФЦС и 1Кс раствором пеницилин-стрептомицина.

Вирус коришћен у овој студији био је рекомбинантни БДВ, који изражава ГФП убачен између П и М гена БДВ соја Хе / 80, названог рБДВ П / М-ГФП 43, 52 . Да би се припремили рБДВ П / М-ГФП без ћелија, Веро ћелије које су трајно инфициране рБДВ П / М-ГФП су ултразвучене (БиоРуптор УЦД-300) и центрифугиране на 1200 × г током 25 минута на 4 ° Ц. Супернатант је сакупљен и коришћен као рБДВ П / М-ГФП без ћелија.

Пептид који је добијен вирусом (МФНПХЕАИДВИНГКПВ), контролни пептид (РНТИСГНИИСА) и ВИПЕР (КИСФКЛИЛАЕИ) са пептидом који продире у ћелију (девет остатака аргинина) на Ц-терминусу су прилагођени синтетизовани (Лифе Тецхнологиес Јапан).

МЕМЕ анализа

Аминокиселинске секвенце свих БДВ гена су достављене на МЕМЕ веб сервер (//меме.нбцр.нет/меме/цги-бин/меме.цги) заједно са по једним геном из сваке од пет људских НФ-κБ породица. Критеријуми за претраживање мотива постављени су на следећи начин: ширина мотива се кретала од 6 до 50 АА, са највише 3 мотива по гену и максимално 2 места по мотиву.

НФ-κБ тест активације

ТХП1-ЦД14 ћелије експримирају ТЛР и ЦД14 на високим нивоима и експримирају СЕАП ген на НФ-кБ-зависан начин. Да би се проценила продукција СЕАП-а, супернатант културе ТХП1-ЦД14 ћелија инкубиран је КУАНТИ-Блуе ™ (ИнвивоГен) 1 х на 37 ° Ц, након чега је оптичка густина (ОД) на 650 нм измерена коришћењем читача микро плоче СХ -9000 (ЦОРОНА ЕЛЕЦТРИЦ Цо., Лтд). Да би се проценила НФ-κБ активација БДВ инфекцијом, ТХП1-ЦД14 ћелије су инфициране рБДВ П / М-ГФП без ћелија при мноштву инфекције од 0, 1, а супернатант је сабран и СЕАП мерен на 12 х, 1 д, 2 д, 3 д и 2 недеље после инфекције. Да би се проценио ефекат активације НФ-кБ на БДВ инфекцију, култура ћелија ТХП1-ЦД14 приближно 30% заражена рБДВ П / М-ГФП је стимулисана са 100 нг / мл ТЛР1 / 2 лиганда. ГФП-позитивне ћелије су мерене коришћењем Тали® Имаге Цитометер-а (Лифе Тецхнологиес Јапан) током 48 сати после стимулације, а СЕАП активност је процењена у току 24 сата после стимулације.

Да би се проценили инхибиторни ефекти вирусног пептида на НФ-κБ активацију, 2 × 10 5 ТХП1-ЦД14 ћелије су инкубиране са 100 µг / мл сваког пептида током 4 сата на 37 ° Ц, а затим подвргнуте стимулацији са 100 нг / мл Пам3ЦСК4, 10 нг / мл ТЛР4 лиганда (ЛПС), 10 нг / мл ТЛР 2/6 лиганда (ФСЛ-1), 10 7 ћелија / мл ТЛР2 лиганда (топлота убија Л. Моноцитогенес ), и 5 μг / мл ТЛР 7/8 лиганда (ЦЛ075) (сви од ИнвивоГен), респективно. 24 сата након стимулације одређена је СЕАП активност супернатанта као што је горе описано. Приказани резултати представљају средства три независна експеримента. П вредности су израчунате коришћењем једноструког т-теста.

20С протеасомски тест

Извели смо 20С тест протеасома као што је претходно описано 36 . Укратко, БДВ-Н и НФ-κБ1 протеини су пречишћени антителом коришћењем Динабеадс Протеин Г (Лифе Тецхнологиес Јапан). Протеин НФ-κБ1 и протеин БДВ-Н, ИПБН или 1 Кс комплетни инхибитор протеазе (Роцхе Диагностиц КК, Токио, Јапан) инкубирани су са 20С протеасомом (Бостон Биоцхем, Цамбридге, МА, САД) у молекуларном односу 25: 25: 1 у пуферу (20 мМ Трис пХ 7, 0, 250 мМ НаЦл, 10 мМ МгЦл2 и 1 мМ ДТТ) на 37 ° Ц током 1 х. Резултирајући протеини подвргнути су СДС-ПАГЕ и западном блотирању анти-ФЛАГ М2 моноклонским антителом (СИГМА-АЛДРИЦХ Јапан) да би се детектовао п105 облик НФ-κБ1. Облик п50 није откривен због одвајања Ц-терминала ФЛАГ током 20С обраде. БДВ-Н је откривен коришћењем анти-ХА моноклонског антитела.

Имунопреципитацијски (ИП) тест

За ИП тест, 293Т ћелије су трансфициране пцДНА3 кодирајући БДВ-Н, мутанти супституције аланином у првих 8 (Ф8А) или последњих 8 (Л8А) аминокиселина ИПБН, или мутанти који делетирају ИПБН из БДВ-Н означени са ХА на Н -терминус, пЦМВ6 који изражава НФ-κБ1 спојен са ФЛАГ ознаком на Ц-терминусу (ОриГене Тецхнологиес, ​​Инц., Роцквилле, МД, САД), и пЦМВ6 који изражава НФ-κБ2 спојен са ФЛАГ ознаком на Ц-терминусу (ОриГене Тецхнологиес, Инц.) И ћелије су затим лизиране у пуферу који садржи 20 мМ Трис-ХЦл пХ 7, 4, 150 мМ НаЦл, 1% Тритон-Кс, 1 мМ ЕДТА и 1 Кс комплетног коктела инхибитора протеазе. Ћелијски лизат који експресионира ХА-означене БДВ-Н или БДВ-Н мутанте је помешан са ћелијским лизатом трансфектираним са ФЛАГ-означеним НФ-κБ1 или ФЛАГ-означеним НФ-κБ2 у трајању од 30 минута на 4 ° Ц, а мешани ћелијски лизати су имунопреципитирани са анти-ФЛАГ М2 моноклонално антитело користећи Протеин Г Динабеадс, према упутствима произвођача. Мешани ћелијски лизати и ИП производи подвргнути су СДС-ПАГЕ и западном блотирању коришћењем анти-ХА моноклонског антитела (Абцам, Цамбридге, Велика Британија) и анти-ФЛАГ М2 моноклоналног антитела.

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Додатне информације

    Додатне информације

Коментари

Подношењем коментара пристајете да се придржавате наших Услова и Смерница заједнице. Ако нађете нешто злоупотребно или то није у складу са нашим условима или смерницама, означите то као непримерено.