Матичне ћелије рака дојке се ослањају на ферментативну гликолизу и осетљиве су на лечење 2-деоксиглукозом | ћелијска смрт и болест

Матичне ћелије рака дојке се ослањају на ферментативну гликолизу и осетљиве су на лечење 2-деоксиглукозом | ћелијска смрт и болест

Anonim

Субјекти

  • Карцином дојке
  • Метаболизам рака
  • Матичне ћелије рака
  • Комбинована терапија лековима

Апстрактан

Бројне студије сугеришу да су матичне ћелије рака кључне за раст тумора, а уколико циљање ових ћелија не може да резултира рецидивом тумора. Пошто се показало да је ова популација ћелија отпорна на зрачење и хемотерапију, неопходно је разумети њихову биологију и идентификовати нове терапијске приступе. Циљање метаболизма рака потенцијална је алтернативна стратегија за спречавање раста и рецидива тумора. Овде смо примењивали протеомску и циљану метаболомијску анализу како бисмо указали на главне метаболичке разлике између ћелија рака дојке које су узгајане као сфере и тако обогаћене матичним ћелијама рака упоређене са истим ћелијама које су узгајане у адекватним условима разликовања. Овај интегрисани приступ омогућио нам је да идентификујемо метаболички фенотип повезан са стабљичним стањем и показује да матичне ћелије рака карцинома дојке (БЦСЦ) прелазе са митохондријске оксидативне фосфорилације према ферментативној гликолизи. Функционална валидација протеомских и метаболичких података даје доказе о повећаним активностима кључних ензима судбине анаеробне глукозе, као што су изоформ пируват киназе М2, лактат дехидрогеназа и 6-фосфат дехидрогеназа глукозе у матичним ћелијама рака, као и различит редокс статус. Штавише, показујемо да третман 2-деоксиглукозом, добро познатим инхибитором гликолизе, инхибира пролиферацију БЦСЦ ако се користи сам и показује синергијски ефекат када се користи у комбинацији са доксорубицином. Закључно, предлажемо да инхибиција гликолизе може бити потенцијално ефикасна стратегија циљања БЦСЦ-а.

Главни

Један од главних проблема у терапији тумора дојке је дуготрајни рецидиви. То се дијелом може објаснити неуспјехом да се искоријени подскуп ћелија унутар тумора који су тада способни да издрже раст тумора. Ове ћелије деле бројне карактеристике са матичним ћелијама и зато су назване матичним ћелијама рака (ЦСЦ). ЦСЦ су изоловани из различитих чврстих тумора, укључујући рак дојке 1 и чини се да имају улогу у отпорности на лечење као и у стварању метастаза. 2 Заиста, ЦСЦ представљају неколико интринзичних механизама резистенције на конвенционалне антитуморске лекове и радијациону терапију, као што је прекомерна експресија транспортера аденосин трифосфата (АТП) касета који веже адекватни трифосфат (АТП), активирање путева преживљавања, повећана производња анти-апоптотичких фактора, већа одбрана против оксидативног стреса и ефикасног поправљања оштећења ДНК. 3 Зато је хитно потребна развој и валидација нових терапијских стратегија којима се циља ЦСЦ како би се побољшао клинички исход.

У последње време, интересовање за проучавање метаболизма рака и тзв. Варбург ефекат је порасло јер циљање специфичних метаболичких путева може бити обећавајући приступ терапији рака. 4, 5 Варбург ефекат дефинише зависност рака од ферментативне гликолизе која омогућава преусмеравање кључних метаболизама у ћелијске биосинтетске путеве у пролиферативним ћелијама рака, 6 укључујући ЦСЦ, и сугерисано је да се може искористити за развој нових фармаколошких третмана који могу сузбити хемо-резистенција ових ћелија. 7, 8

Такође се сугерише да метаболичке промене могу имати узрочну улогу у индуковању различитих фенотипских стања ћелија рака. Као пример, Донг и др. 9 су показали да ћутање глуконеогеног ензима фруктоза-1, 6-бифосфатаза који активира ферментативну гликолизу резултира фенотипом у облику стабљике. Упркос њиховој важности, метаболичке карактеристике ЦСЦ-а и даље су углавном непознате. Недавно је показано да ЦСЦ-ови изоловани из неколико чврстих тумора показују значајну измену енергетског метаболизма и више су гликолитички у поређењу са диференциранијим ћелијама тумора 10, 11, 12, 13 или нормалним матичним ћелијама. 14 Међутим, ово је и даље контроверзно питање јер су претходне студије показале да су ЦСЦ-ови мање гликолитични од диференцираних. 15

Овде, користећи интегрисани протеомски и циљани метаболомички приступ, показујемо да је метаболизам матичних ћелија рака карцинома дојке (БЦСЦ) узгајаних као сфере снажно повезан са ферментативном гликолизом у поређењу са истим ћелијама које се узгајају у адекватним условима разликовања (адхезивне ћелије које потичу из сфероида ( СДАЦ-ови)). На основу ових доказа покушали смо да тестирамо ефекат добро карактерисаног гликолитичког инхибитора, 2-деокси-Д-глукозе (2-ДГ), 16, 17 сами или у комбинацији са широко коришћеним хемотерапијским доксорубицином (Доко) о расту и проширењу БЦСЦ-а. Наши резултати показују да су БЦСЦ-ови веома осетљиви на 2-ДГ који такође показују синергијски ефекат са Доко третманом.

Резултати

Диференцијална анализа протеомике показује помак према ферментативном метаболизму глукозе у сферама БЦСЦ

У овој студији анализирали смо диференцијалан профил експресије протеина БЦСЦ и СДАЦ. Као што је раније објављено, 18 ин витро модел усвојен за диференциране ћелије, уобичајено пријављене као СДАЦ, ослања се на ћелије сфере узгајане у Дулбеццовом модификованом медијуму орао (ДМЕМ) са додатком 10% феталног говеђег серума (ФБС) у адекватним условима. Ове ћелије изражавају више нивое кластера диференцијације 24 (ЦД24) како се очекује за СДАЦ (допунска слика С1). 19, 20

У поређењу са гел-електрофорезом-масеном спектрометријом (ГЦ-МС) протеомичким приступом, табеларна масена спектрометрија без течности (ЛЦ-МС / МС) омогућава високу пропусност и јефтину аналитичку методу за карактеризацију сложених протеинских смеша са одговарајућом осетљивошћу и Поновљивост. Процењена је идентификација протеина, квантификација и квалитет података тачних кластера задржавања масе (ЕМРТ), који су евидентиране масовне врсте повезане са њиховом тачном масом и временима задржавања. Укупно је утврђено 39 379 и 39 379 ЕМРТ за поређење БЦСЦ-а који су узгајани као сфере у односу на СДАЦ током 3, 5 односно 7 дана. За сваки поновљени услов, расподјела грешке масе била је испод 15 ппм (слике 1а, д и г за БЦСЦс и СДАЦ прикупљене након 3, 5 дана, односно 7 дана), коефицијент варијације интензитета изражен као проценат (% интензитета ЦВ) је имао Гауссова дистрибуција са свим вредностима <4, 5% (Слике 1б, е и х за БЦСЦс и СДАЦ прикупљене после 3, 5 дана и 7 дана, респективно) и коефицијент задржавања у варијанти изражен као проценат (% ЦВ РТ) био је <10% ( Слике 1ц, ф и и за БЦСЦ, СДАЦ сакупљени након 3, 5 дана, односно 7 дана) са већином врста <5%. Примјењујући строге критерије идентификације и квантификације протеина описаних у Материјалима и поступцима, идентификовали смо 54 и 28 протеина различито изражених у БЦСЦ-има у поређењу са СДАЦ-овима прикупљеним након 3, 5 и 7 дана у диференцирајућим условима. Листе диференцијалних протеина приказане су у допунским табелама С1 и С2, док су детаљи о пептидним идентификацијама приказани у допунским табелама С3 и С4.

Image

Процена квалитета података, Веннова анализа и омјер експресије за значајно регулисане протеине у БЦСЦ-има у поређењу са СДАЦ-овима. Аналитичка репродуктивност масених спектра процењена је на БЦСЦ, а ћелијама је остављено да се диференцирају као СДАЦ током 3, 5 и 7 дана. Бар графикони приказују релативну масовну стандардну девијацију (РСД) и коефицијенте варијације интензитета и времена задржавања (% ЦВ) тачних задржаних масених кластера откривених у БЦСЦс ( а, б, ц ) и СДАЦс прикупљених 3, 5 дана ( д, е, ф ) и 7 дана ( г, х, и ) пост-диференцијација (пд). ( ј ) Четверосмерна Веннова дијаграмска анализа различито изражених протеина идентификује 15 локуса. Бројеви у заградама представљају укупан број идентификованих протеина групираних у сваком локусу. БЦСЦ-ови у поређењу са СДАЦ-овима 3, 5 дана пд показују 25 и 5 протеина, посебно горе-доле-регулираних, респективно; БЦСЦ показују 4 протеина горе регулисана у поређењу са СДАЦ-овима 7 дана пд; БЦСЦ показују 19 и 5 протеина уп-регулисаних и доле регулисаних, односно у поређењу са СДАЦ-овима без обзира на време диференцијације. Приступни бројеви Свисс-Прот наведени су у табели (видети детаљан опис у Додатним табелама С1 и С2). Анализа је извршена коришћењем четвеространог Венновог дијаграма генератора који је слободно доступан на //ввв.панглосс.цом/сеидел/Протоцолс/венн4.цги. ( к ) Бар графикон приказује средње омјере нивоа експресије протеина ( н = 3) од 19 и 5 протеина према горе и доље регулисано, односно у БЦСЦс у поређењу са СДАЦ без обзира на вријеме диференцијације. Црвена линија означава омјер израза = 1

Слика пуне величине

Веннова анализа (слика 1ј) показује да је 19 протеина подрегулирано у сферама у поређењу са обе временске тачке диференцијације, док је 5 било подрегулирано у истим експерименталним условима. Занимљиво је да се нивои експресије ових протеина нису мењали између 3, 5 и 7 дана у адхезивним условима (слика 1к), што наговештава да су разлике биле у строгој вези са стабљичним стањем. Стога смо одлучили да употријебимо СДАЦ прикупљене након 3, 5 дана у адхезивним условима за све наредне студије, фокусирајући се на ране промјене између БЦСЦ и СДАЦ услова.

Биоинформатска анализа ових различито протеинских протеина идентификовала је две значајне мреже преклапајућих протеина повезаних са хематолошким, имунолошким и упалним болестима (скор = 62) и уклањањем слободних радикала и путовима рака (скор = 3) (слике 2а и б). Функционална анализа заснована на ГО терминима показала је да је неколико различито експримираних протеина строго повезано са гликолизом ( П = 3 × 10 -13 ) и глуконеогенезом ( П = 2 × 10 -8 ) (Слика 2ц). Конкретно, повећани нивои експресије кључних ензима ферментативне гликолизе, попут пируват киназе М2 (ПКМ2) и лактат дехидрогеназе А (ЛДХ-А) у сферама у поређењу са СДАЦ, могу указивати на то да сфере у основи метаболишу глукозу неоксидативним путем чак и испод нормоксична стања. Ова хипотеза је у складу са пријављеном регулацијом хипоксије-индуцибилног фактора 1 α (ХИФ-1 α ) у ЦСЦ 12, 21 и са предвиђеном активацијом ХИФ-1 α- зависног пута као што је предложено ( з -сцоре = 2.791) од виша експресија у БЦСЦ у поређењу са СДАЦс неколико протеина који су укључени у овај пут, као што су триоза-фосфат изомераза 1, фосфоглицерат киназа 1, галектин 1, ЛДХ-А, 70-кДа протеин топлотног шока, глицералдхејд 3-фосфат дехидрогеназа, енолаза 1, и алдолаза А. Анализа западне блотуре (ВБ) потврђује да БЦСЦ изражавају више нивое ХИФ-1 α у поређењу са СДАЦ (слика 2д).

Image

Функционална анализа и мрежа протеина указује на појачану гликолизну активност и активирање ХИФ-1 α путање у БЦСЦ. Анализа пута интензитета различито протеинских протеина у БЦСЦ-има у поређењу са СДАЦ-ом резултира у две интерактивне мреже повезане са ( а ) хематолошким, имунолошким и упалним болестима и ( б ) уклањањем слободних радикала и путом рака. На дијаграмима су гени за фокусирање (различито експримирани протеини) који су приказани зеленом (доле регулисаном) или црвеном (урегулирани). Чврсте и испрекидане линије означавају директне и индиректне интеракције, а стрелице означавају модулацијску улогу протеина или ендогених хемикалија. ( ц ) Канонски путеви повезани са БЦСЦ су гликолиза, глуконеогенеза и радикална деградација супероксида. Функционална анализа стазе изведена је употребом алата за анализу пута Ингенуити за значајно регулисане протеине у БЦСЦ у поређењу са СДАЦ-овима. Стварни графикон приказује резултате (−лог 10 П ) повезане са путевима обогаћеним регулисаним протеинима, како је одређено коришћењем тачно исправног Фисхер-овог теста са прагом <0, 050. Жута линија означава омјер израчунат као број протеина на одређеној путањи који задовољавају критерије прекида ( П = 0, 050) подијељен с укупним бројем молекула које чине тај пут. ( д ) БЦСЦ регулирају нормоксични ХИФ-1 α . Нуклеарни екстракти су процењени на ХИФ-1 а и ламинин П помоћу ВБ. Светска банка показује да ниво експресије ХИФ-1 α значајно опада у ћелијама којима је дозвољено да се диференцирају као СДАЦ током 3, 5 дана

Слика пуне величине

Циљана метаболомика показује повећани степен млечне ферментације и инхибицију бета-оксидације масних киселина (ФА) у БЦСЦ

Да бисмо проверили да ли су БЦСЦ-ови били гликолитичнији када се узгајају као сфероиди, него када се узгајају као СДАЦ, извршили смо циљану метаболомску анализу интермедијара гликолизе. Открили смо да су нивои фруктозе 1, 6-дифоспата, пирувата, млечне киселине и рибоза 5-фосфата значајно виши у БЦСЦ (Слика 3а, Додатна табела С5). Поред тога, нисмо пронашли значајне разлике у концентрацији интермедијара Кребс-овог циклуса, осим јантарне киселине која је била значајно већа у БЦСЦ-има (слика 3а, допунска табела С5) и фумарне киселине, која је била већа у БЦСЦ, али разлика са СДАЦ нису били статистички значајни (средња вредност ± СД = 1995 ± 257 и 1233 ± 638 нг / мг -1 у БЦСЦ и диференцираним ћелијама; П = 0, 204).

Image

Циљана метаболомика открива значајне промене гликолитичких интермедијара, несенцијалних аминокиселина добијених из глукозе, слободног карнитина и АцЦс, што сугерише појачану млечну ферментацију и инхибицију ФАоксидације у БЦСЦ. Графички графикони показују средње концентрације интермедијара ( а ) гликолитичког и Кребсовог циклуса и ( б ) аминокиселина и слободног карнитина у БЦСЦ и СДАЦс. Резултати циљане метаболомске анализе доступни су у Додатној табели С5. Разлике приказане у графиконима су значајне (двоструки т- тест, П <0, 050). Концентрације су изражене као нг / мг (мокра тежина). Траке показују средњу вриједност ± СД ( н = 6)

Слика пуне величине

Наши подаци такође указују на релевантне измене профила ацилкарнитина (АцЦс) и аминокиселина (АА) у БЦСЦ. Концентрације валина (Вал), орнитина, фенилаланина, аргинина (Арг), тирозина, серина, хистидина (Хис), пролина, глицина (Гли) и лизина / глутамина повећане су у БЦСЦ-има у поређењу са СДАЦ-има (Слика 3б; Додатна табела С5). И ЛЦ-МС / МС не разликују Лис и Глн и успели смо да проценимо њихову укупну концентрацију. Супротно томе, аланин (Ала) се значајно смањио у БЦСЦ-има у поређењу са СДАЦ-има (Слика 3б; Додатна табела С5).

Треба напоменути да смо пронашли значајно нижи ниво слободног карнитина у сферама у поређењу са СДАЦ-има (слика 3б, допунска табела С5), што сугерише инхибицију синтезе АцЦс и коначно ФА бета-оксидацију. У складу са овом хипотезом, АЦЦ-ови кратког, средњег и дугог ланца нису могли да се открију у БЦСЦ. Супротно томе, АцЦс је било квантификовати у СДАЦ-овима (допунска табела С5).

БЦСЦ показују већу активност кључних ензима анаеробног метаболизма глукозе

Надаље смо потврдили ниво експресије ПКМ2 и ЛДХ-А, кључног ензима аеробне гликолизе, ВБ анализом протеинских екстраката прикупљених из БЦСЦ и СДАЦ. Потврдили смо да су ПКМ2 и ЛДХ-А били значајно регулирани у БЦСЦ-има у поређењу са СДАЦ-овима (Слика 4а, П = 0, 008 и 0, 034, респективно; н = 3). Поред тога, БЦСЦ показали су пораст ПК (средња вредност ± СД = 2, 5 ± 0, 7 и 1, 0 ± 0, 2 μ мол / мг протеина / мин у БЦСЦс и СДАЦс, П ; 0, 0001; н = 6) и ЛДХ-А (средња вредност ± СД = 2, 0 ± 0, 8 и 1, 3 ± 0, 1 μ мол / мг протеин / мин у БЦСЦс и СДАЦ, респективно; П = 0, 044; н = 6) активност (слике 4б и ц).

Image

Нивои експресије и активности гликолизних ензима повећавају се у БЦСЦ и корелирају са измењеном енергијом и редокс статусом БЦСЦ. ( а ) ВБ показује ПКМ2, ЛДХ-А и Г6ПДХ експресију у БЦСЦс у поређењу са СДАЦс. П- Актин се користи као контрола пуњења протеина. Приказана је репрезентативна Светска банка од три независна експеримента. ( б ) ПК и ( ц ) ЛДХ и ензимске активности процењене у сферама (БЦСЦ) у поређењу са диференцираним ћелијама (СДАЦ). Графички графикони приказују средњу активност ( н = 6) изражену у μ мол / мг протеина / мин, а шипке представљају СЕМ ( д ) ВБ који приказује експресију ПКМ2 и ЛДХ-А у ћелијама сортираним за ЦД24 експресију. β -актин се користи као контрола оптерећења. ( е ) ПК и ( ф ) ЛДХ активност у ЦД24 - / ниским ћелијама у поређењу са ЦД24 + БЦСЦ. Графички графикони приказују средњу активност ( н = 6) изражену у μ мол / мг протеина / мин, а шипке представљају активност ензима СЕМ ( г ) Г6ПДХ процењену у сферама (БЦСЦ) у поређењу са диференцираним ћелијама (СДАЦ). Графички графикони приказују средњу активност ( н = 6) изражену у μ мол / мг протеина / мин, а шипке представљају СЕМ ( х ) НАДП + / НАДПХ, ( и ) НАДП / / НАДХ и ( ј ) АДП / АТП омјере у БЦСЦ-има у поређењу са СДАЦ-овима. Третман ротеноном не утиче на производњу АТП-а у БЦСЦ, док снажно повећава однос АДП / АТП и инхибира производњу митохондријалног АТП-а у СДАЦ-има. Нису примећене промене у односу АДП / АТП код БЦСЦ и СДАЦ после додавања диметилсулфоксида (ДМСО) који се користи као контрола возила. Траке показују средњу вриједност ± СД ( н = 3). * П <0, 050 (непарни двоструки т- тест или дво-фактор АНОВА)

Слика пуне величине

Да бисмо потврдили да су примењене метаболичке разлике заиста последица разлика између ЦСЦ-а и више диференцираних ћелија рака, сортирали смо ЦД24 - / ниске ћелије унутар сфере културе, за које је требало да буду мање диференциране више матичних ћелија и упоредили их са више диференцирана популација која изражава виши ниво ЦД24. Процењивали смо нивое експресије и ензимске активности ЛДХ и ПК у ЦД24 - / лов и ЦД24 + БЦСЦ. У складу са више гликолитним фенотипом, ЦД24 - / ниске ћелије показују више нивое (слика 4д) и активности ПК (средња ± СД = 19, 2 ± 0, 3 и 2, 0 ± 0, 4 μ мол / мг протеина / мин у ЦД24 - / ниска и ЦД24 + ћелије, респективно; П = 6 × 10 -13 ; н = 6) и ЛДХ (средња вредност ± СД = 3, 6 ± 0, 3 и 2, 5 ± 0, 5 μ мол / мг протеин / мин у ЦД24 - / ниска и ЦД24 + ћелија, респективно; П = 0, 002; н = 6) (Слике 4е и ф) у поређењу са ћелијама ЦД24 + .

Глукоза 6-фосфат дехидрогеназа (Г6ПДХ) је кључни ензим пута пентоз фосфата, метаболички процес који НАДПХ даје ћелијама који су потребни за анаболичке путеве. Наши протеомски подаци такође показују да је Г6ПДХ више изражен у БЦСЦс иако разлика са СДАЦ-овима није статистички значајна (подаци нису приказани). Заправо анализом ВБ-а, показујемо да је Г6ПДХ у сферама регулисан у поређењу са СДАЦ-овима ( П = 0, 036; н = 3; Слика 4а), а његова активност је значајно повећана (средња вредност ± СД = 2, 3 ± 0, 8 и 1, 2 ± 0, 3 μ мол / мг протеина / мин у БЦСЦс и диференцираним ћелијама; П = 0, 004; н = 6; Слика 4г). Према повећању експресије и активности Г6ПДХ, пронашли смо смањени однос НАДП + / НАДПХ у сферама (средња ± СД = 0, 94 ± 0, 05 и 1, 063 ± 0, 004 у БЦСЦс и СДАЦс, П ; 0, 013, слика 4х). Ови резултати сугеришу појачану биосинтезу НАДПХ кроз пентосе фосфатни пут у БЦСЦ у поређењу са СДАЦс.

БЦСЦ показују повећану смањену потрошњу никотинамид аденин динуклеотида (НАДХ) и производњу цитосолне АТП

Омјер аденосин-дифосфата (АДП) / АТП и НАД + / НАДХ су индекси аеробног или анаеробног метаболизма енергије, промета ћелијске енергије и редок ћелијског стања. Открили смо да су омјери НАД + / НАДХ значајно већи у БЦСЦ-има у поређењу са СДАЦ-ом (просјек ± СД = 11, 9 ± 0, 6 и 6, 7 ± 0, 3 у БЦСЦ-у и диференциране ћелије; П = 2 × 10 −4, слика 4и). Ово је повезано са повећањем потрошње НАДХ и смањењем производње НАД + у БЦСЦ-има. У ствари, концентрације НАДХ (средње ± СД = 0, 06 ± 0, 04 и 0, 13 ± 0, 02 μ мол / л у БЦСЦс и СДАЦс, П ; 0, 050), као и нивои НАД + (средње ± СД = 0, 73 ± 0, 04 и 0, 88 ± 0, 07 μ мол / л у БЦСЦс и СДАЦс, респективно; П = 0, 045) значајно се смањује у БЦСЦс у поређењу са СДАЦс.

БЦСЦ такође показују повећан однос АДП / АТП (средње ± СД = 0, 23 ± 0, 03 и 0, 15 ± 0, 06 у БЦСЦ и диференциране ћелије, респективно; П = 0, 016, слика 4ј).

Треба напоменути да смо открили да третман ротеноном, одвајајућим агенсом електронског транспортног ланца (ЕТЦ), повећава однос АДП / АТП у СДАЦ (средња ± СД = 0, 13 ± 0, 02 и 0, 247 ± 0, 006 за контролу и СДАЦ третиране ротеноном, респективно; П = 0, 001), док нема утицаја на производњу АТП-а у БЦСЦ-у (средња вредност ± СД = 0, 21 ± 0, 02 и 0, 20 ± 0, 01 за контролу, а БЦСЦ-и третирани ротеноном, респективно; П = 0, 732). Ови налази сугерирају да одвајање ЕТЦ-а изразито инхибира производњу АТП-а у СДАЦ-овима, али не и у БЦСЦ-има који се ослањају на млечну ферментацију (Слика 4ј).

2-деоксиглукоза (2-ДГ) инхибира раст и опстанак БЦСЦ-а

Свеукупно, наши подаци показују да БЦСЦ-ови приказују анаеробни фенотип метаболизма у поређењу са СДАЦ-овима. Стога смо тестирали утицај, на раст и опстанак БЦСЦ-а, једињења за које се зна да инхибира прву фазу гликолизе, самостално или у комбинацији са Доко, хемотерапијским средством које се користи за лечење рака дојке.

Наши резултати показују да Доко делује цитостатички на БЦСЦ, али врло скромно, ако уопште има, токсично дејство (слике 5а и б). Приметно, БЦСЦ-ови су знатно блокирани у Г2 фази ћелијског циклуса (подаци нису приказани). Супротно томе, 2-ДГ пружа значајан временски зависан цитотоксични ефекат индукујући до 44% апоптозе након 48 х лечења (Слика 5б).

Image

2-ДГ индукује апоптозу БЦСЦ, а његов ефекат се повећава комбинацијом са доксорубицином. ( а ) БЦСЦ се третирају само доксорубицином (Доко) и 2-деоксигликозом (2-ДГ) или комбинацијом Доко и 2-ДГ (Доко + 2-ДГ). Третман Доко-ом пружа цитостатски ефекат, али број ћелија се значајно не разликује 24 и 48 х након примене Доко-а (Фисцхеров ЛСД пост-хоц тест, П = 0, 768). Супротно томе, лечење са 2-ДГ смањује број БЦСЦ у поређењу са контролом, 24 х (Фисцхеров пост-хоц тест, П = 0, 055) и 48 х ( П = 8 × 10 -4 ) Доко третманом. Третман са Доко + 2-ДГ значајно смањује број ћелија у поређењу са 24 х ( П = 0.0009) и 48 х ( П = 1 × 10 −6 ) доко третманом и 48 х лечењем са само 2-ДГ (Фисцхер пост-хоц тест, П = 0, 002). Процена апоптозе у ( б ) БЦСЦ-има и ( ц ) СДАЦ-има третираним 48 сати 2-ДГ, Доко или комбинацијом ова два. Приказан је проценат хипо-диплоидних догађаја који су процењени проточном цитометријом након бојења пропидијум-јодидом

Слика пуне величине

Занимљиво је да комбинација 2-ДГ и Доко доводи до већег цитотоксичног ефекта у поређењу са третманом самим Доко-ом или самим 2-ДГ након 2 дана достижући 80% апоптозе након 48 х (Слика 5б). Као што се и очекивало, диференцираније ћелије више реагују на Доко; међутим, делују мање осетљиво на 2-ДГ од БЦСЦ (слика 5ц). То је у складу са мање метаболизмом гликолатности. Поново, комбиновани третман резултира много већим одговором и код СДАЦ-а (слика 5ц).

Дискусија

Све већи докази показују да је подскуп ћелија рака, познат као ЦСЦ, кључни покретачи прогресије тумора, што је клоногенска популација која подржава раст тумора. Према ЦСЦ моделу, неуспех да се те ћелије искоријене тренутним терапијама може резултирати рецидивом тумора. Како су ове ћелије генерално врло хемо- и радио-резистентне, постоји хитна потреба за терапијским агенсима да селективно циљају ову популацију. 2, 3 Показано је да неколико путања трансдукције сигнала доприносе матичном фенотипу и предложено је као потенцијални терапијски циљ; штавише, недавна истраживања показују да циљање метаболизма ЦСЦ-а у комбинацији са класичним хемотерапијским средствима може пружити драгоцену стратегију за искорјењивање ЦСЦ-а. Наша интегрисана протеомска и циљана метаболомичка анализа сугерише да БЦСЦ зависе више од анаеробног метаболизма глукозе него од више диференцираних ћелија тумора.

Појачана производња гликолитичког флукса и лактата, чак и у присуству кисеоника, сугерише прелазак БЦСЦ метаболизма са оксидативне фосфорилације на аеробну гликолизу, феномен познат као Варбург ефекат. Поред тога, показало се да урегулација аеробне гликолизе корелира са повећаном агресивношћу тумора и развојем отпорности на више лекова. 22, 23

Варбург ефекат се сматра ћелијским одговором на хипоксичне размере у микроокољу тумора и адаптивном прекомерном експресијом транскрипционог фактора ХИФ-1 α који може промовисати опстанак ћелија рака. Виши ниво ХИФ-1 α у сферама, предвиђен силиконом и ефикасно примећен у БЦСЦ, чак и под нормоксичним условима, резултира повећаним нивоом експресије протеина који учествују у транспорту и метаболизму глукозе, као и стварању лактата индукцијом ЛДХ-А, кључни ензим ферментације глукозе. 24 Показано је да лактат и пируват, нађени значајно повећани у БЦСЦ-има, увећавају гене индуциране хипоксијом независно од хипоксије стимулишући акумулацију ХИФ-1 α . 25 Занимљиво је да смо такође открили да су БЦСЦ обогаћени у Кребсовом циклусу интермедијат сукцината и показују тренд повећања концентрације фумарата. Сукцинат и фумарат промовишу акумулацију ХИФ-1 α инхибицијом ензима из домена пролил хидроксилазе зависних од кисеоника који катализују разградњу ХИФ-1 α , пружајући тако поткрепљујуће доказе за повећани ХИФ-1 α у БЦСЦ под нормоксичним условима.

Сматра се да је ЛДХ-А главни молекуларни посредник Варбург ефекта. ЛДХ-А и ЛДХ-Б гени кодирају два протеина, односно М и Х, који се заједно комбинују да би добили пет изоензима који се разликују у електрофоретској покретљивости и константи Мицхаелис-Ментен за лактат и пируват. ЛДХ-А, прекомерно изражен у БЦСЦ, повезан је са конверзијом пирувата у лактат, што сугерише појачану млечну ферментацију у овим ћелијама. Ова хипотеза је подржана повећањем активности ЛДХ ПирЛац и млечне киселине која се налази у сферама. Повећана локална концентрација токсичне млечне киселине и смањени ванћелијски пХ недавно су повезани са ефектом Варбург-а и изгледа да су повољни за инвазију и тумореригенезу. 26, 27, 28

ПКМ2 је изоформа ПК ниске активности која промовише аеробну гликолизу и доприноси анаболичком метаболизму. 17, 29 Познато је да ПКМ2 замењује нормалан ПК ензим у пролиферацијским и туморским ћелијама, а 30 и ПКМ1 (високо активна ПК изоформа) на ПКМ2 изоформни прекидач су повезани са повећаним ферментацијским метаболизмом, повећаном производњом пирувата и лактата и нижим потрошња кисеоника 17 Приметно, активност ПКМ2 се ослања на алостеричну активацију фруктозом 1, 6-дифосфатом 31 и серином. 32 Повећана ПК активност у БЦСЦс је у складу са нашим подацима који показују значајно повећање ова два алостерична ефектора у БЦСЦ у поређењу са СДАЦс. Поред тога, ПК има глобалну регулаторну улогу у биосинтетском метаболизму АА и утиче на концентрацију слободних АА. 33 Показано је, нарочито, да регулација ПКМ2 стимулише биосинтезу серина де ново , 34 што заузврат може алостерично активирати ПКМ2, у складу са вишим нивоима серина који смо пронашли у БЦСЦ. Урегулација ПКМ2 и пораст ПК активности могу такође бити у корелацији са повећањем Арг, Вал и Хис које су раније пријављене. 33 Већа стопа биосинтезе глукозе добијених од глукозе повезане са повећањем ПК активности указује на то да БЦСЦ преусмерају угљек који потиче од глукозе у путеве који не производе АТП и подржавају повећање ћелијске биомасе.

Повећани нивои експресије и активности Г6ПДХ и пораст 5-фосфата рибозе у БЦСЦ јасно указује на активирање пута пентозног фосфата. Ови налази подржавају идеју да се БЦСЦ пребаце из катаболичког метаболизма усмереног на производњу енергије ка анаболичком стању који има за циљ снабдевање прекурсора биосинтезе, као што је НАДПХ. Према овој хипотези, однос НАДП / НАДПХ у сферама значајно је смањен, што указује на повећани ниво унутарћелијских НАДПХ.

БЦСЦ такође показују висок однос АДП / АТП који може указивати на смањену производњу оксидативно добијеног митохондријалног АТП-а, и на тај начин алтернативни путеви који стварају АТП у БЦСЦ као и повећани нивои цитосолне АДП, потребне за одржавање високе стопе гликолизе. Треба приметити да третман ротеноном, инхибитором митохондријалног комплекса И, значајно смањује АТП производњу ћелија након диференцијације без значајних ефеката на БЦСЦ. Због тога су БЦСЦ мање зависни од активности митохондрија од нормалних ћелија рака и за производњу АТП-а се ослањају на аеробну гликолизу.

Забиљежено је да гликолитичке ћелије показују ниске цитосолне и митохондријске НАД + / НАДХ омјере који инхибира циклус трикарбоксилних киселина (ТЦА) погодујући анаеробној гликолизи. 35 Поред тога, повећање нивоа НАД + / НАДХ инхибира тумоуригенесис и метастазе код рака дојке. 36 Неочекивано, БЦСЦ-ове карактерише виши ниво НАД + / НАДХ у поређењу са СДАЦ-овима. Чини се да је то у супротности са агресивним фенотипом ове ћелије и њиховом способношћу стварања тумора. Међутим, наши подаци су у складу са хипотезом да БЦСЦ-ови могу конзумирати НАДХ без стварања АТП-а из митохондријског транспорта електрона. Смањење нивоа НАДХ и одговарајуће повећање односа НАД + / НАДХ у БЦСЦ могу бити повезани са повећањем брзине хомолактичке ферментације ради регенерације довољног НАД + базена и одржавања високих стопа гликолизе, повећања потрошње НАДХ или са инхибицијом ТЦА циклус. У ствари, познато је да повећана концентрација интермедијара циклуса ТЦА инхибира циклус. Повећање концентрације сукцината и тренд значајног повећања фумарата у БЦСЦ могу делимично објаснити повећани однос НАД + / НАДХ кроз инхибицију циклуса ТЦА. Снажна инхибиција бета-оксидације ФА коју смо приметили у БЦСЦ даје даље доказе о утишавању активности митохондрија. Иако је тачна улога инхибиције инхибиције оксидативног катаболизма ФА тренутно нејасна, ови прелиминарни резултати оправдавају даља испитивања.

Вредно је напоменути да је Варбург ефекат повезан са митохондријалном стабилношћу и ћелијским редокс равнотежом у ћелијама рака. 37 Промовисање гликолизе и ограничавање митохондријске активности може инхибирати производњу реактивних кисикових врста митохондрија (РОС). Недавно је показано да ниски нивои настајања РОС-а кроз гликолитички помак доприносе одржавању фенотипа ЦСЦ-а. 9 Открили смо да се БЦСЦ не само ослањају на аеробну гликолизу, већ и снажно прекомерно експримирају неколико антиоксидативних ензима као што су митохондријски супероксид дисмутаза и синтетишу више НАДПХ него диференциране ћелије. Појачана биосинтеза НАДПХ може указивати на повећани извор редукције еквивалента и на побољшање анти-оксиданса одбране кроз систем прореироксина, тиоредоксина и глутатион. Треба напоменути да је недавно показано да кључни регулатор аеробне гликолизе ПКМ2 има релевантну улогу у одржавању ћелијске редокс хомеостазе омогућавајући већу диверзију гликолизних интермедијара у пентоз фосфатни пут и НАДПХ биосинтезу као одговор на оксидативни стрес. 38 Стога је могуће да су БЦСЦ-и покренули такве механизме за сузбијање РОС-а.

Фармаколошким циљањем аеробне гликолизе превазилази се лековита резистенција ЦСЦ-а изолованих из неколико чврстих тумора. Конкретно, показано је да инхибиција гликолизе враћа осетљивост на лекове у високим малигним ћелијама тумора кроз инактивацију АБЦ транспортера који обезбеђују механизам за испуштање хемотерапијских лекова у ЦСЦ. 39 Аналог синтетичке глукозе, 2-ДГ је један од инхибитора гликолизе за које се показало да инхибира раст чврстог тумора и тренутно је под клиничким испитивањима фазе И / ИИ. 40, 41 Треба напоменути да је недавно сугерисано да комбинација 2-ДГ са широко кориштеним хемотерапеутицима као што је трастузумаб може бити драгоцена стратегија за превазилажење БЦСЦ резистентних на лекове. 42 Овде показујемо да акутно лечење са 2-ДГ има значајан цитотоксични ефекат и индукује апоптозу БЦСЦ. Ови налази су у складу са подацима који показују да 2-ДГ значајно утиче на способност ЦСЦ-а да формирају сфероиде. 14 Цитотоксични ефекат 2-ДГ претходно је објашњен не само инхибицијом гликолизе и следећим метаболичким стресом, већ и индиректним ефектима на неколико сигналних путева, као што су инхибиција сисарских мета рапамицин сигнализације 43 или директни ефекти на про-апоптотичке протеине, као што је Бцл-2 хомологни антагонист / убица. 44

Супротно томе, широко коришћени хемотерапеутски лек Доко пружа само цитостатски ефекат на ЦСЦ и показало се да доводи до обогаћивања ћелија са ЦСЦ карактеристикама унутар популације, чиме потенцијално повећава отпорност и ризик од поновне појаве. 45 Занимљиво је да смо открили да комбинација Доко-а и 2-ДГ показује синергијски ефекат, значајно побољшавајући смрт БЦСЦ-а на временски зависан начин. Штавише, комбиновани третман има важан ефекат и на више диференциране ћелије рака, што сугерише да ова комбинација може циљати на различите популације ћелија рака. Познато је да Доко повећава производњу РОС-а који може посредовати на митохондријском оштећењу и апоптози на п53-независан начин. 46, 47 Такође је познато да лечење 2ДГ-ом доводи до повећања РОС-а. 48, 49 Ово може пружити образложење за побољшање ефекта Доко-а од стране 2-ДГ. Са друге стране, комбиновање 2-ДГ са другим лековима може да појача ниску ин виво цитотоксичност 2-ДГ 40 и такође да надвлада цитостатски ефекат класичних хемотерапијских лекова. У ствари, циљање аеробне гликолизе са 2-ДГ значајно примењује Доко отпорност БЦСЦ, пружајући тако обећавајућу фармаколошку примену против БЦСЦ.

Материјали и методе

Хемикалије

Све хемикалије су испоручивале Сигма-Алдрицх (Схнеллдорф, Немачка) и Флука (Схнеллдорф, Немачка), осим ако није другачије наведено.

Сакупљање ткива, изолација и култура ћелија рака

Ткива рака дојке код људи су добијена од пацијената који су били подвргнути операцији у складу са етичким стандардима институционалног Одбора за експериментисање на људима (ауторизација бр. ЦЕ-ИСС 09/282). Туморска ткива су механички и ензимски дигестирана колагеназом (1, 5 мг / мл; Гибцо Лифе Тецхнологиес, ​​Гранд Исланд, НИ, УСА) и хиалуронидазом (20 мг / мл) у ДМЕМ (Гибцо), мућкајући 1 сат на 37 ° Ц. Резултујућа ћелијска суспензија је посађена у боце са ултра-ниским везањима (Цорнинг Инцорпоратед, Цорнинг, НИ, УСА) у медијуму без серума са додатком основног фактора раста фибробласта (10 нг / мл) и фактора раста епидерме (20 нг / мл), претходно описано. 50 Овај поступак је дао БЦСЦ линије које су подвргнуте генотипизацији како би се потврдила индивидуалност сваке ћелијске линије и додатно су тестиране на њихову способност стварања ксенографта тумора који су реплицирали хистологију родитељског тумора. Да би се постигла ин витро диференцијација БЦСЦ-а, ћелије дисоцијаисане сфере узгајане су у ДМЕМ-у назначена времена (3, 5 или 7 дана) са додатком 10% феталног говеђег серума (ФБС) у адекватним условима. Ове ћелије су конвенционално означене као СДАЦ. 18

Тест ћелије пролиферације

Животна способност ћелије одређена је у току 24 и 48 х тестом искључења трипан плаве боје после третирања БЦСЦ са 35 ммол / л 2-ДГ као што је раније објављено, 14 доксорубицин хидрохлорида (1 μ мол / л) и комбинације ова два лека у истим концентрацијама. Контролни узорци су изведени у раствору фосфатном пуферу (ПБС).

Цитофлуориметријска анализа

Процена садржаја проточне цитометријске ћелијске ДНК изведена је према Ницолетти ет ал. 51 Укратко, ћелије су сакупљене трипсином, гранулиране су на 800 × г током 10 мин и фиксиране у 70% етанолу преко ноћи на -20 ° Ц. Узорци су затим испрани у ПБС-у и инкубирани на 37 ° Ц, током 15 минута са 13 Кунитз-ових јединица РНАсе А раствора и 20 мин са 50 μг / мл пропидијум-јодида. Двадесет хиљада догађаја је прикупљено (ФАЦСЦанто ИИ Инструмент, БД Биосциенцес, Сан Јосе, Калифорнија, САД) и анализирано коришћењем БД ФАЦСДИВА софтвера (БД Биосциенцес).

Проведена је цитометријска анализа површинских маркера ЦД24 и кластера диференцијације 44 (ЦД44) на 2 × 10 5 ћелија по узорку. Ћелије су испране у ПБС, ресуспендоване у 100 μл специфичног антитела (антитело-ЦД24-Р-фикоеритрин-цијанинско бојило7 (анти-ЦД24-ПЕ-Ци7), 561646, БД Пхарминген (Франклин Лакес, Њ, САД); ЦД44-алофикоцијанин (анти-ЦД44-АПЦ), 559942, БД Пхарминген) је разблажен у 0, 5% албумину говеђег серума и инкубирао 20 минута на собној температури у мраку. Cell viability solution (555815, BD Biosciences) was used for detection of non-viable cells according to manufacturer's protocol. Samples were then washed and stored at 4 °C in the dark until acquisition. A FACSCantoII flow cytometer, running with FACSDiVa software (BD Biosciences), was used for sample acquisition and analysis.

Cell sorting of CD44 + /CD24 + and CD44 +/ CD24 −/low sub-populations was performed on single cell suspension from BCSC double stained with anti-CD24-PE-Cy7 antibody and anti-CD44-APC antibody. Cells were sorted with fluorescence-activated cell sorting Aria III cell sorter (BD Biosciences). Sub-populations of cells co-expressing CD44 and CD24 at higher levels or CD24 weak/absent were collected, and a small amount of cells were re-analysed to check for purity.

Иммуноблоттинг

Cells grown as BCSCs and SDACs were collected by centrifugation at 1200 revolutions/min. Cell pellets were washed twice with ice-cold PBS, resuspended in a 50 mmol/l tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)/HCl (pH 7.5), 150 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA, 1 mmol/l NaF, 10% Glycerol (V/V), 1 mmol/l MgCl, 1% Triton X-100 (V/V) ice-cold buffer containing proteinase inhibitor cocktail and incubated for 30 min on ice. Sample lysates were centrifugated at 10 000 × g for 10 min, and supernatants were collected. Equal amounts of whole proteins extracts and nuclear extract (B-625 Sigma N-XTRACT, Shnelldorf, Germany) for HIF-1 α immunodetection were resolved on 10% sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis gel using a mini-gel apparatus (GmbH Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, USA), transferred onto polyvinylidene fluoride membranes and subsequently blocked with 5% non-fat dry milk in PBS/0.1% (V/V) Tween 20. Immunodetection was performed by incubating the membranes with the different primary antibodies diluted in blocking buffer for 2 h at room temperature or overnight at 4 °C. The following antibodies were used: anti-LDH (PA5-27406, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), anti-PKM2 (PA-23034, Thermo Scientific), anti-G6PD (PA5-27359, Thermo Scientific), anti-HIF-1 α (NB100-449, Novus Biologicals, Cambridge, UK), anti-Actin (clone AC-15, A5441 Sigma-Aldrich), and anti-Laminin β (M-20) (sc-6217, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA). Immunoreactive bands were visualized with SuperSignal West Dura Substrate (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA).

Differential proteomic analysis

Sample preparation, data acquisition and data processing were performed as previously described. 52, 53, 54 A total of 100 μ g of protein extracts from the different conditions in separate experiments were precipitated with a mix of ethanol, methanol, and acetone (ratio 2 : 1 : 1, V/V) and then dissolved in 100 mmol/l Tris/HCl pH 7.9 containing 6 M urea and 0.1% 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate and sonicated. The reduction of proteins was performed by adding 100 mmol/l dithiothreitol (DTT) (1 h at 36 °C) and 200 mmol/l iodoacetamide (1 h at room temperature). Protein samples at a final concentration of 2 μ g/ μ l were digested with 1 : 20 (w/w) sequence-grade trypsin (Promega, Madison, WI, USA) at 36 °C overnight. The reactions were stopped by adding 1 μ l of 10% (V/V) trifluoroacetic acid. A total of 0.25 μ g of the protein digestion was loaded onto the nanoACQUITY UPLC System (Waters Corporation, Milford, MA, USA) coupled to a quadrupole-time of flight (Q-Tof) Premier mass spectrometer (Waters Corporation). Before loading, a digested enolase from Saccharomyces cerevisiae (Waters Corporation) was added to the sample as internal standard at a final concentration of 200 fmol/l. Samples were injected onto a Symmetry C18 5 μ m, 180 μ m × 20 mm precolumn (Waters Corporation) for preconcetration and desalting and were subsequently separated using a NanoEase BEH C18 1.7 μ m, 75 μ m × 25 cm nanoscale LC column (Waters Corporation) maintained at 35 °C. Mobile phase A was water with 0.1% formic acid, and mobile phase B was 0.1% formic acid in acetonitrile. Peptides were eluted by a gradient of 3–40% mobile phase B over 150 min at a flow rate of 250 nl/min followed by a gradient of 40–90% mobile phase B over 5-min and a 15-min rinse with 90% mobile phase B. The Q-Tof Premier mass spectrometer (Waters Corporation) was programmed to step between low (4 eV) and high (15–40 eV) collision energies using a scan time of 1.5 s over 50–1990 m / z . Samples from each condition were run at least in triplicate. The best replica for each condition was used for the subsequent analysis. The Continuum LC-MS data were processed and searched using ProteinLynx GlobalServer v2.3 (PLGS) (Waters Corporation). Protein identification was performed using the embedded ion accounting algorithm of the software and by searching a Uniprot/SWISSProt human database release 2011_02 (20253 entries), to which the sequence from the enolase of S. cerevisiae was appended. The parameters for the database search were as follows: automatic tolerance for precursor ions, automatic tolerance for product ions, minimum of three fragment ions matched per peptide, minimum of seven fragment ions matched per protein, minimum of two peptides matched per protein, one missed cleavage, and carbamidomethylation and oxidation of methionine as modifications. The false positive rate of the identification algorithm is typically 3–4% with a randomized database appended to the original one, which is five times the size of the original utilized database. 55, 56 The identified proteins displayed in the protein table were normalized against the P00924 entry (Enolase S. cerevisiae ), and peptides from Enolase S. cerevisiae digestion that were the most reproducible for retention time and intensity deriving ( m / z 807.42, m / z 814.49, m / z 1286.71, m / z 1288.70, m / z 1755.94, m / z 1789.83, m / z 1840.89) were used to normalize the EMRT table, the list of paired peptide exact masses and retention time. The list of normalized proteins was screened according to the following criteria: proteins that were identified in at least two out of the three injections of the same conditions; proteins with 0< P <0.05 or 0.95< P 1.3 on decimal scale. If 0< P 95%, and if 0.95< P 95%. Setting the threshold of ratio at 1.3 on a decimal scale allowed us to consider the average relative fold change ±0.30 on a natural log scale. This setting is typically 2–3 times higher than the estimated error of the intensity measurements. 56

Targeted metabolomic analysis by GC–MS

GC–MS analysis of cell lysates was performed as previously described. 57 Briefly, cell samples (approximately 1.5 × 10 6 cells) were extracted with a solution of ethanol/water (50 μ l, 80 : 20, V:V), and cell homogenate (50 μ l) were precipitated with 100 μ l of cold 0.1% (V/V) methanolic trichloroacetic acid immediately after homogenization. Internal standards ( 13 C 4 malic acid, 13 C 4 succinic acid, 13 C 6 glucose; IS) were then added to give a final concentration of 10 μ g/ml. Samples were centrifuged at 10 000 × g for 30 min, and supernatants were collected and dried in a SpeedVac system (ThermoSavant, Waltham, MA, USA). The dried extracts were derivatized with 20 μ l of 20 mg/ml of methoxyamine hydrochloride solution in pyridine for 60 min at 70 °C followed by reaction with 20 μ l of N, O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% of trimethylchlorosilane for 60 min at 70 °C. GC–MS analysis was performed using a 6890N gas-chromatograph equipped with a 7863 Series auto-sampler and coupled with a 5973N mass spectrometer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) operating in electron impact ionization mode. Three microlitres were injected in pulsed-splitless mode by applying a pressure of 80 psi. The injector temperature was kept at 250 °C. Chromatographic separations were obtained using a fused silica capillary column HP-5MS (30 mx 0.25 mm, Agilent Technologies). Helium was used as carrier gas at a constant flow rate of 1 ml/min. The GC oven was programmed as follows: start at 70 °C (hold time 1 min), which was raised at 4 °C/min to 300 °C (hold time 5 min). The mass spectrometer was automatically calibrated using per-fluoro tributylamine as calibration standard. For quantification, the mass spectrometer was used in the selective ion monitoring mode, and mass spectra were recorded in positive modes by monitoring the following ions: m / z 174 (pyruvic acid; IS: 13 C 3 pyruvic acid, m / z 177), m / z 147 (lactic acid; IS: 13 C 4 succinic acid, m / z 251), m / z 247 (succinic acid; IS: 13 C 4 succinate, m / z 251), m / z 245 (fumaric acid; IS: 13 C 4 malic acid, m / z 236), m / z 233 (malic acid; IS: 13 C 4 malic acid, m / z 236); m / z 328 (glyceraldheyde 3-phosphate; IS: 13 C 4 malic acid, m / z 236), m / z 357 (3-phosphoglyceric acid; IS: 13 C 4 malic acid, m / z 236), m / z 375 (citric acid; IS: 13 C 4 malic acid, m / z 236), m / z 319 (glucose; IS: 13 C 6 glucose, m / z 323), m / z 387 (glucose 6-phosphate; IS: 13 C 6 glucose, m/z 323), and m / z 459 (fructose 1, 6-diphosphate; IS: 13 C 6 fructose 1, 6-diphosphate, m / z 462). Mass spectrometer operating parameters were: interface temperature 300 °C, ion source 250 °C, and quadrupole 150 °C. The external standard method and internal standard correction were applied for quantification of target metabolites. Data acquisition was performed using the G1701CA ChemStation software (Agilent Technologies).

Determination AAs and AcCs

AA and AcCs analysis was performed by LC-MS/MS as previously described. 58, 59 Cell samples (approximately 1.5 × 10 6 cells) were extracted with a solution of Ethanol/Water (50 μ l, 80 : 20, V:V). The samples were then sonicated and centrifuged (15 600 rpm at 4 °C for 20 min), and the supernatant was recovered. The lysate (7 μ l) were added to 100 μ l of the stable isotope-labeled IS obtained from the NeoBase Non-derivatized MSMS Kit (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finland). The sample were analysed by direct infusion mass spectrometry using a LC-MS/MS system consisting of an Alliance HT 2795 HPLC Separation Module coupled to a Quattro Ultima Pt ESI tandem quadrupole mass spectrometer (Waters Corporation). The instrument was operated in positive electrospray ionization mode using MassLynx V4.0 Software (Waters Corporation). A detailed description of electrospray ionization mass spectrometry acquisition parameters are available in Supplementary Table S6. Auto data processing was performed using the NeoLynx (Waters Corporation) software.

Pyruvate kinase activity

PK activity was measured by converting the product pyruvate into lactate using LDH, with a concomitant conversion of NADH to NAD +, resulting in a decrease in absorbance at 340 nm. 60 In all, 7 × 10 6 cells were lysed in 200 μ l of buffer containing 10 mmol/l Tris–HCl (pH 7.5), 1.5 mmol/l MgCl 2, 20 mmol/l NaCl, 1 mmol/l DTT, 1 mmol/l phenylmethylsulfonyl fluoride, and protease inhibitor cocktail. After two centrifugations at 17 000 × g for 30 min each, PK activity was measured in the supernatant by a LDH-coupled assay. The 200- μ l reaction mixture was prepared on ice containing 100 mmol/l Tris–HCl (pH 8.0), 100 mmol/l KCl, 10 mmol/l MgCl2, 0.5 mmol/l EDTA, 0.2 mmol/l NADH, 1.5 mmol/l ADP, 5 mm phosphoenolpyruvate, and 200 units/ml LDH. The reaction was initiated by the addition of 0.7 μ g of total cell extract. PK activity was calculated at 37 °C by monitoring the absorbance at 340 nm every 30 s for 5 min in an microplate reader (Spectra max 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). A unit of PK activity is defined here as the amount of enzyme required to oxidize 1 μ mol of NADH per minute under these experimental conditions.

LDH activity

Direct LDH activity (LDH PyrLac ) was spectrometrically assayed as previously described 61, 62 using a tunable microplate reader (Spectra max 190, Molecular Devices). Briefly, cell pellets were lysed in 0.010 mol/l PBS (20 ml/g of pellet, wet weight; pH=7.4). Cell lysates were centrifuged at 2000 × g for 3 min at 4 °C to remove cell debris. Supernatants were further centrifuged 8000 × g for 10 min at 4 °C in order to obtain cytosolic fractions. Protein concentration was determined according to the Bradford assay. 63 Therefore, pyruvate (25 μ l, 2.50 g/l) and NADH (100 μ l, 0.3 g/l) were added to the samples (10 μ l corresponding to 0.5 μ g of total proteins) and the decrease of absorbance at 340 nm was measured at 37 °C every 30 s for 5 min. LDH PyrLac activity is expressed as μ mol/mg protein /min.

G6PDH activity

G6PDH was assayed using a tunable microplate reader (Spectra max 190, Molecular Devices), according to the spectrophotometric methods previously described 64 with minor modifications. Cell pellets were homogenized, and protein quantification were performed as described for LDH activity assay. To measure G6PDH activity, the sample (10 μ l corresponding to 0.5 μ g of total proteins) was added to a solution containing glucose 6-phosphate (0.2 mmol/l), NADP + (0.1 mmol/l), Tris/HCl buffer (50 mmol/l, pH=8.1), and MgCl 2 (1 mmol/l). The final volume was 150 μ l. The increase of absorbance at 340 nm was measured every 30 s for 5 min at 37 °C. G6PDH activity was expressed as μmol/mg protein/min.

NAD + /NADH and NADP + /NADPH determination

NAD + /NADH ratio were measured by a ultrasensitive colorimetric assay (EnzyChrom NAD + /NADH Assay Kit (E2ND-100), BioAssay Systems, Hayword, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. This assay is based on a LDH cycling reaction. 65 Briefly, cells were lysed with either 100 μ l NAD + extraction buffer for NAD + determination or 100 μ l NADH extraction buffer for NADH determination. After heating at 60 °C for 5 min, 20 μ l of assay buffer and 100 μ l of the opposite extraction buffers (NADH extraction buffer or NAD + extraction buffer, respectively) were added. The samples were then centrifuged at 14 000 rpm for 5 min, and the supernatants (40 μ l) were used for NAD + /NADH assays. The optical density (OD) was read at 565 nm in a tunable microplate reader (Spectra max 190, Molecular Devices) for time 0 and after 15 min. NAD + and NADH concentrations were measured as: (ΔOD- b 0)/ b 1, where b 0 and b 1 are the intercept and slope of the external calibration curve.

NADP + /NADPH ratio were measured by a ultrasensitive colorimetric assay (EnzyChrom NADP + /NADPH Assay Kit (ECNP-100), BioAssay Sistems) following the manufacturer's instructions. This assay is based on a glucose dehydrogenase cycling reaction. 65 The absorbance was measured at 565 nm using a tunable microplate reader (Spectra max 190, Molecular Devices), and the same procedure applied for NAD + /NADH determination was performed. All analysis were performed in triplicate.

ADP/ATP ratio determination

ADP/ATP ratio was measured based on luciferin–luciferase reaction using Enzylight ADP/ATP ratio assay kit (ELDY-100) (BioAssay Systems) following the manufacturer's instructions. Briefly, BCSCs cells were seeded in a 96-well flat-bottom plate and incubated for 3 days to allow for cell differentiation and recovery (1 × 10 4 cells at 100 μ l per well). BCSCs (1 × 10 4 cells) were treated with the assay buffer (90 μ l) containing luciferin–luciferase. After 1 min, luminescence (relative light units (RLU) A) was recorded by Lumat LB 9507 Ultra Sensitive Tube Luminometer (Berthold Technologies, Oak Ridge, TN, USA). The luminescence was read also after 10 min (RLU B). This measurement provided background before measuring ADP. Therefore, 5 ml ADP reagent was added to each well, and after 1 min, luminescence (RLU C) was obtained. ADP/ATP ratio was measured as: (RLU C−RLU B)/RLU A. All analysis were performed in triplicate. The same procedure was applied for the measurement of ADP/ATP ratio in BCSCs and SDACs following treatment with rotenone (50 μ mol/l) for 60 min.

Statistical and bioinformatic analysis

Differences between the protein expression levels, enzymatic activities, and metabolite concentrations in BCSCs and SDACs were assessed by unpaired two-tailed t -test. Two-factor ANOVA followed by Fisher's least significant difference (LSD) post-hoc test was performed in order to assess the significance of the treatment effects. Data were ranked and aligned where Levene test failed to show homoscedasticity. Aligned rank transformation (ART) of data was performed using the ART web software available at //faculty.washington.edu/aimgroup/proj/art/artweb/. 66 Treatment (PBS, Doxo, 2-DG, and Doxo+2-DG) and the treatment time (24 or 48 h) were the independent factors. P -values <0.050 were considered statistically significant. Statistical analysis was performed using the Statistica 6.0 (StatSoft Inc., Tulsa, OK), XLStat2007.1 (Microsoft, Redmond, WA, USA) and Microsoft Excel software.

Protein network analysis was performed using the Ingenuity Pathway Analysis (IPA) application (Ingenuity System, //www.ingenuity.com). IPA constructs hypothetical protein interaction clusters on the basis of the Ingenuity Pathways Knowledge Base. Direct and indirect relationships between the identified proteins were shown as networks on the base of all genes, and endogenous chemicals present in the Ingenuity Knowledge Network scores are calculated as −log ( P -value) and indicate the likelihood that focus genes (ie, the identified proteins within a specific network) are clustered together. Biological functions and canonical pathways over-represented among the identified proteins were also assigned to networks stored in the Ingenuity Pathways Knowledge Base. Biological functions and canonical pathways were ranked in accordance to their significance. Significance was evaluated by exact Fisher's test. A P -value of 0.01 corresponding to a score of 2 was considered the cutoff for the analysis.

Додатне информације

Датотеке слика

  1. 1.

    Допунска слика

Ворд документи

  1. 1.

    Допунска слика легенда

  2. 2

    Допунска табела С1

  3. 3.

    Додатна табела С2

  4. 4.

    Додатна табела С3

  5. 5.

    Додатна табела С4

  6. 6

    Додатна табела С5

  7. 7.

    Додатна табела С6

Речник

2-ДГ

2-deoxy-D-glucose

АА

amino acid

АБЦ

ATP-binding cassette

AcCs

acylcarnitines

АДП

adenosine diphosphate

АТП

аденозин трифосфат

anti-CD24-PE-Cy7

antibody-CD24-R-phycoerythrin-cyanine dye7

anti-CD44-APC

antibody-CD44-allophycocyanin

Arg

Arginine

BCSC

breast cancer stem cell

бФГФ

основни фактор раста фибробласта

CD24

cluster of differentiation 24

CD44

cluster of differentiation 44

ЦСЦ

cancer stem cell

DMEM

Dulbecco's Modified Eagle Medium

Doxo

doxorubicin

ДТТ

дитиотреитол

ЕГФ

фактор раста епидерме

EMRT

exact mass retention time cluster

ЕТЦ

electron transport chain

FA

fatty acid

G6PDH

glucose 6-phosphate dehydrogenase

GC–MS

gas-chromatography mass spectrometry

Gly

glycine

HIF-1α

hypoxia-inducible factor 1α

Његов

histidine

IPA

Ingenuity Pathway Analysis

ЛЦ-МС / МС

liquid chromatography tandem mass spectrometry

ЛДХ

лактат дехидрогеназе

LDH-A

lactate dehydrogenase A

NAD

nicotinamide adenine dinucleotide

NADP

nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

ПК

pyruvate kinase

PKM2

pyruvate kinase M2

ПМСФ

phenylmethylsulfonyl fluoride

RLU

relative light units

РОС

реактивне врсте кисеоника

SDAC

spheroid-derived adherent cell

ТЦА

tricarboxylic acids cycle

Вал

valine

ВБ

western blotting

Додатне информације прате овај рад на веб локацији Целл Деатх анд Дисеасе (//ввв.натуре.цом/цддис)