Ц2238 / αанп модулира аполипопротеин е кроз егр-1 / мир199а у васкуларним ћелијама глатких мишића ин витро | ћелијска смрт и болест

Ц2238 / αанп модулира аполипопротеин е кроз егр-1 / мир199а у васкуларним ћелијама глатких мишића ин витро | ћелијска смрт и болест

Anonim

Субјекти

  • Атеросклероза
  • Ћелијска сигнализација
  • Експресија гена
  • Липопротеини

Апстрактан

Субјекти који носе варијанту гена Т2238Ц за АНП имају већи ризик да доживе мождани удар или инфаркт миокарда. Механизми помоћу којих Т2238Ц / α АНП врши штетне васкуларне ефекте потребно је у потпуности разјаснити. У овом раду смо желели да истражимо утицај Ц2238 / α АНП (мутирани облик) на путеве повезане са атеросклерозом. Као први корак, извршена је макроарраи анализа експресије гена за атеросклерозу у васкуларним ћелијама глатких мишића (ВСМЦ) изложених или Т2238 / α АНП (дивљи тип) или Ц2238 / α АНП. Главни налаз је био да је експресија гена за аполипопротеин Е ( АпоЕ ) значајно смањена Ц2238 / α АНП и да је регулисана Т2238 / α АНП. Накнадно смо открили да Ц2238 / α АНП индукује смањивање АпоЕ кроз натриуретски пептидни рецептор типа Ц (НПР-Ц) који укључује урегулацију миР199а-3п и миР199а-5п и смањивање ДЊА4. У ствари, НПР-Ц решавање проблема спасило је ниво АпоЕ. Појачавање миР199а НПР-Ц посредовано је повећањем реактивног фактора транскрипције протеина-1 (Егр-1) који зависи од реактивног кисеоника. У ствари, Егр-1 обустава укинула је утицај Ц2238 / α АНП на АпоЕ и миР199а. Треба напоменути да је смањивање АпоЕ помоћу Ц2238 / α АНП повезано са значајним повећањем упале, апоптозе и некрозе које је у потпуности спасило егзогена примена рекомбинантног АпоЕ. Закључно, наша студија је сецирала нови механизам оштећења васкуларног оштећења изазван Ц2238 / α АНП који је посредован редукцијом АпоЕ. Ми пружамо прву демонстрацију да Ц2238 / α АНП снижава АпоЕ у ВСМЦс активирањем Егр-1 зависним од НПР-Ц и последичном урегулацијом миР199а. Обнављање нивоа АпоЕ могао би представљати потенцијалну терапијску стратегију за сузбијање штетних ефеката Ц2238 / α АНП.

Главни

Атријски натриуретски пептид (АНП) игра важне цитопротективне кардиоваскуларне функције, попут антихипертрофичних, антипролиферативних и просурвивалних ефеката у кардиомиоцитима, ћелијама глатких мишића васкула (ВСМЦс), фибробластима и ендотелним ћелијама. 1 Недавни рад показао је да је молекуларна варијанта α АНП (Ц2238 / α АНП), за коју је карактеристично Ц-терминално продужење пептида са два остатка аргинина и секундарна је супституцији тимина цитозином на положају 2238 од ген АНП , делује штетно на васкуларне ефекте. У ствари, ми и друге групе раније смо показали да субјекти који носе варијанту гена Т2238Ц за АНП имају значајно већи ризик од можданог удара или инфаркта миокарда и показују значајно повећање циркулирајућих маркера активације леукоцита. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 Свеукупно, овај доказ наглашава потребу за проналажењем терапијских циљева за спречавање или смањење штетних ефеката варијанте гена Ц2238 / α АНП, што је релативно често у општој популацији. Међутим, ово је могуће само ако се у потпуности разјасне молекуларни механизми преко којих Ц2238 / α АНП погодује развоју васкуларне дисфункције, атеросклерозе и кардиоваскуларних несрећа.

Раније смо извештавали да Ц2238 / α АНП молекуларна варијанта подстиче ћелијску апоптозу, некрозу и оксидативни стрес, док смањује ћелијску пролиферацију, ангиогенезу и вазодилатацију. 9, 10, 11 Механички смо открили да су штетни ефекти варијанте Ц2238 / α АНП посредовани дерегулираном активацијом натриуретског пептидног рецептора типа Ц (НПР-Ц) са последичним смањењем нивоа цАМП и активности ПКА. 10, 11 Откривено је да је ненормална активација НПР-Ц повезана са смањењем пута Акт / еНОС и повећањем активности реактивних кисикових врста (РОС) из НАДПХ оксидазе у ендотелним ћелијама. 9, 10 Поред тога, епигенетски феномен који укључује миР21 значајно је допринео штетним ефектима Ц2238Ц / α АНП на ћелијску одрживост и функционисање у ВСМЦ. 11 Међутим, ови молекуларни механизми могу само објаснити штетна својства Ц2238 / α АНП на стабилност атеросклеротске плоче. Са друге стране, интеракција Ц2238 / α АНП са више гена / протеина директно повезаних са атеросклеротским процесом остаје непозната. Ова последња могућност је подржана познатим учешћем натриуретичких пептида у атеросклерози. 1

Из тог разлога, спровели смо анализу генске експресије макроарраи у ВСМЦ-у, кључном ћелијском елементу у развоју атеросклерозе 12 и циљу АНП, 1 да бисмо истражили потенцијални утицај Т2238Ц / α АНП на механизме који стоје на основи атеросклерозе. Открили смо да Ц2238 / α АНП индукује значајну редукцију експресије гена аполипопротеин Е ( АпоЕ ), кодирајући познати антиатеросклеротски и противупални протеин, активацијом сигналног пута НПР-Ц / Егр-1 / миР199а / ДНАЈА4 који овде сецирамо први пут. Откривено је да је за смањење регулације АпоЕ одговорна штетна станична абнормалност изазвана Т2238Ц / α АНП у ВСМЦ.

Резултати

Диференцијална експресија АпоЕ гена у ВСМЦ индукована ТТ2238 / α АНП и ЦЦ2238 / α АНП

Профил експресије гена за атеросклерозу ћелија глатких мишића пупчане вене (ХУВСМЦ) изложених било ТТ2238 / α АНП или ЦЦ2238 / α АНП, у поређењу са несимулираним ћелијама, приказан је у Табели 1. Међу низовима који су били значајно и различито регулисани (бар 5 пута) од два α АНП облика, АпоЕ ген је значајно смањен ЦЦ2238 / α АНП, док је видно стимулисан ТТ2238 / α АНП. Резултате макроарраи смо потврдили показујући да су и ниво АПЕ мРНА и протеина експресије протеина смањени у оба ХУВСМЦ (слике 1а и б) и СМЦ коронарних артерија (ЦАМСЦс) (слике 1ц и д) ЦЦ2238 / α АНП, док су их регулирали ТТ2238 / α АНП. Пошто је познато да АпоЕ врши критичне антиатеросклеротске и противупалне акције, 13 одлучили смо да проценимо да ли смањивање АпоЕ посредује штетним ефектима ЦЦ2238 / α АНП.

Табела пуне величине

Image

Диференцијална регулација нивоа мРНА АпоЕ и протеина помоћу ТТ2238 / α АНП и ЦЦ2238 / α АНП у ХУВСМЦ и ЦАМСЦс. Резултати РТ-ПЦР ( а и ц ) и западног блотирања ( б и д, са одговарајућом дензитометријском анализом) за нивое експресије АпоЕ у ХУВСМЦ (горњи део) и у ЦАСМЦ (доњи део). Резултати су изражени као средња вредност ± СД Број независних експеримената = 6. Δ П <0, 005 за ТТ2238 / α АНП у односу на ЦТР. ** П <0, 0001 за ТТ2238 / α АНП насупрот ЦЦ2238 / α АНП ( а и б ) и за ЦЦ2238 / α АНП насупрот и ЦТР и ТТ2238 / α АНП ( б и д ). ЦЦ2238 / α АНП, варијанта α АНП; ТТ2238 / α АНП, дивљи тип α АНП; ЦТР, контрола

Слика пуне величине

ЦЦ2238 / α АНП индукује смањивање АпоЕ путем механизама зависних од НПР-Ц повезаних са регулацијом миР199а

Затим смо сецирали механизме преко којих ЦЦ2238 / α АНП индукује редукцију АпоЕ експресије. Претходни рад из наше лабораторије показао је да ЦЦ2238 / α АНП изазива штетне васкуларне ефекте дерегулираном активацијом НПР-Ц. 10, 11 Стога смо истражили да ли НПР-Ц посредује ефекте ЦЦ2238 / α АНП на нивое експресије АпоЕ. Наши резултати потврдили су ову хипотезу, јер смо открили да је пад НПР-Ц спасио ниво експресије АпоЕ у ХУВСМЦ и ћелијама глатких мишића коронарне артерије (ЦАСМЦ) изложених ЦЦ2238 / α АНП (слике 2а и 3а).

Image

Ц2238 / α АНП индукује смањивање АпоЕ путем механизама зависних од НПР-Ц повезаних са регулацијом миР199а и Егр-1 у ХУВСМЦ. ( а ) Анализа помоћу РТ-ПЦР и западним мрљањем нивоа АпоЕ експресије на ЦЦ2238 / α АНП у НПР-Ц нису утихнуте и утихнуте ћелије. ** П <0, 0001 за ЦЦ2238 / α АНП у односу на све остале узорке. ( б ) миР199а-3п, миР199а-5п, ДННА4 мРНА нивоа било под ТТ2238 / α АНП или ЦЦ2238 / α АНП (горњи део панела) и у НПР-Ц нису утихнуте и утихнуте ћелије под ЦЦ2238 / α АНП (доњи део панела). За добијање пригушивања гена НПР-Ц коришћене су две специфичне сиРНА. ** П <0, 0001 за ЦЦ2238 / α АНП насупрот ТТ2238 / α АНП и ЦТР. Δ П <0, 005 за ТТ2238 / α АНП насупрот ЦТР и за ЦЦ2238 / α АНП насупрот ЦТР (миР199а-3п и миР199а-5п). ( ц ) Репрезентативно западно брисање Егр-1, са одговарајућом дензитометријском анализом било под ТТ2238 / α АНП или ЦЦ2238 / α АНП изложеношћу (лева страна) и испод ЦЦ2238 / α АНП у НПР-Ц, а нису утихнуте и утихнуте ћелије (десна страна) . ** П <0, 0001 за ЦЦ2238 / α АНП у односу на све остале узорке. Резултати су изражени као средња вредност ± СД Број независних експеримената = 6. ЦЦ2238 / α АНП, варијанта α АНП; ТТ2238 / α АНП, дивљи тип α АНП; сиРНА1, НПР-Ц пригушивач гена 1; сиРНА2, НПР-Ц пригушивач гена 2; хса-миР199а, људска микроРНА199а; Егр-1, протеин раног одговора-1; ЦТР, контрола

Слика пуне величине

Image

Ц2238 / α АНП индукује смањивање АпоЕ путем механизама зависних од НПР-Ц повезаних са регулисањем миР199а и Егр-1 у ЦАСМЦ-има. ( а ) Анализа помоћу РТ-ПЦР и западним мрљањем нивоа АпоЕ експресије на ЦЦ2238 / α АНП у НПР-Ц нису утихнуте и утихнуте ћелије. ** П <0, 0001 за ЦЦ2238 / α АНП у односу на све остале узорке. ( б ) миР199а-3п, миР199а-5п, ДННА4 мРНА нивоа било под ТТ2238 / α АНП или ЦЦ2238 / α АНП (горњи део панела) и у НПР-Ц нису утихнуте и утихнуте ћелије под ЦЦ2238 / α АНП (доњи део панела). За добијање пригушивања гена НПР-Ц коришћене су две специфичне сиРНА. ** П <0, 0001 за ЦЦ2238 / α АНП насупрот ТТ2238 / α АНП и ЦТР. Δ П <0, 005 за ТТ2238 / α АНП насупрот ЦТР и за ЦЦ2238 / α АНП насупрот ЦТР (миР199а-3п и миР199а-5п). ( ц ) Репрезентативно западно брисање Егр-1, са одговарајућом дензитометријском анализом било под ТТ2238 / α АНП или ЦЦ2238 / α АНП изложеношћу (лева страна) и испод ЦЦ2238 / α АНП у НПР-Ц, а нису утихнуте и утихнуте ћелије (десна страна) . ** П <0, 0001 за ЦЦ2238 / α АНП у односу на све остале узорке. Резултати су изражени као средња вредност ± СД Број независних експеримената = 6. За скраћенице погледајте Слику 2

Слика пуне величине

Треба напоменути да су претходни докази показали да су нивои експресије АпоЕ епигенетички регулисани миР199а-3п и миР199а-5п, који заузврат могу директно циљати на АпоЕ или циљати протеин топлотног удара ДНАЈА4, који поспешује регулацију АпоЕ. 14 У складу са овим доказима, открили смо да су нивои експресије миР199а-3п и миР199а-5п значајно регулисани ЦЦ2238 / α АНП, док их ТТ2238 / α АНП смањује. С друге стране, ниво експресије ДНАЈА4 резултирао је смањењем вредности ЦЦ2238 / α АНП, док је у ћелијама изложеним ТТ2238 / α АНП био непромењен (слике 2б и 3б). Занимљиво је да смо приметили да је пад НПР-Ц спасио ниво експресије миР199а-3п, миР199а-5п и ДНАЈА4 у обе ВСМЦ линије третиране ЦЦ2238 / α АНП (слике 2б и 3б). Ови подаци сугерирају да НПР-Ц регулише ниво АпоЕ кроз регулацију миР199а-3п, миР199а-5п и ДНАЈА4.

НПР-Ц регулише миР199а путем РОС-зависне активације протеина-1 раног одговора (Егр-1)

Затим смо покушали да разјаснимо механизме сигнализације помоћу којих НПР-Ц промовише регулацију миР199а-3п и миР199а-5п, смањивање ДНК44 и на крају смањивање нивоа АпоЕ експресије као одговор на ЦЦ2238 / α АНП. Раније је пронађено да транскрипциони фактор Егр-1 поспешује регулацију миР199а. 15 Поред тога, Егр-1 се често активира у васкулатури током стреса и описано је да укључује у атеросклеротски процес. 16 Стога смо проценили да ли је Егр-1 укључен у регулацију миР199а-3п и миР199а-5п зависну од НПР-Ц и као одговор на ЦЦ2238 / α АНП. Открили смо да је Егр-1 регулисан као одговор на ЦЦ2238 / α АНП и тај ефекат је поништен падом НПР-Ц (слике 2ц и 3ц). Познато је да АНП ЦЦ2238 / α индукује активирање НАДПХ оксидазе зависне од НПР-Ц и производњу РОС. 9, 10 Егр-1 може да активира РОС. 17 У складу са тим, открили смо да је Ц2238 / α АНП-зависна регулација Егр-1 била појачана апоцинином, инхибитором НАДПХ оксидазе (допунска слика С1). Најзад, открили смо да је пад Егр-1 нормализовао ниво миР199а и ДНАЈА4 и блокирао смањивање АпоЕ у обе ВСМЦ линије третиране ЦЦ2238 / α АНП (слика 4). Свеукупно, ови подаци показују да ЦЦ2238 / α АНП доводи до повећања миР199а и смањења АпоЕ у ВСМЦ-ом кроз производњу РОС-а зависног од НПР-Ц, што заузврат доводи до активирања Егр-1.

Image

Утицај ушуткивања гена Егр-1 на АпоЕ регулаторни пут у ХУВСМЦ и ЦАМСЦс. ( а ) Утицај пригушивања гена Егр-1 на нивое експресије Егр-1, миР199-3п, миР199-5п, ДНАЈА4 (што је детектовано РТ-ПЦР) и на нивое АпоЕ експресије (што је откривено и РТ-ПЦР и западним блоттингом) ) у ХУВСМЦ. За добијање поремећаја гена Егр-1 коришћене су две специфичне сиРНА. ( б ) Утицај пригушивања гена Егр-1 на нивое експресије Егр-1, миР199-3п, миР199-5п, ДНАЈА4 (као што је детектирано помоћу РТ-ПЦР) и на нивое АпоЕ експресије (као што су откривени и РТ-ПЦР и западни блот) у ЦАСМЦ-овима. Резултати су изражени као средња вредност ± СД Број независних експеримената = 4 за сваку ћелијску линију. ** П <0, 0001 за ЦЦ2238 / α АНП у односу на све остале тачке. сиРНА1, Егр-1 пригушивач гена 1; сиРНА2, Егр-1 пригушивач гена 2; за остале скраћенице видети слике 2 и 3

Слика пуне величине

ЦЦ2238 / α АНП модулира апоптозу, некрозу и упалу у ВСМЦс редукцијом АпоЕ зависне од НПР-Ц

Затим смо проценили биолошки значај редукције регулације АпоЕ у ћелијама изложеним ЦЦ2238 / α АНП. Додатне слике С2 и С3 приказују резултате западњачке блот анализе како би се проценио нивои експресије одцепљене каспазе-3, ћелијског репрепресора гена стимулисаног Е1А (ЦРЕГ), и фосфорилираних и укупних облика ЈНК и п38МАПК у ХУВСМЦ (допунска слика С2 ) и у ЦАСМЦ (допунска слика С3) у присуству ЦЦ2238 / α АНП. Одцепљена каспаза-3 повећана је ЦЦ2238 / α АНП (допунске слике С2А и С3А). С друге стране, експресија ЦРЕГ-а, антиапоптотског фактора, је смањена (допунске слике С2Б и С3Б). У складу са претходним истраживањима која показују да ЦРЕГ инхибира ВСМЦ апоптозу кроз инхибицију п38МАПК и ЈНК сигналних путева, 18 приметили смо паралелно повећану фосфорилацију и п38МАПК и ЈНК у оба ХУВСМЦ и ЦАСМЦс третирана са ЦЦ2238 / α АНП у поређењу са контролним ћелијама (допунска Слике С2Ц, Д, С3Ц и Д). Напомињемо да је НПР-Ц уништење у потпуности спасило ефекте АНП ЦЦ2238 / α на одцепљену каспазу-3, фосфо-п38МАПК, фосфоЈНК и ЦРЕГ. Ћелијски нивои НФ- κ Б и Смад4, познатих маркера упале, такође су значајно порасли и за ХУВСМЦ и за ЦАСМЦ изложене ЦЦ2238 / α АНП (допунске слике С2Е, Ф, С3Е и Ф). Пригушивање гена НПР-Ц спречило је повећање и НФ- κ Б и Смад4 упркос присуству ЦЦ2238 / α АНП у обе ВСМЦ линије (допунске слике С2Е, Ф, С3Е и Ф). Све у свему, ови налази показују да Ц2238 / α АНП индукује апоптозу и упалу у ВСМЦ путем механизама зависних од НПР-Ц.

Треба напоменути да смо открили да су ови механизми посредовани смањивањем АпоЕ. Пре свега, анализа секвенцирања открила је да ХУВСМЦ изражавају АпоЕ изоформе 2 и 3 (АПОЕ2 / АПОЕ3) док ЦАСМЦ изражавају АпоЕ изоформу 3 и 4 (АПОЕ3 / АПОЕ4) (допунска слика 4). Оно што је још важније, открили смо да је обнављање нивоа АпоЕ у оба ХУВСМЦ (слика 5а) и ЦАСМЦ (слика 5б) третирано ЦЦ2238 / α АНП кроз истодобну егзогену примену одговарајућег рекомбинантног изоформ АпоЕ успело да спаси одрживост ћелије, што је било значајно ослабљен само ЦЦ2238 / α АНП у поређењу са необрађеним ћелијама. Примјена АпоЕ значајно је смањила и рану и касну апоптозу и некрозу индуковану ЦЦ2238 / α АНП. Поред тога, ВСМЦ показали су значајно смањење упале под излагањем рекомбинантном АпоЕ упркос присуству ЦЦ2238 / α АНП (слика 6).

Image

Утицај рекомбинантног АпоЕ на виталност ћелије у присуству ЦЦ2238 / α АНП и у ХУВСМЦ ( а ) и у ЦАСМЦс ( б ) ћелије су истовремено изложене рекомбинантном АпоЕ и ЦЦ2238 / α АНП. На крају стимулације ћелијска одрживост је анализирана помоћу ФАЦС. Свака плоча с сликама приказује репрезентативне плоче распршивања за свако експериментално стање (лева страна) и одговарајућу дензитометријску анализу (десна страна). Резултати су изражени као средња вредност ± СД Број независних експеримената = 3 за сваку АпоЕ изоформу. ** П <0, 0001 за ЦЦ2238 / α АНП у односу на све остале тачке. ЦЦ2238 / α АНП, варијанта α АНП; ЦТР, контрола; ПИ, пропидијум јодид; АпоЕ, аполипопротеин Е; ЦТР, контрола

Слика пуне величине

Image

Утицај рекомбинантног АпоЕ на маркере упале у присуству ЦЦ2238 / α АНП у оба ХУВСМЦ ( а ) и ЦАСМЦ ( б ). Ћелије су истовремено изложене рекомбинантном АпоЕ и ЦЦ2238 / α АНП. Двадесет и четири сата након завршетка стимулације, укупни протеини су анализирани на маркере упале Вестерн блот-ом. ( а ) Репрезентативни западни део Нф- κ Б и Смад4, са одговарајућом дензитометријском анализом, у ХУВСМЦ. ( б ) Репрезентативни западни део Нф- κ Б и Смад4, са одговарајућом дензитометријском анализом, у ЦАСМЦ-у. Подаци су изражени као средња вредност ± СД Број независних експеримената = 3 за сваки АпоЕ изоформ. ** П <0, 0001 за ЦЦ2238 / α АНП у односу на све остале тачке. ЦЦ2238 / α АНП, варијанта α АНП; АпоЕ, аполипопротеин Е; ЦТР, контрола

Слика пуне величине

Дискусија

Варијанта гена АНП Т2238Ц / α је нови непроменљиви фактор кардиоваскуларног ризика. У ствари, субјекти који носе ову генетску варијанту имају већи ризик од појаве кардиоваскуларних нежељених догађаја, попут можданог удара и инфаркта миокарда. Поред тога, ови испитаници показују знакове ендотелне дисфункције већ у младој доби. Овде смо анализирали утицај варијанте гена Т2238Ц / α АНП на механизме повезане са атеросклерозом. Открили смо да Ц2238 / α АНП значајно смањује експресију АпоЕ гена у ВСМЦ путем механизама зависних од НПР-Ц. Такође смо показали да Ц2238 / α АНП овај ефекат игра селективном епигенетском регулацијом АпоЕ која укључује Егр-1 и две мале некодирајуће РНА (миР199а-3п и миР199а-5п). Оно што је најважније, пружили смо доказе да се штетни ефекти изазвани оси Ц2238 / α АНП – НПР-Ц у ВСМЦ-овима, попут повећане стопе апоптозе, некрозе и упале, могу у потпуности опоравити рекомбинантним додавањем протеина АпоЕ (слика 7).

Image

Схематски приказ путање која укључује НПР-Ц, Егр-1, миР199а-3п и миР199а-5п на АпоЕ модулацији на ЦЦ2238 / α АНП изложености у ВСМЦ. Позитивни ефекти суплементације АпоЕ ВСМЦ-ом, упркос изложености ЦЦ2238 / α АНП, подржавају снажан допринос овог пута у промоцији васкуларних оштећења кроз коначну редукцију АпоЕ. Ц2238 / α АНП, варијанта α АНП; НПР-Ц, натриуретски пептидни рецептор типа Ц; РОС, реактивне врсте кисеоника; Егр-1, протеин раног одговора-1; миР199а, мицроРНА199а; ЦРЕГ, ћелијски репрепресор гена стимулисаног Е1А; ЈНК, ц-јун Н-терминална киназа

Слика пуне величине

Ови подаци значајно проширују наше претходне доказе који показују да Ц2238 / α АНП индукује смрт ендотелне ћелије и оксидативни стрес, смањује ангиогенезу и потиче ендотелну дисфункцију кроз дерегулирану активацију сигнала НПР-Ц / цАМП и смањење пута ПКА / Акт / еНОС. 9, 10 Поред тога, недавно смо открили да Ц2238 / α АНП повећава оксидативни стрес и ћелијску миграцију и подстиче вазоконстрикцију путем сигналног пута НПР-Ц / цАМП / ПКА / ЦРЕБ / миР21. 11 Тренутна студија показује по први пут директан утицај Ц2238 / α АНП на механизме који стоје на бази атеросклерозе у ВСМЦ-у, кључни елемент у овом процесу. У ствари, Ц2238 / α АНП индукује значајну смањивање АпоЕ која игра важну улогу у развоју атеросклерозе. 19, 20 АпоЕ је протеин од 34 кДа који учествује у мобилизацији и дистрибуцији холестерола и других липида међу разним ткивима у телу. 20 Познато је да недостатак АпоЕ сам поспешује развој атеросклеротичних плакова аорте код мишева. Претходне студије су показале да АпоЕ делује и на плеиотропне антиатеросклеротске и противупалне ћелијске ефекте. Претходно је пронађено да се АпоЕ експримира у ВСМЦ-има где је снижење регулације АпоЕ позитивно повезано са типичним маркерима упале као што су Смад4 22 и НФ- κ Б. 23 Поред тога, АпоЕ омета протуупалне функције инфламаторних ћелија. 24 Код људи, где је недостатак АпоЕ редек, ризик од атеросклерозе је снажно повезан са три уобичајена апоЕ изоформа реда АПОЕ4> АПОЕ3> АПОЕ2. Поред тога, познато је да АпоЕ игра улогу у развоју кардиоваскуларних и неуролошких болести. 26 Стога, наша студија може сугерисати да Ц2238 / α АНП индукује ћелијске неправилности инхибицијом горе описаних плеиотропних ефеката АпоЕ. Штавише, пошто су виши нивои миелопероксидазе пријављени код мишева Апо - / - 27, можемо претпоставити да се Ц2238 / α АНП може, бар делимично, повезати са вишим нивоима мијелопероксидазе, као што је раније објављено код пацијената са коронарном артеријом, 4, захваљујући њеној способности да смањи експресију гена АпоЕ.

С друге стране, наши тренутни резултати показују да дивљи тип АН АН може да испољава физиолошке антиатеросклеротске ефекте урегулирањем нивоа АпоЕ. Ову могућност подржавају претходни докази који сугеришу блиску везу натриуретичких пептида (НП) и атеросклерозе. У ствари, НП су значајно израженији у људским коронарним експлантима узнапредовалих атеросклеротских лезија. 28 Инхибиција разградње НП инхибитором НЕП кандоксатрил спречила је масно наслађивање на моделу кунића. 29 Нивои циркулације НП повећавају се паралелно са порастом стенозе коронарног плака и достижу ниво платоа на највишем степену стенозе посуда. 30

Значајно је да је ранији рад показао да атеросклероза расте на животињском моделу коме недостају и НПР-А и АпоЕ (Нпр1 - / - АпоЕ - / - мишеви), 31 сугеришући да недостатак НПР-А може да индукује раст ВСМЦ путем сигнализације других рецептора, дакле појачавајући негативне васкуларне ефекте услед недостатка АпоЕ.

Још један оригинални налаз наше студије је демонстрација да Ц2238 / α АНП индукује смањивање АпоЕ путем регулације Егр-1 зависне од НПР-Ц. Овај ефекат је посредован активношћу НАДПХ оксидазе, пошто је апоцинин укинуо ефекте Ц2238 / α АНП на активацију Егр-1. Колико знамо, ово је први пут да се негативна епигенетска регулација АпоЕ од стране Егр-1 показује у васкуларном контексту. Овај налаз такође проширује претходне доказе који заговарају улогу активације Егр-1 у развоју атеросклерозе и може сугерисати да активација Егр-1 може допринети атеросклерози путем смањивања АпоЕ. Занимљиво је да је ранији рад показао да је атеросклероза редукована двоструким нокаутом модела Егр-1 и АпоЕ мишева, у поређењу са оним који је примећен само у АпоЕ - / - кноцкоут моделу, што сугерира да недостатак Егр-1 штити у одсуству од АпоЕ. 32 Наша студија проширује овај доказ показујући да Егр-1 може бити узводно од АпоЕ, негативно регулишући његову експресију.

Треба напоменути да смо открили да активирање Егр-1 помоћу Ц2238 / α АНП потиче повећање регулације миР199а-3п и миР199а-5п, потврђујући на тај начин претходне налазе који показују да Егр-1 регулише миР199а. Ови подаци сугерирају да Егр-1 може епигенетички регулисати АпоЕ кроз ова два микроРНА (миРНА). У ствари, Пенцхева и др. 14 су недавно показали да миР199а-3п и миР199а-5п регулишу формирање метастаза меланома кроз смањивање нивоа АпоЕ. Аутори су открили да ове миРНА могу било циљати АпоЕ директно или индиректно инхибирати ниво АпоЕ кроз циљање ДНАЈА4, протеина топлотног удара који стимулише ниво АпоЕ. У складу са овим доказима, такође смо открили да сигнализација Ц2238 / α АНП / НПР-Ц / Егр-1 / миР199а промовише смањивање нивоа ДНАЈА4.

Очекивано, ови налази потврђују расположиве доказе који разјашњавају улогу миРНА у патогенези ВСМЦ абнормалности и васкуларних болести уопште. С тим у вези, раније смо открили да дисрегулација миР21 доприноси ВСМЦ дерангирању након стимулације Ц2238 / α АНП. 11 Поред тога, недавно је откривено да регулација миР23б у повређеној васкуларној стијенци модулира ВСМЦ фенотипску промену укључивањем и СМАД3 и ФОКСО4. 33 У целини, ови докази подржавају сазнање да епигенетски механизми који зависе од миРНА могу на високо интегративан начин регулисати патогенезу људских болести.

Претходне испоруке хуманог АпоЕ3 интрамускуларном ињекцијом плазмида и аденовируса, 34 синтетским аполипопротеин миметичким пептидима 35 или помоћу ћелијске платформе, 36 су инхибирале развој атеросклеротичних лезија. Прво смо проценили специфичну АпоЕ изоформу изражену двема ВСМЦ линијама коришћеним у нашим студијама, о којима раније није било извештаја. Сходно томе, приметили смо пуне користи од изложености ВСМЦ специфичној рекомбинантној АпоЕ изоформи, упркос присуству Ц2238 / α АНП. Плеиотропни ефекти АпоЕ могу добро објаснити наше резултате, пошто је овај протеин атеропротективан не само својим дејством на смањење липида, већ и антиоксидативним и противупалним активностима. 19 Корисни резултати добијени третманом АпоЕ оштећених ВСМЦ изложених Ц2238 / α АНП указују на потенцијалну кључну улогу ове молекуле у лечењу атеросклерозе код испитаника са Ц2238 / α АНП варијантом, мада за клиничку примену још увек постоји неколико ограничења.

Укратко, извештавамо о првим доказима новог механизма васкуларне болести код ВСМЦ-а посредованих НПР-Ц, који укључују Егр-1 и две мале некодирајуће РНК, што у коначници доводи до смањења АпоЕ, у присуству варијанте гена Ц2238 / α АНП, настајући фактор кардиоваскуларног ризика. Ова новооткривена каскада трансдукције доприноси широком спектру оштећења васкуларних деловања услед Ц2238 / α АНП која су у супротности с познатим корисним својствима дивљег типа АН АНП. Штавише, наша нова открића откривају непозната плеиотропна дејства НПР-Ц у васкуларним ћелијама кроз његово учешће у епигенетској регулацији васкуларних антиатеросклеротских протеина, попут аполипопротеина Е.

Материјали и методе

Стимулација ХУВСМЦ са ТТ2238 и ЦЦ2238 / α АНП и РНА екстракцијом за анализу макрораста атеросклерозе

Комерцијално доступни ХУВСМЦ стимулисани су било синтетским дивљим типом (ТТ2238) или мутантом (ЦЦ2238) / α АНП у крајњој концентрацији од 10 9 мол / л током 12 х, као што је претходно описано. 9, 10, 11 Контролне плоче су добиле медијум без АНП-а. Извршена су три експеримента. Укупна РНА, добијена на крају стимулације, коришћена је за синтезу цДНА, а затим и за анализу макрораста. Потврда гена АпоЕ гена и протеинске модулације на ЦЦ2238 / α АНП и ТТ2238 / α АНП је накнадно добијена у независним експериментима у ХУВСМЦс и такође у ЦАСМЦ (број експеримената = 6 за сваку ћелијску линију) помоћу РТ-ПЦР, заснованог на СИБР Греен методологији, и западним упијањем укупних протеина.

Утицај утишања гена НПР-Ц на модулацију АпоЕ гена и протеина на ЦЦ2238 / α АНП

Стимулација ХУВСМЦ и ЦАСМЦ са ЦЦ2238 / α АНП је поновљена и у присуству и у одсуству НПР-Ц (број експеримената = 6) да би се верификовала улога овог рецептора у посредовању ефеката ЦЦ2238 / α АНП на АпоЕ ген и нивои експресије протеина, према нашим претходним извештајима. 10, 11

Улога активирања миРНА199а-3п и миРНА199а-5п зависне од НПР-Ц и модулације АпоЕ ЦЦ2238 / α АНП. Укључивање Егр-1

Да би се проверило да ли је позната епигенетска модулација АпоЕ, зависна од миРНА199а-3п и 199а-5п, 14 играла улогу у нашем експерименталном контексту, укупна РНА, извађена из оба НПР-Ц, није утихнута и утихнута ХУВСМЦс и ЦАСМЦ, је пречишћена да се изолује мале РНК помоћу комерцијално доступног комплета. За РТ-ПЦР ДНАЈА4 кориштен је познати циљ миРНА199а, 14 а ТакМан тест експресије гена. Затим, на основу претходног сазнања да су нивои експресије миРНА199а модулирани Егр-1, 15, процијенили смо ниво експресије протеина Егр-1 или на ТТ2238 / α АНП или ЦЦ2238 / α АНП западним блоттингом. Такође смо боље утврдили улогу Егр-1 у АпоЕ модулацији под ЦЦ2238 / α АНП додатним експериментима. Прво, позната улога оксидативног стреса на Егр-1 стимулацију 17 верификована је излагањем ВСМЦ-а ЦЦ2238 / α АНП и у одсуству и у присуству апоцинина (број експеримената = 3), следећих претходно описаних услова. Због тога је 9 нивоа експресије Егр-1 процењено западним блотирањем. Након тога, одређена је модулација и миРНА199а-3п и миРНА199а-5п, ДНАЈА4 и АпоЕ у ВСМЦ-у који су утишали Егр-1, изложени ЦЦ2238 / α АНП (број експеримената = 4).

Процена нивоа експресије цепане каспазе-3, ЦРЕГ, ЈНК, п38МАПК, Нф- к Бп65 и ТГФ β (Смад4) као маркера апоптозе, некрозе и упале на ЦЦ2238 / α АНП, у присуству и у одсуству НПР-Ц

Да би се проверило да ли је смањивање експресије АпоЕ у нашим експерименталним условима повезано, како се очекивало, са повећаном стопом апоптозе, некрозе и упале, анализирано је 13 укупних протеина коришћењем следећих специфичних примарних антитела: анти-цепана каспаза-3, анти-ЦРЕГ, анти-фосфоЈНК, анти-ЈНК, анти-фосфо-п38МАПК, анти-п38МАПК, анти-НФ κ Бп65, анти-Смад4, анти- П- актин. Потоњи је коришћен као протеин за одржавање. После инкубације са секундарним антителом коњугираним хрен пероксидазом, откривени су сигнали као што је описано у даљем тексту.

Утицај изложености рекомбинантном АпоЕ на виталност ћелије, апоптоза, некроза и упала у ХУВСМЦ и ЦАСМЦ у присуству ЦЦ2238 / α АНП

Да би се тестирала способност додавања АпоЕ-а да се спаси штетни ефекти изазвани ЦЦ2238 / α АНП, а на основу резултата секвенцирања специфичних АпоЕ изоформа изражених у две ћелијске линије, ХУВСМЦ-и су били изложени 12 х ЦЦ2238 / α АНП и било рекомбинантном АпоЕ2 или АпоЕ3 протеин (10 µг / мл; Сигма). ЦАМСЦ су били изложени ЦЦ2238 / α АНП и рекомбинантном АпоЕ3 или АпоЕ4 протеину (10 μг / мл; Сигма). Рекомбинантни протеини за АпоЕ су додавани у ВСМЦ као што је претходно описано. 37

Двадесет и четири сата након завршетка изложености ЦЦ2238 / α АНП и специфичне рекомбинантне АпоЕ изоформи, бројање апоптотских ћелија извршено је проточном цитометријском анализом (ФАЦС) и укупни протеини су екстраховани за анализу западног блотирања Нф- κ Бп65 и Смад4.

Експерименти су изведени у три примерка за сваки АпоЕ изоформу.

Култура ћелија

Комерцијално доступни ХУВСМЦ-ови, купљени од АТЦЦ (Америцан Типе Цултуре Цоллецтион; Манассас, ВА, УСА), узгајани су у Каигхновом медијуму Ф12 који садржи 2 мМ 1-глутамин, 1, 5 г / л натријум бикарбоната и допуњен 0, 1 мг / мл хепарина, 0, 03 мг / мл додатка за раст ендотелних ћелија, 10% говеђег серума фетуса. Комерцијално доступни ЦАСМЦ-ови (купљени од Лонза, Валкерсвилле, МД, САД) узгајани су у глатком мишићном расту средње (2) (СмгМ-2; Лонза). Четири шарже кориштене су за сваку станичну линију за обављање свих експеримената.

Ћелије су коришћене унутар петог прелаза и при 70% утоку. За стимулацију било са ТТ2238 или ЦЦ2238 / α АНП, посејане су у плоче са 24 јажице (8 × 10 4 ћелије / базенчић), узгајане у одговарајућем медију за раст током 24 сата, након чега су гладиране и стимулисане са α АНП у крајњој концентрацији од 10 9 мол / л током 12 х у присуству 10% серума фетуса телета. Контролне плочице су добиле медијум без АНП-а.

Тотална РНА екстракција

Укупна РНА добијена је користећи реагенс Тризол (Лифе Тецхнологиес, ​​Царлсбад, Калифорнија, САД), подвргнут третману ДНК И (Киаген, Венло, Холандија) и потом пречишћен коришћењем РНеаси Мини Кит (Киаген) према упутствима произвођача. Интегритет РНА је процењен денатурацијом електрофорезе гела од агарозе, а концентрација је верификована коришћењем НаноДроп2000ц УВ-Вис спектрофотометра (Тхермо Сциентифиц, Валтхам, МА, УСА).

РТ-ПЦР анализа макрораста

Обављена су три експеримента са сваким подражајем и РНА је сакупљена за анализу макроарраи-а. Два микрограма укупне РНА коришћена су за синтезу цДНА коришћењем РТ 2 Фирст Странд Кит (Киаген). Извели смо квантитативну РТ-ПЦР макрорезу анализу помоћу ПЦР арраи људске атеросклерозе РТ 2 купљеног од Киаген-а. Експерименти су изведени као што је претходно описано. 9 Укратко, цДНА предложак је помешан са оним који је спреман за употребу РТ 2 Реал ПЦ-ја у стварном времену Греен ПЦР Мастер Мик (Киаген). Изабрани низ садржи панел од 84 сета прајмера за гене са фокусом на путу (људска атеросклероза), пет гена за домаћинство и три контроле квалитета РНА и ПЦР. Смеша је аликвотована у сваку јажицу исте плоче која садржи предиспониране генско-специфичне секвенце прајмера и ПЦР је извршен на ВииА 7 ПЦР систему у стварном времену (Лифе Тецхнологиес). Експерименти су изведени у три примерка. Анализа података изведена је коришћењем веб портала за анализу података ПЦР Арраи (//ввв.суперарраи.-цом/пцрарраидатааналисис.пхп) и ΔΔЦт методом. 38 Резултати су изражени као релативни нивои сваке мРНА гена под утицајем ЦЦ2238 или ТТ2238 / α АНП који се односи на експресију овог гена у нестимулираним ћелијама (које су изабране да представљају 1к експресију сваког гена). Резултати су сматрани значајним када је експресија мРНА била 5 пута већа или нижа од оне нестимулиране ћелије.

Квантитативни РТ-ПЦР АпоЕ, НПР-Ц, Егр-1 (СИБР Греен методологија)

Два микролита цДНА су помешана са 5 μл СИБР Греен ПЦР мастер микса (Лифе Тецхнологиес) и 0, 5 μл специфичних прајмера: АпоЕ (напред 5 '-ГАГЦААГЦГГТГГАГАЦАГ-3' и реверзно 5 '-ЦАТЦАГЦГЦЦЦТЦАГТТЦЦ-3'); НПР-Ц (напријед 5 '-ГГААГАЦАТЦГТГЦГЦААТА-3' и натраг 5'-ГАТГЦТЦЦГГАТГГТГТЦА-3 '); Егр-1 (напријед 5 '-АЦЦГЦАГАГТЦТТТТЦЦТГАЦА-3' и натраг 5 '-ГГТГЦАГГЦТЦЦАГГГАААА-3').

П- Актин је коришћен као ген за одржавање (напред 5 '-ГЦААГАГАТГГЦЦАЦГГЦТГ-3' и реверзни 5 '-ЦАЦАГГАЦТЦЦАТГЦЦЦАГ-3'). РТ-ПЦР је спроведен у ВииА 7 ПЦР систему у реалном времену са бициклистичким условима од 50 ° Ц током 2 мин, 95 ° Ц током 10 минута, а затим 95 ° Ц током 15 с и 60 ° Ц током 60 с укупно од 40 циклуса. Мерења су извршена у три примерка у сваком тесту. Резултати су изражени као релативни нивои сваке мРНА гена у поређењу са контролним ћелијама.

Квантитативни РТ-ПЦР миРНА199а-3п, миРНА199а-5п, ДНАЈА4 (ТакМан методологија)

Укупна РНА је пречишћена да изолује мале РНК са одређеним китом (миРНеаси Мини Кит; Киаген) према упутствима произвођача. За синтезу цДНА миР199а-3п, миР199а-5п и контролни миРУ87, 1 μг прочишћене РНА је помешано са 3 μл НЦоде ВИЛО миРНА цДНА Кит за синтезу (Лифе Тецхнологиес) и 1 × РТ-прајмер (Лифе Тецхнологиес) у а укупна реакциона запремина 20 µл . Реакција је инкубирана на 16 ° Ц током 30 минута, 42 ° Ц током 30 минута и 85 ° Ц током 5 минута у Т-100 термалном бициклу (Био-Рад, Херцулес, ЦА, САД). Затим је додато 2 μл реакције РТ у 1 μл специфичног ТакМан МицроРНА теста 20 × (миР199а-3п, миР199а-5п, миРУ87; Лифе Тецхнологиес) и 10 μл ТакМан Универсал ПЦР Мастер Мик ИИ са УНГ (Лифе Тецхнологиес) у запремини од 20 μл . РТ-ПЦР је извршен коришћењем ВииА 7 ПЦР система у реалном времену са цикличним условима од 95 ° Ц у трајању од 10 минута, а затим 95 ° Ц током 15 с и 60 ° Ц током 60 с током укупно 40 циклуса. Сваки ТакМан тест изведен је у три примерка. Резултати су изражени као релативни нивои сваке миРНА под утицајем различитих третмана у односу на нестимулиране ћелије.

За РТ-ПЦР ДНАЈА4, 2 μл цДНА је помешано са 10 μл ТакМан Универсал Мастер Мик ИИ са УНГ и 1 μл ДНАЈА4 ТакМан тест експресије гена (Лифе Тецхнологиес) у крајњој запремини од 20 μл. П -Актин је коришћен као ген за одржавање. РТ-ПЦР је извршен коришћењем ВииА 7 ПЦР система у реалном времену са цикличним условима од 50 ° Ц током 2 мин, 95 ° Ц током 10 минута, а затим 95 ° Ц током 15 с и 60 ° Ц током 60 с, укупно 40 циклуса. Свако испитивање извршено је у три примерка. Резултати су изражени као нивои мРНА под утицајем различитих третмана у односу на нестимулиране ћелије.

Тотална екстракција протеина и западни блот

Укупни протеини су екстраховани из ћелија 24 сата након завршетка изложености ТТ2238 / α АНП или ЦЦ2238 / α АНП. Узорци су лизирани у 1: 10 тежина / запремина у пуферу за лизу (50 мМ НаЦл, 100 мМ Трис-ХЦл пХ 7, 4, 1 мМ етилендиаминететрацетне киселине (ЕДТА), 1% СДС) са додатком инхибитора протеазе и фосфатазе (Сигма Алдрицх, Саинт Лоуис, МО, САД), инкубирати на леду током 15 мин. и центрифугирано на 13 000 о / мин током 15 мин. Концентрација протеина одређена је ДЦ Протеин Ассаи Кит (Био-Рад) пратећи упутства произвођача. Лизати протеина су кувани на 95 ° Ц током 5 мин у присуству пуфера за пуњење гела (Био-Рад). Педесет микрограма сваког узорка стављено је на 10% СДС-полиакриламидни гел и покренуто је 120 мин на 100 В. Протеини су затим пренети на поливинилидене дифлуоридне мембране (ПВДФ; Био-Рад) коришћењем Транс-Блот Турбо Трансфер Систем (Био-Рад ). Неспецифична места везања блокирана су на собној температури током 1 х у 5% албумину говеђег серума у ​​Трис-пуферираном физиолошком пуферу са 0, 1% Твеен 20 (Сигма) (ТБС-Т). Membranes were incubated at 4 °C overnight with the following primary antibodies:

anti-ApoE (1 : 1000; Millipore, Temecula, CA, USA), anti-Egr-1 (1 : 1000; Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-phosphoJNK (1 : 200; Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA, USA), anti-JNK (1 : 200; Santa Cruz), anti-phospho-p38MAPK (1 : 200; Santa Cruz), anti-p38MAPK (1 : 200; Santa Cruz), anti-NF κ Bp65 (1 : 200; Santa Cruz), anti-cleaved caspase-3 (1 : 1000; Cell Signaling), anti-Smad4 (1:1000; Cell Signaling); anti-CREG (1:1000; R&D System, Minneapolis, MN, USA), anti- β -actin (1 : 1000; Santa Cruz).

Following three washes of 10 min in TBS-T, membranes were incubated for 1 h at room temperature with 1 : 5000 horseradish peroxidase-conjugated donkey anti-goat (for ApoE) or goat anti-mouse or goat anti-rabbit secondary antibodies diluted in TBS-T. After three washes of 10 min in TBS-T, signals were revealed with an enhanced chemiluminescence detection system (Luminata Crescendo; Millipore, Darmstadt, Germany) and the immunoreactivity of bands was visualized using ChemiDoc XRS+Imaging System (Bio-Rad). Protein bands were scanned and quantified densitometrically. They were finally normalized using β-actin levels.

NPR-C and Egr-1 gene silencing

NPR-C and Egr-1 gene silencing was performed with specific siRNAs (Mission siRNA; Sigma) by following conditions previously described. 10, 11 Twenty-four hours after transfection, both silenced and not silenced cells were exposed to CC2238/ α ANP for 12 h and subsequently extracted for total RNA and total proteins. Efficiency of gene silencing was assessed by RT-PCR, following conditions described above.

Role of oxidative stress in the Egr-1 induced increase by CC2238/ α ANP

The known role of oxidative stress on Egr-1 stimulation 17 was verified by exposing VSMCs to CC2238/ α ANP both in the absence and in the presence of apocynin, following conditions previously described. 9 Egr-1 expression levels were therefore assessed by western blotting.

Sequencing of apoE gene expressed in HUVSMCs and CASMCs

Genomic DNA was isolated from both HUVSMCs and CASMCs using a commercially available kit (Qiagen, Chicago, IL, USA). In order to identify the three allelic forms of human ApoE gene (allele ɛ2, ɛ3, ɛ4) PCR reactions were set up by using a specific pair of primers: forward 5′-CTCCCACTGTGCGACACC-3′, reverse 5′-CTGCTCCTTCACCTCGTCC-3′. DNA was first amplified by PCR with 40 cycles at an annealing temperature of 55 °C using a T-100 Thermal Cycler (Bio-Rad). Following purification of the PCR product (562 bp) with MinElute PCR purification kit (Qiagen), sequence reactions were prepared using the Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Unincorporated dye terminators from sequencing reactions were removed using DyeEx 2.0 Spin kit (Qiagen). Purified fragments were electrophoresed on an ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) according to the manufacturer's protocol. All sequencing results were compared with those present in the NCBI databases using BLAST to confirm the allelic variants.

Flow-cytometry analysis

Twenty-four hours after completion of exposure to CC2238/ α ANP and the specific recombinant ApoE isoform, counting of apoptotic cells was performed by FACS using Annexin V-Fitc and propidium iodide (PI) staining (ImmunoStep, Salamanca, Spain). For this purpose, cells were harvested by incubation with 1 ml of trypsin/EDTA (Lonza) for 3 min at 37 °C. Trypsinization was stopped by addition of medium and the suspension was centrifuged at 1200 rpm for 5 min at 4 °C. Each pellet was washed with cold phosphate-buffered saline (PBS 1 × ). Then, tubes were vortexed thoroughly and centrifuged again as before. Cells were gently resuspended and vortexed in binding buffer at a concentration of 3 × 10 6 cells/ml. Then, 100 μ l of cell suspension was added to 5 μ l of Annexin V and 10 μ l of PI. Samples were mixed for 15 min in the dark at 4 °C and 400 μ l of PBS 1x was added to the solution. Ten thousand cells were analyzed by FACS on a BD Accuri C6 flow cytometer (Biosciences, Erembodegem-Dorp, Belgium) to count apoptotic cells. Both negative control (untreated cells) and positive control (cells treated with hydrogen peroxide) were included in the analysis.

Статистичка анализа

Continuous variables are expressed as mean±SD Comparisons between two groups were performed using Student's t- test. When the analysis was adjusted for the multiplicity of compared groups, one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test was performed. Normality of variables distribution was tested by the Kolmogorov–Smirnov test. GraphPad Software (San Diego, CA, USA; version 5.0) and SPSS statistical software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA; version 12.0) were used for statistical analysis. П <0, 05 се сматра значајним.

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Додатне информације

Речник

Akt

protein kinase B

ApoE

apolipoprotein E

ANP

atrial natriuretic peptide

TT2238/ α ANP

wild-type atrial natriuretic peptide at pos. 2238

CC2238/ α ANP

mutant atrial natriuretic peptide at pos. 2238

камп

циклични аденозин монофосфат

CREG

cellular repressor of E1A-stimulated gene

ЦРЕБ

cAMP responsive element binding protein

DNAJA4

DnaJ (Hsp40) homolog

Egr-1

early growth response protein-1

еНОС

ендотелна синтеза азот оксида

ЕДТА

ethylenediaminetetracetic acid

FOXO4

forkhead box O4

ФАЦС

анализа проточне цитометрије

ЈНК

ц-јун Н-терминална киназа

миРНА

микроРНА

NADPH

никотинамид аденин динуклеотид фосфат-оксидаза

Nf- κB

nuclear factor kappa-light chain-enhancer of activated B cells

NPR-C

type C natriuretic peptide receptor

NPR-A

type A natriuretic peptide receptor

ПКА

протеин киназа А

РОС

реактивне врсте кисеоника

РТ-ПЦР

real time-polymerase chain reaction

Smad4

mothers against decapentaplegic Homolog 4

TGF

tumor growth factor

ВСМЦ

васкуларна ћелија глатког мишића

HUVSMC

human umbilical vein smooth muscle cell

CASMC

coronary artery smooth muscle cell

Додатне информације прате овај рад на веб локацији Целл Деатх анд Дисеасе (//ввв.натуре.цом/цддис)