Регулација акт сигнализације везана за сплав | ћелијска смрт и болест

Регулација акт сигнализације везана за сплав | ћелијска смрт и болест

Anonim

Субјекти

  • Ћелијска сигнализација
  • Рак ЦНС-а
  • Механизам дејства

Апстрактан

20 С -протопанаксадиол (аППД) је метаболит гинсенг сапонина, за који се наводи да је про-апоптотичан у неким ћелијама, али анти-апоптотичан у неуронским ћелијама регулисањем Акт сигнализације. Због своје структуре сличне холестеролу, хипотетирали смо да аППД може да регулише Акт сигнализацију интеракцијом са липидним сплавовима. Овде смо упоредили Акт сигнализацију у глиобластому У87МГ и неуробластома Неуро-2а ћелија третираним аППД. аППД није променио Акт активност у укупним плазма мембранама сваке врсте ћелија, већ је драстично променио активност Акт-а повезан са сплавом. Изненађујуће, активност Акт је смањена на сплавовима У87МГ ћелија, али се повећала у Н2а ћелијама помоћу аППД регулисањем дефосфорилације повезане са сплавом. Двосмерна регулација Акт сигнализације повезана са сплавом, појачала је хемотоксичност паклитаксела или винбластина у У87МГ ћелијама, али је умањила ексцитотоксичност Н- метил-Д-аспартата у Н2а ћелијама. Наши резултати показали су да активност сплава повезане, али не укупне мембране Акт, одређује његове ћелијске функције. Липидни сплавови се разликују у различитим типовима ћелија, што омогућава могућност циљања специфичног за ћелију за које се аППД може показати као корисно средство.

Главни

20 С -протопанаксадиол (аППД) је гастроинтестинални метаболит гинсенг сапонина. Последње су главне фармаколошки активне компоненте гинсенга. аППД је занимљиво једињење за које се чини да има супротне ефекте на не-неуронске ћелије и ћелије неурона. Претходне студије наше групе и других показале су да аППД инхибира активност Акт и индукује апоптозу у различитим ћелијама тумора. 1, 2, 3 Међутим, доказано је да аППД штити неуронске ћелије од глутаматне и Н- метил-Д-аспартата (НМДА) изазване ексцитотоксичности 4, 5 и да стимулише регенерацију неуронских ћелија активирањем путање Акт. 6, 7 Механизам који стоји у основи ефеката аППД-а који зависи од ћелије, још увек није расветљен.

Плазматска мембрана (ПМ), као главно место активације Акт, садржи више микродомена, а међу њима је предложена микродомена отпорна на детерџент, позната као липидни сплав, као критична платформа за ћелијску сигнализацију. 8, 9 Липидни сплавови доприносе хетерогености латералне мембране и настају липидно-липидним и специфичним интеракцијама липид-протеин. 10 Захваљујући дугим и засићеним масним киселинама сфинголипида и холестерола, липидни сплавови постоје у текућем фазу. Супротно томе, остали одељци ПМ настају у фази поремећаја течности јер су састављени од фосфолипида са кратким и незасићеним масним киселинама. 11 Верује се да холестерол служи као одстојник између угљоводоничних ланаца сфионголипида и да делује као динамично лепак које држи сплав заједно. 12

Акт сигнализација у ПМ микродоменама тек је недавно испитана као важан онкогени пут. 13, 14, 15 Везивање фактора раста са њиховим рецепторима тирозин киназама стимулише фосфорилацију фосфатидилинозитол 3-киназе (ПИ3К) која се састоји од подјединица П85 и П110, који се локализују у липидним сплавовима. ПИ3К претвара фосфатидилинозитол-4, 5-бисфосфат (ПИ (4, 5) П2) у фосфотидилинозитол-3, 4, 5-трисфосфат (ПИ (3, 4, 5) П3), док је хомолог фосфатазе и тензина избрисан на хромозому 10 реверзија ова реакција. Акт транслоцира у ПМ и у интеракцији је с ПИ (3, 4, 5) П3 преко његове ПХ домене, а фосфорилира се у два остатка (Тхр308 и Сер473) од фосфоинозидне зависне киназе (ПДК) и различитих киназа повезаних са сплавом, укључујући мТОРЦ2 и кинезу повезану са интегрином (ИЛК). 16, 17 Једна од првих мета Акт-а за коју се показало да има директне импликације на регулацију преживљавања ћелија је члан проапоптотске породице Бцл-2 и позната је као смрт повезана са Бцл-2 (БАД). Везан је за липидне сплавове у пролиферирајућим ћелијама, мада је повезан са митохондријима у апоптотичким ћелијама. 12, 18 Једном фосфорилирани, фосфосерински остаци (Сер136 и Сер112) БАД формирају места везања афинитета за 14-3-3 молекуле, локализирајући тако фосфорилирани БАД на цитосол и ефикасно неутралишујући његову про-апоптотичку активност. 19, 20 Недавна истраживања показала су да Акт повезан са сплавом може бити важна одредница онкогености. 21, 22 Студије ћелија рака малих ћелија плућа показале су да специфични ПИ3К изоформи живе у липидним сплавовима и да поремећај мембранских сплавова метил- β- циклодекстрином (М β ЦД) инхибира активност Акт-посредовану ПИ3К. 23 Флуоресцентно снимање живих ћелија показало је да се сплав Акт активира брже и снажније од не-рафт Акт-а, вероватно због раздвајања различитих компоненти сигналног пута, укључујући рецепторе, ПИ3К и сам Акт. 22

С обзиром на структуру сличну сапонину, гинсенозиди су познати по својој способности да повећавају флуидност ћелијских мембрана. 11, 24 Пошто структура аППД веома подсећа на холестерол, ми смо хипотетирали да ово једињење може да омета липидне сплавове и мења бочно кретање протеина који живи у сплаву. Надаље смо спекулирали да се различите врсте ћелија могу разликовати у резиденцијалним протеинима њихових липидних сплавова, што може објаснити горе наведени контраст у ефектима аППД-а на неуроне насупрот не-неуронским ћелијама. Да бисмо тестирали горњу хипотезу, за наше истраживање користили смо ћелијску линију глиома У87МГ и ћелију неуробластома Н2а. Иако обе ћелије имају порекло нервног ткива, оне се разликују по томе што У87МГ потиче из глијалних ћелија, а Н2а је неуронски тип ћелије. 25, 26 Након третмана обе врсте ћелија са аППД-ом, истраживали смо Акт сигнални пут у липидним сплавовима, а самим тим и њихов ћелијски одговор на хемотерапијска и ексцитотоксична средства. Наши резултати показали су да је аППД изменио Акт активност повезану са сплавом различито у две ћелијске линије, али не и у укупном ПМ. Штавише, ћелијски исходи токсичног подражаја били су супротни, што указује да фармаколошки ефекти овог једињења могу бити у потпуности специфични за ћелију због разлика у његовом утицају на ћелијску сигнализацију различитих ћелија.

Резултати

аППД утиче на снопове липида другачије од М β ЦД и ти ефекти зависе од ћелијског типа

Да бисмо показали разлике у ефектима аППД-а на липидне сплавове у две ћелијске линије, гледали смо промене концентрације холестерола у различитим ПМ фракцијама У87МГ и Н2а ћелија третираних са аППД или М β ЦД. Последњи је познати разарач липидног сплава, који функционише тако што смањује холестерол из мембране. 11, 27 Да би се испитало да ли је аППД цитотоксичан за ћелије, морталитет ћелија мерен је различитим концентрацијама аППД у различитим временским тачкама. Иако третман са 10 µМ аППД није имао ефекта на ћелијску смртност за 4 х за обе ћелије 5, 20 ± 2, 45%, П = 0, 196) за У87МГ и 3, 76 ± 5, 97%, П = 0, 276) за ћелије Н2а), смртност се лагано повећала, али није статистички сигнификантна за 24 х (12, 64 ± 13, 57%, П = 0, 089 у ћелијама У87МГ и 11, 30 ± 10, 41% у ћелијама Н2а, П = 0, 095). Примећена је значајна ћелијска смрт у току 24 сата у ћелијама третираним са 20 µМ аППД, посебно не само за У87МГ (42, 7 ± 14, 78%, П = 0, 002), већ и за Н2а у мањем степену (23, 12 ± 5, 39, П = 0, 002). Тако је 10 μМ аППД коришћено у следећим експериментима. Ћелијске мембране су раздвојене 4 сата након третирања са 10 µМ аППД ултрацентрифугирањем у 12 фракција (Слика 1б). Липидни сплавови су се углавном налазили у фракцији 5, што су показали западњачки блоти флотиллин-1, маркер липидног сплава (Слика 1ц). Као што се очекивало, максималан садржај холестерола такође је пронађен у фракцији 5 необрађених ћелија У87МГ и Н2а (слике 2а и б), што додатно потврђује обогаћивање липидних сплавова у овој фракцији. Третман са 10 мМ М β ЦД-а у потпуности је умањио замућени изглед фракције 5 протеина обе врсте ћелија (слика 2ц) и значајно смањио ниво укупног холестерола у овој фракцији (слике 2а и б), што указује на потпуни поремећај липидни сплавови обе врсте ћелија овог средства. Третирање ћелија обе линије са аППД такође је умањило замућен изглед фракције 5 (слика 2д). Изненађујуће, међутим, није дошло до промене нивоа холестерола у овој фракцији (слике 2а и б), што указује да за разлику од М β ЦД-а аППД не узрокује исцрпљивање холестерола у мембрани. Поред тога, нивои протеина флотилин-1 у ћелијама У87МГ и Н2а смањени су у фракцији 5 након третмана М β ЦД-ом (слика 3а). Међутим, лечење аППД-ом смањило је концентрацију флотилин-1 само у ћелијама У87МГ. Уместо тога, аППД третман је регулирао ниво флотилин-1 у сплавовима Н2а ћелија на 142, 91 ± 10, 71% контроле, као што је приказано на слици 3б. Узето заједно, ови подаци сугерирају да аППД може ометати липидне сплавове, али не и истим механизмом који се користи у случају М β ЦД-а. Даље, аППД може имати супротан ефекат на протеини флотиллин-1 који живи у сплаву, зависно од врсте ћелије.

Image

Изолација и идентификација липидних сплавова. ( а ) Хемијска структура 20 С- пропатопанаксадиола (аППД). ( б ) Мембрански препарати после центрифугирања за изоловање липидних сплавова како је описано у Материјалима и поступцима. Липидни сплавови су углавном у фракцији 5 и изгледали су као непрозиран појас. ( ц ) Протеини сваке фракције приказане у ( б ) су анализирани помоћу СДС-ПАГЕ и избрисани флотиллин-1 антителом. Као резидуални протеин липидног сплава, флотилин-1 је углавном био присутан у фракцији 5 (понекад и у 6). Сви резултати представљају најмање три независна експеримента

Слика пуне величине

Image

аППД не троши холестерол у мембрани. ( а ) Концентрације холестерола у ПМ и свакој фракцији У87МГ ћелија измерене помоћу комплета за испитивање холестерола Амплек Ред. ( б ) Концентрације холестерола у ПМ и свакој фракцији Н2а ћелија. Највиши ниво холестерола откривен је у фракцији 5 у обе ћелијске линије. ( ц и д ) Узорци ћелијске мембране од 10 мМ М β ЦД- или 10 μМ а87П-третираних аППД ћелијама прикупљени центрифугирањем. Иако су и М β ЦД и аППД узроковали нестанак непрозирног опсега, само М β ЦД, а не аППД је осиромашио холестерол ( а и б ). * П <0, 05, ** П <0, 001 у поређењу са контролом, т -тест ( н = 3 независна експеримента)

Слика пуне величине

Image

Нивои флотилина-1 у липидним сплавовима и ћелија У87МГ и Н2а третираних или М β ЦД ( а ) или аППД ( б ). * П <0, 05, ** П <0, 001 у поређењу са контролом, т -тест ( н = 3 независна експеримента)

Слика пуне величине

аППД мења Акт фосфорилацију повезану са сплавом без промене укупног нивоа Акт мембране

Затим смо питали да ли је аППД променио ниво Акт и његов статус фосфорилације у ћелијској мембрани две врсте ћелија. Западне мрље укупног Акт и његова два фосфорилациона остатка, Тхр308 и Сер473, изведени су са укупним мембранским протеинима У87МГ и Н2а ћелија третираних аППД. Слике 4а и б показују да није било значајних промена Акт или његовог стања фосфорилације у ПМ сваке врсте ћелија третираних аППД-ом.

Image

Утицај аППД на активност Акт у ћелијској мембрани. аППД није имао утицаја на концентрацију Акт нити на његово стање фосфорилације у ћелијама У87МГ или Н2а ( а и б ). аППД регулише Акт фосфорилацију у липидним сплавовима У87МГ и Н2а ћелија на супротан начин ( ц и д ). * П <0, 05 у поређењу са контролом, т -тест ( н = 3 независна експеримента)

Слика пуне величине

Занимљиво је да су Акт и његово стање фосфорилације били потпуно различити у липидним сплавовима изолованим из две различите врсте ћелија третираних аППД-ом. Као што је приказано на сликама 4ц и д, иако аППД није значајно променио укупни ниво Акт у липидним сплавовима две ћелијске врсте, фосфорилација у Тхр308 и Сер473 значајно је смањена у У87МГ ћелијама, али повећана у Н2а, што указује да аППД може инхибирати раф-повезана Акт активност у У87МГ ћелијама, али стимулишу ову активност у Н2а ћелији.

аППД регулише активност Акт у липидним сплавовима мењајући нивое фосфатаза повезаних са сплавом

Да бисмо утврдили како аППД селективно активира активност Акт повезане са сплавом у ћелијама Н2а, али је инхибира у ћелијама У87МГ, измерили смо нивое ПИ3К, ПДК и ИЛК у липидним сплавовима, који су познати као киназе узводно које регулишу фосфорилацију Акт. 17 Као што је приказано на слици 5а, нисмо приметили значајне промене у ПИ3К, укључујући активност која укључује регулаторну подјединицу П85 и каталитичку подјединицу П110 α , након аППД третмана било У87МГ или Н2а ћелија. Даље смо истражили да ли су лекови аППД утицали на ниво сплава ПДК1 и ИЛК, који су фосфорилирали Тхр308 и Сер473 из Акт. Слика 5б показује да се количина ПДК1 није значајно променила у свакој врсти ћелије третиране аППД-ом. Међутим, количина ИЛК1 у липидним сплавовима Н2а ћелија значајно се повећала, док се смањила у У87МГ. Коначно, измерили смо ниво две главне фосфатазе, ПХ домену леуцином богате фосфатазе 1 и 2 (ПХЛПП1 и 2), које су одговорне за Акт депхосфорилацију. 28, 29, 30, 31, 32, 33 Наши резултати (слика 5ц) показали су да је лечење аППД-ом проузроковало значајне промене и у ПХЛПП1 и ПХЛПП2 у липидним сплавовима. Невероватно, ниво ПХЛПП1 и ПХЛПП2 на сплавовима повећао се за 56, 31 ± 5, 12 и 82, 97 ± 5, 02%, у ћелијама У87МГ, али се смањио за 30, 38 ± 3, 94 и 30, 22 ± 8, 31% у Н2а ћелијама.

Image

Утицај аППД на Акт регулаторе у липидним сплавовима. ( а ) Није било значајних промена нивоа П85 и П110 α ПИ3К после третмана аППД-ом било у У87МГ ћелијама, или у Н2а ћелијама. ( б ) Количина ПДК1 се није значајно променила у ћелијама третираним аППД сваке ћелијске линије. Међутим, количина ИЛК1 у липидним сплавовима значајно се повећала у ћелијама Н2а и смањила у ћелијама У87МГ. ( ц ) Нивои ПХЛПП1 и ПХЛПП2 у сплавовима значајно су порасли у ћелијама У87МГ, али су се смањили у ћелијама Н2а. * П <0, 05 у поређењу са контролом, т -тест ( н = 4 независна експеримента)

Слика пуне величине

Двосмерна регулација Акт функција глиомских ћелија насупрот ћелијама неурона

Да бисмо испитали да ли су контрастни ефекти аППД на Акт повезан са сплавом у две врсте ћелија у корелацији са разликом у њиховим фармаколошким одговорима, измерили смо виталност ћелија под токсичном увредом са или без аППД. У87МГ ћелије су третиране са различитим концентрацијама паклитаксела (ТАКСОЛ) (Бристол-Миерс Скуибб, Торонто, ОН, Канада) или ћелије Винбластина и Н2а третиране су НМДА. Обе ћелије су третиране са 10 µМ аППД. Изузетно појачана токсичност је била очита у ћелијама У87МГ које су третиране аППД и ТАКСОЛ или Винбластином (слике 6а и б). Супротно томе, аППД је снажно заштитио Н2а ћелије од ексцитотоксичности изазване НМДА (слика 6ц).

Image

аППД је појачао цитотоксични ефекат хемотерапеутика у ћелијама глиома и ослабио цитотоксични ефекат у неуронским ћелијама третираним НМДА-ом. ( а и б ) У87МГ ћелије су инкубиране са или без 10 µМ аППД у присуству различитих концентрација Пацлитакол (ТАКСОЛ) или Винбластине. ( ц ) аППД значајно смањује неуроексцитотоксичност изазвану НМДА у ћелијама Н2а. * П <0, 05, ** П <0, 001 у поређењу са контролом, т -тест ( н = 3 независна експеримента)

Слика пуне величине

На крају, питали смо да ли се горња разлика у фармаколошким ефектима аППД-а може приписати његовим различитим ефектима на Акт-пут у липидним сплавовима две ћелијске линије под токсичним увредама. Упоредили смо нивое Акт-а повезаног са сплавом и фосфорилирани Акт, као и БАД. Последњи је циљ Акт-а низводно, а БАД фосфорилација је важан анти-апоптотички механизам Акт сигнализације. Ни ТАКСОЛ ни Винбластин значајно нису променили Акт активност у липидним сплавовима У87МГ ћелија (слике 7а и ц). Поред тога, оба хемотерапијска средства значајно су смањила укупне нивое БАД у липидним сплавовима У87МГ ћелија, али нису утицала на њихово стање фосфорилације (слике 7б и д). Са друге стране, НМДА је значајно смањила фосфорилацију Акт у липидним сплавовима Н2а ћелија и, сходно томе, такође је смањена и фосфорилација БАД-а који је повезан са сплавом (слике 7е и ф). Као што се очекивало, аППД је драстично потиснуо Акт фосфорилацију у липидним сплавовима у У87МГ ћелијама третираним ТАКСОЛ или Винбластином. Нивои фосфорилације БАД такође су значајно смањени (слике 7а-д). Супротно томе, аППД је вратио статус фосфорилације Акт и БАД у липидним сплавовима Н2ДА-третираних Н2а ћелија (слике 7е и ф). Према томе, ови резултати потврђују да аППД врши супротне фармаколошке ефекте на ове различите ћелијске типове и да се ова специфична, двосмерна појава специфична за ћелију може приписати разлици у активностима аППД-а у Акт сигнализацији повезаној са сплавом, приписати разлици специфичној за ћелију.

Image

Акт сигнализација у липидним сплавовима У87МГ и Н2а ћелија третираних хемотерапеутицима и НМДА са и без аППД. Укупна Акт и Акт фосфорилација у липидним сплавовима инхибирана је аППД у У87МГ ћелијама третираним ТАКСОЛ или Винбластином ( а и ц ). Фосфорилација БАД у липидним сплавовима такође је смањена аППД ( б и д ). аППД је обновио фосфорилацију Акт и БАД у липидним сплавовима Н2а ћелија третираних НМДА ( е и ф ). * П <0, 05, ** П <0, 001 у поређењу са контролом, т -тест ( н = 3 независна експеримента)

Слика пуне величине

аППД инхибира миграцију ћелија глиома

Познато је да Акт сигнални пут повезан са сплавом регулише инвазију и покретљивост ћелија. 34 Дакле, ин витро испитивање огреботина 35 извршено је за мерење 24-сатне стопе миграције ћелија и ћелија У87МГ и Н2а третираних аППД. Слика 8 показује да третман аППД значајно инхибира миграцију ћелија у У87МГ ћелијама (53.2 ± 20.1% контроле, П = 0.0002), али има много мањи ефекат на ћелије Н2а (82.4 ± 20.8%, П = 0.166).

Image

Утицај аППД на ћелијску миграцију У87МГ и Н2а ћелија. ( а ) Миграција ћелија у посудама са културом. Рубови (испрекидане линије) узгајаних У87МГ ћелија 0 и 24 сата након огреботине приказани су као линија повреде и линија миграције. Подручје миграције израчунато је као региони између линија повреде и миграције. ( б ) Квантификација стопе миграције ћелије. Брзина миграције У87МГ ћелија је ефективно смањена третманом аППД у У87МГ, али не и Н2а ћелијама. Подаци су били просеци два поновљена експеримента са четвороструком за сваки пут, * П <0, 05 у поређењу са контролом

Слика пуне величине

Дискусија

Горњи резултати јасно показују да је (1) аППД високо ефикасан у ометању протеинског састава липидних сплавова не мењајући ниво холестерола; (2) ефекти аППД на протеине који живе у сплаву веома зависе од ћелијског типа; (3) аППД сузбија активност Акт стазе у липидним сплавовима глиомских ћелија, али их повећава у неуронским ћелијама, не утичући на Акт активност у укупном ПМ обе врсте ћелија; (4) активност Акт-а повезане са сплавом је регулисана аППД променом нивоа фосфатаза у сплаву; (5) разлика у ефекту аППД на активност пута Акт-а повезаног са сплавом резултира инхибицијом миграције ћелије и појачаном цитотоксичношћу са ТАКСОЛ или Винбластином у У87МГ ћелијама, али ослабљеном ексцитотоксичношћу са НМДА у Н2а ћелијама; Наше истраживање показује да је крајњи метаболит протопанаксадиол гинсенозида, аППД, високо ефикасан растављач сплава. За разлику од М β ЦД-а, аППД мења садржај резидуалних протеина у липидним сплавовима не мењајући ниво холестерола. За Рх2, показало се да гликозилирани облик протопанаксадиола утиче на бочно кретање Фас-а између сплава и не-рафт микродомана ћелијске мембране. 11 Пошто је аППД структурно сличнији холестеролу, не би било изненађујуће ако делује као јачи растројник сплава кроз интеркалирање у липидне сплавове да би проузроковао промене у микро окружењу мембране, што за последицу има измену протеина. састав липидних сплавова. Остаје да се утврди да ли аППД мења протеинске резидуалне протеине изазивањем опште промене флуидности мембране, слично осталим дериватима холестерола 36, или да ли једињење директно у интеракцији са специфичним протеинима у липидним сплавовима модулира њихову активност. Вриједно је напоменути да иако АППД не мења ниво холестерола у липидним сплавовима, узроковао је нестанак непрозирности фракције липидног сплава, као и М β ЦД (слика 2). Како непрозирност може указивати на присуство специфичног облика комплекса који садржи нерастворљиве протеине и липиде, његово нестајање изазвано аППД јасно указује на то да једињење може да промени физичко стање протеина у липидним сплавовима.

Најупечатљивији налаз ове истраге је да аППД регулише Акт пут глиомских ћелија и ћелија неурона повезаних са сплавом на супротан начин. аППД смањује Акт фосфорилацију у ћелијама У87МГ, али увећава фосфорилацију у ћелијама Н2а. Резултати су показали да ово двосмерно регулисање активности Акт-а повезаног с сплавом од стране аППД није последица промена у активности ПИ3К или ПДК1 на сплавовима (слика 5). Последњи је одговоран за фосфорилацију у Тхр308, за коју се сматра да је од суштинске важности за Акт активацију. 37 Како је аППД изменио статус фоксфорилације Акт без промене ПИ3К или ПДК1, вероватније је да је активност Акт регулисана променама фосфатазама повезаних са сплавом. Заиста, ћелија специфична за ћелијску промену у сплаво-повезаним ПХЛПП-има примећена је у ћелијама третираним аППД-ом. Обе фосфатазе су познате по својој улози у слабљењу укупног нивоа фосфорилације хидрофобног мотива и опстанку ћелије. 28 Не постоји очигледно објашњење контрастних ефеката аППД-а на две ћелијске линије у односу на Акт сигнализацију у њиховим липидним сплавовима. Објављено је да је ПХЛПП1 можда повезан са Акт2 и Акт3, док би ПХЛПП2 могао да буде са Акт1 и Акт3. 33 Остаје да се проучи да ли диференцијална дистрибуција Акт изоформа и њихових ПХЛПП-а има било какву улогу у њиховим функцијама у липидним сплавовима различитих типова ћелија. Алтернативно, такође је могуће да ћелије могу да се разликују у одговарајућим структурама липидних сплавова, попут оних које одражавају састав резидентних протеина, и да се ове разлике могу разјаснити протеомском анализом сплавова. 38

Горња двосмерна регулација Акт сигнализације повезане са сплавом је високо у складу са контрастном фармаколошком активношћу овог једињења у У87МГ ћелијама и Н2а ћелијама када је симултано стимулисана токсичном увредом (Слика 6). Занимљиво је да су у У87МГ ћелијама и ТАКСОЛ и Винбластин значајно смањили укупну количину БАД-а који је повезан са сплавом, фосфорилирајући циљ Акт, без промене количине фосфорилираног БАД у липидним сплавовима. Како није било значајне разлике у активности Акт на сплавовима ћелија третираних лековима, чини се да су хемотерапеутски агенси повећали однос фосфорилираног БАД и нефосфорилираног БАД у липидним сплавовима уклањањем последњег из ових структура. Занимљиво је да је у Н2а ћелијама НМДА инхибирала фосфорилацију Акт и БАД повезаних са сплавом без промене укупне количине ових протеина у липидним сплавовима. Коначно, аППД је повећао хемотоксичност у У87МГ ћелијама и заштитио Н2а ћелије од ексцитотоксичности изазване НМДА. Ови двосмерни ефекти били су у сагласности са променама примећеним у активности Акт као и у његовом низводном циљном БАД-у у липидним сплавовима две врсте ћелија, које могу директно бити у корелацији са про-апоптотичким или анти-апоптотичким ефектом зависним од ћелије. од аППД. Оно што је још важније, чињеница је да фармаколошке функције аППД-а корелирају са активношћу Акт-а повезаном с сплавом, али не и да у укупном ПМ-у још више наглашава идеју да само Акт повезан са сплавом одређује функције његове сигнализације.

У овом истраживању показујемо да само фосфорилација Акт-а повезаног са сплавом одређује активност и смер Акт сигнализације, јер аППД нема утицаја на Акт фосфорилацију у укупном ПМ две врсте ћелија. Ово подвлачи важност фокусирања на микродомене мембрана уместо на глобалну ћелијску мембрану када се проучавају функције сигналних протеина. Наши резултати су први који јасно показују да ћелије могу бити различито циљане према разликама у структури микродоменских мембранских мембрана, а аППД је овде коришћен као прво средство које је примењено у ту сврху.

Материјали и методе

Материјали

аППД је пружио Шангајски иновативни истраживачки центар традиционалне кинеске медицине (Шангај, Кина). Једињење је било 97, 9% чисто, мерено ХПЛЦ анализом. Антитела на фосфор-Акт (Сер 473 ), фосфор-Акт (Тхр 308 ), Акт (пан), ПИ3 киназа п85, ПИ3 киназа п110 α , ИЛК1, фосфор-ПДК1 (Сер 241 ), БАД, фосфор-БАД (Сер 112 ) и фосфор-БАД (Сер 136 ) су набављени од Целл Сигналинг Тецхнологи, Инц. (Миссиссауга, Онтарио, Канада). Флотиллин-1 антитело је набављено од Абцам, Инц. (Цамбридге, МА, УСА). ПХЛПП1 и ПХЛПП2 антитела су набављена од Бетхил Лабораториес, Инц. (Монтгомери, ТКС, УСА). ХРП-коњугирани анти-зечји и анти-мишји ИгГ су набављени од компаније Перкин-Елмер Лифе Сциенцес (Бостон, МА, САД). Коктели са инхибиторима протеазе добијени су од Роцхе Молецулар Биоцхемицалс (Маннхеим, Немачка). Модификовани комплет за испитивање ДЦ протеина и нитроцелулозне мембране купљени су од БИО-РАД (Херцулес, ЦА). М β ЦД, Винбластин, НМДА, медијуми (Дулбеццова модификована ораона средина, ДМЕМ), тиазолил плави тетразолијум бромид (МТТ) и друге хемикалије су купљени од Сигме (Ст. Лоуис, МО, УСА). Пацлитакел је купљен у апотекама Агенције за борбу против рака Бритисх Цолумбиа (Ванцоувер, БЦ, Канада). У87МГ ћелије и Н2а ћелије су купљене од Америцан Типе Цултуре Цоллецтион (АТЦЦ) (Манассас, ВА, УСА). Физиолошка отопина пуферирана фосфатима (ПБС), додаци ћелијској култури (фетални говеђи серум (ФБС) и антибиотици су добијени од ГИБЦО БРЛ (Гаитхерсбург, МД, САД).

Ћелијске културе и третмани

Хумане У87МГ и Н2а ћелије су култивисане у ДМЕМ са додатком 10% ФБС, 100 У / мл пеницилина и 100 μг / мл стрептомицина, на 37 ° Ц у влажној атмосфери која садржи 5% ЦО2 и храњене су свака 2-3 дана. Основни раствор 50 мМ аППД је припремљен у 100% етанолу и разблажен до одговарајућих концентрација у ДМЕМ непосредно пре сваког експеримента. Ћелије за третирање лековима су претходно третиране са ДМЕМ током 4 сата на 37 ° Ц, након чега је следило додавање 10 мМ М п ЦД или 10 µМ аППД током 1 сата.

Изолација сплавова сплава

Ћелије у пет посуда од 100 мм помешане су са 3 мл пуфера за лизу по јелу (150 мМ НаЦл, 20 мМ На2 ХПО 4, 2 мМ НаХ2П04, 20% (в / в) глицерола, 2 мМ натријум-ортовананадата са инхибиторима протеазе, пХ 7, 4) и хомогенизован 30 пута с чврстим Доунцеовим хомогенизатором (Сигма). Узорци су додатно прекинути прекидајућих соникација (шест 30-с импулса са временом хлађења од 1 мин), а затим центрифугирани при 10 К рпм (Бецкман-Цоултер Оптима Л-90К ултрацентрифуга са СВ55Ти ротором, Миссиссауга, ОН, Канада) 11 мин на 4 ° Ц за одвајање крхотина ћелија и нуклеарних материјала. Супернатант је затим центрифугиран на 32, 5 К о / мин (СВ55Ти ротор) током 90 мин на 4 ° Ц да би се умочио ПМ. ПМ се суспендује и солубилизује у 2 мл солубилизујућег пуфера који садржи 0, 5% в / в Тритон Кс-100 у Месо пуферираном физиолошком отопином (МБС: 25 мМ Мес, пХ 6, 5 / 0, 15 М НаЦл), инхибиторима протеазе и 2 мМ натријум ортовананадата за 15 мин на леду. Затим је 2 мл солубилизованог ПМ даље разблажено једнаком запремином 80% сахарозе у МБС и стављено на дно 13 мл епрувете за ултрацентрифугу, прекривене 4 мл 30% сахарозе / МБС. Коначно, 4 мл 5% раствора сахарозе / МБС је додато као горњи слој градијента. Градијент је центрифугиран на 31 К рпм (СВ41Ти ротор) 16 х на 4 ° Ц како би се изоловао липидни сплав и не-сплавови одељци. Градијент је затим фракционалан у 12 фракција. 39

Вестерн блоттинг

Концентрација протеина је мерена коришћењем модификованог ДЦ протеинског теста. Једнака запремина фракције (10 μл / трака) из сваког узорка је одвојена на полиакриламидном гелу. За имуноблотинг, протеини су пренети на нитроцелулозне мембране помоћу система влажног преноса (БИО-РАД). Мембране су блокиране са 5% немасног млека (БИО-РАД) током 1 сата на собној температури и испитиване са примарним антителом на 4 ° Ц током ноћи. Мембране су затим испране три пута са Трис-пуферираним физиолошким раствором са 0, 05% Твеен 20 (ТБСТ) и инкубиране 1 х на собној температури са ХРП-коњугованим анти-зечјим или козјим ИгГ (1: 5000). Сигнали су откривени употребом побољшане хемилуминисценције (Перкин-Елмер Лифе Сциенцес) и интензитети опсега квантификовани су коришћењем Имаге Ј софтвера (НИХ, Бетхесда, МД, САД).

Мерење холестерола

Педесет микролитара сваке фракције анализирано је с Амплек Ред анализом холестерола (Молецулар Пробес, Еугене, ОР, УСА) према протоколу произвођача.

МТТ тест

Да би се преживела ћелија, ћелије су сејане у плочице са 96 јажица, густине 2, 5 × 10 4 / базенчић, 1 дан пре експеримената. Културе су затим инкубиране са ДМЕМ који садржи ТАКСОЛ, Винбластин или НМДА, са или без аППД (10 μМ) током 24 сата на 37 ° Ц. На крају сваке временске тачке, медијум за културу је уклоњен и додато је 50 μл МТТ (0, 5 мг / мл у медијуму без серума) у сваку јажицу. После инкубације на 37 ° Ц током 4 х, 100 μл пуфера за лизу (50в / в Н, Н- диметилформамид (Сигма), 20% СДС (БИО-РАД) и 0, 4% (в / в) ледена сирћетна киселина дестилована додата је вода (пХ 4.8) и плоче су инкубиране преко ноћи у влажној атмосфери (37 ° Ц са 5% Ц02). Оптичка густина сваке јажице је одређена помоћу читача микро плоча (БИО-ТЕК, Винооски, ВТ, УСА) на 595 нм.

Тест ћелије миграције

У87МГ или Н2а ћелије узгајане су у посудама са културом са шест бунара до 70-90% сутока, праћено гребањем са 1 мл стерилизованих врхова пипете. После прања претходно загрејаним ПБС-ом, ћелије су култивисане у ДМЕМ без серума током 24 сата. Слике су снимљене у 0 и 24 сата након огреботине помоћу микроскопа Зеисс Акиоверт 200 (Зеисс, Торонто, ОН, Канада) са × 5 (за ћелије У87МГ) или × 10 (за ћелије Н2а). Слике истих тачака снимљене у 0 и 24 сата прекривене су и прилагођене софтверу Пхотосхоп ЦС4 (Адобе, Оттава, ОН, Канада). Руб култивираних ћелија био је обележен повезивањем ћелијских тела најудаљенијих, али непрекидно повезаних ћелија из нешкодованих региона. Руба у 0 и 24 х била је дефинисана као линија повреде и линија миграције. Подручје између повреда и миграционих линија сматрало се подручјем миграције и било је предмет квантификације. 40 Подручја миграције на сликама измерена су помоћу ИмагеЈ.

Статистичка анализа

Подаци су добијени из најмање два независна експеримента, од којих је сваки изведен најмање у три примерка. Подаци су изражени као средство ± СЕ и анализирани за статистичку значајност двоструким т- тестом Студента. Разлике са П- вредностима <0, 05 сматране су статистички значајним и на сликама су означене звездицом ( * ).

Речник

аППД

20С-протопанаксадиол

БАД

Промотор смрти повезан са Бцл-2

М β ЦД

метил- П- циклодекстрин

НМДА

Н- метил-Д -аспартат

ПХЛПП

ПХ домена богата леуцином понавља фосфатазу

ПОСЛЕ ПОДНЕ

Плазма мембране

ТАКСОЛ

Пацлитакел