Цревне упалне реакције изазване хемотерапијом посредују егзозомским излучивањем дволанчане дна путем упалеомске активације аим2 | ћелијско истраживање

Цревне упалне реакције изазване хемотерапијом посредују егзозомским излучивањем дволанчане дна путем упалеомске активације аим2 | ћелијско истраживање

Anonim

Субјекти

  • Нежељени ефекти
  • Хемотерапија
  • Инфламмасоме
  • Интестиналне болести

Апстрактан

Познато је да хемотерапије често изазивају јаку токсичност на гастроинтестинални тракт, али основни механизам остаје нејасан. Ова студија разматра широко примењено цитотоксично средство иринотекан (ЦПТ-11) као репрезентативно средство и показује да лечење индукује масовно ослобађање дволанчане ДНК из црева што објашњава цревну токсичност овог једињења која ограничава дозу. Конкретно, „само-ДНК“ ослобођен излучивањем егзозома улази у цитосол урођених имуних ћелија и активира АИМ2 (одсутну у меланому 2) упалу. То доводи до зреле секреције ИЛ-1β и ИЛ-18 и индукује цревни мукозитис и дијареју касног почетка. Занимљиво је да укидање сигнала АИМ2, било код мишева са недостатком АИМ2, било од фармаколошког инхибитора, попут талидомида, значајно смањује учесталост дијареје изазване лековима без утицаја на ефикасност антиканцера ЦПТ-11. Ови налази пружају механички увид у то како хемотерапија покреће урођене имуне одговоре узрокујући цревну токсичност, и откривају нове режиме хемотерапије који одржавају антитуморске ефекте, али заобилазе придружени нежељени упални одговор.

Увод

Хемотерапије, које остају примарни избор лечења за многе врсте узнапредовалих карцинома, доводе до цитотоксичне анти-туморске активности кроз различите механизме. Поред директног убијања ћелија рака, цитотоксични ефекти хемотерапије често су повезани са снажним имуностимулирајућим ефектима. Укључују про-упалну секрецију цитокина 1, активацију мијелоидних ћелија и регрутовање 1 и активирање Т-ћелија 2, 3, што значајно доприноси анти-туморској ефикасности лечења карцинома заснованих на хемотерапији 4 . Заиста, накупљање доказа указује да се терапијска ефикасност многих доступних хемотерапеутика ослања на њихову способност да изазову анти-туморске имуне одговоре. Иако су данас пожељни приступи који побољшавају имунолошке реакције изазване хемотерапијом, прекомерни имуни одговори такође могу изазвати неконтролисану токсичност хемотерапије која се у великој мери игнорише.

Имуногени одговори индуковани цитотоксичним агенсима ослањају се на изложеност молекулима ослобођеним из умрлих ћелија тумора који функционишу или као помоћни или антигенски сигнали за урођени имуни систем 5, 6, 7 . Ови сигнали, као што је протеин Б1 велике покретљивости, ослобођен током ћелијске некрозе, заједно са мокраћном киселином и АТП, познати су као молекуларни обрасци (ДАМП) повезани са оштећењем 7, 8 . Селф-ДНА, кључни узрок запаљенске и аутоимуне болести, је важан ДАМП ослобођен током хемотерапије 9, 10, 11 . Цитотоксични антиканцерогени агенси, попут цисплатина, етопозида или радијацијске терапије, показали су да изазивају урођене имуне одговоре који укључују цурење нуклеарног само-ДНК из туморских ћелија 12, 13, 14 . Ослобођена само-ДНК је у могућности да приступи цитосолу дендритичких ћелија да активира стимулатор производње цитокина зависног од гена интерферона путем препознавања помоћу цитосолног ДНК сензора цГАС (циклична ГМП-АМП синтаза) 15 . До данас, прецизно порекло и механички детаљи системских или локалних имуногенских реакција посредованих само ДНК остају нејасни. Да ли би поред антитуморског имунитета масовно ослобађање само-ДНК могло довести до ширих имуногених одговора, нарочито нежељених ефеката повезаних са хемотерапијом, дуго се занемарује. Добијање механичких увида у ове имуногене одговоре може бити од суштинске важности за максимизирање клиничких користи лекова за хемотерапију.

Гастроинтестинални синдром је добро препозната нуспојава повезана са различитим хемотерапијским средствима, нарочито иринотеканом (ЦПТ-11) и флуороурацилом (5ФУ). Као прво лечење колоректалног карцинома (ЦРЦ), клиничка корист ЦПТ-11 ограничена је негативним дејством тешке дијареје, која се јавља код ∼ 40% пацијената који су примали ЦПТ-11 лечење 16, 17, 18 . Перзистентна или јака дијареја није само по живот опасна нуспојава за пацијенте са ЦРЦ-ом, већ може утицати и на ефикасност хемотерапије кроз потребу за смањењем доза лечења или прекидом терапије. За сада је механизам ЦПТ-11 покретан по живот опасан гастроинтестинални синдром слабо разумљив. Клиничко лечење дијареје одражава потребу за препознавањем раних знакова упозорења и потребу за раним и агресивним лечењем 19 . Треба напоменути да неколико доказа доказује да је дијареја изазвана ЦПТ-11 повезана са производњом про-упалних цитокина ИЛ-1β и ИЛ-18 20, што сугерише имуногени одговор. Претходне студије су такође показале антиканцерогени ефекат анти-туморских имуности 21 повезаних са ЦПТ-11. Сходно томе, сматрамо дијареју изазвану ЦПТ-11 идеалним моделом за сецирање механизма интеракције између анти-туморске ефикасности повезане са имуногеним одговором и штетних ефеката хемотерапије. Ова студија може олакшати дизајн нове стратегије за клиничку употребу хемотерапијских лекова који су у стању да одржавају равнотежу између ефеката против тумора и токсичности повезаних са упалним одговором.

Резултати

Ослобадање дволанчане ДНК повезано је са дијарејом изазваном лечењем ЦПТ-11

Докази указују да дијареја изазвана ЦПТ-11 нуспојавама посредује упалом, али одговорни имуноген остаје нејасан 20, 22, 23, 24 . Да бисмо истражили да ли је дијареја изазвана ЦПТ-11 повезана са ослобађањем дволанчане ДНК (дсДНА), прво смо анализирали клиничке узорке од пацијената са ЦРЦ који су примили хемо-режим на бази ЦПТ-11. Међу укупно 69 узнапредовалих болесника са ЦРЦ-ом, ∼ 40% показало је дијареју степена 1-3 (Додатне информације, Слика С1А), појаву сличну претходним извештајима 16, 17, 18 . Процена концентрације дсДНА у серуму пацијената изведена је квантитативним бојењем помоћу ПицоГреен-а, боје специфичног за дсДНА и неосјетљивог на једноланчану ДНК или РНА. Упоређујући укупну концентрацију дсДНА пре и после лечења ЦПТ-11 приметили смо да је концентрација дсДНА у серуму пацијената, посебно код дијареје степена 2-3, повишена 48 х након примене ЦПТ-11 (Слика 1А-1Б) . Занимљиво је да је подмножа пацијената са дијарејом вишег степена показала већи ниво дсДНА у серуму у односу на преостале пацијенте (Слика 1Ц), што сугерише да је већа концентрација дсДНА повезана са тешком дијарејом изазваном ЦПТ-11.

Image

ЦПТ-11 покреће отпуштање дсДНА ин виво и ин витро . (АЦ) Концентрација дсДНА у плазми пацијента пре или 48 сати након третмана ЦПТ-11 (ЦПТ). Значај се одређује помоћу упареног или непарног т- теста. (А) Укупан број пацијената; (Б) пацијенти са дијарејом степена 2-3; (Ц) пацијенти са дијарејом степена 0-2 у односу на оне са степеном 3 у 48 х након лечења. (ДГ) Ц57БЛ / 6 мишеви који носе туморе или не-туморе су третирани (ип) ЦПТ-11 (75 мг / кг за мишеве који носе тумор, 90 мг / кг за мишеве који не носе тумор) дневно за 4 узастопна дана и жртвовано је 5. дана (Д) Дужина танких црева; (Е) дужина колона; (Ф) репрезентативне слике Х&Е хистопатологије пресека илеума код мишева који не носе тумор; (Г) концентрација дсДНА у текућини за испирање перитонеума исцрпљеном ћелијом. (ХЈ) Ослобађање од времена ослобађања дсДНА у Пф (Х), испираном течности илеума (И), или испираном течношћу дебелог црева (Ј) . Мишеви Ц57БЛ / 6 који не носе тумор су жртвовани у назначене дане након третмана ЦПТ-11. Стрелице означавају давање ЦПТ-11 (90 мг / кг, ип) на дан 0-3. (К) Квантитативна ПЦР анализа домаћина ГАПДХ и укупне бактеријске (Еубацтериа) копије ДНК у ДНК врстама изолованим из Пф-ДНА и илеум течности (Иле-ДНА). Ц57БЛ / 6 мишевима администрирани су ЦПТ-11 (90 мг / кг, ип) дневно током 4 узастопна дана и жртвовани су на дан 5. Употребљени су ГД слезена (геномски ДНК из мишјих спленоцита) и фекална ДНК (ДНК из мишјег измета). као контроле. (ЛМ) Концентрације ДНК у медијуму за културу ћелија ХЦТ-116 третиране са 500 нМ СН-38 у назначеним временима (Л) или са назначеним концентрацијама на 72 х (М) . (НО) Квантитативна ПЦР анализа АТПасе8 и ГАПДХ копија ДНК у ДНК ослобођеној из ХЦТ-116 ћелија (Н) или у ГД из ХЦТ-116 ћелија (О) . ХЦТ-116 ћелије су третиране СН-38 (500 нМ) 72 х пре жетве ради екстракције ДНК. ГД из ХЦТ-116 ћелија; ХЦТ-ДНА, ДНК ослобођена из ХЦТ-116 ћелија. Сваки симбол представља једног пацијента , Б и Ц) или једног миша , Е) . Подаци (ДО) су репрезентативни за три независна експеримента и приказују значење ± СЕМ. * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001. ГД, геномска ДНК; НС, није значајно; Пф, перитонеална течност.

Слика пуне величине

Да бисмо тестирали ову хипотезу и идентификовали детаљан механизам, одлучили смо покушати да то клиничко опажање ускладимо са мишјим моделом цревног мукозитиса дијареје повезаног са ЦПТ-11 25 . Модел је генерисан у Ц57БЛ / 6 мишевима који носе или не носе канцерогене мишје дебело црево, карцином МЦ38. Тежина мукозитиса процењена је оценом стопе преживљавања, тежином дијареје, дужином црева и хистопатологијом. И код мишева који носе тумор и који нису носили тумор, узастопне интраперитонеалне ињекције ЦПТ-11 4 узастопна дана довеле су до озбиљне упале црева што је резултирало скраћивањем танког црева, али не и дебелог црева (слика 1Д-1Е). Резултати су потврђени хистопатолошким променама танког црева (Слика 1Ф; Додатне информације, Слика С1Б-С1Ц), које у великој мери одражавају патолошке карактеристике тешке дијареје изазване ЦПТ-11 уочене код клиничких пацијената 16 .

Занимљиво је да су велике количине слободне дсДНА откривене у текућини за испирање перитонеума и код мишева који не носе тумор и код мишева који носе тумор (слика 1Г) током индукције мукозитиса (5 дана након ињекције ЦПТ-11). Концентрација дсДНА је досегла 1. до 3. дан, а затим се смањила на нижи ниво после третмана ЦПТ-11 (Слика 1Х). Кинетичка промена концентрације дсДНА опонашала је клинички ток примећен код пацијената. У складу са тешким оштећењем танког цревног тракта (Слика 1Ф), приметили смо веће дисоцијативно нагомилавање дсДНА у течности испраној из танког црева (Слика 1И). Супротно томе, није примећена индукција дсДНА у течности испраној из дебелог црева (слика 1Ј). Даљња квантитативна ПЦР (кПЦР) анализа потврдила је да је акумулирана дсДНА углавном изведена из ћелија домаћина, а не из цревног бактеријског порекла у поређењу са позитивном контролом (геномска ДНК из мишјих спленоцита) и негативном контролом (укупна ДНК из мишјег измета) (Слика 1К ). Ови подаци сугерирају да постоји блиска повезаност између цревног мукозитиса изазваног ЦПТ-11 и производње дсДНА. Третман ЦПТ-11 може покренути ћелију домаћина да ослобађа огромне количине само-дсДНА, која служи као јак имуни стимуланс за покретање развоја мукозитиса.

ЦПТ-11 директно покреће ослобађање нуклеарне геномске ДНК из ћелија које се шире

Затим смо испитали ослобађање дсДНА изазвано лечењем ЦПТ-11, што није било јасно описано у претходним истраживањима цитотоксичних агенаса или цурења изазваног радијацијом 13, 14, 15, 26 . Познато је да ЦПТ-11 специфично циља пролиферирајуће ћелије, попут туморских ћелија и ћелија цревног епитела 27 . Такође је примећено да је количина дсДНА код мишева који носе тумор и не носе миве била упоредива, што сугерише да ћелије цревног епитела, а не туморске ћелије, могу бити главни извор дсДНА (Слика 1Г). Стога смо одабрали трансформисане ХЦТ-116 ћелије као модел ћелијске цревне епителне линије 28, 29, 30, 31 да би процијенили да ли третман ЦПТ-11 може директно покренути само ослобађање ДНК ин витро . ХЦТ-116 ћелије су третиране СН-38, активним обликом про-лека ЦПТ-11. Слично резултатима добијеним ин виво , дсДНА је откривена у медијуму културе ХЦТ-116 ћелија после третмана СН-38 (Слика 1Л). Поред тога, СН-38 покренуо је ослобађање дсДНА из ћелија ХЦТ-116, на време и дозу зависан начин (Слика 1Л-1М). Такође смо тестирали друго средство које оштећује ДНК, цисплатин, и приметили смо сличан образац ослобађања дсДНА у ХЦТ-116 ћелијама (додатне информације, слика С1Д).

Ослобођена дсДНА може потицати или из нуклеарне геномске ДНК или из митохондријске ДНК (мтДНА) 32 . Да бисмо идентификовали порекло ослобођене дсДНА, испитали смо нивое гена за АТПасе8 (мтДНА маркер) и ГАПДХ (маркер за нуклеинску геномску ДНК) помоћу кПЦР у дсДНА ослобођеној из ХЦТ-116 ћелија (ХЦТ-ДНА). Заиста су гени АТПасе8 и ГАПДХ откривени у дсДНА, што сугерише да су и нуклеарна геномска ДНК и мтДНА допринеле ослобођеној дсДНА у медијуму ћелијске културе (Слика 1Н). Такође смо приметили да је однос гена АТПасе8 / ГАПДХ у ХЦТ-ДНК био много нижи него у ДНК издвојеној из укупних ћелија (Слика 10). С обзиром на велики број копија мтДНА у ћелијама, ово сугерира да нуклеинска геномска ДНК даје доминантан допринос дсДНА ослобођеној од ЦПТ-11. Узето заједно, ови подаци показују да ЦПТ-11 директно покреће ослобађање нуклеарног генома у размножавајућим ћелијама.

Селф-ДНА индукована ЦПТ-11 промовише сазревање ИЛ-1β и ИЛ-18 на начин зависан од АИМ2

Последице велике количине дсДНА ин виво остају нејасне. Сумњали смо да ослобађање дсДНА може бити повезано са цревном упалом изазваном ЦПТ-11. Отуда смо мерили производњу ИЛ-1п у моделу мишјег мукозитиса изазваног ЦПТ-11. Након примјене ЦПТ-11, образац излучивања ИЛ-1β у текућини за испирање перитонеума показао је сличну кинетику као и ниво дсДНА (Слике 2А, ​​1Х). Овај налаз сугерира да се дсДНА ослобођена из ћелија цревног епитела накупља у цревном микроокољу, а заузврат покреће активацију упалезома како би се произвео ИЛ-1β. Да би се испитала та могућност, ослобођена само-ДНА је изолована из СН-38 третираних ХЦТ-116 ћелијских култура или из илеума мишева који не носе тумор са третираним ЦПТ-11 и затим је трансфектирана у макрофаге који потичу из коштане сржи ( БММ). Ослобођена само-ДНК драматично је индуцирала зрелу секрецију ИЛ-1п у обе липопосахаридне (ЛПС) примењене (Слика 2Б) и БММ-ове који нису били примењени ЛПС (слика 2Ц), користећи мишју геномску ДНК као позитивну контролу. Такође смо проценили ниво п10 подјединице каспазе 1 да бисмо проценили активацију упала. Заправо, само-ДНК ослобођен и из цревне ћелијске културе и цревног ткива изразито је покренуо активацију каспазе 1 (Слика 2Д).

Image

Ослобођење дсДНА изазвано ЦПТ-11 активира АИМ2 упалу. (А) Времена зависна производња ИЛ-1п у перитонеалној течности осиромашеном ћелијом. Ц57БЛ / 6 мишеви су жртвовани у назначене дане након третмана ЦПТ-11. Стрелице су показале да се примењује ЦПТ-11 (90 мг / кг, ип) од дана 0 до 3. (БЦ) Производња ИЛ-1β у БММ трансфектованим ГД или изолованом супернатантом ДНК из ХЦТ-116 третираног СН-38 (ХЦТ-ДНК) ) са (Б) или без (Ц) ЛПС прајмирања. ХЦТ-116 ћелије су третиране СН-38 (500 нМ) 72 х пре жетве супернатанта. (Д) Имуноблотска анализа каспазе 1 у БММ-намазаним ЛПС трансфектираним 1, 0 μг / мл назначене ДНК. Иле-ДНА, ДНК изолована из илеума мишева третираних ЦПТ-11. Ц57БЛ / 6 мишевима је давано ЦПТ-11 (90 мг / кг, ип) дневно током 4 узастопна дана и жртвовано је на дан 5 за жетву илеума. β-актин је служио као контрола оптерећења. (ЕИ) Производња ИЛ-1β, ИЛ-18 или ИЛ-6 помоћу БММ (ЕГ) или БМДЦ (ХИ) од дивљих врста и АИМ2 - / - мишева. БММ и БМДЦ су третирани као у Д. (ЈК) Производња ИЛ-1β (Ј) и ИЛ-6 (К) помоћу БМДЦ-а примедованих ЛПС, трансфектираних са 1, 0 µг / мл ХЦТ-ДНК, претходно третиране ДНазом или РНазом. Подаци су репрезентативни за три независна експеримента и приказују средства ± СЕМ; * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001. ГД, геномска ДНК; НС, није значајно; Про-Цасп1, пропапаза 1; п10, активни облик каспазе 1.

Слика пуне величине

АИМ2 је цитосолни дсДНА рецептор на путу инфламације који посредује цепање неактивног прекурсора ИЛ-1β и ИЛ-18 у зреле цитокине 33, 34, 35 . Мишеви са мањком АИМ2 показују неисправан одговор сазревања ИЛ-1β / ИЛ-18 на стимулацију дсДНА и осетљивији су на инфекције патогенима, као што су Франциселла туларенсис и вирус вакциније 36, 37 . Стога смо истражили да ли је АИМ2 посредовао производњом ИЛ-1β и активирањем инфламације стимулисаном ослобађеном дсДНА. Да би се испитала ова хипотеза, ослобођена само-ДНК изолована из СН-38 третираних ХЦТ-116 ћелијских култура или из илеума мишева третираних ЦПТ-11 трансфектована је у БММ-темељене на ЛПС-у или БМП-ове добијене из коштане сржи (БМДЦ) од мишева са дивљим типом или АИМ2. Подаци су показали да је само-ДНК индукована производња ИЛ-1β и ИЛ-18 скоро у потпуности укинута у БММ-има од мишева са недостатком АИМ2 у поређењу са дивљим типом (Слика 2Е-2Ф). Ми смо потврдили недостатак мишева са недостатком АИМ2 анализом нивоа мРНА АИМ2 (додатне информације, слика С2А) и функционалним тестом (допунске информације, слика С2Б-С2Ц). Супротно томе, на секрецију ИЛ-6, која зависи од сигнала на наплатну рецепцију, није утицао дефицит АИМ2 (Слика 2Г). БМДЦ трансфектирани ДНК-ом различитог порекла показали су сличне фенотипове (Слика 2Х-2И).

Да би се даље верификовало да ли је производња ИЛ-1п била функција зависна од ДНК, уведене су ДНаза и РНаза за варење ДНК и РНА, респективно. Као што се очекивало, третман ДНазом укинуо је лучење нуклеинске киселине стимулисану ИЛ-1β секрецију, док је третман РНазом имао минималан ефекат (слика 2Ј). Такође смо измерили производњу ИЛ-6 као одговор на лечење ДНазом или РНазом и нисмо приметили ефекат (Слика 2К). Ови подаци показују да је производња цитокина ИЛ-1β / ИЛ-18 специфичан догађај стимулисан ослобађањем само-ДНК на начин зависан од АИМ2.

Ексосоми достављају ослобођену само-ДНК у цитосол урођених имуних ћелија

АИМ2 је цитосолни ДНК сензор који се може активирати само дсДНА у цитосолу, без обзира да ли је изведен из патогена, оштећеног ткива или се испоручује катионским липосомима 38 . Ово запажање поставља питање да ли дсДНА резултат индукције ЦПТ-11 може ући у цитосол. Да бисмо решили ово питање, користили смо ин витро систем ко-културе који се састоји од ХЦТ-116 ћелија и имунолошких ћелија урођених од мишева, наиме примарних БММ и БМДЦ. ХЦТ-116 ћелије у којима је геномска ДНК визуализована ДНК интеркалирањем боја ДРАК5 стимулисана је третманом СН-38 након чега је уследило кокултивирање са макрофагама или дендритичким ћелијама током 24 сата. Макрофаги и дендритичке ћелије су затим одабрани проточном цитометријом на основу бојења да би се открило бојање мишјег ЦД11б или ЦД11ц. Отприлике 40% ЦД11б + ћелија (слика 3А) и 44% ЦД11ц + ћелија (Додатне информације, слика С3А) биле су позитивне на обојење ДРАК5 добијеним од ХЦТ-116, за разлику од контрола, што сугерише да је ДНК изведена ХЦТ-116 заробиле су урођене имуне ћелије.

Image

Ослобођена дсДНА може се пренети у макрофаге путем егзоома. (А) улазак дсДНА у БММ-ове. ХЦТ-116 ћелије претходно третиране са СН38 (500 нМ, 72 х) обојене су са ДРАК5 (10 µМ) и затим кокултивиране са БММ-ом још 24 сата. ДРАК5 бојење у БММ-има је анализирано проточном цитометријом. (БЕ) СН-38-стимулисано ослобађање егзозома у ћелијама ХЦТ-116. Ћелије су третиране са назначеним агенсима (СН-38, 500 нМ; ГВ4869, 20 μМ) током 72 х пре него што је сакупљен медијум за културу. (Б) Схема тока дисекције медијума за културу; (Ц) концентрације дсДНА у свакој фракцији; (Д) репрезентативна слика електронског микроскопа за пренос (леви панел) и расподела величине (десни панел) на основу анализе слике електронског микроскопа на егзосним фракцијама. Вага, 25 нм; (Е) имуноблотска анализа ЦД63 у фракцијама егзозома. Фракција микрочестица је коришћена као контрола. (Ф) Имунохистохемијско бојење ЦД63 у илеуму изолованом од мишева Ц57БЛ / 6 третираних са ЦПТ-11 (90 мг / кг, ип) 4 дана заредом. Вага, 100 µм. (Г) Концентрације дсДНА у медијуму културе ХЦТ-116 ћелија. , И) Локализација егзосомске дсДНА у БММ-има. Мишеви БММ су третирани изолованим егзозомима из СН-38 ћелија третираних ХЦТ-116 током 2-3 сата, а поли (дА: дТ) обележен ДРАК5 у БММс је транспонован у БММ са Липофецтамине 2000. . (Х) дсДНА означена ДРАК5 (црвена), ЦД11б (зелена) и језгра (ДАПИ, плава). (И) дсДНА означена ДРАК5 (црвена), лизосоми (ЛАМП-1, горњи, зелени), рани ендосоми (ЕЕА1, доњи, зелени), језгра (плава) и β-актин (љубичаста). Подаци су репрезентативни за три независна експеримента и приказују средство ± СЕМ.

Слика пуне величине

Остаје нејасно како дсДНА улази у макрофаге и дендритичке ћелије. Мембранске ванћелијске везикуле, као што су микрочестице и егзозоми, познати су као витални преносници интрацелуларних сигнала у спољашње окружење, који служе као посредници међућелијске комуникације 39, 40, а показало се да активација имунолошких ћелија изведена туморима посредује егзосомима и микрочестицама 41, 42 . Стога смо спекулирали да су ванћелијски везикули вероватно укључени у ослобађање само-ДНК које покреће ЦПТ-11. Одвајањем фракција честица од супернаната ћелија третираних са СН-38 уз помоћ градијентног центрифугирања 42, 43 (Слика 3Б), открили смо да је већина дсДНА у медијуму културе ХЦТ-116 вероватно присутна у егзосомима (Слика 3Ц). Томе је допринела расподјела величине изолованих честица, од којих је већина била испод 50 нм (Слика 3Д) и релативно мања од типичних микрочестица 43, 44 . Излучивање егзоома потврђено је и имуноблотингом ЦД63, молекуларног маркера за егзосоме (слика 3Е). Такође смо тестирали егзосомско присуство ин виво након третмана мишева ЦПТ-11. Нашли смо невероватно повећање нивоа експресије ЦД63 у вилима танког црева (слика 3Ф).

Претходне студије су објавиле да се ссДНА и дсДНА могу носити са егзосомима 45, 46, 47, 48 . За даљу карактеристику егзосомске ДНК (егзоДНА) користили смо С1 нуклеазу или дсДНасе варење. С1 нуклеаза разграђује једноланчане нуклеинске киселине, а дсДНасе је дволанчана специфична ендонуклеаза. Приметили смо снажно смањење укупне екстраховане ДНК у узорцима третираним дсДНасе, у поређењу са непробављеним или третираним С1 нуклеазом (Додатне информације, Слика С3Б), показујући да је дсДНА доминантна компонента у егзоДНА. Штавише, егзоДНА је имала поријекло ДНК слично као улазна ДНК (Додатне информације, слика С3Ц-С3Д), што сугерира егзосом посредовану испоруку дсДНА. У складу са овим резултатом, инхибиција излучивања егзозома помоћу ГВ4869 увелике је ослабила ослобађање дсДНА стимулисану ЦПТ-11, што сугерише да ослобађање дсДНА зависи од секреције егзозома (Слика 3Г). Колективно, ови резултати сугерирају да се дсДНА излучује из цревних епителних ћелија преко егзосома у међућелијску микрооколу.

Затим смо испитивали да ли се егзосоми који садрже ослобођену дсДНА могу бити достављени у цитосол. У том циљу, БММ су инкубирани у медијуму за културу који садржи претходно обележене егзосоме изоловане из ХЦТ-116 ћелије третиране СН-38. ДНК упакован у егзосоме обојен је ДРАК5. Заиста, ДРАК5-дсДНА у егзосима такође је откривена у цитосолу БММ-а конфокалном микроскопом, на сличан начин као позитивна контрола трансфектирана поли-дА: дТ обележеном ДРАК5 (слика 3Х). Такође смо испитали интрацелуларну локализацију испорученог ДРАК5 позитивног дсДНА обојењем макрофага лизосомалним маркером ЛАМП-1 или раним ендосомским маркером ЕЕА1. У паралелном експерименту нисмо могли приметити очигледну ко-локализацију између цитосолне ДРАК5-дсДНА са другим органелама, као што су лизосоми или рани ендосоми, што сугерише егзосомско специфичан пут испоруке ДРАК5-дсДНА до одељења за фагоците (Слика 3И). Ови подаци заједно показују да ЦПТ-11 индукује ослобађање дсДНА која се директно испоручује у цитосол фагоцита путем егзоома.

Блокада ослобађања егзосома поништава цријевну токсичност изазвану ЦПТ-11

Следеће смо испитивали функцију егзоДНА (егзосом ослобођене ДНК) у упали изазваној ЦПТ-11. БММ и перитонеални макрофаги су стимулисани егзоДНА и мерена је производња ИЛ-1β. Резултати су показали да егзоДНА индукује привидну производњу ИЛ-1β, која је у великој мери укинута у АИМ2 КО (Додатне информације, слика С4А-С4Б). Изоловани егзосоми из ХЦТ-116 ћелија су такође директно инкубирани са илеумима у култури. То је резултирало појачаном секрецијом ИЛ-1β у медијуму за узимање илеума дивљег типа, али не и илеуму АИМ2 КО (Додатне информације, слика С4Ц).

Да би се потврдила функционална веза између излучивања егзозома и цревне упале изазване ЦПТ-11 ин виво , ГВ4869 је коришћен да блокира ослобађање егзоома код мишева. ЦПТ-11 је интраперитонеално убризган 4 узастопна мишева у мишеве Ц57БЛ / 6, а лечење ГВ4869 започето је један дан унапред (слика 4А). Као што се очекивало, ослобађање дсДНА изазвано ЦПТ-11 у текућину за испирање перитонеума и течност из танког црева у великој мери је поништено лечењем ГВ4869 (слика 4Б-4Ц). Доследно, ГВ4869 значајно смањује озбиљност дијареје (слика 4Д), губитка телесне тежине (слика 4Е) и скраћења црева (слика 4Ф-4Г) након третмана ЦПТ-11. Даљњом хистопатолошком анализом илеума потврђено је да је ГВ4869 у великој мери преокренуо оштећење слузнице (слика 4Х) и скраћење вилуса (слика 4И) изазвано третманом ЦПТ-11. Заједно, ови подаци указују на то да је за оштећење црева узроковано ЦПТ-11 потребно егзосомско ослобађање.

Image

Блокада секреције егзозома поништава цријевну токсичност изазвану ЦПТ-11. Ц57БЛ / 6 мишеви су третирани са ЦПТ-11 (50 мг / кг, ип) дневно током 4 узастопна дана или су комбиновани са ГВ4869 (2, 5 мг / кг, ип) од 1 дана пре давања ЦПТ-11 до жртвовања. (А) дијаграм тока администрације дрога; (Б) концентрације дсДНА у течности осиромашеном ћелијама у илеуму дужине 3 цм; (Ц) концентрације дсДНА у текућини за перитонеално испирање које исцрпљује ћелије; (Д) оцене за дијареју; (Е) промена телесне тежине; (Ф) слике танког црева; (Г) дужина танких црева; (Х) репрезентативне слике Х&Е обојења одсека илеума; (И) однос виллуса / крипте у пресецима илеја обојених од Х&Е. Линија скале, 200 µм (горња) или 100 µм (доња).

Слика пуне величине

Мањак АИМ2 смањује цревну токсичност изазвану ЦПТ-11

Горе наведени резултати сугерисали су начин давања дсДНА посредоване егзозомом у фагоците које АИМ2 инфламазом може осетити током хемотерапије. Да бисмо додатно потврдили функционалну потребу за АИМ2 инфламазомом код цревне упале и пролива са ЦПТ-11, упоредили смо цревну упалу и дијареју изазвану ЦПТ-11 и између мишева дивљег типа и мишева са недостатком АИМ2. ЦПТ-11 је интраперитонеално убризган 4 узастопна дана, а тежина мукозитиса процењена је као што је горе поменуто. Након изазивања од стране ЦПТ-11, мишеви са мањком АИМ2 показали су одложену морбидитет и нижу леталност у поређењу са дивљим типом мишева (Слика 5А). 5. дана, ЦПТ-11 је изазвао тешку дијареју у групи дивљих врста, док су мишеви са недостатком АИМ2 значајно смањили озбиљност дијареје (Слика 5Б). Смањена тежина болести праћена је и смањењем скраћења танког црева (слика 5Ц-5Д), али не и скраћивањем дебелог црева, код мишева са недостатком АИМ2 (додатне информације, слика С5А). Хистопатологија илеума открила је да су мишеви са недостатком АИМ2 побољшали инфилтрацију инфламаторне ћелије и оштећење слузнице, укључујући улцерације епитела, субмукозни едем (слика 5Е) и скраћивање вилија (слика 5Ф), након изазивања ЦПТ-11. Супротно томе, није било очигледних промена у хистопатологији дебелог црева (допунске информације, слика С5Б). Ова запажања су показала да АИМ2 погоршава цревни мукозитис изазван ЦПТ-11.

Image

Мишеви са мањком АИМ2 показују атенуирани цревни мукозитис и пролив након третмана ЦПТ. (АЛ) ВТ и АИМ2 - / - Ц57БЛ / 6 мишеви су третирани са ЦПТ-11 (90 мг / кг, ип) дневно током 4 узастопна дана и жртвовани на дан 5 (БЈ), 3 узастопна дана и жртвовани 4. дана ( КЛ) или свакодневно надгледана ради преживљавања (А) ( н = 6 по групи). (А) Опстанак мишева; (Б) оцене процене дијареје; (Ц) слике танког црева; (Д) дужина танких црева; (Е) репрезентативне слике Х&Е обојења одсека илеума. Вага, 100 µм; (Ф) дужина вилуса у односу на однос дубине крипте у пресецима илеума обојеног Х&Е; (ГИ) производња ИЛ-1β, ИЛ-18 и ИЛ-6 у текућини за испирање перитонеума. Један милилитар ПБС-а убризган је у перитонеалну шупљину и прикупљен за анализу цитокина; (Ј) Производња ИЛ-1п у експлицитној течности из комада илеума дужине 2 цм; (К) имуноблотска анализа каспазе 1 п10 у илезним лизатима третираним ЦПТ-11 (90 мг / кг, ип) током 3 узастопна дана; (Л) дензитометријска квантификација интензитета опсега п10 у односу на β-актин у (К) . (МП) АИМ2 - / - химера мишеви конструисани су пресађивањем ћелија коштане сржи из ВТ (ВТ> ВТ) или мишера са недостатком АИМ2 (АИМ2 - / - > ВТ) у смртоносно озрачене Ц57БЛ / 6 мишеве. Затим су мишеви изазвани са ЦПТ-11 (50 мг / кг, ип) 7 узастопних дана и жртвовани 9. дана. (М) Промене телесне тежине; (Н) слике танког црева; (О) дужина танких црева; (П) репрезентативне слике Х&Е обојења илеузних пресека 9. дана Вага, 200 µм (горња) или 100 µм (доња). Сваки симбол представља један миш , О) . Подаци су репрезентативни за три независна експеримента и приказују средство ± СЕМ. * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001. НС, није значајно; ВТ, дивљи тип.

Слика пуне величине

У складу са заштитним фенотипом мишева са недостатком АИМ2, ЦПТ-11 је индуцирао масовну акумулацију ИЛ-1β и ИЛ-18 у перитонеалној течности за испирање у мишева дивљег типа (Слика 5Г-5Х) мерено 7. дана након изазивања ЦПТ-11. Штавише, нису откривене разлике у ослобађању дсДНА између мишева дивљих врста и АИМ2 (недостатак информација, слика С5Ц). Супротно томе, иако је ЦПТ-11 такође покренуо лучење ИЛ-6, није било разлике између дивљег типа и мишева са недостатком АИМ2 (Слика 5И). Слично томе, зрела секреција ИЛ-1β је била високо индукована ЦПТ-11 у експлантатима илеума и значајно је атенуирана код мишева са недостатком АИМ2 (Слика 5Ј). Да би се потврдила активација АИМ2 инфламазома ин виво , активност каспазе 1 п10 у цревима је одређена имуноблотском анализом. Након примјене ЦПТ-11, мишеви са недостатком АИМ2 показали су смањен активни п10 у илеуму (слика 5К-5Л), али не и у дебелом цреву (Додатне информације, слика С5Д-С5Е). Ови подаци показали су да АИМ2 модулира цревни мукозитис на начин овисан о производњи ИЛ-1β и ИЛ-18, сугерирајући да ЦПТ-11-активира само-ДНК изазвану АИМ2 индукцију упала.

Ху и др . 49 извештава да је АИМ2 инфламација у цревним епителним ћелијама била последица гастроинтестиналног синдрома. Да бисмо додатно потврдили укљученост АИМ2 активације у имунолошке ћелије, генерисали смо химерне мишеве трансплантацијом ћелија коштане сржи из давалаца дивљих врста или АИМ2 дефицитарних у смртоносно озрачене Ц57БЛ / 6 мишеве. Учинковитост реконституције потврђена је проточном цитометријском проценом обојења ЦД45.1 и ЦД45.2 (најмање 95%, подаци нису приказани) и испитивањем нивоа експресије АИМ2 у спленоцитима и ћелијама цревног епитела. Експресија АИМ2 у спленоцитима дивљег типа мишева реконституисаних коштаном срж-мањком дефицита АИМ2 (АИМ2 - / - > ВТ) била је значајно исцрпљена, у поређењу с оним код мишева дивљег типа који су реконституисани коштаном сржи АИМ2 дивљег типа (ВТ> ВТ). У међувремену, експресија АИМ2 у епителним ћелијама црева између АИМ2 - / - > ВТ и ВТ> ВТ мишева била је упоредива (Додатне информације, Слика С5Ф-С5Г). У складу са фенотипом мишева са недостатком АИМ2, АИМ2 - / - > ВТ мишеви показали су мањи губитак телесне тежине (слика 5М) и скраћење танког црева (слика 5Н и 5О) у односу на ВТ> ВТ мишеве након изазивања ЦПТ-11. Доследно, хистопатолошка анализа илеума показала је мања оштећења црева код АИМ2 - / - > ВТ мишева (слика 5П). Ови подаци заједно истичу улогу АИМ2 у урођеним имуним ћелијама у посредовању цревне токсичности изазване ЦПТ-11.

АИМ2 модулира цревни мукозитис изазван ЦПТ-11 независно од микробиоте црева

Цријево сисара колонизирало је велике количине микроорганизама, углавном бактерија, које се обично називају микробиота 50, 51 . Микробна ДНК је још један лиганд АИМ2-ове упала. Интеракције домаћина и микробиота могу бити обострано корисне или штетне, подстичући упалу црева 52 . Да бисмо утврдили да ли је микробна ДНК из цревне микробиоте неопходна за ефекат недостатка АИМ2 на мукозитис изазван ЦПТ-11, користили смо коктел антибиотика за уклањање микробиоте. Ефикасност исцрпљивања потврђена је проценом броја копија бактерија 16С рДНА у фекалијама (Додатне информације, Слика С6А). Након исцрпљивања микробиоте, мишеви са недостатком АИМ2 показали су значајно смањено скраћивање танког црева после изазивања ЦПТ-11 (Додатне информације, Слика С6Б). Хистопатолошка анализа илеума открила је да исцрпљивање микробиоте посредовано антибиотицима нема утицаја на архитектуру црева. Важно је да су мишеви са недостатком АИМ2 штитили упалну инфилтрацију изазвану ЦПТ-11, оштећење архитектуре субмукозе и улцерацију у одсуству микробиоте црева (допунске информације, слика С6Ц). Следеће смо проценили ниво активације упалема у одсуству микробиоте. Мањак АИМ2 је такође био повезан са значајним смањењем цепања активне каспазе 1 п10 (Додатне информације, слика С6Д-С6Е). Колективно, ови резултати сугерирају да микробна ДНК није повезана са активацијом АИМ2 упаломасом и да само-ДНК заузима доминантну улогу током давања ЦПТ-11.

Инхибиција запаљења ублажава цревну токсичност изазвану ЦПТ-11

Узети заједно, наши резултати сугерирају да инхибиција АИМ2 инфламације може да пружи терапијско решење за управљање цревном токсичношћу изазваном ЦПТ-11. Упркос недостатку специфичних инхибитора за овај пут, талидомид, имуномодулаторни лек који инхибира активацију инфламације 53, 54, могао би бити опција за ублажавање дсДНА посредоване активације АИМ2 упалама. Код мишева Ц57БЛ / 6, комбиновани третман талидомидом смањује губитак тежине изазван ЦПТ-11 (слика 6А) као и скраћење црева (слика 6Б-6Ц). Такође је у великој мери преокренуо хистопатолошко оштећење (слика 6Д-6Е), подржавајући његов терапеутски потенцијал за спречавање цревне токсичности изазване ЦПТ-11. Важно је да третман талидомида није умањио анти-туморски ефекат ЦПТ-11. У моделу МЦ38 ксенографта, талидомид је спасио губитак тежине изазван ЦПТ-11 (слика 6Ф) и хистопатолошка оштећења (слика 6Ј), без утицаја на ефикасну инхибицију раста тумора третманом ЦПТ-11 (слика 6Г-6И).

Image

Инхибиција цревне токсичности изазване инфламацијом амелиората ЦПТ-11. (АЕ) Ц57БЛ / 6 мишеви су примењени са ЦПТ-11 (90 мг / кг, ип) 4 узастопна дана или талидомидом (ТХА, 100 мг / кг, по) дневно од 1 дана пре давања ЦПТ-11 до жртвовања. Дана 7 након прве примене, мишеви су жртвовани, а црева су изолована ради даље анализе ( н = 6 по групи). (А) промене телесне тежине; (Б) слике танког црева; (Ц) дужина танких црева; (Д) репрезентативне слике Х&Е бојења пресека илеума. Вага, 200 µм (горња) или 100 µм (доња); (Е) анализа дужине вилуса у односу на однос дубине крипте у пресецима илеја обојених од Х&Е од (Д) . (ФЈ) Ц57БЛ / 6 мишевима убризгано је МЦ38 туморских ћелија да би се створио модел који носи тумор. Десет дана након ињекције, мишеви који носе тумор су примењени са ЦПТ-11 (75 мг / кг, ип) 4 узастопна дана и ТХА (100 мг / кг, по) дневно од 1 дана пре давања ЦПТ-11 до жртвовања. Петог дана после прве примене, мишеви су жртвовани, а црева су изолована за даљу анализу. (Ф) промене телесне тежине; (Г) величина тумора; (Х) тежина тумора на дан 5; (И) слике тумора 5. дана; (Ј) репрезентативне слике одсека илеума обојених у Х и Е. Вага, 100 µм. (К) Модел цревне токсичности посредоване дсДНА активирањем упаломаома током давања ЦПТ-11. Подаци су репрезентативни за три независна експеримента и приказују средство ± СЕМ. * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001. НС, није значајно.

Слика пуне величине

Дискусија

Пролив је уобичајена нуспојава хемотерапије рака 55 . У многим случајевима дијареја може бити лек који ограничава лечење или опасан по живот, што резултира дехидрацијом, шоком, оштећењем бубрега и поремећајима електролита 56 . Третман са 5ФУ, оксалиплатином, капецитабином и алкилирајућим агенсом цисплатином такође може да изазове тешку дијареју, али ова нуспојава је мање уобичајена код ових третмана него код третмана ЦПТ-11 27 .

У овој студији открили смо да је, од укупно 69 узнапредовалих болесника са ЦРЦ-ом, ∼ 40% показало дијареју степена 1-3 (Додатне информације, Слика С1А). Јачина дијареје је показала блиску повезаност са већом продукцијом дсДНА. Такође смо открили да ЦПТ-11 директно покреће ћелије цревног епитела да отпушта дсДНА на егзосом посредовани начин. Отпуштање дсДНА изазване ЦПТ-11 из нормалних ћелија црева активирало је АИМ2 упалузом у урођеним имунолошким ћелијама, објашњавајући прекомерни цревни упални одговор после овог третмана (Слика 6К). Изузетно висока учесталост ЦПТ-11 можда је резултат високе концентрације активног ЦПТ-11 који се одржава у цревном микро окружењу и била је повезана са прекомерном изложеношћу дсДНА у мишјем моделу (Слика 4). In our study, we also found that dsDNA release was not restricted to CPT-11, and was also induced by another chemotherapeutic agent cisplatin (Supplementary information, Figure S1D). However, whether other chemotherapeutic-induced diarrhoea events are associated with release of self-dsDNA should be further explored.

AIM2 is commonly known as a DNA sensor that assembles and is part of the inflammasome complex. However, AIM2 mutations are frequently identified in CRC patients. Recently, two studies highlighted the role of AIM2 in modulating colorectal tumourigenesis via distinct mechanisms, both of which were inflammasome-independent. Вилсон ет ал . 57 revealed that AIM2 suppressed colon tumourigenesis by inhibiting DNA-PK-mediated AKT activation, whereas another study indicated that AIM2 regulated stem cell proliferation in the intestinal mucosa 58 . Our results advance the current understanding of the role of AIM2 in CRC by revealing an inflammasome-dependent role that exacerbates chemotherapy-induced intestinal mucositis and diarrhoea. Of note, a very recent study reported that the AIM2 inflammasome was also essentially required in intestinal epithelial cells for irradiation-induced gastrointestinal syndrome. The mechanistic insights pointed to the role of nuclear AIM2, which is believed to sense radiation-induced DNA damage in the nucleus and mediates inflammasome activation and cell death 49 . These two studies complemented each other in advancing an understanding of the essential role of AIM2 in radiation and chemotherapy in relation to intestinal toxicity.

dsDNA recognition by different sensors has been extensively studied, yet a mechanistic link explaining the access of tumour cell-derived dsDNA relative to immune cells is lacking. Tumour-derived immune cell activation is mediated by soluble factors as well as by extracellular vesicles known as exosomes and microparticles 42 . In the present study, we demonstrated that CPT-11 induced rapidly proliferating cells, including tumour cells and intestinal epithelial cells, to release host DNA in an exosome-dependent manner. Exosomes are endosome-derived organelles with a diameter of 10-100 nm that contain proteins, lipids, RNA, DNA, and other molecules 39 . Like microparticles, exosomes mediate intercellular communication between tumour and immune cells and regulate immune signalling 41 . Exosomes function as “drivers” to deliver self-DNA into the cytosol of macrophages and DCs. These findings solve the unanswered question of how free DNA traverses the cell membrane to gain access to targeting sensors.

Treatment with CPT-11 can disrupt the intestinal mucosal barrier with increased epithelial apoptosis 27 . Rapid initiation of excessive epithelial apoptosis disrupts the barrier architecture and causes subsequent gut microbial translocation. This may be an important mediator in CPT-11-induced intestinal mucositis, as in dextran sulphate sodium-mediated colitis, which is induced mainly by translocation of gut bacteria. However, under conditions of gut microbiota depletion, a previous study 59 and our data (Supplementary information, Figure S6) revealed that intestinal damage and inflammatory cell infiltration also occurred upon CPT-11 challenge. These data suggest that the microbiota in the intestine were not the essential mediators and that excessive apoptosis may trigger intestinal damage via release of immunogenic mediators.

The immunogenicity of apoptotic cell death is controversial. In general, physiological cell death (apoptosis) is thought to be intrinsically tolerogenic, whereas pathological cell death (necrosis) is inherently immunogenic 60 . However, in-depth investigations have revealed that apoptotic cells can also be highly immunogenic, whereas necrotic cells are less immunogenic than cells undergoing an immunogenic form of apoptosis 61, 62 . Chemotherapy-induced cell death occurs frequently through apoptosis, including irinotecan administration 63 . However, whether self-DNA from chemotherapy-mediated apoptosis provides a dangerous or a friendly signal to the host has not been fully characterized. Here, we report that self-dsDNA released by irinotecan induction can, in part, activate the AIM2 inflammasome, which may provide new insights into the immunogenicity of chemotherapy-induced apoptosis.

In addition to mechanistic insight, this study has identified a potentially valuable potential therapeutic application by providing a mechanism-based rationale for combating diarrhoea. The concurrent inhibition of AIM2 by an inflammasome inhibitor, thalidomide, alleviated CPT-11-induced intestinal toxicity without compromising its anticancer efficacy. Because thalidomide is clinically available for the treatment of multiple myeloma or solid tumours, our findings may be readily translated into a therapeutic opportunity that could be rapidly tested in clinical trials. Moreover, the exploration of therapeutic opportunities for thalidomide together with other compounds could also be promising.

Прилози аутора

QL, JX and SY performed the experiments and analyzed the data; MH, JD, BS and MG conceived the project and provided supervision; HD collected patients serum samples; XS and AB contributed to animal experiments; QL, JX and MH wrote the manuscript. All the authors provided comments and suggestions to the manuscript.

Конкурентски финансијски интереси

Аутори изјављују да не постоје противно финансијски интереси.

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Додатне информације, слика С1

    CPT-11 triggers double-strand DNA release in vivo and in vitro.

  2. 2

    Додатне информације, слика С2

    CPT-11-induced dsDNA release activates the AIM2 inflammasome.

  3. 3.

    Додатне информације, слика С3

    Released dsDNA can be transferred into macrophages via exosomes..

  4. 4.

    Додатне информације, слика С4

    Exosome DNA induces inflammation.

  5. 5.

    Додатне информације, слика С5

    AIM2 deficient mice exhibit attenuated intestinal mucositis and diarrhoea upon CPT treatment.

  6. 6

    Додатне информације, слика С6

    Intestinal microbiota depletion does not impede AIM2 deficiency-mediated protection against CPT-11 administration.

    ( Додатне информације повезане су са интернетском верзијом рада на веб локацији Целл Ресеарцх .)