Увјетни мутанти миша истичу механизме дјеловања хормона који лучи кортикотропин на понашање у борби са стресом | молекуларна психијатрија

Увјетни мутанти миша истичу механизме дјеловања хормона који лучи кортикотропин на понашање у борби са стресом | молекуларна психијатрија

Anonim

Апстрактан

Хиперсекреција централног хормона који ослобађа кортикотропин (ЦРХ) подразумевала се у патофизиологији афективних поремећаја. И основне и клиничке студије сугерисале су да поремећај ЦРХ сигнализације путем ЦРХ рецептора типа 1 (ЦРХ-Р1) може побољшати клиничка стања повезана са стресом. Да бисмо проучили ефекте блокаде ЦРХ-Р1 на понашања и неурохемијске промене изазване ЦРХ-ом, створили смо различите мишје линије које прекомерно изражавају ЦРХ у различитим просторно ограниченим обрасцима. Прекомерна експресија ЦРХ-а у целом централном нервном систему, али не и када је прекомерно изражена у одређеним предбраздним регионима, резултирала је хиперсекрецијом хормона стреса изазваном стресом и појачаним активним понашањем у борби са стресом, одраженим смањеном непокретношћу у тесту принудног пливања и испитивању огибљења. Ове промене биле су повезане са акутним ефектима прекомерно експримираног ЦРХ-а пошто су биле нормализоване лечењем антагониста ЦРХ-Р1 и рекапитулирале ефекат активирања ендогеног ЦРХ-а изазваног стресом. Штавише, идентификовали смо појачану норадренергичку активност као потенцијални молекуларни механизам који стоји у основи повећаног активног понашања у борби са стресом примећеног код ових животиња. Према томе, ове трансгеничне линије миша могу послужити као животињски модели за патологије изазване стресом и лечењем које циљају централни ЦРХ систем.

Увод

Кортикотропин-ослобађајући хормон (ЦРХ) - такође означен као кортикотропин-ослобађајући фактор (ЦРФ) - важан је у координацији неуроендокриних, аутономних, бихевиоралних и имунолошких одговора на различите стресне подражаје. 1 Поред своје функције главног физиолошког регулатора система хипоталамичког-хипофизно-адренокортикалног (ХПА), ЦРХ је способан да модулира широк спектар понашања, укључујући понашање везано за анксиозност, узбуђење, сензорну обраду информација, учење и памћење, као и локомоторна активност. 2, 3, 4 Већина понашајних ефеката ЦРХ приписују се екстрахипоталамичким неуронским круговима, укључујући некортикалне, лимбичке и мождане структуре у којима ЦРХ делује као неуромодулатор. Дисрегулација ЦРХ система и пратећи хронично повишени нивои ЦРХ умешани су у људске стресне и афективне поремећаје, укључујући анксиозне поремећаје и велику депресију. 5, 6, 7 У овој линији, повишени нивои ЦРХ у цереброспиналној течности, 5 повећани број ЦРХ и ЦРХ / аргинин вазопресин који експресирају неуроне и повишен ниво ЦРХ мРНА у паравентрикуларном језгру хипоталамуса (ПВН), 8 такође као што су смањена места везивања ЦРХ у предњем кортексу доказана код депресивних пацијената. Поред тога, студије на животињама које укључују централну примену ЦРХ откриле су фенотипске промене које подсећају на симптоме који су примећени код погођених субјеката. 4 Штавише, антагонисти рецептора ЦРХ могу да ублаже последице стреса у понашању, подвлачећи улогу ендогене ЦРХ у посредовању многих понашања изазваних стресом. Коначно, клиничка испитивања показала су ефикасност селективног антагониста рецептора ЦРХ типа 1 (ЦРХ-Р1) у лечењу депресивних пацијената. 9

За разлику од класичних антидепресива који модулирају моноаминергички систем, антагонисти рецептора ЦРХ нису дали упоредиве резултате у парадигми скрининга антидепресива код глодара, као што је тест присилног пливања (ФСТ) или тест о суспензији репа. 10 У овим тестовима животиње су проучаване у базалним условима. Међутим, према хипотези Хокфелт-а и Лундберга, 11 неуропептида, за разлику од моноамина, излучују се у знатним количинама под патолошким условима или јаким стресом. Сходно томе, анксиолитички сличне активности ЦРХ-Р1 антагониста као што су ДМП696 и Р121919 најбоље се примећују код животиња које имају повишен ниво ЦРХ и хиперреактивне су или више подложне стресу. 12 Ови налази су у сагласности са појачаним одговором хормона стреса код здравих људи претходно лечених антагонистом ЦРХ-Р1. 13 Да би се проучавали ефекти централне хиперактивности ЦРХ на животињском моделу, успостављене су ЦРХ трансгене мишје линије које изражавају ЦРХ било под контролом широко активног металотионеина (ЦРХ-Тг) или Тхи-1.2 ограниченог централног нервног система (ЦНС) ЦРХ-ОЕ 2122 ) промотор. 14, 15 У оба случаја, неограничена ЦРХ претјерана експресија резултирала је повишеним нивоом адренокортикотропина (АЦТХ) и кортикостерона праћеним симптомима синдрома сличног Цусхингу, што комплицира интерпретацију резултата понашања повезаних са стресом. Да бисмо заобишли ове проблеме, развили смо модел миша који дозвољава прекомерну експресију ЦРХ без стварања изражених неуроендокриних поремећаја у базалним условима. Комбиновање убацивања једног примерка мишје Црх цДНА у локус 16 РОСА26 ( Р26 ) са системом Цре / локП омогућило нам је да прекомерно експримирамо ЦРХ на просторно-временски регулисан начин у различитим дозама. Активирали смо ЦРХ експресију у целом мозгу и у специфичним врстама неурона у предњем мозгу помоћу Нес-цре , 17 Цамк2а-цре 18 и Длк-цре . 19 Показали смо да је овај приступ ефикасан начин за проучавање понашања и неуроендокриних ефеката просторно затворене ЦРХ прекомерне експресије код мишева.

материјали и методе

Вектор циљања

Циљани вектор заснован је на пРОСА26-1 који је носио 5.5-кб хомологију мишјем РОСА26 локусу ( Р26 ) и касету за експресију дифтеријског токсина (ДТА). 20 Конструисан је увођењем следећих компоненти у јединствену Ксба И локацију пРОСА26-1: акцептор спајања аденовируса (СА), локП , ПГК-Нео - укључујући ПГК секвенцу полиаденилације (пА) и две копије СВ40 пА ( ПГК - Нео -3 × пА), локП , ИРЕС-ЛацЗ и говеђи хормон раста (бГХ) пА (од 5 'до 3'). СА и бГХ пА су субклонирани из пСАβгео. 21 ИРЕС-ЛацЗ је изолован и модификован из ЕТЛпА- / ЛТНЛ. 22 ПГК - касета са фоком пк - Нео -3 × пА је амплификована ПЦР из геномске репне ДНК репортерских мишева Р26 . 20 ДТА касета је инвертирана и истовремено је уведено место Сва И за линеаризовање. ЦдНА мишјег Црх је убачена на јединствено место Пац И између другог локП места и касете ИРЕС-ЛацЗ . Спољне сонде коришћене за идентификацију хомологних рекомбинација појачане су ПЦР-ом из геномске ДНК и клониране помоћу ТОПО ТА клонирајућег комплета (Инвитроген, Карлсрухе, Немачка). 5'-сонда: напријед 5 '-ГЦГ-АГА-ЦТЦ-ГАГ-ТТА-ГГЦ-3' и натраг 5 '-ГЦГ-ГЦЦ-ГЦЦ-ГЦЦ-ЦГЦ-ЦТГ-ЦГ-3' (150 бп); 3 'сонда: напред 5'-ГТТ-ГАГ-ЦЦА-ЦТГ-АГА-АТГ-Г-3 'и назад 5'-ГАА-АЦТ-АЦА-АЦЦ-АТТ-ГТТ-ЦАТ-3 '(662 бп) .

Генерација условних ЦРХ мишева са прекомерним притиском

Линеаризовани циљни вектор је електропорисан у ћелије ембрионалних матичних (ЕС) ТБВ2 (129С2). Мутантни ЕС ћелијски клонови идентификовани су анализом Соутхерн блот анализе геномске ЕС ћелијске ДНК дигестиране Ецо РВ или Апа И користећи спољну 5 '- или 3'-сонду. Мутантне ЕС ћелије коришћене су за генерисање химерних мишева ињекцијом бластоцисте. Пренос гермино-модификованог алела Р26 ( флокЦрх флокед стоп) Р26 потврђен је у потомству мушких химера узгајаних на дивље врсте мишева Ц57БЛ / 6Ј. За условну, ЦНС-рестриктивну прекомерну експресију ЦРХ (ЦРХ-ЦОЕ-Нес), добијени Р26 + / флопЦрх мишеви су прешли на трансгеничне мишеве трансгених нестина ( Нес ). 17 Резултирајући хетерозиготни Р26 + / флопЦрх и Р26 + / флопЦрх Нес-цре Ф 1 животиње су пресрећене да би се добиле животиње из генерације Ф2 жељених генотипова: Р26 + / + (ЦРХ-ЦОЕ вт -Нес), Р26 флопЦрх / флопЦрх (ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес), Р26 + / флопЦрх Нес-цре (ЦРХ-ЦОЕ хет -Нес) и Р26 флопЦрх / флопЦрх Нес-цре (ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес). За прекомерну експресију ЦРХ у главном мозгу у главним неуронима (ЦРХ-ЦОЕ-Цам), Р26 + / флопЦрх мишеви су прешли на трансгеничне мишеве Цамк2а-кре . 18 Као што је горе, Р26 + / + (ЦРХ-ЦОЕ вт -Цам), Р26 флопЦрх / флопЦрх (ЦРХ-ЦОЕ цон -Цам), Р26 + / флопЦрх Цамк2а-цре (ЦРХ-ЦОЕ хет -Цам) и Р26 флопЦрх / флопЦрх Цамк2а-цре (ЦРХ-ЦОЕ хом -Цам) животиње су добијене у генерацији Ф2. ЦРХ-ЦОЕ-Длк мишеви прекомерно експримирају ЦРХ у ГАБАергичким неуронима предњег мозга су, према томе, генерисани коришћењем Длк5 / 6 ( Длк ) -цре мишева. 19

Генотипизација је изведена помоћу ПЦР примера: РОСА-1, 5, 5'-ААА-ГТЦ-ГЦТ-ЦТГ-АГТ-ТГТ-ТАТ-3 '; РОСА-2, 5 '-ГЦГ-ААГ-АГТ-ТТГ-ТЦЦ-ТЦА-АЦЦ-3' и РОСА-4, 5 '-ГГА-ГЦГ-ГГА-ГАА-АТГ-ГАТ-АТГ-3'. Стандардни ПЦР услови резултирали су дивљим типом од 398 бп и мутираним ПЦР производом од 320 бп. Присуство Нес- , Цамк2а- и Длк-кре је процењено коришћењем прајмера ЦРЕ-Ф, 5'-ГАТ-ЦГЦ-ТГЦ-ЦАГ-ГАТ-АТА-ЦГ-3 'и ЦРЕ-Р5'-ААТ-ЦГЦ- ЦАТ-ЦТТ-ЦЦА-ГЦА-Г-3 'резултирало је производом ПЦР од 574 бп. Генотипови су потврђени анализом Соутхерн блот-а Ецо- РВ-дигестиране репне ДНК коришћењем 5'-сонде и сонде специфичне за Цре-рекомбиназу. 23 Ефикасност ексцизирања секвенције транскрипционих терминатора посредована Нес- кре - ом демонстрирана је Соутхерн блот анализом генске ДНК дигестиране ЕцоР В припремљеном од кортекса, хипокампуса, таламуса, церебелума, репа и јетре коришћењем спољне сонде 5′. Мишеви коришћени за ову студију држени су на мешовитој позадини 129С2 / Св × Ц57БЛ / 6Ј.

Бојење Кс-Гал

Животиње (старе од 2 до 3 месеца; н = 4–5 по генотипу) су убијене прекомерном дозом изофлурана и транскардно перфузиране са 4% параформалдехидом, 2 м М МгСО 4 и 5 м М ЕГТА. Накнадно бојење Кс-Гал-ом је изведено на слободно плутајућим секцијама вибратора од 50 или 100 µм или на нетакнутим органима као што је претходно описано. 22

Ин ситу хибридизација

Мишеви (стари 10 недеља) убијени су ујутро (10:00 ујутро) прекомерном дозом изофлурана. За квантификацију непосредних раних гена (ИЕГ) ц-фос и зиф268 животиње су или убијене под базалним условима или подвргнуте 10 мин присилног пливања 30 мин пре убијања. Мозак је пажљиво уклоњен и одмах је смрзнут на сувом леду. Смрзнути мозак исечен је на криостату у пресецима дебљине 20 µм. За квантитативне ин ситу хибридизацијске одсеке кристастата ЦРХ-ЦОЕ цон и ЦРХ-ЦОЕ хом мозгови су монтирани један поред другог на тобоганима СуперФрост Плус (Мензел ГмбХ, Браунсцхвеиг, Немачка). Овим поступком је омогућена паралелна ин ситу хибридизација секција под идентичним условима уз обезбеђивање смислене квантификације и поређења сигнала хибридизације. Сви одсеци су обрађени за ин ситу хибридизацију према модификованој верзији поступка који су описали Дагерлинд и др. 24 Коришћене су следеће рибопробе: ЦРХ, нуклеотиди 1306–1661 о приступању ГенБанк бр. АИ128673; ендогени ЦРХ (3'-УТР), нуклеотиди 1816–2107 о приступању ГенБанк бр. АИ128673; ЦРХ-Р1, нуклеотиди 1570–2273 о приступању ГенБанк бр. НМ_007762; ц-фос, нуклеотиди 608–978 о приступању ГенБанк бр. НМ_010234; зиф268, нуклеотиди 245–786 о приступању ГенБанк бр. НМ_007913 и ЛацЗ, нуклеотиди 192–569 о приступању ГенБанк бр. У46489. Специфичне рибопробе су генерисане ПЦР применом Т7 и Т3 или СП6 прајмера коришћењем плазмида који садрже горе поменуте цДНА као шаблоне. Антисенске и осећајне цРНА сонде преписане су са 200 нг одговарајућег ПЦР производа и директно коришћене као предложак за синтезу радиоактивно обележених транскрипата ин витро транскрипцијом са 35 С-УТП (Амерсхам Биосциенцес, Писцатаваи, Њ, УСА) коришћењем Т7 и Т3 РНА полимераза (Роцхе, Пензберг, Немачка). Након 20 мин третмана ДНасе И (Роцхе), сонде су пречишћене РНеаси Цлеануп протоколом (Киаген, Хилден, Немачка) и мерене у сцинтилацијском бројачу. За хибридизацију, пресеци су претходно третирани и прехибридизирани као што је претходно описано. 24 Након тога, хибридизирани су преко ноћи са концентрацијом сонде 7 × 1 6 цпм мл -1 на 57 ° Ц и испрани на 64 ° Ц у 0, 1 × физиолошком раствору натријум-цитрата (ССЦ) и 0, 1 м М дитиотреитола. Хибридизирани тобогани умочени су у ауторадиографску емулзију (тип НТБ2; Еастман Кодак, Роцхестер, НИ, УСА), развијену након 3-6 недеља и супротстављени крезикалном љубичицом.

За квантификацију, дигитализовани су ауторадиографи и одређени релативни нивои мРНА помоћу компјутерски подржане оптичке дензитометрије (ИмагеЈ; //рсб.инфо.них.гов/иј/). За ин ситу хибридизације примењено је три различита времена излагања како би се осигурало да су сигнали који су квантификовани били у линеарном опсегу.

ЦРХ радиоимуноанализа

Мишеви (стари од 2 до 3 месеца) убијани су дислокацијом грлића материце у 10:00 ујутру. Мозак је пажљиво уклоњен и коришћен у целини или даље сециран за селективну припрему коре, хипокампуса и таламуса. ЦРХ-специфични радиоимуно-тест (РИА) на ткивним хомогенатима изведен је након претходне екстракције као што је претходно описано. 25

Ендокринске анализе

Две недеље пре експеримената, од 3- до 5 месеци старе животиње су раздвојене и смештене у јединствену светлост од 12:12 х: таман распоред (светла се искључују у 19:00). Сви експерименти и анализе података изведени су одвојено за мушке и женске животиње. Да би се одредио ниво базалног хормона у плазми, мишеви су остављени неометани током целе ноћи пре експеримента. Узорковање крви извршено је у рано јутро (07: 30–09: 30 сати) и поподне (04: 30–05: 30 сати) прикупљањем крви из дебла од животиња које су брзо обглављене под лаганом анестезијом изофлуране или урезом репа, са време од првог руковања животињом до завршетка крварења које није дуже од 45 с. За процену ендокриног одговора на стрес, узели смо узорке крви одмах после и 30 минута након 10-минутног рестриктивног стреса, за које су животиње смештене у конусну епрувету од 50 мл са уклоњеног дна. Експерименти са стресом су вршени ујутро (07: 30–10: 00). Концентрације кортикостерона у плазми и АЦТХ мерене су у дупликату комерцијално доступним РИА сетовима (ИЦН Биомедицалс, Ирвине, ЦА, САД).

Субјекти за тестирање у понашању

Мишеви су појединачно смештени 2 недеље пре експеримената у стандардним лабораторијским условима (22 ± 1 ° Ц, 55 ± 5% влажности) са храном и водом ад либитум под обрнутим светлом: тамни распоред 12:12 х (светла у 09:00 ). Старост тестираних животиња кретала се у распону између 3 и 6 месеци. Експерименти на животињама спроведени су у складу са Водичем за негу и употребу лабораторијских животиња Владе Баварске. Експерименти су изведени током мрачне, активне фазе на животињама између 01:00 и 18:00 сати у условима црвеног светла, осим ако није другачије наведено. Понашање животиња у репној суспензији и ФСТ анализирали су на мрежи обучени посматрачи који су били слепи за лечење и генотип. Ако није наведено другачије, за експерименте су кориштени мушки мишеви. Експерименти за процену последица понашања стрес-регулиране активације ендогене ЦРХ изведени су на претходно описаним ЦРХ-Р1 кноцкоут мишевима, 26 који су задржани на мешовитој 129 / Ола × ЦД1 позадини.

Отворено поље

Животиње су тестиране под црвеним светлом у отвореном пољу (висине 26 × 26 × 38 цм) направљеног од белог пода и бистрих пластичних зидова, а опремљене су инфрацрвеним сензорима фотоћелије. Тестирање је трајало 30 мин. Удаљеност и позиционирање су измерени коришћењем програма Тру Сцан Софтваре верзија 1.1 А (Цоулбоурн Инструментс, Аллентовн, ПА, САД) (фреквенција узорковања, 4 Хз).

Присилни тест пливања

Сваки миш је смештен у стаклену чашу од 5 л (висина, 23, 5 цм; пречник, 16, 5 цм) која садржи 15 цм воде на 25 ± 1 ° Ц или 32 ± 1 ° Ц током 6 минута. Вода је измењена између субјеката. Током сваког суђења, плутајуће (непокретност) и време борбе постигнуто је притиском унапред постављених тастера на тастатури рачунара, коришћењем прилагођеног бесплатног софтвера (ЕВЕНТЛОГ). Добијени ехограм λ-канала је даље обрађен прилагођеним софтвером (Винрат верзија 2.31; Хеинз Бартхелмес, МПИ Минхен, Немачка). Мишину су оценили да плута када је зауставио било какве покрете, осим оних који су били неопходни да би држао главу изнад воде. Снажни покрети пливања који су укључивали сва четири мишића удова, а предње шапе су ломиле површину воде, обично код зидова чаше, сматране су мучним. Испитивање је спроведено два дана заредом.

За анализу утицаја рестриктивног стреса на понашање ФСТ-а, животиње су биле подвргнуте 1 х рестриктивног напрезања у 50 мл мл конусној епрувети 4 сата пре излагања принудном пливању према претходно утврђеном протоколу за активирање ЦРХ изазваног стресом. -Р1. 27

Тест огибљења

Животиње су до краја репа објешене љепљивом траком на челичну шипку која је била 35 цм изнад пода. Свака сесија трајала је 6 минута и снимала се на снимку. Трајање непокретности је утврдио обучени посматрач који је био слеп за генотип животиња, користећи ЕВЕНТЛОГ софтвер. Мишеви су се сматрали непокретним само када су пасивно висили без померања удова или главе.

Фармакологија

Сви лекови су свеже припремљени у запремини од 10 мл кг -1 . ДМП696 (Бристол-Миерс Скуибб, Минхен, Немачка) суспендован је у 0, 9% физиолошком раствору који садржи 5% диметил сулфоксида, 5% полиетилен гликола 400 и 10 μл Твеен 80 по 1, 5 мл (све хемикалије из Сигма-Алдрицх, Стеинхеим, Немачка ), и убризгавали су ип 1 х пре ФСТ-а у данима 1 и 2. За анализу утицаја ДМП696 на нивое АЦТХ-а изазваног стресом, мишеви су декапутирани одмах након ФСТ-а, 2. дана.

Пара- хлорофенилаланин метил естер (ПЦПА) и α-метил- пара- тирозин метил естер (АМПТ) (сви лекови из Сигма-Алдрицх-а, Стеинхеим, Немачка) суспендовани су у 0, 9% физиолошком раствору који садржи 1% диметил сулфоксида и примењују се ип ПЦПА (250 мг по кг) давано је два пута дневно (сваких 12 х) током 3 дана, а последња доза је дата 18 х пре ФСТ. 28 АМПТ (200 мг по кг) је примењен као појединачна доза 4 х пре ФСТ. 28

Неурохемијска анализа

Мишеви третирани АМПТ и ПЦПА убијени су директно након ФСТ-а. Мозак је свеже сециран на леду, а хипокампи уклоњени, одмерјени и чувани на -80 ° Ц до анализе. Узорци ткива хипокампала су разређени 20 пута в / в са ХЦл (0, 1 М) у леденој купељи и хомогенизовани ултразвуком (40 с, 75% радни циклус, граница од 3, 5 микро врхова; Брансон сонифиер 250, Сониц Повер Цомпани, Данбури, ЦТ, САД). Хомогенизирано ткиво је затим ултрацентрифугирано (35 000 г , 20 мин, 4 ° Ц; Бецкман Л-60 Ултрацентрифуга, Минхен, Немачка), а резултирајући водени слој је филтриран (0, 22 µм × 13 мм, поливинилилиден флуорид, Миллек филтери; Миллипоре, Бедфорд, ТКС, САД). Филтрат је аликвотиран у 20 µл узорака у одвојене еппендорфне епрувете и чуван на -80 ° Ц до даље анализе.

Одређивање серотонина (5-хидрокситриптамин), 5-хидроксиндол-сирћетне киселине, 3, 4-дихидрофенилоцтене киселине и 4-хидрокси-3-метоксифенилоцтене киселине извршено је течном хроматографијом високих перформанси са реверзном фазом са електрохемијским откривањем, као што је претходно описано. 29 Хипокампални филтрати (20 µл основни раствори) су разблажени, а 50 μл је аутоматски убризган хладеним аутосамплером ЦМА 200 (ЦМА Мицродиалисис АБ, Стоцкхолм, Шведска). Мобилна фаза се састојала од 93% фосфатног пуфера (0, 1 М НаХ2П04, 1 м М натријум октанесулфонске киселине, 10 м М НаЦл и 0, 5 м М На2-ЕДТА) и 7% ацетонитрила, а пХ је подешен на 4, 0 са о -фосфорна киселина (све хемикалије су из Мерцка, Дармстадта, Немачка). За квантификацију ткива норадреналина (НА) и допамина (ДА), хипокампални филтрати (20 μл матичних раствора) су разблажени и концентрација је одређена радиоензимским тестом као што је претходно описано. Ово испитивање укључује ЦОМ-каталирану О- метилацију користећи [3Х] С-аденосилметионин као донора метила и одвајање резултирајућег [3Х] норметанефрина танкослојном хроматографијом (ТЛЦ).

Статистичка анализа

Подаци су анализирани за вишеструко упоређивање употребом једносмерне, дво- или тросмерне анализе варијанце (АНОВА) за поновљене мере, где је то прикладно, након чега је уследио пост-хоц тест Невман-Кеулс вишеструке поређења. За упоређивање у две групе коришћен је непарни Студентов т- тест. Разлике су сматране статистички значајним када је П <0, 05. Подаци су представљени као средња вредност ± сем

Резултати

Генерација мутираних мишева условно прекомерно експримирајући ЦРХ у ЦНС-у (ЦРХ-ЦОЕ-Нес)

Користили смо хомологну рекомбинацију у ЕС ћелијама како бисмо циљали на свеприсутно изражену локусу РОСА26 (Р26) са једном копијом цДНА мишјег Црх-а, а претходила је секвенца транскрипције 'Стоп', окренуто локП-ом (слике 1а-ц). Као што је раније речено, 20 мишева хомозиготних за модификовани алел Р26 ( Р26 флопЦрх / флопЦрх флокед Стоп), који је осетљив на Цре-рекомбиназу, нису разликовали од дивљих врста смећа, бихевиорално (подаци нису приказани), као и у односу на ендогена ЦРХ мРНА (слике 2е и ф) и ниво протеина (слика 3а). Хомозиготни Р26 флопЦрх / флопЦрх мишеви су укрштени у трансгеничне Нес-цре мишеве 17 омогућавајући прекомерну експресију ЦРХ с ограниченом ЦНС код двоструких трансгених животиња (ЦРХ-ЦОЕ-Нес). У овој мишјој линији креирање експресије контролише нестински промотор и неуронски појачивач, који покрећу експресију креираних неуронских и глијалних прекурсора већ ембрионалног дана 10.5. 30 У генерацији Ф2 добили смо Р26 + / +, Р26 флопЦрх / флопЦрх Р26 + / флопЦрх Нес-цре и Р26 флопЦрх / флопЦрх Нес-цре мишеве (Слика 1д), које ћемо назвати ЦРХ-ЦОЕ вт -Нес, ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес, ЦРХ-ЦОЕ хет -Нес и ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес, респективно. На геномском нивоу, Цре-посредовано брисање секвенције транскрипционих терминатора примећено је само у ЦНС-у, али не и у периферним органима мишева ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес (Слика 1е).

Image

Генерација мишева који прекомерно експримирају кортикотропин-ослобађајући хормон (ЦРХ) ограничен на централни нервни систем (ЦНС). ( а ) Стратегија за условно, Цре-посредовано изражавање ЦРХ из локуса Р26 . Карте дјеломичне рестрикције локуса дивљег типа Р26 , циљни вектор, рекомбиновани алел флопЦрх Р26 и активирани алел Р26 Црх (ВТ, фрагмент дивљег типа; МТ, фрагмент мутанта након хомологне рекомбинације; ДЕЛ, фрагмент брисања који настаје услед ексцизирања посредованог Цре-ом „Стоп“ касета; А, Апа И; Е, Ецо РВ; С, Сва И; С, акцептор за спајање; локП места су означена као црне стрелице). ( б ) Анализа јужног блота дивљих врста и циљаних ембрионалних матичних клонова (ЕС). Сонда Р26 5'је хибридизирана у геномску ЕС-ћелијску ДНК гена ЕС-РВ-а. Циљани алел је назначен присуством додатног мутантног фрагмента 4.1-кб. ( ц ) Р26 3'-сонда је хибридизирана на ДНА пробављену Апа И из истих клонова ЕС ћелија потврђујући хомологну рекомбинацију детекцијом додатног фрагмента мутанта на 11, 4 кб. д ) Анализа репне ДНК мишева ЦРХ-ЦОЕ-Нес са Соутх Рт-а истовремено хибридизирана са 5'-сондом и сондом специфичном за Цре-рекомбиназу. Добијени хибридизациони фрагменти одговарају назначеним генотипима. ( е ) Анализа јужњачке блокаде геномске ДНК из Ецо РВ-а из различитих ткива животиње ЦРХ-ЦОЕ -Нес хибридизирана с 5'-сондом, која показује степен брисања посредованог Цре-ом у транскрипцијској секвенцији како је назначено присуство додатног 5.2-кб фрагмента.

Слика пуне величине

Image

Верификација прекомерне експресије кортикотропино-ослобађајућег хормона (ЦРХ) са централним нервним системом (ЦНС) код ЦРХ-ЦОЕ-Нес мишева. Нетакнути органи ( а ) контроле, ( б ) хетерозиготни и ( ц ) хомозиготни ЦРХ-ЦОЕ-Нес мишеви обојени су преко ноћи Кс-Гал. (лево: мозак са кичменом мождином; десно, одозго: јетра, плућа, срце, слезина, тестис са епидидимисом; инлаи: надбубрежна жлезда (лево) и хипофиза (десно). Обратите пажњу на позадинско бојење епидидимиса. Интензивно плаво обојење у мозак и кичмена мождина ЦРХ-ЦОЕ хет - и ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишеви одражавају специфичну прекомерну експресију ИРЕС-ЛацЗ репортер гена специфичног за мозак. Није опажено бојење у периферним органима мишева ЦРХ-ЦОЕ-Нес. Експресија гена ИРЕС-ЛацЗ гена Кс-Гал бојењем на короналним пресецима ( д ) ЦРХ-ЦОЕ цон -, ( г ) ЦРХ-ЦОЕ хет - и ( ј ) ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишевима. Превелика експресија Црх је демонстрирана у ситу хибридизација помоћу специфичне радио-обележене рибопробе која детектује и ендогену и егзогену ЦРХ експресију. Приказани су репрезентативни фотомикрографи тамног поља короналних и сагиталних одсека мозга ЦРХ-ЦОЕ-Нес мишева ( е, ф ) ЦРХ-ЦОЕ са мишевима који приказују приказ карактеристична, хетерогена Црх експресија кроз цео ЦНС са строном г експресија у паравентрикуларном језгру (ПВН) хипоталамуса, централном језгру амигдале (ЦеА), бедреном језгру стриа терминалис (БСТ), олфакторној сијалици (ОБ) и језграма можданог стабљике. Поред тога, пронађени су ЦРХ неурони распршени унутар кортекса (ЦКС) и хипокампуса (ХИП). У ( х, и ) ЦРХ-ЦОЕ хет - и ( к, л ) ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишеви егзогени ЦРХ се експримира у целом мозгу што одговара обрасцу експресије гена ИРЕС-ЛацЗ репортер. Ниво експресије експресије ЦрХ мРНА зависи од дозирања гена, што показује и јачи ин ситу хибридизација сигнала откривених у ЦРХ-ЦОЕ хом - насупрот ЦРХ-ЦОЕ хет -Нес животињама (ац, предња комесија).

Слика пуне величине

Image

Прекомерна експресија кортикотропиног хормона (ЦРХ) са локуса Р26 доводи до повећања садржаја протеина ЦРХ у зависности од гена у ( а ) целом мозгу, ( б ) кортексу, ( ц ) хипокампусу, ( д ) таламусу и ( е ) мозак из мушких ЦРХ-ЦОЕ хет -не (хет) и ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес (хом) мишева у поређењу са ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес (цон) мишевима ( н = 5–12). Садржај ЦРХ у мозгу ЦРХ-ЦОЕ цон -Нише мишева не може се разликовати од дивљих врста ЦРХ-ЦОЕ вт -Нес (вт) мишева. Садржај ЦРХ је дат у виду пг мг -1 тежине влажне марамице. * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001.

Слика пуне величине

Верификација ЦНС-ове ограничене прекомерне експресије ЦРХ код ЦРХ-ЦОЕ-Нес мишева

Да бисмо детаљно процијенили просторну расподјелу егзогене ЦРХ експресије, искористили смо уведени ИРЕС-ЛацЗ репортерски ген, који се ко-активира након креирања ексцизиране секвенције транскрипционог терминара (Слика 1а). Бојење Кс-Гал нетакнутих органа открило је одсуство било ког специфичног бојења у ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес мишевима (Слика 2а). ЦРХ-ЦОЕ хет -Нес и ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишеви су показали интензивно бојење у мозгу и кичменој мождини, док су периферни органи лишени бојења зависног од ЛацЗ . Повећани интензитет бојања у нетакнутом мозгу и кичмени мождини, као и на короналним одсецима мозга ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес у поређењу са ЦРХ-ЦОЕ хет -Нес животињама, одражавао је претпостављени ефекат дозирања гена (слике 2б, ц, г и ј). Условна прекомерна експресија ЦРХ је верификована ин ситу хибридизацијом помоћу рибопробе специфичне за ЦРХ. Код ЦРХ-ЦОЕ кон- нишних мишева, ендогена експресија ЦРХ детектирана је хетерогено широм целог ЦНС-а као што је претходно описано 31 (слике 2е и ф). Код ЦРХ-ЦОЕ хет - и ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишева, образац индукције ЦРХ паралелно је активирао ИРЕС - ЛацЗ репортерски ген, што је показано Кс-Гал бојењем. Експресија егзогене ЦРХ откривена је на различитим нивоима у целом мозгу и приписана је експресији Нес-цре на нивоу ЦНС-а и свеприсутној активности локуса Р26 . ЦРХ мРНА детектирана је на највишим нивоима у олфакторној жаруљи, кортексу и хипокампусу, опет на начин зависан од дозе гена (слике 2х, и, к и л). Штавише, потврдили смо повећани садржај пептида ЦРХ у целом мозгу и различитим деловима мозга ЦРХ-ЦОЕ хет -Нес и ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишева коришћењем РИА-специфичне РИА (слике 3а-е). Није уочена разлика у садржају ЦРХ пептида између ЦРХ-ЦОЕ вт - и ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес мишева (Слика 3а).

Експресија ендогених ЦРХ и ЦРХ-Р1 је измењена у мозгу ЦРХ-ЦОЕ-Нес мишева

Да бисмо истражили промјене у експресији ендогене ЦРХ и ЦРХ-Р1 као одговор на егзогену ЦРХ изражену из локуса Р26 , користили смо ин ситу хибридизацију. Приметили смо снажно смањење нивоа ендогене ЦРХ мРНА у ПВН-у (допунска слика 1ц), у свим областима хипокампуса (ЦА1-ЦА3) и у зубним зубима (допунска слика 1а) ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишева у поређењу за контролу смећа. Међутим, у ЦеА (допунска слика 1б) нивои ендогене ЦРХ мРНА су значајно порасли. ЦРХ-ЦОЕ хом -Не мишеви су показали повећане нивое мРНА ЦРХ-Р1 у хипокампусу и дентатним гирусима (допунска слика 1д). Изненађујуће, ниво ЦРХ-Р1 мРНА у хипокампусу је порастао само у ЦА2 и ЦА3, али не и у ЦА1 (допунска слика 1д). Поред тога, ЦРХ-Р1 експресија је значајно повећана у базолатералној амигдали хомозиготних ЦРХ мишева који су прекомерно експримирали (допунска слика 1е).

ХПА осовина мушких, али не женских ЦРХ-ЦОЕ-Нес мишева преосјетљива је на стрес

Нивои базалног АЦТХ и кортикостерона у плазми нису се значајно разликовали између мушких ЦРХ-ЦОЕ хет - и ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишева током циркадијанског циклуса, ни на дневном кориту, ни на дневном врху (допунске слике 2а и ц). Да би се испитао одговор ХПА оси на стрес, животиње су биле подвргнуте 10 мин суздржавајућег стреса ујутро и убијане директно или 30 мин након завршетка стресора (додатне слике 2б и д). Ограничени стрес резултирао је значајно повишеним нивоима АЦТХ (Ф 2, 32 = 7, 5; П <0, 01) и кортикостерона (Ф 2, 32 = 4, 10; П <0, 05) у мушких ЦРХ-ЦОЕ хет - и ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишева у поређењу ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес литтерматес. Код ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишева ниво кортикостерона остао је значајно повишен 30 мин након стреса у поређењу са ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес и ЦРХ-ЦОЕ хет -Нес мишевима (Ф 2, 27 = 4, 10; П <0, 05).

Слично мужјацима, женке ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес животиње нису показале разлику у базалним нивоима АЦТХ и кортикостерона у поређењу са ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес мишевима (допунске слике 2е и ф). Међутим, за разлику од мушкараца, женке ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишеви такође нису показали повишену секрецију АЦТХ и кортикостерона као одговор на обуздавајући стрес у поређењу са ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес мишевима (допунске слике 2е и ф).

Прекомерна експресија ЦРХ ограничена на ЦНС доводи до смањене непокретности у ФСТ-у и тесту огибљења репа

У отвореном пољу, ЦРХ-ЦОЕ мишеви у кући нису показали разлику у локомоторној активности у поређењу са контејнерима ЦРХ-ЦОЕ (Слика 4а). ЦРХ-ЦОЕ домаћи мишеви показали су појачано истраживачко понашање у поређењу са ЦРХ-ЦОЕ контејнерима, што је назначено повишеним бројем вертикалних покрета (стражњег кретања) ( т 18 = 2, 14, П <0, 05; Слика 4а). За испитивање понашања у борби са стресом, ЦРХ-ЦОЕ-Нес мишеви били су изложени ФСТ-у. Код мушких мишева, прекомерна експресија ЦРХ резултирала је смањењем дозе гена који је плутао у ФСТ-у и првог дана (Ф 2, 30 = 20, 0; П <0, 001) и другог дана (Ф 2, 30 = 15, 0; П <0, 001 ) и са ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес и ЦРХ-ЦОЕ хет -Нес мишевима који плутају знатно мање од ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес литара (Слика 4б). Надаље, прекомјерна експресија ЦРХ резултирала је повећањем дозе овисним у борби са првим даном (Ф 2, 30 = 3, 4; П <0, 05) и 2. дан (Ф 2, 30 = 4, 3; П <0, 05) са ЦРХ-ЦОЕ хом -Не мишеви који се боре углавном више од ЦРХ-ЦОЕ су -Не остаци легла (подаци нису приказани). Женке ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишеви показали су у основи исти фенотип у ФСТ-у као и мужјаци: они су плутали знатно мање од својих ЦРХ-ЦОЕ-коњских носача и у данима 1 и 2 (додатна слика 3а).

Image

Прекомерна експресија кортикотропин-ослобађајућег хормона (ЦРХ) доводи до повећања активног понашања у стресу у парадигми скрининга антидепресива. ( а ) Током 30-минутног излагања отвореном пољу, мушки ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес (хом) мишеви нису показали разлику у укупном растојању премештених у поређењу са ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес (цон) леглом (леви панел). Међутим, ЦРХ-ЦОЕ домаћи мишеви су показали повећане вертикалне покрете (стражње позадине; десни панел, н = 8–12 животиња по генотипу). ( б ) У тесту присилног пливања (ФСТ; 25 ° Ц) прекомерна експресија ЦРХ резултирала је смањењем дозе у плутању и првог дана (д1) и 2. дана (д2) са оба мужјака ЦРХ-ЦОЕ хет - (хет ) и ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес (хом) мишеви који плутају знатно мање од својих мужјака ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес (цон) легла ( н = 9–15 животиња по генотипу). ( ц ) У испитивању репне суспензије мушки ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишеви показали су значајно смањену непокретност у поређењу са мушким ЦРХ-ЦОЕ цон - и ЦРХ-ЦОЕ хет -Нес легломатерима. Подаци су сакупљени из два независна експеримента, који су у основи показали исте резултате, што је резултирало н = 27-30 мишева по генотипу и протоколу. ( д ) ДМП696 (примењено у 10 и 50 мг по кг, ип 1 х пре тестирања у данима 1 и 2) повећава се плутајуће понашање ЦРХ-ЦОЕ хет -Нес мишева у поређењу са контролама третираним носачем (0 мг по кг ) и првог дана (д1) и другог дана (д2) ( н = 12–13 животиња у групи). ( е ) ДМП696 је био у стању да ублажи пораст адренокортикотропина (АЦТХ) изазваног стресом пливања 2. дана у хет мишевима ЦРХ-ЦОЕ у дозама од 10 и 50 мг по кг ( н = 5–6 животиња по групи). ( ф ) Претходна изложеност рестриктивном стресу резултирала је смањеним плутајућим понашањем у тесту присилног пливања у мишева дивљег типа (ЦРХ-Р1 + / + ) рецептора ЦРХ-Р1) у поређењу са нестрпљивим контролама и стресним ЦРХ-Р1 нокаутом (ЦРХ-Р1 - / - ) животиње 1. дана. Ограничени стрес није значајно утицао на плутајуће понашање ЦРХ-Р1 - / - животиња ( н = 13-16 животиња у групи). * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001.

Слика пуне величине

Изложеност хладној води (25 ° Ц) у ФСТ доводи до брзог хлађења тела код мишева. Да би се искључило да фенотип ЦРХ-ЦОЕ хет - и ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишева у ФСТ није проистекао само из бржег смањења телесне температуре у поређењу са ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес литтермати, поновили смо ФСТ на 32 ° Ц температура воде. Такође на 32 ° Ц, мишеви ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес плутали су знатно мање од ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес стељера (додатна слика 3б).

Да би додатно потврдили налаз да ЦРХ промовише смањење непокретности у ФСТ-у, мушке животиње смо подвргли испитивању суспензије репа (ТСТ). 32 Опет, ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишеви показали су значајно смањену непокретност у поређењу са ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес и ЦРХ-ЦОЕ хет -Нес литтермазима (Ф 2, 83 = 8, 9; П <0, 001), није примећена разлика између ЦРХ- ЦОЕ хет -Нес и ЦРХ-ЦОЕ су животиње (Слика 4ц).

Ефекти прекомерне експресије ЦРХ на понашање ФСТ-а могу се поништити селективним ЦРХ-Р1 антагонистом ДМП696

Да бисмо утврдили да се понашања, као и неуроендокрини последице прекомерне експресије, више односе на акутне ефекте ЦРХ него на дугорочне промене у физиологији мозга изазване доживотном прекомерном експресијом ЦРХ, лечили смо мушке ЦРХ-ЦОЕ хет мишеве селективни ЦРХ-Р1 антагонист ДМП696. 33 Зависно од дозе третман антагониста преокренуо је ФСТ фенотип повећањем времена плутања и првог дана (Ф 2, 35 = 4, 4; П <0, 05; Слика 4д) и другог дана (Ф 2, 35 = 4, 4; П <0, 05; Слика 4д). Штавише, ДМП696 је ослабио хиперактивацију оси ХПА изазване стресом пливања (Ф 2, 14 = 10, 6; П <0, 01; Слика 4е).

Условна прекомерна експресија ЦРХ опонаша последице понашања последица активирања ендогеног ЦРХ-а изазваног стресом.

Да бисмо процијенили да прекомјерна експресија егзогених ЦРХ опонаша посљедице понашања посљедица стресно регулиране активације ендогене ЦРХ, анализирали смо ФСТ понашање нокаута ЦРХ-Р1 (ЦРХ-Р1 - / - ) мишева 26 и дивљих врста легла (ЦРХ-Р1 + / + ) без претходног 1-сатног уздржавајућег стреса. У складу с нашим претходним налазима, 34, 35 аблација ЦРХ-Р1 није утицало на плутајуће понашање код наивних животиња, аргументирајући тако опћенито учешће ендогене ЦРХ у понашању ФСТ-а. Међутим, претходно ограничење стреса резултира смањењем плутања у ЦРХ-Р1 + / + мишевима у поређењу са нестресираним ЦРХ-Р1 + / + контролама ( т 27 = 3, 7, П <0, 01), што је било слично понашању ЦРХ-ЦОЕ хет -Нес и ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишеви (Слика 4ф). Плутајући одговор је такође био знатно мањи од одговора на стресне ЦРХ-Р1 - / - мишеве ( т 29 = 3, 1, П <0, 01), на које стресор није имао утицаја ( т 27 = 1, 2, П <0, 243). Ови резултати подразумевају да се ЦРХ систем мора активирати претходним излагањем стресору пре него што ће ендогени ЦРХ модулирати понашање у ФСТ-у путем ЦРХ-Р1.

Претјерано експресија ЦРХ са ограниченим предбрањем мозга код главних неурона или ГАБАергични интернеурони не утиче на понашање суочавања са стресом у ФСТ

Да бисмо специфицирали мождане регије и неурохемијске супстрате који су укључени у ефекат егзогеног ЦРХ на смањење непокретности, искористили смо својства условног алела фло26Црх Р26 . Узгој ЦРХ-ЦОЕ мишева на мишеве Цамк2а-цре 18 и Длк-цре 19 ограничавао је прекомерну експресију ЦРХ на главне неуроне, односно ГАБАергиц интернеуроне, предњег предњег мозга, укључујући лимбичке мождане структуре. Промотор Длк5 / 6 покреће креирање експресије већ у ембрионалном дану 10.5 (ЈЛ Рубенстеин и М Еккер, необјављени подаци), док Цамк2а промотор креира креирање експресије отприлике након постнаталног дана 15. 18 Аналогно ЦРХ-ЦОЕ-Нес мишевима које смо добили жељене контролни (ЦРХ-ЦОЕ цон -Цам / -Длк), хетерозиготни (ЦРХ-ЦОЕ хет -Цам / -Длк) и хомозиготни (ЦРХ-ЦОЕ хом -Цам / -Длк) ЦРХ-ЦОЕ-Цам / -Длк мишеви, респективно у генерација Ф 2 . Ин ситу хибридизација потврдила је експресију егзогених ЦРХ ограничених на предњи мозак у обе мишје линије које прекомерно изражавају (слике 5а, ц и е). Функција ХПА оси хомозиготних ЦРХ-ЦОЕ-Цам / -Длк мишева није значајно измењена у поређењу са контролним мишевима, ни под базалним ни под стресним условима (Додатна слика 4).

Image

Претјерана експресија кортикотропина-ослобађајућег хормона (ЦРХ) која је ограничена на форебраин не утиче на понашање присилног пливања. Ин ситу хибридизација коришћењем рибопробе специфичне за ЛацЗ, која детектује транскрипцију фузије ЦРХ-ЛацЗ, потврдила је егзогену ЦРХ експресију у предњем мозгу ЦРХ-ЦОЕ хом -Цам и ЦРХ-ЦОЕ хом -Длк мишева. ( а ) Сагитални одељак мишјег мозга ЦРХ-ЦОЕ хом -Цам показује јаку прекомерну експресију ЦРХ у олфакторној сијалици, свим кортикалним слојевима, хипокампусу и стриатуму. ( б ) У тесту присилног пливања плутајуће понашање у данима 1 (д1) и 2 (д2) није се значајно разликовало између мушких ЦРХ-ЦОЕ цон -Цам (цон) и ЦРХ-ЦОЕ хом -Цам (хом) мишева ( н = 10–13 животиња по генотипу). ( ц ) Сагитални одељак мишјег мозга ЦРХ-ЦОЕ хом -Длк показује јаку прекомерну експресију ЦРХ у олфакторној сијалици, стриатуму, ретикуларном језгру, кортикалним слојевима и хипокампусу. ( д ) У тесту присилног пливања плутајуће понашање у данима 1 (д1) и 2 (д2) није се значајно разликовало између мушких ЦРХ-ЦОЕ цон -Длк (цон) и ЦРХ-ЦОЕ хом -Длк (хом) мишева ( н = 11 животиња по генотипу). ( е ) Сагитални одељак ЦРХ-ЦОЕ вт -Цам мишјег мозга који показује позадинске сигнале хибридизације ин ситу сигнала рибопробе специфичне за ЛацЗ. Секције ЦРХ-ЦОЕ вт -Длк мишева показале су идентичне позадинске сигнале хибридизације (подаци нису приказани).

Слика пуне величине

Да би се испитало да ли је експресија ЦРХ са ограниченом мождином довољна да рекапитулише ефекат егзогеног ЦРХ који смањује непокретност изражен у ЦНС код мишева ЦРХ-ЦОЕ-Нес, мушки ЦРХ-ЦОЕ хом -Цам и ЦРХ-ЦОЕ хом -Длк мишеви били су изложени на ФСТ. Претјерана експресија ЦРХ-а ограничена на предњи мозак није успјела значајно утјецати на плутајуће или борбено понашање (подаци нису приказани) код хомозиготних мишева ЦРХ-ЦОЕ-Цам (слика 5б) или ЦРХ-ЦОЕ-Длк (слика 5д) у успоредби с контролним луткарима, оба дана 1 и 2

Активно понашање савладавање ЦРХ мишева који прекомерно експресира зависи од катехоламинергичког преноса

ЦРХ-ЦОЕ-Цам, као и ЦРХ-ЦОЕ-Длк мишеви, сугеришу укључивање више каудалних језгара мозга у средњи / задњи мозак, укључујући моноаминергичне ћелијске популације које прекомерно изражавају ЦРХ, које промовишу смањену непокретност у ФСТ и ТСТ. У покушају да се разумеју неурохемијски механизми који су у основи понашања ЦРХ-ЦОЕ-Нес мишева у ФСТ, животиње су претходно третиране или инхибитором триптофан хидроксилазе ПЦПА или инхибитором тирозин хидроксилазе АМПТ пре тестирања у ФСТ. ПЦПА третманом је смањио ниво серотонина у хипокампама за 85% у ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес мишевима и за 71% у ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишевима (подаци нису приказани). Ниво катехоламина није утицао. Блокада триптофан хидроксилазе није успела значајно да утиче на плутајуће понашање ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес и ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишева у ФСТ (Слика 6а; статистика није приказана). У складу с нашим претходним налазима код наивних животиња (упоредите слику 4б), ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишеви третирани носачем плутали су мање него ЦРХ-ЦОЕ-контејнери третирани носачем.

Image

Активно понашање у борби са ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишевима делимично је посредовано повећаном катехоламинергичном неуротрансмисијом, која потиче од хиперактивације локус коерулеуса посредоване кортикотропин-ослобађајућим хормоном (ЦРХ). ( а ) Предобрада мушких ЦРХ-ЦОЕ-Нес мишева инхибитором триптофан хидроксилазе Пара- хлорофенилаланин метил естера (ПЦПА) није утицала на плутајуће понашање мушких ЦРХ-ЦОЕ цон - или ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишева у тесту принудног пливања (25 ° Ц). ( б ) Инхибиција тирозин хидроксилазе третманом а-метил- пара- тирозин метил естером (АМПТ) довела је до значајног повећања плутајућег понашања мишева ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес, док плутајуће понашање ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес није утицало ( н = 7–10 животиња у групи). ( ц - г ) Присилни пливајући стрес изазвао је значајно јачу експресију ц-фос и зиф268 мРНА у лоцус цоерулеус ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес (хом) мишева него код ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес (цон) мишева. Репрезентативне фотомикрографије тамног поља ин ситу хибридизације одсека короналног мозга које приказују ( ц ) ц-фос и ( е ) експресију мРНА зиф268 у локусу коерулеуса мушких ЦРХ-ЦОЕ кон- нес (цон) и ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес ( хом) мишеви. Квантификација одговарајуће ( д ) ц-фос и ( ф ) експресије зиф268 мРНА у лоцус цоерулеус како је одређена ин ситу хибридизацијом. ( г ) Квантификација експресије зиф268 мРНА у лоцус цоерулеус женки ЦРХ-ЦОЕ-Нес мишева како је одређено ин ситу хибридизацијом. * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001.

Слика пуне величине

АМПТ третман смањио је ниво хипокампалних НА за 35% код ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес мишева и за 43% у ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишевима (подаци нису приказани). Нивои ДА су смањени за 38% у ЦРХ-ЦОЕ цон- нес мишевима и за 47% у ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишевима. Ниво серотонина није утицао. Блокада тирозин хидроксилазе није успела да утиче на плутајуће понашање ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес мишева, али је довела до значајног повећања плутања у ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишевима ( т 13 = 2, 5, П <0, 05; слика 6б), што сугерише да смањено плутање у ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишевима је бар делимично посредовано повећаним катехоламинергичким неуротрансмисијом код ових животиња. ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишеви који су третирани возилом плутали су мање од лекова, третираних возилима ЦРХ-ЦОЕ, према нашим претходним налазима код наивних животиња (упоредите слику 4б).

Прекомерна експресија ЦРХ појачава ФСТ-посредовану активацију лоцус цоерулеуса

Да бисмо утврдили у којој мери ЦРХ прекомерна експресија активира катехоламинергичне неуроне, анализирали смо ин ситу хибридизацијом нивоа транскрипта ИЕГ-а ц-фос и зиф268 са фокусом на лоцус цоерулеус (ЛЦ), језгро солитарног тракта, вентрално-тегментално подручје (ВТА), субстантиа нигра (СН) и дорзално рапхе језгро (ДРН). Као што је раније показано код пацова, експресија ц-фос и зиф268 у тим језграма није се открила под базалним условима (подаци нису приказани). 36 Међутим, 30 минута након форсираног пливања, опажен пораст ц-фос и експресије зиф268 откривен је у ЛЦ (слике 6ц и е), али не и у ВТА и СН или ДРН (подаци нису приказани). Квантификација сигнала открила је снажнији пораст нивоа ц-фос (1, 35 пута; т 6 = 4, 24, П <0, 01) и зиф268 (1, 55 пута; т 6 = 6, 15, П <0, 001) нивоа транскрипта у мушким ЦРХ-ЦОЕ хом -Не мишеви него у ЦРХ-ЦОЕ цон -Нес мишеви (слике 6д и ф), што сугерише појачану активацију ЛЦ-а условљену стресом због прекомерне експресије ЦРХ.

Да бисмо процијенили да ли је хиперактивација ЛЦ неовисна о побољшаној реактивности оси ХПА, такође смо анализирали експресију зиф268 код женских мишева ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес који не показују преосјетљивост ХПА оси (упоредите додатне слике 2е и ф). Слично мужјацима, женке ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишева показале су значајно јачи пораст експресије зиф268 (1, 30 пута; т 10 = 3, 12, П <0, 05) у ЛЦ у поређењу са ЦРХ-ЦОЕ против -мишевима 30 мин након примора пливајући стрес (слика 6г).

Дискусија

Да генетски сецирамо утицај вишка ЦРХ у различитим регијама мозга и популацији неуронских ћелија на понашање у борби са стресом, користили смо „кноцк-ин“ приступ како бисмо генерисали мишји модел који је омогућио прекомерну експресију ЦРХ на различитим нивоима на просторно ограничен начин. Супериорни од стандардне трансгенезе, овај условни модел миша пружа могућност генерисања и упоређивања различитих ЦРХ мишјих линија прекомерног притиска - што је показано узгојем Нес- , Цамк2а- и Длк-цре мишева - избегавајући уобичајене несигурности производње трансгена, као што су број копије или место проналаска убацивање трансгена Иако образац прекомерне експресије ЦРХ искључиво зависи од просторних и / или временских својстава уведене Цре рекомбиназе, контрола транскрипције путем Р26 гарантује идентичне нивое експресије.

Овај приступ нам је омогућио да специфично истражимо ефекте ЦНС различитих доза ЦРХ код ЦРХ-ЦОЕ мишева без утицаја на периферни ЦРХ систем или циркадијанску регулацију оси ХПА у базалним условима. Ипак, хронична прекомерна експресија егзогеног ЦРХ активира компензаторне механизме који утичу на нивое експресије ендогеног ЦРХ и ЦРХ-Р1 на начин специфичан за регију мозга, као што је показано код ЦРХ-ЦОЕ-Нес мишева. Измене ендогених нивоа ЦРХ и ЦРХ-Р1 ће се узајамно ометати у постојећим регулаторним круговима и, заједно са ефектима егзогене експресије ЦРХ, додати још један слој сложености. На пример, експресија ЦРХ у ПВН ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес се значајно смањује у базалним условима и тиме вероватно сензитизује или поништава ЦРХ-Р1 у кортикотрофима хипофизе. Као последица тога, базални ниво АЦТХ и кортикостерона у плазми мушких ЦРХ-ЦОЕ хет - и ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишева не разликују се од оних контролних легла, док је ХПА осовина ових животиња хиперреактивна као одговор на стрес. Занимљиво је да женски ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишеви нису показали такву хиперреактивност оси ХПА оси, подупирући претходна запажања о родним разликама у биолошким функцијама ендогеног ЦРХ система. 37 Код ЦРХ-ЦОЕ хом -Нес мишева приметили смо појачану експресију ЦРХ у ЦеА као и ЦРХ-Р1 у БЛА и хипокампусу. Супротно томе, прекомерна експресија Тхи-1 у пројекционим неуронима мишева ЦРХ-ОЕ 2122 резултира прилично уједначеном редукцијом ЦРХ-Р1 у неколико језгара мозга. 38 Међутим, примећено је да хронично повећани нивои кортикостерона 15 овде могу доминирати ефектима на експресију ЦРХ-Р1 у поређењу са експресијом трансгена ЦРХ.

Мушки ЦРХ-ЦОЕ-Нес мишеви показали су значајно непокретно смањење зависности гена у ФСТ и ТСТ, које није последица прекомерне секреције хормона стреса, као што су показали женски ЦРХ-ЦОЕ-Нес мишеви који су показали нормалну реактивност ХПА оси. сличне промјене у понашању у ФСТ-у. Према томе, нити брисање ЦРХ-Р1 35 нити адреналектомија нису резултирали измењеним понашањем присилног пливања. 39 У складу са опажањима у нашем хроничном моделу вишка ЦРХ, такође акутна интрацеребровентрикуларна (ицв) ињекција ЦРХ или кортагина, моћан ЦРХ-Р1 агонист, као и убризгавање ЦРХ на место у ЛЦ смањује непокретност у ФСТ код пацова и мишева. 40, 41, 42 Поред тога, ЦРХ-Тг мишеви су такође показали смањену непокретност у ФСТ-у. 43 Занимљиво је да је и ЦРХ показао да изазива ефекте сличне антидепресивима у диференцијалном појачању распореда ниских стопа код пацова. 44

Порсолт ФСТ је високо предиктиван за клинички ефикасне антидепресиве који циљају моноаминергички систем, међутим конструкција смањене непокретности није разумљива. Сматра се да непокретност одражава или неуспјех упорности у понашању усмјереном на бијег (тј. Очајнички очај) или развој пасивног понашања које раздваја животињу од активних облика суочавања са стресним подражајима. 46 Међутим, други су сугерисали да би непокретност такође могла да одражава адаптивни механизам за уштеду енергије. 47 Поред тога, ФСТ сигурно укључује и јаку компоненту будности, будности и понашања у борби са стресом. Стога, смањена непокретност код ЦРХ-ЦОЕ-Нес мишева може радије одражавати појачану реакцију на стресну ситуацију што резултира повећаним активним понашањем у односу на антидепресивно понашање. Показано је да ЦРХ утиче на повезаност неурона у хипокампусу у развоју. 48 Дакле, прекомерна експресија ЦРХ-а почевши од ране ембриогенезе можда је изазвала адаптивне промене неуронске физиологије. Међутим, пригушивање активног понашања у превладавању и хиперреактивности оси ХПА претхретом ЦРХ-ЦОЕ хет -Нес мишевима са ЦРХ-Р1 селективним антагонистом ДМП696 сугерише да су ови фенотипи акутна последица ЦРЕ-ове прекомерне експресије. 33 Узимајући у обзир запажање да антагонисти ЦРХ-Р1 показују највећу ефикасност код глодара који су хиперреактивни на стрес и показују повећане нивое ЦРХ, 12, 39 ЦРХ-ЦОЕ-Нес мишеви могу представљати модел миша са снажним и предвидљивим одзивом на ЦРХ-Р1 антагонисте. .

Да бисмо били сигурни да ФСТ фенотип ЦРХ-ЦОЕ-Нес мишева није вештачке природе, произишао из прекомерне ектопичне експресије ЦРХ у мозгу, разјаснили смо улогу ендогеног ЦРХ система у понашању ФСТ-а. Под базалним, неактивираним условима ендогени ЦРХ систем не утиче на понашање ФСТ-а, јер ни генетски поремећаји ни фармаколошка блокада ЦРХ-Р1 нису утицали на понашање ФСТ-а. 10, 34, 35 Међутим, могли бисмо показати да активирана ендогена ЦРХ система посредована стресом пре ФСТ смањује непокретност код контролних мишева, али не и код ЦРХ-Р1 кноцкоут мишева. Ови налази сугерирају да ектопична прекомерна експресија ЦРХ код мишева ЦРХ-ЦОЕ-Нес опонаша посљедице понашања узроковане стресом активираним ендогеним ЦРХ системом и да сигнални путеви који зависе од ЦРХ-Р1 промовишу пораст активног понашања за суочавање.

Сметње ометања ЦРХ-Р1 ограниченим предбрађинским мозгом у ЦРХ-Р1 лок / лок мишевима Цамк2а-цре смањује понашање везано за анксиозност, 23 сугерирајући умешаност путања зависних од ЦРХ / ЦРХ-Р1 у структуре предњег предњег мозга, укључујући оне лимбичке систем у контроли емоционалности. Да бисмо истражили да ли су ове структуре такође узрочно повезане са измењеним понашањем ФСТ-а, просторно смо ограничили ЦРХ прекомерну експресију користећи Цамк2а-цре мишеве. Слично ЦРХ-ОЕ 2122 мишевима, 15 ЦРХ прекомерна експресија у предњем мозгу није резултирала смањеном непокретношћу примећеном у ЦРХ-ЦОЕ-Нес (ово истраживање) и ЦРХ-Тг мишевима, 14, 43, вероватно због превелике експресије у главним неуронима . До данас ћелијска и субћелијска локализација ЦРХ-а и његових рецептора, укључујући ефекте посредоване рецепторима у синапсама, нису добро разумети. In the hippocampus, endogenous CRH expression has been assigned to GABAergic interneurons from where CRH is released in the cause of acute physiological stress. 49 CRH release excites pyramidal cells, which express CRH-R1 postsynaptically on their dendritic spines. However, using Dlx-cre mice to direct CRH overexpression to GABAergic interneurons, in order to model more closely endogenous expression sites in the forebrain, failed to affect FST behavior. The absence of the FST phenotype in forebrain-specific CRH overexpressing mouse lines argues against volume transmission throughout the brain as mediating CRH effects, but clearly favors a mechanism involving specific synaptic release. Furthermore, our results suggest that CRH overexpression in more caudal brain nuclei of the mid/hind brain could promote the effects of CRH on stress-coping behavior.

In the brain stem of mice and rats CRH-R1 is expressed in serotonergic neurons of the median and DR 50 and in dopaminergic neurons of the SN and VTA. 51 CRH is expressed in noradrenergic neurons of the LC, 52 and icv injection of CRH has been demonstrated to induce a strong Fos immunoreactivity in the LC indicating the activation of CRH-R-dependent signaling pathways. 52 Accordingly, CRH is able to potentiate noradrenergic, 40, 53 dopaminergic 54 and serotonergic 55 neurotransmission. Here we could demonstrate that the pharmacological blockade of catecholamine synthesis by AMPT, but not of serotonin synthesis by PCPA, could partially reverse the phenotype of CRH-COE hom -Nes mice. Therefore, it is likely that CRH overexpression activates the endogenous catecholaminergic system similarly as antidepressants, which would explain increased arousal in an open field and the reduced immobility in the FST and TST.

Quantification of c-fos and zif268 expression in response to forced swim stress further identifies the hyperactivation of noradrenergic neurons of the LC in CRH-COE-Nes mice. Intracoerulear microinfusion of CRH in rats has demonstrated that CRH can serve as an excitatory neurotransmitter in the LC 56 resulting in enhanced NA release in LC projection areas. 57 CRH–NA interactions not only occur in the LC, where CRH activates the LC, but also at the projections of the forebrain noradrenergic system, where NA stimulates CRH release. 58 For instance, stress induces NA release in the PVN and thereby stimulates secretion of CRH. 59 This feed-forward mechanism could be a causal factor to the hyperreactivity of the HPA axis upon stress.

In conclusion, we have created a new, highly flexible transgenic mouse model, which can help in dissecting the contribution of CRH-sensitive pathways involved in the transition from physiological to pathological stress responses, which are thought to underlie the etiology of affective and anxiety disorders. 6 This animal model is also suited for validating drug candidates targeting the central CRH system.

Приступања

ГенБанк / ЕМБЛ / ДДБЈ

  • AY128673
  • NM_007762
  • NM_007913
  • NM_010234
  • U46489

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Supplementary Figures and Legends

    Додатне информације прате рад на веб локацији Молекуларна психијатрија (//ввв.натуре.цом/мп)