Контрола миграције хематопоетских матичних ћелија / прогенитора ћелијом протеина ванћелијског матрикса3 | лабораторијско истраживање

Контрола миграције хематопоетских матичних ћелија / прогенитора ћелијом протеина ванћелијског матрикса3 | лабораторијско истраживање

Anonim

Субјекти

  • Миграција ћелија
  • Хематопоетске матичне ћелије
  • Мембрански протеини

Апстрактан

Пацијентима чији је хематопоетски систем угрожен хемо- и / или радиотерапијом потребна је трансплантација хематопоетских матичних и потомских ћелија (ХСПЦ) да би се обновила хематопоеза. Успешно постављање трансплантираних ХСПЦ-а у коштану срж (БМ) у великој мери зависи од њиховог миграцијског потенцијала, што критички регулише хемокин ЦКСЦЛ12. У овом истраживању, истраживали смо експресију и функцију Слит протеина и њихових одговарајућих Роундабоут (Робо) рецептора у хуманој ХСПЦ миграцији. Протеини са резом су протеини изванћелијског матрикса који могу модулирати (хемоатрактансом) миграцију зрелих леукоцита. Показујемо да су мРНА за све прорезе (Слит1–3) изражене у примарној БМ строми и ендотелним и стромалним ћелијским линијама које потичу од БМ, али не у ЦД34 + ХСПЦ. Људски ЦД34 + ХСПЦ су изразили мРНА за све Робосе (Робо1–4), али на њиховој ћелијској површини детектиран је само протеин Робо1. Функционално, третман Слит3 повећао је ин виво ефикасност приказивања ЦД34 + ХСПЦ у БМ у НОД / СЦИД мишевима, док је ХСПЦ миграција изложена Слит3 ин витро била инхибирана. Чини се да ови ефекти нису резултат модулиране реакције ЦКСЦЛ12 као експресије ЦКСЦР4, полимеризације актина изазване ЦКСЦЛ12 или адхезије базалног и ЦКСЦЛ12 изазваног фибронектином или ендотелним ћелијама које потичу од БМ, нису промијењене изложеношћу Слит3. Међутим, показујемо да је Слит3 брзо смањио ниво активног РхоА у ћелијама ХЛ60 и примарном ЦД34 + ХСПЦ, директно утичући на пут који је укључен у преградњу актиног цитоскелета и ХСПЦ миграцију. Наши резултати заједно подржавају улогу Слит3 у миграцији хуманог ХСПЦ-а ин витро и куцање ин виво и могу допринети дизајнирању будућих приступа усмерених на побољшање ефикасности трансплантације хуманих ЦД34 + ХСПЦ.

Главни

Одржавање броја хематопоетских матичних ћелија (ХСЦ) од суштинског је значаја за дугорочну хематопоезу. У одраслих особа ХСЦ-ови претежно бораве у шупљини коштане сржи (БМ) где се налазе у непосредној близини специјализованих стромалних ћелија које стварају специфично микро-окружење (тј. Нишу) које олакшава само-обнављање и / или диференцијацију ХСЦ-а. 1, 2 Пацијентима чији је хематопоетски систем компромитован хемо- и / или радиотерапијом потребна је трансплантација ХСЦ-а да би се обновила хематопоеза. Интравено администрирани ХСЦ-ови саобраћају ка БМ-у, процес који се назива удварањем. У БМ-у, кућни ХСЦ-ови репопулирају нише да би се створиле све линије зрелих крвних зрнаца. ХСЦ куцање је кључно за ефикасан хематолошки опоравак и терапијски режими који повећавају миграцијски потенцијал ХСЦ могу побољшати ефикасност трансплантације.

Кућање БМ-а је процес у више корака који подсећа на трговину зрелих леукоцита на места упале. Првобитно везивање селективно посредованим селективом и котрљање леукоцита преко ендотела праћено је адхезијом посредованом интегрином на слоју ћелије ендотела и последичном миграцијом трансендотела. 3 Ова смерна миграција леукоцита првенствено је регулисана хемокинима. Хемокин ЦКСЦЛ12 (или фактор-1 стромални ћелијски излучевина), који сигнализира путем рецептора ЦКСЦР4-везаног за протеин, потиче хаптање посредовано интегрином у ендотелијум и индукује миграцију ХСЦ-а. 4, 5 ЦКСЦЛ12 може се сматрати главним хемоатратантом за ХСЦ ин виво . 6 и производи их ендотелна БМ, БМ стромална (БМС) ћелија 4, 7 и што је још важније, специјализоване нишне ћелије, као што су ретикуларне ћелије које производе ЦКСЦЛ12. 8

Прорези су велики матрични протеини који делују као негативни регулатори миграције леукоцита изазваних хемоатратантима. 9, 10, 11 Откривена су три високо хомолошка протеина Слит 12, 13 која се вежу за рецепторе породице Роундабоут (Робо) кроз други поновљени домен богат леуцином. 14, 15 Робоси су једноструки трансмембрански рецептори који усмеравају растуће неуронске аксоне током ембрионалног развоја. 16 До сада су идентификована четири еволуцијски сачувана хумана Робо хомолога која се углавном разликују у својим интрацелуларним цитоплазматским доменима. 16, 17, 18, 19 Молекуларни механизми помоћу којих Слит посредује своје ефекте на миграцију ћелија нису у потпуности разумљиви и вероватно укључују активирање чланова мале РТП породице Рхо као што су Рац1, Цдц42 и РхоА. Претходно смо показали да Слит3 брзо индукује активацију РхоА у ЦД14 + људским моноцитима и поспешује њихову миграцију. 20 Слит3 је функционисао на сличан начин на ендотелним ћелијама, као што су показали Зханг ет ал. 21 Моноцити експримирају релативно ниске нивое Робо1 у поређењу са ЦД34 + хематопоетским матичним и потомственим ћелијама (ХСПЦ), а показали смо да ХСПЦ смањују експресију Робо1 након њихове диференцијације у моноците. 20

У овом истраживању смо даље дефинисали профил експресије Робо и Слит у циркулишућим људским ћелијама ЦД34 + ХСПЦ и не-хематопоетских људских БМ ћелија и истражили утицај праширања ХСПЦ-а код људи помоћу Слит3 на ин витро и ин виво миграцију.

РЕЗУЛТАТИ

Протеини с прорезом се изражавају ћелијама из БМ нише, док су хумани ЦД34 + ХСПЦс Екпресс Робо

Прво смо истражили да ли су хомолози Слит и Робо експримирани у људском БМ-у, тј. У не-хематопоетским БМ ћелијама, попут ендотелних и стромалних ћелија, које се налазе у непосредној близини ЦД34 + ХСПЦ. Помоћу РТ-ПЦР, лако смо открили експресију Слит1, -2 и -3 у примарном БМС-у и стромалним дериватима БМ-а (Л87 / 4) и БМЕЦ-28 ћелијским линијама (слика 1а). Квантификација нивоа Слит мРНА помоћу РТ-ПЦР у стварном времену открила је да је ниво Слит1 мРНА у зрелим леукоцитима упоредив са нивоом БМС ћелијске линије, Л87 / 4. Експресија Слит2 и -3 мРНА није детектирана ни у једној од типова хематопоетских ћелија, а ниједан од резова није могао да се препозна у ЦД34 + ћелијама (слика 1б). Експресија Робо1, -2 и -3 мРНА је лако уочена у свим испитиваним ћелијама хематопоетских и не-хематопоетичких (Слика 1ц), док је експресија мишева Робо4 детектована у Л87 / 4 ћелијама, БМЕЦ-28 ћелијама и ЦД34 + ХСПЦ. Да бисмо потврдили да ли је експресија мРНА корелирана са експресијом протеина, испитивали смо површинску експресију протеина Робо1–4 користећи антитела специфична за Робо-хомолог (допунска слика 1) у проточном цитометричком приступу. Људски ЦД34 + ХСПЦ из различитих извора, тј. БМ, ЦБ и МПБ, сви изражавају Робо1 на својој ћелијској површини (Слика 1д). Међутим, површинска експресија осталих Робо протеина тешко је откривена на ЦД34 + ћелијама добијеним са МПБ (Слика 1е).

Image

Кружна (Робо) и експресија прореза у ћелијама хематопоетских и коштаних сржи (БМ). ( а ) Експресија слит1–3 мРНА у БМ нишним ћелијама, тј. примарном БМ стромалу (БМС), ћелијској линији Л87 / 4 БМС и ендотелној ћелијској линији која потиче од БМ (БМЕЦ). ( б ) Ниво мРНА на прорезу у ћелијама хематопоезе нормализован је на β- глукуронидазу (ГУС) и у односу на ниво Л87 / 4. ( ц ) Робо1–4 мРНА експресија у хематопоетским и БМ нишним ћелијама. ( д ) Ћелијска површина Робо1 експресија ЦД34 + ћелија (подебљана линија: специфично антитело које препознаје наведени Робо хомолог; испрекидана линија: изотипско контролно антитело). Приказује се репрезентативни донатор од три или више давалаца. ( д ) Експресија ћелијске површине Робо2, Робо3 и Робо4 на мобилизованим ЦД34 + ћелијама које добијају периферну крв (МПБ) (подебљана линија: специфично антитело које препознаје наведени Робо хомолог; испрекидана линија: антитијело за контролу изотипа). Приказује се репрезентативни донатор од три или више давалаца).

Слика пуне величине

Дакле, мРНА за све Слит лиганде се експримирају стромалним и ендотелним ћелијама које су изведене са БМ, док је Робо1 главни рецептор за Слит који се изражава људским ЦД34 + ХСПЦ.

Слит3 инхибира ЦКСЦЛ12-индуковану и спонтану миграцију ЦД34 + ХСПЦ

Пошто хумани ХСПЦ изражавају Робо1 рецептор који препознаје Слит протеине, ми смо истражили да ли је лечење Слитом утицало на миграцију ХСПЦ ин витро . Претходно је показано да Слит2 инхибира ЦКСЦЛ12-индуковану хемотаксију на Робо1-позитивну промеелоцитну ХЛ60 леукемијску ћелијску линију. 11 Овде је испитиван утицај комерцијално доступног пречишћеног рекомбинантног Н-терминала Слит3 (Слит3) на ћелије ХЛ60 у концентрацијама за које је претходно показано да инхибирају пролиферацију ГАБАергичког интернеурона 29 или да промовишу миграцију хуманих моноцита. 20 Слика 2а показује да је ЦКСЦЛ12-индукована миграција ћелија ХЛ60 претходно инкубирана Слит3 инхибирана на начин зависан од дозе. Слични резултати добијени су када је коришћен ХЕК293Т-кондиционирани медијум обогаћен за комплетан хумани ГФП обележени Слит3 протеин (допунска слика 2).

Image

Слит3 ин витро инхибира миграцију ЦД34 + хематопоетских матичних и матичних ћелија (ХСПЦ). ( а ) Трансвелл миграција ћелија ХЛ60 третирана са 6.3 или 12.5 µг / мл пречишћеног Слит3 (Слит3) у присуству или одсуству 100 нг / мл ЦКСЦЛ12 у доњем одељку. Експерименти су изведени у три примерка и представљени као средња вредност сд Подаци показују репрезентативан пример два експеримента. ( б ) Пребацивање миграције пупчане крви (ЦБ) - или мобилизоване периферне крви (МПБ) добијене ЦД34 + ћелије третиране растварачем или 12, 5 µг / мл Слит3 у присуству или одсуству 100 нг / мл ЦКСЦЛ12 у доњем одељку. Експерименти су изведени по донору у три примерка и представљени су као средња вредност ± сд ( ц ) Миграција МПБ-изведених ЦД34 + ћелија третираних растварачем, 3, 15 или 6, 3 µг / мл Слит3 према миграционом медијуму или 100 нг / мл ЦКСЦЛ12. Експерименти су изведени по донору у три примерка и приказани су као средња вредност ± сд ( д ) миграције хуманог ИгГ или кружног тока (Робо) 1Фц пре-инкубиране ЦД34 + ХСПЦ добијене МПБ (средња ± сем; н = 3). Подаци представљају промјену преласка у миграцији у успоредби с миграцијом нетретираних ХСПЦ-а према 100 нг / мл ЦКСЦЛ12. П- вредности се израчунавају коришћењем дворедног непарног Студент-овог т- теста.

Слика пуне величине

Затим смо испитали да ли је изложеност Слит3 утицала на примарну миграцију ЦД34 + ХСПЦ код човјека ин витро . Слит3 није утицао на ЦКСЦЛ12-индуцирану миграцију ЦД34 + ХСПЦ-а изведених из три здрава МПБ и три ЦБ давалаца, користећи концентрације које су индуцирале максималну инхибицију миграције ХЛ60 (12, 5 µг / мл; слика 2б). Међутим, ниже концентрације Слит3 су смањиле миграцију ЦД34 + ХСПЦ-а добијених од МПБ-а код ЦКСЦЛ12 код пет од шест давалаца (средњи проценат инхибиције (± сд) у распону од 20, 9 ± 2, 5% (МПБ донор 7) на 6, 3 µг / мл инхибиције Слит3 до 58.0 ± 6.9% (МПБ донор 6) при 3.15 µг / мл Слит3; Слика 2ц). Концентрације прореза <3, 15 µг / мл не изгледају ефикасно (допунска слика 3А). Занимљиво је да је Слит3 такође утицао на спонтану миграцију (без ЦКСЦЛ12) МП34-изведених ЦД34 + ХСПЦ-ова већине донатора (слика 2ц), осим МПБ донора 8 који је био ватросталан према ефектима посредованим прорезом. Чини се да одговор који индукује Слит3 зависи од дозе и вероватно следи кривуљу у облику звона, која је такође типична за хемоаттрактане. 30 Важно је да је специфичност одговора изазваног Слит3 потврђена додатком растворљивог ванћелијског Робо1 (Робо1Фц), који је укинуо инхибицију посредовану Слит3 ЦД2 + ХСПЦ хемотаксијом (Слика 2д). Процена свих давалаца заједно показала је да обе ефективне дозе Слит3 значајно инхибирају ЦСПЦЛ12-индуцирану ХСПЦ миграцију ( н = 9; П <0, 05 за 3, 15 µг / мл Слит3 и 6, 3 µг / мл Слит3 користећи упарени т- тест).

Стога, Слит3 инхибира спонтану и ЦКСЦЛ12-индуцирану миграцију ЦД34 + ХСПЦ-а преко Трансвелл филтера обложених ФН-ом на начин који зависи од дозе и донора.

Слит3 побољшава слагање ХСПЦ-а са БМ НОД / СЦИД мишева

Миграције су важна карактеристика регрутовања ХСПЦ-а у БМ (навођење). Да би се утврдио ефекат Слит3 на ХСПЦ навођење, коришћен је ксеногени модел ксеногене трансплантације НОД / СЦИД. Миграција ЦД34 + ХСПЦ претходно изложених Слит3 и даље је смањена након прања (допунска слика 3Б). За тестове кувања, хумани ЦД34 + ХСПЦ, претходно изложени растварачу или Слит3, трансфузијски су интравенски, а проценат хуманих ЦД34 + / ЦД45 + ХСПЦ који су били смештени у БМ или другим органима одређен је 22 сата након инфузије. ЦД34 + / ЦД45 + хумани ХСПЦ лако су откривени у БМ (слика 3а) и слезине, али нису били у крви и јетри (подаци нису приказани). Занимљиво је да је двоструко већи проценат ХСПЦ-а третираних Слит3-ом примљен у БМ у поређењу са необрађеним ХСПЦ-ом и ови резултати су потврђени у другом експерименту користећи другачији донор МПБ (слика 3б). Стога је, за разлику од инхибицијског ефекта примећеног ин витро , Слит3 појачао прилагођавање ХСПЦс БМ-у НОД / СЦИД мишева.

Image

Слит3 појачава ЦД34 + хематопоетских матичних и матичних ћелија (ХСПЦ). ( а ) Живе ћелије које су затворене у Р1 (расипање према напријед (ФСЦ) / бочни расипање (ССЦ): граф леве тачке) приказане су у тачки ССЦ / ЦД34 тачке, а ССЦ ло ЦД34 хи- експресионирајуће ћелије су затворене у Р2 и приказане у ЦД34 / ЦД45 тачкасти заплет. Хумане (ху) ЦД34 + / ЦД45 + ћелије су затворене и квантификоване у Р3. Куглице добијене у Р4 коришћене су за квантификацију. Репрезентативне тачкасте парцеле приказане су на којима се налазе суспензије ћелија коштане сржи (БМ) на мишу који није примио људске ћелије (контрола зрачења / бојења), миш који је примио необрађене хумане ХСПЦ и миш који је примио ХСПЦ третиране са 3, 15 µг / мл Слит3, редом. ( б ) Графикони који приказују средњи проценат ХСПЦ-а (± сем) који су постављени на укупни БМ (отворене шипке) или слезену (испуњене шипке) од пет мишева по експерименталном стању за два одвојена даваоца. П- вредности се израчунавају коришћењем непарног т- теста ученика. ( ц ) Просечни проценат хуманих ЦД45 + ћелија у крви, БМ и слезини НОД / СЦИД мишева ( н = 5 / експериментално стање), 5 недеља након трансплантације ЦД34 + ХСПЦ, третираних растварачем, 3, 15 µг / мл Слит3 или 6, 3 µг / мл Слит3. Приказан је репрезентативан експеримент из два одвојена експеримента. П- вредности се израчунавају коришћењем непарног т- теста ученика. ( д ) Леви граф приказује ин витро мијелоидну диференцијацију ЦД34 + ХСПЦ третиране растварачем или 6, 3 µг / мл Слит3. Сложен трачни граф приказује проценат ЦД34 + ЦД33 - ћелија (испрекидане шипке), ЦД34 + ЦД33 + ћелије (отворене шипке), ЦД34 - ЦД33 + ћелије (испрекидане шипке), ЦД14 + моноцити (вертикалне испрекидане шипке) и ЦД66б + гранулоцити (испуњене шипке) на 3, 6 и 9 дана културе. Приказани су подаци репрезентативног експеримента из два одвојена експеримента. Стварни графикон десно приказује апсолутни број ћелија (средња вредност ± сд) током ин витро мијелоидне диференцијације два различита даваоца третирана растварачем (отворене шипке) или 6, 3 µг / мл Слит3 (напуњене шипке).

Слика пуне величине

Појачано БМ усмеравање може повећати ефикасност трансплантације мерено капацитетом ХСПЦ-а за генерисање хематопоетског потомства након колонизације БМ-ом. Да би се утврдило да ли Слит3 утиче на потенцијал уградње ХСПЦ-а, претходно третирани Слит3 ХСПЦ-ови су пресађени у НОД / СЦИД мишеве и проценат зрелих хематопоетских људских ЦД45 + ћелија је одређен у крви, БМ, слезини, јетри и плућима на 5 недеља после трансплантације. У складу са повећаним стањем у кући, примећен је јасан тренд ка повећаном БМ гравитацији хуманог ХСПЦ-а претходно третираног Слит3, мерено бројем ЦД45 + ћелија откривених у крви и БМ (слика 3ц).

Укључивање не овиси само о приказивању, већ и о пролиферацији и диференцијацији капацитета кућних ХСПЦ-а. Стога смо додатно испитали да ли Слит3 утиче на мијелоидну диференцијацију хуманог ЦД34 + ХСПЦ ин витро користећи прилагођени протокол Олвеус ет ал. 22 После 3 дана у култури, већина ХСПЦ изгубила је експресију површинског ЦД34, али стекла је експресију површинског ЦД33, што је карактеристично за диференцијацију мијелоида (Слика 3д). Примећена је површинска експресија моноцита-молекуле ЦД14 и гранулоцита-везане ЦД66б од стране ЦД33 + ћелија после 6 дана. Нису пронађене значајне разлике у процентима или апсолутном броју ћелија ЦД34 + / ЦД33 -, ЦД33 + / ЦД34 -, ЦД33 + / ЦД34 +, ЦД14 + или ЦД66б + ћелија између ХСПЦ-а третираних растварачем или Слит3 током ин витро културе (Слика 3д). На основу ових ин витро експеримената, чини се да Слит3 не утиче на преживљавање ХСПЦ или на њихову способност за диференцијацију мијелоида под овим условима.

Слит3 није утицао на адхезију ХСПЦ-а или трансендотелну миграцију преко БМЕЦ-а

За ефикасно куцање ин виво , интравенски примењени ХСПЦ морају да се придржавају и емигрирају кроз БМ ендотел. Пошто су примећени супротни ефекти Слит3 на ХСПЦ миграцију ин витро и ин виво , испитивали смо ефекте Слит3 на трансмиграцију ХСПЦ-а преко моноцеста БМЕЦ-28. Пред третман ХСПЦ-а с Слит3 није променио број ХСПЦ-ова који су мигрирали преко моно-слојева БМЕЦ-28 као одговор на ЦКСЦЛ12 (средњи проценат миграције ± сем ( н = 3), од 5, 4 ± 0, 7% за необрађен, 6, 2 ± 0, 7% за 3, 15 μ г / мл третирано Слит3 и 5, 7 ± 0, 5% за 6, 3 μг / мл ХСПЦ третирано Слит3, респективно; Слика 4а). Надаље, излагање ХСПЦ-а Слит3 није значајно промијенило базалну или ЦКСЦЛ12-индуцирану адхезију ХСПЦ-а на ФН (слика 4б), није изазвало проматрање промјена површинских нивоа β 1-интегрин (ЦД29; слика 4ц) нити је Слит3 промијенио базална или ЦКСЦЛ12-индукована адхезија ХСПЦ-а на БМЕЦ (слика 4д). Заједно, ово сугерише да Слит3 не утиче на ћелијску машинерију потребну за трансендотелну миграцију или је ефекат Слит3 супротстављен интеракцијом ХСПЦ-а са ендотелним ћелијама које потичу од БМ.

Image

Слит3 не мења трансендотелну миграцију или адхезију хематопоетских матичних и матичних ћелија (ХСПЦ) на ендотелну ћелијску линију добијену из ФН или БМ-а. ( а ) ЦД34 + ћелије које добијају мобилну периферну крв (МПБ) које транспортују БМЕЦ-28. Промјена миграције у односу на контролу (средња ± сем; н = 3). ( б ) ЦД34 + ћелије изведене са МПБ адхезивне на површинама прекривеним ФН ( ц ). Површинска експресија ЦД29 ЦД34 + ћелија изведених са МПБ приказана као средња промена набора флуоресценције (МФИ) (± сем) у односу на ћелије третиране растварачем ( н = 3). ( д ) ЦД34 + изведене МПБ ћелије које су везане за површине обложене БМЕЦ-ом, као у ( б ) средња промена адхезије (± сем) три различита донора (ФН адхезија) или пет различитих давалаца (БМЕЦ адхезија) у односу на растварач Приказане су третиране ћелије.

Слика пуне величине

Учинак Слит3 се не посредује модулацијом ЦКСЦЛ12 одзивности

Да бисмо даље истражили механизам којим Слит3 утиче на миграцију ХСПЦ-а, испитали смо да ли изложеност ХСПЦ-а на Слит3 модулира реакцију ЦКСЦЛ12. ЦКСЦЛ12 одговори посредују његов рецептор ЦКСЦР4, а обим интернализације ЦКСЦЛ12 посредоване ЦКСЦЛ4 корелира са реакцијом и хемотаксијом изазваном ЦКСЦЛ12. 31 Пре-инкубација ХСПЦ-а са Слит3 није утицала на нивое експресије базалне површинске ћелије ЦКСЦР4, ЦД34 или ЦД45, док је изложеност ЦКСЦЛ12 смањила нивое површинске експресије ЦКСЦР4 као што се очекивало (Слика 5а). Занимљиво је да је изложеност ЦКСЦЛ12 смањила ниво експресије Робо1 на ХСПЦ-у за 16, 0 ± 10, 6% (средњи ± сем), што се значајно још више смањило (27, 9 ± 5, 5%) када је ЦКСЦЛ12 стимулацији претходила инкубација ХСПЦ-а са Слит3 (слика 5а ), што сугерира да ЦКСЦЛ12 / ЦКСЦР4 сигнализација може негативно регулисати експресију Робо1 на површини ћелије. Следеће смо испитивали да ли је изложеност ЦД34 + ХСПЦс полимеризацијом актина изазваном Слит3 модулисаном ЦКСЦЛ12 (слика 5б), флукс калцијума изазваним ЦКСЦЛ12 (није приказано) или морфологија ХСПЦ (није приказано), али ниједан од ових параметара није утицао. Заједно, ови подаци показују да је мало вероватно да је измењена ХСПЦ миграција након излагања Слит3 последица смањене реакције на ЦКСЦЛ12.

Image

Слит3 не мења ЦКСЦР4 сигнализацију. ( а ) ЦД34 + ћелије добијене периферном крвљу (МПБ) које су третиране 10 минута растварачем (троуглови) или 3, 15 µг / мл Слит3 (кругови), средње повећање набора (± сем) у полимеризованом актину ( н = 3). П- вредности се израчунавају коришћењем дворедног непарног Студент-овог т- теста. ( б ) Површинска експресија ЦКСЦР4, кружна линија (Робо) 1, ЦД34 или ЦД45 ЦД34 + ћелија изведених са МПБ приказана као средњи средњи интензитет флуоресценције (МФИ) (± сем) у односу на ћелије третиране растварачем ( н = 3).

Слика пуне величине

Слит3 смањује ниво активне РхоА у људским ХСПЦ

Поред ЦКСЦЛ12-индуковане миграције, Слит3 је такође смањио спонтану миграцију ХСПЦ-а ин витро . Стога смо истражили да ли Слит3 сам иницира догађаје унутарћелијске сигнализације. Слит3 је заиста индуковао унутарћелијску сигнализацију, што показује фосфорилација тирозинских остатака протеина који одговарају молекулским тежинама између 65–95 и 36–55 кДа након третирања примарних ЦД34 + ХСПЦ са различитим концентрацијама Слит3 (слика 6а). Затим је испитивана активација протеина унутар ових величина региона који су важни за ћелијску миграцију као што су Акт, ПАК и протеински киназе активиране митогеном (МАПК) п38 и пЕРК 32, 33, 34 . У ту сврху, примарни ЦД34 + ХСПЦ су третирани растварачем, ЦКСЦЛ12 и / или Слит3. Као што је приказано на слици 6б, ПАК фосфорилација је повећана као одговор на ЦКСЦЛ12, али нису примећене промене базалног или ЦКСЦЛ12 индукованог нивоа фосфорилираног ПАК-а приликом третмана Слит3. Нивои фосфорилираног АКТ, п38 и п42 / п44 МАПК били су врло ниски, а пораст фосфорилације примећен је тек након перванадатског лечења хуманим ЦД34 + ХСПЦ. Свеукупно, ови подаци не сугеришу да су Акт, ПАК, п38 или ЕРК1 / 2 укључени у одговоре изазване Слит3-ом ХСПЦ-а.

Image

Слит3 смањује ниво активне РхоА у људским ћелијама ХЛ60 и примарним ћелијама хематопоезе и матичних ћелија (ХСПЦ). ( а ) Имуноблот обојен за тирозин-фосфорилиране протеине примарних ЦД34 + ХСПЦ лизата. Перванадат је коришћен као позитивна контрола. Фосфорилација изазвана прорезом је означена стрелицама. ( б ) Имуноблотс примарних ЦД34 + ХСПЦ лизата обојених за различите ефекторе ЦКСЦЛ12 низводно. РхоГДИ (∼ 28 кДа) кориштен је као контрола оптерећења. Приказане су репрезентативне мрље појединачног даваоца ЦД34 + ХСПЦ од два или више давалаца. ( ц ) Графикон приказује проценат (средњи ± сем, н = 3) активног РхоА у ћелијама третираним Слит3 ХЛ60 (10 µг / мл Слит3, чврста линија) у односу на ћелије третиране растварачем у свакој временској тачки (испрекидани линија). ( д ) Проценат активног РхоА у ЦД34 + ХСПЦ-у третираном с прорезом (5 µг / мл Слит3) изолован од четири различита даваоца (чврсте линије) у односу на ћелије третиране растварачем у свакој тачки (испрекидана линија).

Слика пуне величине

У људским моноцитима Слит3 брзо активира РхоА и појачава миграцију моноцита. 20 Испитали смо ефекте примјене Слит3 на нивое активног РхоА у ћелијама ХЛ60 и примарних хуманих ЦД34 + ХСПЦ. Насупрот Слит3 ефектима раније примећеним за хумане моноците, нивои активног РхоА су брзо смањени у ћелијама ХЛ60 у поређењу са ћелијама третираним растварачем (Слика 6ц), са максималним смањењем на 2 мин ( П = 0, 03 Средње ± сем, н = 3). Слит3 је на сличан начин смањио ниво активног РхоА у ЦД34 + ХСПЦ са максималним смањењем на 5 мин након додавања Слит3. Као и код миграционог одговора, примећена је значајна хетерогеност давалаца (слика 6д).

Стога третман Слит3 директно утиче на суштински пут миграције ХСПЦ-а тако што брзо смањује РхоА активност.

ДИСКУСИЈА

Трансплантација ЦД34 + ХСПЦ користи се за обнављање хематопоезе код пацијената чији је хематопоетски систем угрожен хемо- и / или радиотерапијом. Ова студија је покренута како би се истражили нови терапијски режими који могу повећати миграцијски потенцијал хуманих ЦД34 + ХСПЦ, са крајњим циљем да се побољша ефикасност трансплантације. Прорези су недавно описани као моћни хеморепеленти који или инхибирају или промовишу миграцију зрелих леукоцита изазваних хемокином. 9, 10, 11 Ова студија је прва која је пријавила ефекте третмана Слит3 на миграцију хуманог ЦД34 + ХСПЦ. Овде показујемо да су сви Слог хомолози експримирани људским примарним БМС, ендотелним ћелијама и стромалним ћелијама које потичу од БМ, али не и људским ХСПЦ. Супротно томе, мРНА за све Робо хомологе детектиране су у људском ЦД34 + ХСПЦ и потврдили смо ћелијску површинску експресију Робо1 протеина. Уочљива је експресија Робо4 мРНА у ХСПЦ, али не и у осталим хематопоетским линијама. Сматрало се да је Робо4 специфичан за ендотел, али је раније откривено да се изражава дуготрајном репопулацијом мишјих ХСЦ. 35 Штавише, функционална улога у задржавању БМ мишјег цКит + Лин-Сца1 + ХСЦс недавно је приписана Робо4 користећи Робо4 кноцкоут модел миша, 36 нисмо могли да откријемо Робо4 експресију ћелијске површине на људској ЦД34 + ХСПЦс испитиваној популацији, што је могуће одражава ниску фреквенцију незрелих ХСЦ присутних у популацији ХСПЦ одабраних ЦД34.

И Робо1 и Робо4 протеини се вежу за Слит3 протеин, 21 и овде показујемо да примање Робо1 експримирајућег ЦД34 + ХСПЦ хуманог човека са Слит3 значајно повећава ХСПЦ усмеравање на БМ НОД / СЦИД мишеве. Поред тога, примећен је јасан тренд ка побољшаном БМ уграђивању ХСПЦ-а третираног Слит3. Ова разлика није достигла статистички значај, што би се могло објаснити употребом шест различитих МПБ давалаца потребних за добијање довољног броја ХСПЦ за трансплантацију. Варијабилност донора која је примећена у одговору Слит3 може чак измамити и прикрити значајан ефекат на ХСПЦ гравграцију.

Супротно појачаном ХСПЦ хоминг ин виво , примећен је инхибиторни ефекат третмана Слит3 на (ЦКСЦЛ12-индуковану) миграцију хуманих ЦД34 + ХСПЦ ин витро . Контрастни ефекти ин витро миграције насупрот ин виво навођењу раније су извештавали Коллет и остали 37 и Фукуда и остали , 38 који су показали смањени ин витро миграциони капацитет ХСПЦ-а према ЦКСЦЛ12, док је БМ повећано. Тешко је препознати основни узрок који има различите исходе, с обзиром на мулти-фактористичку природу ин виво миграције. Цхаласани и др. 39 показали су да ЦКСЦЛ12 може антагонизирати Слит функцију смањујући одзивност ћелија мрежнице ганглион на прорез. Ћелије изведене са БМ могу производити ЦКСЦЛ12 на нивоима који супростављају одговору изазваном Слит3. Штавише, приметили смо да ЦКСЦЛ12 смањује експресију површинског Робо1, ефекта који је још очитији након претходне инкубације ХСПЦ-а са Слит3. Ово може указивати на могући механизам повратних информација преко оси ЦКСЦЛ12 / ЦКСЦР4 који спречава реакције изазване прорезом у ХСПЦ релевантним за њихово постављање и задржавање унутар БМ-а. Одговорност на ЦКСЦЛ12 је главна одредница за ефикасно лечење, 6 али други подражаји примљени из микро окружења, као што су цитокини и фактори раста, могу значајно утицати на одговор ХСПЦ-а на успоравање. 40 У различитим ћелијским моделима заиста је доказано да одговори проузроковани прорезом могу бити модулисани микроеколошким сигналима на које се наилази ин виво , као што су протеогликани хепаран сулфата, 41 циклични нуклеотиди 42 или антагонисти коштаних морфогенетских протеина 9 који мењају или поништавају одговор индукован прорезом. од одбојности у привлачност. 43 Дакле, сигнални путеви активирани ин виво могу функционирати као молекуларни прекидач реакције изазване Слит3 и модификовати миграционо понашање трансплантираних ССП3 претходно обрађених ХСПЦ.

Молекуларни механизми помоћу којих Слит3 делује, углавном су непознати. Прорез је првобитно описан да би се супротставио ЦКСЦР4 посредованим сигналним догађајима у хематопоетским ћелијама. 10, 11 Наши резултати сугеришу да Слит3 не утиче искључиво на сигнализацију изазвану хемоатратантима, већ утиче на миграцију ХСПЦ на општији начин. Претходно смо открили да Слит3 брзо индукује активацију РхоА у примарним људским моноцитима и подстиче миграцију моноцита. 20 Слит3 је на сличан начин повећао РхоА активност и покретљивост у ендотелним ћелијама које експримирају Робо1 / Робо4. 21 Мале РхоГТПазе као што су Рац, Цдц42 и РхоА су важни регулатори цитоскелета актина и критично су укључени у регулисање ХСПЦ навођења. 44 Овде показујемо да Слит3 инхибира и ЦКСЦЛ12-индуцирану и спонтану ХСПЦ миграцију давалаца који реагују на прорез. Изложеност ХСПЦ-а Слит3 повећала је ниво фосфорилације остатака тирозина неколико протеина унутар распона 65–95- и 36–55-кДа. Штавише, ми показујемо да Слит3 смањује ниво активне РхоА у ХЛ60 ћелијама и примарним ЦД34 + ХСПЦ. Активна РхоА потребна је за правилну миграцију хуманог ХСПЦ 45 и моноцита 46 и дестабилизира структуру микротубула на задњем полу. Интригантно, Гхиаур и др. 47 показали су да смањена РхоА активност у мишјим ХСЦ-има резултира смањеном ЦКСЦЛ12-индуцираном миграцијом ин витро , али и појачаним БМ усађивањем. Нажалост, у овој студији ХСЦ хоинг није био одвојено третиран. Сецирање тачних сигналних догађаја које индукује Слитс биће од значајне важности за разумевање како Слит3 врши утицај на миграцију и помоћи ће развоју будућих приступа усмерених на побољшање ефикасности трансплантације хуманих ЦД34 + ХСПЦ.

Додатне информације

Датотеке слика

  1. 1.

    Допунска слика 1

  2. 2

    Допунска слика 2

  3. 3.

    Допунска слика 3

    Додатне информације прате рад на веб локацији Лабораторијска истрага (//ввв.лабораториинвестигатион.орг)