Кортикални брзо-шиљасти интервалуро парвалбумина умотани у перинеуронску мрежу изражавају металопептидазе адамтс8, адамтс15 и неприлисин | молекуларна психијатрија

Кортикални брзо-шиљасти интервалуро парвалбумина умотани у перинеуронску мрежу изражавају металопептидазе адамтс8, адамтс15 и неприлисин | молекуларна психијатрија

Anonim

Субјекти

  • Неурознаност

Апстрактан

Ин ситу хибридизација Аллен Моусе мозга Атлас је минирана због протеаза изражених у соматосензорној можданој коре. Међу 480 гена који кодирају протеазу / пептидазе, само су четири пронађена обогаћена кортикалним интернеуронима: Релн кодира за реелин; Адамтс8 и Адамтс15 који припадају класи метзинцин протеаза укључених у преобликовање перинеуроналне мреже (ПНН) и Мме који кодирају Неприлисин, ензим који разграђује амилоидне β-пептиде. Образац експресије металопротеаза (МП) анализиран је једноцелијском реверзном транскриптазом мултиплексом ПЦР након патцх стезаљке и упоређен је са експресијом 10 канонских маркера интернеурона и 12 додатних гена из Аллен Атласа. Кластерирање ових гена алгоритмом К-средстава приказује пет различитих кластера. Између ових пет кластера идентификована су два интернаронска грозда која брзо експиришу протеине који везују калцијум Пвалб , један коекспресионирајући Пвалб са Сст (ПВ-Сст) и други коекспресирајући Пвалб са три металопептидазе Адамтс8 , Адамтс15 и Мме (ПВ- МП). Коришћењем Вистериа флорибунда аглутинин, пронађени су специфични маркери за ПНН, ПВ-МП интернеурони окружени ПНН, док они који изражавају Сст, ПВ-Сст, нису.

Увод

Перинеуроналну мрежу (ПНН) открио је Голги 1 пре једног века и поново је откривен више пута. 2 Недавни извештаји су показали важност протеаза у пластичности неурона променом ПНН-а. 3, 4, 5, 6 Свет протеаза је од највеће важности у биологији, а најмање 480 гена за протеазе идентификовано је у геному читавог миша. У овом истраживању минирали смо атлас Аллен Моусе Браин ин ситу хибридизације (ИСХ) ради експресије протеаза у кортикалним интернеуронима. Аллен Моусе Браин Атлас садржи ћелијске узорке експресије целог генома у свим областима мишјег мозга. 7 У шест слојева соматосензорног кортекса експримирано је 1043 гена у различитим специфичним неуронским популацијама, 22 од тих гена су припадала класи протеаза / пептидаза, а само 4 протеазе / пептидазе изражене су преференцијално у интеруроронима (Табела 1 и види допунску табелу С1 у Соренсен и др. 8 ). Ови гени су: Релн кодирање за реелин; Адамтс8 и Адамтс15 који припадају класи метзинцин протеаза укључених у преобликовање ПНН и Мме кодирања за Неприлисин и ензима који разграђују амилоидне β-пептиде Алзхеимер-ових плакова.

Табела пуне величине

Последњих година једноћелијска реверзна транскриптаза мултиплекс ПЦР (сцРТ-мПЦР) након патцх стезаљке коришћена је за класификацију кортикалних интернерона. Коришћењем неуписаног профилирања експресија канонских интернеуронских маркера, дефинисане су четири класе ГАБАергичних интернеурона: вазоактивни цревни пептид (ВИП), неуроглиаформ (НГ), соматостатин (Сст) и брзо-шпицасти парвалбумин (ФС-ПВ). 9, 10, 11 У овом раду смо користили сцРТ-мПЦР након патцх стезаљке да недвосмислено утврдимо у којој су класи интернеурона изражене четири горе наведене протеазе. Кластерирање је обогаћено додатком 12 гена из Атласа мозга Аллен Моусе изабраних да се једва или никада не експримирају у ексцитацијским неуронима. Додавање гена металопептидазе доводи до преуређења ФС-ПВ кластера у два подкласера, једном који експримира Сст (ПВ-Сст) и другом који експримира ове три металопептидазе (ПВ-МПс), али не и Сст . Примећено је да су интернетски ПВ-МП окружени ПНН-ом, док ПВ-Сст нису. Ова два ФС-ПВ кластера разликовала су се и по њиховим електрофизиолошким својствима; ПВ-МП неурони се празне на већој фреквенцији и мање су побуђиви од ПВ-Сст кластера.

Ограничена експресија три металопептидазе у подскупини ФС-ПВ интернеурона је интригантна. Предлаже се да ове излучене протеазе модификују структуру ПНН-а и да заузврат могу бити укључене у пластичност неурона и дугорочну меморију.

материјали и методе

Припрема кришки

Сви експерименти су изведени у складу са смерницама Директиве Савета Европске заједнице од 24. новембра 1986 (86/609 / ЕЕЗ). Јувенилни Ц57БЛ / 6 мишеви (Јанвиер Лабс, Ле Генест-Саинт-Исле, Француска) у доби од постнаталног дана П14 – П17 дубоко су анестезирани халотаном и декапутирани. Мозак је брзо уклоњен и потопљен у ледено хладни (~ 4 ° Ц) раствор за резање континуирано гашен карбогеном (95% О 2 /5% ЦО 2 ), који садржи (у мМ): 110 холин хлорид, 11, 6 натријум аскорбат, 7 МгЦл2, 2, 5 КЦл, 1, 25 НаХ2П04, 25 глукозе, 25 НаХЦО3 и 3, 1 натријум-пирувата. Охлађени мозгови су стављени на сцену вибратора и исечени на кришке дебљине 300 μм са нагибом од 30 до 40 ° од сагиталне равнине, окомито на површину коре коре цеви. Резања су затим пребачена у топли (~ 33 ° Ц) вештачки раствор цереброспиналне течности, аерирани карбогеном у трајању од 20 минута и који садржи (у мМ): 126 НаЦл, 2, 5 КЦл, 2 ЦаЦл2, 1 МгЦл 2, 1, 25 НаХ2П04, 20 глукозе, 26 НаХЦО 3 и 1 мМ кинуренске киселине. Резови су преношени на собну температуру најмање 1 х пре снимања. За детаље видети Перреноуд и др. 11

Снимке закрпа у целој ћелији

Резови су потопљени у термостатизовану комору за снимање, постављени на сцену микроскопа, опремљени Додтовом опцијом градијентских контраста и визуелизовани инфрацрвеним осветљењем. Препарат је континуирано суперфундиран (1-2 мл мин- 1 ) са вештачком течном цереброспиналном течношћу загрејаном до 30 ° Ц. Бачви су визуелизовани у одсуству лаког кондензатора. Пипете (4–6 МОхмс) су извучене из боросиликатних капилара и напуњене са 8 μл аутоклавираног унутрашњег раствора који садржи 144 м М К-глуконата, 3 м М МгЦл2, 0, 5 м М ЕДТА, 10 мМ 4- (2-хидроксиетил) - 1-пиперазинетансулфонска киселина, пХ 7, 2 (285/295 мОсм) и 3 мг мл -1 биоцитина. Снимање закрпа у целоцеличним закрпама изведено је на 30 ± 1 ° Ц у режиму тренутне стезања.

сцРТ-мПЦР протокол

На крају снимака, ћелијски се садржај нежно усисавао у пипету за фластер. Пипете су полако уклоњене из снимљених ћелија да би се омогућило поновно затварање ћелијских мембрана. Садржај пипета избачен је у епрувету за микроцентрифугу у којој је извршена обрнута транскрипција као што је претходно описано. 11 Производи обрнуте транскрипције чувани су на –80 ° Ц до даљње обраде. СцРТ-мПЦР протокол је дизајниран тако да открива присуство мРНА гласника који кодирају 27 гена (26 интернеурон гена и Слц17а7 за везикуларни транспортер глутамата 1 (ВГлуТ1)). Два узастопна круга појачања изведена су употребом угнијежђених парова прајмера. Сви маркери су прво амплификовани истовремено са првим сетом прајмера (Додатна табела С1), током 21 циклуса појачања (94 ° Ц током 30 с, 60 ° Ц током 30 с и 72 ° Ц током 35 с) у коначном волумену од 100 μл. Сваки маркер је затим амплифициран појединачно користећи други пар прајмера унутарњих парова коришћених у првом кругу (угнијежђени пар прајмери) током 35 додатних циклуса појачања. Сви прајмери ​​су дизајнирани да буду на два различита ексона циљне мРНА, тако да се разликују стварни транскрипти од могућих контаминација геномске ДНК. Коначно је откривено присуство производа амплификације на 2% агарозном гелу обојеном етидијевим бромидом.

Електрофизиолошка анализа

Измерено је 28 електрофизиолошких параметара на траговима који одговарају реакцијама напона изазваним хиперполаризацијом и деполаризацијом струјних импулса од 800 мс. Ових 28 параметара за 157 ћелија доступно је у Додатној табели С2. Ћелије су повезане у једну од четири категорије засноване на својствима пасивне мембране, ћелијским својствима паљења и анатомској структури визуелизованим под инфрацрвеним осветљењем: редовно спикирно пирамидално, ФС, правилно спикрисање, непирамидно или касно шиљање (ЛС), за детаље видети Перреноуд ет ал. 11

Анализа кластера

Кластерирање је изведено на бинарним вредностима експресије гена користећи Вард-ове хијерархијске и К-начине користећи статистички пакет Р (//ввв.р-пројецт.орг/). Анализа стабилности кластера за К-значи користи цлустерграм за идентификацију оптималног к. 12

Дво-флуоресцентна ин ситу хибридизација (дФИСХ)

Рибопробе су обележене са дигокигенин-УТП и / или динитрофенил-11-УТП (ДНП; Перкин Елмер, Валтхам, МА, УСА). Сонда са обележеном ДНП и сонда обележена дигоксигенином хибридизирани су на ткиво истовремено. Амплификација тирамидног сигнала изведена је за сваку појединачну сонду, користећи анти-дигокигенин-хрен пероксидазу са тирамид-биотином, или анти-ДНП-пероксидазу хрену са тирамидом-ДНП. Сигнали су визуелизовани коришћењем стрептавидин-Алека Флуор 488 (Лифе Тецхнологиес-Молецулар Пробес, Гранд Исланд, НИ, УСА) и анти-ДНП-Алека Флуор 555 (Лифе Тецхнологиес-Молецулар Пробес). 13

Имунофлуоресценција и конфокално снимање

Одсеци мозга мужјака П40, Ц57 / Бл6, који садрже С1, прво су инкубирани са физиолошком отопином пуферираном фосфатом + Тритон 0, 3% + натријум азид (1 г л -1 ), који садржи 2–5% нормалног коњског серума, а затим су смештени у 48 х у раствор са мишјим моноклонским антипарвалбумином (1: 2500; Свант, Марли, Швајцарска) и козјим анти-соматостатином (1: 100; Санта Цруз, Даллас, ТКС, УСА) примарним антителом заједно са лектином коњугираним са биотином Вистериа флорибунда аглутинин (ВФА, 1: 2000; Сигма, Буцхс, Швајцарска). Одсеци су затим испрани, инкубирани са флуоресцентним коњугатима секундарног антитела (козји анти зечји имунуглобулин (Иг) Г (1: 300; ЦИ3; Цхемицон Интернатионал, Биллерица, МА, САД) и козји антис миш (1: 300; А488; Живот Тецхнологиес, ​​Гранд Исланд, НИ, УСА) и стрептавидин 405 коњугат (1: 300; Миллипоре Цорпоратион, Биллерица, МА, САД)), када се гледају троструко бојење на ПВ, Сст и ВФА. Да бисмо истражили ПВ / Сст-МП у истим регионима, користили смо исти поступак имуно обојења са поликлоналним зечјим анти-парвалбумином зеца (1: 2500; Свант) и анти-мишјим Неприлисином (1:50; Р&Д Системс, Абингдон, Велика Британија) примарно антитело заједно са лектинским ВФА, контрастанираним флуоресцентним коњугатима секундарних антитела (козји анти-зечји ИгГ (1: 300; ЦИ3) и козји анти-миш (1: 300; А488) и флуоресцентни стрептавидин 405 коњугат (1: 300)). Секције су сличне обојени зечјим антипарвалбумином (1: 2500; Свант) и анти-коза АДАМТС8 (1: 100; Санта Цруз) примарним антителом заједно са ВФА лектином (1: 2000), контрастираним флуоресцентним секундарним коњугатима (магарац анти -Гог ИгГ (1: 500; ЦИ3; Инвитроген, Гранд Исланд, НИ, УСА) и магарац против зечева ИгГ (1: 500; А488; Инвитроген) и флуоресцентни стрептавидин 405 коњугат (1: 300)). Коначно, С1 пресеци су обојени било мишјим моноклонским анти-парвалбумином (1: 2500) или козјим анти-соматостатином (1: 100), и зечјим поликлонским анти-Мибпц1 (1: 100; Сигма Лифе Сциенце, Ст Лоуис, МО, САД) заједно са лектином ВФА, затим контрастанираним флуоресцентним коњугатима секундарних антитела (козји анти-миш (1: 300; ЦИ3; Цхемицон Интернатионал) или магарац против козлића (1: 300: ЦИ3) и магарац против зеца (1 : 300) и флуоресцентни стрептавидин 405 коњугат (1: 300)). Одсеци су визуелизовани и обрађени Зеисс-овим конфокалним микроскопом (Фелдбацх, Швајцарска) опремљеним циљевима к10, к40 и к63 План-НЕОФЛУАР. Све периферије су контролисане ЛСМ 710 Куасар софтвером (Царл Зеисс АГ, Фелдбацх, Швајцарска). З-снопови девет слика (са интервалом 3, 13 µм) скенирани су (1024 × 1024 пиксела) са к10 и к63 циљевима за квалитативну анализу помоћу софтвера ИМАРИС 7.3 (Битплане АГ, Цирих, Швајцарска). Регион интересовања, како је дефинисано у стереолошком поступку, створен је у С1. Детаљни протоколи доступни су у Цабунгцал ет ал. 14, 15

Резултати

Избор 27 гена за сцРТ-мПЦР након спајања патцх-а

Гени одабрани за сцРТ-мПЦР након спајања фластера укључују и нове маркере и известан број канонских маркера чији су производи генерално имунодетенирани у интернеуронима. Они укључују две изоформе глутамат-декарбоксилазе ( Гад1 и Гад2 ), три протеина који везују калцијум, парвалбумин ( Пвалб ), калбиндин ( Цалб1 ) и калретинин ( Цалб2 ), четири следећа неуропептида Вип , неуропептид И ( Нпи ), колецистокинин , Сст и ензим азотни оксид синтаза 1. 10, 11 У два недавна велика истраживања која су користила сцРТ-мПЦР након стезања фластера, ови маркери су дефинисали четири класе интернеурона. 10, 11 У овој студији су додате четири протеазе / пептидазе Адамтс15 , Адамтс8 , Мме и Релн које је идентификовао ИСХ (Табела 1).

Адамтс8 и Адамтс15 су два члана породице метазинпротеиназа у Метзинцину, тако названи по сачуваном Мет остатку на активном месту и употреби цинковог јона у ензимској реакцији. АДАМТС-ови су акроними за дисинтегрин и металопротеиназу са мотивима ТхромбоСпондина.

Мме кодира за пептидазу са многим алиасима: Неприлисин, мембранска металоендопептидаза, неутрална ендопептидаза, ЦД10, заједнички антиген лимфобластичне леукемије и енкефалиназа. Неприлисин је металопротеаза цинка која разграђује бројне излучене пептиде, од којих су најпознатији амилоидни П-пептиди чија абнормална агрегација изазива стварање плакова код Алзхеимерове болести. Синтетизован као протеин везан за мембрану, Неприлисин ектодомена ослобађа се у ванћелијској течности.

Релн кодира реелин, серин протеазу изванстаничне матрице. Овај гликопротеин изванстаничне матрице излучује и регулише миграцију неурона.

Осталих 12 наводних маркера одабрано је анализом ИСХ експресије гена података у можданој коре. Ови одабрани гени су расподељени на ниској густини унутар ламина кортекса и хипокампуса (види Додатну табелу С1 Соренсена и др. 8 ) и ретко су или никада нису експримирани у ексцитацијским неуронима. Абецедним редом су описани доле: Акр1ц18 , алдо-кето редуктаза која учествује у метаболизму прогестерона; Бтбд11 , кодирајући протеин са непознатом функцијом који садржи домену анкинина и индукован ретиноичном киселином; Цок6а2 , подјединица цитохром ц оксидазе; Хтр3а, подјединица алфа ионотропног серотонинског рецептора 5ХТ3А; Кит , прото-онкогена тирозин-протеин киназа; Мибпц1 , протеин Ц који веже миозин ; Нацц2 , кодирајући Бтбд14а, још један протеин са непознатом функцијом; Нр2ф2 , фактор транскрипције такође познат као ЦоупТФИИ; Нкпх1 , члан породице неурекопхилин који поспешује адхезију између дендрита и аксона; Пноц проноцицептин, прекурсор антианалгетског пептида ноцицептин; два семафорина Сема4г и Сема3ц који делују као аксонални молекули конусног раста. Као контрола је изабрана Слц17а7 која кодира ВГлуТ1 маркер за ексцитацијске неуроне.

Разрађен је сцРТ-мПЦР тест за истовремено откривање 27 гена, заснован на најбољем могућем мултиплексу постављеном без олигонуклеотидне унакрсне реактивности. Листа прајмера и угнездених прајмера је дата у Додатној табели С1. Неурони (218) из различитих слојева соматосензорног кортекса кришки малолетних мишева (П14-17) били су закрпани и анализирани на електрофизиолошка својства (види Додатну табелу С2). На крају периода снимања, ћелије су смештене између четири електрофизиолошке шеме, правилног пирамидалног шиљатог, правилног шпијунчења, непирамидног, ФС и ЛС. Цитоплазма неурона је аспирирана у патцх пипету и извршен је сцРТ-мПЦР.

Вард-ово хијерархијско групирање

На основу експресије бинарне мРНА за 27 маркера изведено је Вардово групирање. Вардово групирање је хијерархијска метода која групише ћелије како би повећала разлике између група и свела их на најмању могућу меру унутар група. Овај алгоритам је идентификовао пет група неурона (слика 1а) у складу са претходним налазима 10, 11 и дискриминисао ексцитаторне неуроне који изражавају Слц17а7 од инхибицијских неурона који експримирају Гад1 и Гад2.

Image

Кластеризација 218 неурона у пет (Вард) или шест ( К -меанс) класа помоћу експресије гена. Свака појединачна ћелија из соматосензорног кортекса код мишева старих 15-19 дана представљена је дуж к-осе. У сваком од 218 колона, детекција гена помоћу сцРТмПЦР у једном неурону означена је црним или обојеним квадратима. Листа 27 откривених гена налази се на оси и. Анатомски и електрофизиолошки профили већине ових ћелија претходно су описани. 11 Комплетни подаци налазе се у Додатној табели С2. ( а ) Вард-ово хијерархијско и К- средство ( к = 6) групирање само за присуство или одсуство (бинарност) експресије гена. Електрофизиолошки профили из Додатне табеле С2 нису коришћени за групирање. ( б ) Анализа стабилности кластера заснована на анализи главних компоненти (ПЦА). 12 ФС-ПВ, брзи шиљасти парвалбумин; КС, ц-Кит са семафорином3ц; НГ, неуроглиаформ; ПВ-МП, парвалбумин са металопептидазама; ПВ-Сст, парвалбумин са соматостатином; Сст, соматостатин; ВГлуТ1, везикуларни транспортер глутамата 1; ВИП, вазоактивни цревни пептид.

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Гране дрвета добијене Вардовим хијерархијским групирањем разликују интернеуроне према њиховом пореклу. Интернеурони из кортекса потичу од ганглионске еминенце између 11 и 15 дана утеро и достижу различите слојеве кортекса ради њиховог коначног сазревања. ВИП биполарне и НГ ћелије потичу од каудалне ганглионске еминенце, док Сст и ПВ из медијалне ганглионске еминенце. Велика еуклидијска удаљеност две гране стабла које раздвајају ВИП биполарне и НГ кластере од ПВ и СОМ кластера могла би да одражава различито порекло ових кластера. У недавној публикацији Сцанзиани и сар. 16 је идентификовало сличне кластере.

И ВИП и НГ кластери су обогаћени за два гена Кит и Сема3ц . Ови гени су једва експримирани у осталим кластерима. Кит и Сема3ц дефинишу један скуп ћелија који се називају КС. Вардов алгоритам такође је назначио да се ПВ ћелије могу поделити у два различита кластера на основу експресије 27 одабраних молекуларних маркера. Испитивани су и остали алгоритми кластерирања, односно ширење афинитета и К-средства. К-средство, нехијерархијски алгоритам, резултирало је рафиниранијом партицијом ПВ интернеурона.

К-значи групирање

Као што је приказано, на слици 1б, анализа стабилности кластера показала је да вредност К-средства од 6 ( к = 6) пружа најбоље одвајање између кластера. Слично као код Вард-овог кластера, КС кластер (жут на слици 1а) је субкластиран у две подразреде, једна (КС-ВИП у зеленој боји) која изражава Вип без израза Нкпх1, а друга, КС-НГ (наранџаста на слици 1а) то не изражава Вип, али изражава Нкпх1 при релативно високој појави (17/35). Овај последњи подклап садржи 40% ЛС неурона који су окарактерисани кашњењем за генерисање акционих потенцијала (Додатна табела С2). Образац испаљивања ЛС је електрофизиолошки потпис НГ ћелија 9 и никада није примећен у ћелијама из других кластера.

Недавно је предложено да се ћелије у ПВ корпама могу поделити у четири класе према њиховим електрофизиолошким својствима. 17 Слика 1а показује да К-значи алгоритам са к од 6, сада дисоцира ПВ цлустер у два подкластера. ПВ поткластер коекспресира Пвалб и Сст . Овај кластер је на слици 1а означен са ПВ-Сст и означен љубичастом бојом. Други ПВ кластер изражава Пвалб и три металопептидазе Мме , Адамтс8 и Адамтс15 . Овај кластер је означен са ПВ-МП и означен плавим словима на слици 1а. Три металопептидазе нису биле или су веома ретко изражене у пет других група.

Подкласирање ФС-ПВ ћелија

Поређење алгоритама Вард-а и К-средстава резултирало је дистрибуцијом која је врло слична за ВГлуТ1, КС-ВИП, КС-НГ и Сст кластере. С друге стране, алгоритам К-средства открива две поткласе ПВ ћелија, ПВ-МП и ПВ-Сст. Неурони из оба ПВ подкласе приказују максималну фреквенцију пражњења> 130 Хз (Табела 2), карактеристику типичну за ФС-ПВ ћелије. 9 Образац паљења високофреквентних ћелија ФС-ПВ користи максимални оксидативни капацитет митохондрија и може објаснити детекцију гена за дисање Цок6а2 који се налази у већини ћелија унутар ПВ-МП и ПВ-Сст кластера. Када се гледају њихова електрофизиолошка својства, ове две подразреде ФС-ПВ показале су различите карактеристике: 39 ПВ-МП ћелија се испуштају на већој максималној фреквенцији од 26 ПВ-Сст ћелија, али су у просеку мање подложне због нижег средњег уноса отпорност и веће вриједности реобасе (Табела 2).

Табела пуне величине

Ова два ПВ кластера су такође различита у експресији пет гена: Акр1ц18 , Мибпц1, Мме, Адамтс8 и Адамтс15 су експримирани у ПВ-МП кластеру и ретко су експримирани или нису у ПВ-Сст кластеру нити у осталим кластерима инхибицијских или ексцитацијских неурона . Акр1ц18 кодира за ензим стероидних метаболизма; Мибпц1 за протеин Ц који везује миозин и Мме за металопептидазу цинка Неприлисин, док су Адамтс8 и Адамтс15 две металопептидазе које могу да цепају протеогликанске агреканне и верзиканске, две главне компоненте ванћелијске матрице ПНН-а. 18, 19 Адамтс8 и Адамтс15 су такође раније идентификовани у ФС-ПВ интернеуронима од Нелсон ет ал. 20 Израз Мибпц1, Мме, Адамтс8 и Адамтс15 је означен бледо плавим бојама у ПВ-МП кластеру (слика 1а). Мибпц1 је откривен у већини ћелија ПВ-МП кластера (26/39) и може се сматрати сурогат маркером ПВ-МП кластера.

дФИСХ анализа Мибпцл, Мме, Адамтс8 и Адамтс15 са Пвалб је извршена и потврђује да је мРНА за Мибпцл и за три МП коекспримирана са Пвалб у свим слојевима соматосензорног кортекса. Слика 2 упоређује дФИСХ од Пвалб или Сст са Адамтс8, Мме и Мибпц1 . Колокализација је пронађена за Пвалб и Адамтс8 (црвена) , Мме (зелена) и Мибпц1 (зелена), са друге стране, ова три гена (сва три у зеленом) никада нису колокализована са Сст (црвена). Ови резултати дФИСХ добијени код одраслих мишева П58 у складу су са резултатима сцРТ-мПЦР добијеним код малољетничких мишева на слици 1а.

Image

Дво-флуоресцентна ин ситу хибридизација (дФИСХ). Са леве стране стрелице означавају неуроне који коекспресионирају Адамтс8, Мме и Мибпц1 са Пвалбом. Са десне стране Сст није повезан са изразом Адамтс8, Мме и Мибпц1. Соматосензорни кортекс код 58-дневних мишева. Бар 30 микрона. Сст, соматостатин.

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Колокализација МП-а и Мибпцл са ПВ даље је испитивана на нивоу протеина троструким обојењем, двоструком имунохистохемијом заједно са ВФА биотин стрептавидином. ВФА означава специфично ПНН. На слици 3, ВФА лектин је увек обојен плавом бојом. На сликама 3б-д, антитела против АДАМТС8, Мме (Неприлисин) и Мибпц1 показују да су ови маркери колокализовани са ПВ и такође са ВФА. Слика 3е показује да Сст (црвена) није колокализована са Мибпц1 (зелена) нити са ВФА. Слика 3а приказује троструко бојење ПВ, Сст и ВФА. Веће увећање има четири ПВ ћелије обојене у црвено; једна ћелија (горња средина) приказује ПВ и ВФА без Сст; две ћелије (горња лева и средња лева) показују ПВ и Сст без ВФА; једна ћелија (средња лева) са ПВ, Сст и ВФА. При великом увећању често се примећивало да пројекције ПВ и Сст имунореактивности делују у корпу. На допунској слици С1, панел А показује да су ћелије обојене ПВ-ом често, али не увек, повезане са ВФА, на другој страни Б панела показује да Сст није повезан са ВФА.

Image

Имунофлуоресценција и конфокално снимање. Парвалбумин (ПВ) интернеурони омотани перинеуроналном мрежом садрже протеин металопептидазе. Колокализација ПВ, соматостатина (Сст), агглутинина Вистериа флорибунда (ВФА), Мме (Неприлисин), Адамтс8 и Мибпц1. ( а ) Микрографија парвалбумин интернеурона (црвена) открива да је већина ПВ коекспресованих са Сст (зелена) празнина перинеуроналне мреже (ВФА; плава). ( б ) Парвалбумин интернеурони (црвени) омотани перинеуроналном мрежом (плави) садрже Неприлисин (Мме; зелени). ( ц ) Адамтс8 (црвени) се може наћи у свим парвалбумин интернеуронима (зелени), али не искључиво. ( д ) Већина интервалурова парвалбумина (црвених) обложених перинеуроналном мрежом (плава) колокализује се Мибпц1 (зелена). ( е ) Соматостатин-позитивни неурони (црвени) нису обухваћени перинеуроналном мрежом (ВФА, плави) и не колокализују се Мибпц1 (зелени). Линија скале, 80 µм при малом (× 10) и 30 µм при високом (× 63) увећању. Стрелице приказују главну ћелију интересовања (црвена). Ово запажање је потврђено код три мужјака, стари 40 дана, Ц57 / Бл6, мишева Ц57 / Бл6.

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Допунска слика С2 показује са троструком имуностанизацијом да су две металопептидазе АДАМТС8 и Мме колокализоване у истим ПВ интернеуронима. Анализа на слици 1 и допунској табели 2 показује да је истовремено откривање три гена Адамтс8 , Адамтс15 и Мме помоћу РТ-ПЦР пронађено у 4 ћелије преко 39 ћелија кластера ПВ-МП; истовремено откривање два гена међу три пептидазе нађено је у 10 ћелија преко 39. Свеукупно, вишеструко имуностанације и сцРТ-мПЦР указују на то да присуство једне од три металопептидазе не искључује присуство два друга.

Општи закључци ИСХ-а и имуноцитолошких студија су да су у соматосензорном кортексу одраслог миша идентификоване две класе интернеурова са ПВ кошем: ПВ интернеурони који изражавају МП били су окружени ПНН-ом и ПВ који изражавају Сст нису обухваћени ПНН-ом. Генерализација овог опсервације на друга подручја кортекса остаје да се уради.

Дискусија

У овом извештају, образац експресије четири протеазе кортикалним интернеуронима анализиран је сцРТ-мПЦР након патцх стезаљке и упоређен је са експресијом 23 додатна гена. Кластерирање ових гена алгоритмом К-средстава приказује пет различитих кластера. Између ових пет кластера идентификована су два ФС интернеуронска грозда која изражавају протеин који веже калцијум Пвалб : један ПВ-Сст коекспресионира Пвалб са Сст и други ПВ-МП коекспресионирајући Пвалб са три металопептидазе Адамтс8, Адамтс15 и Мме . Коришћењем ВФА, пронађено је да је специфични маркер за ПНН ПВ-МП интернеурони окружен ПНН, док интернеурони који изражавају Сст и ПВ-Сст нису.

Нови маркери који дефинишу ћелије кластера

27 маркера коришћених у сцРТ-мПЦР дефинисало је пет кластера. Два кластера експресионирају два молекуларна маркера: Кит тирозин-протеин киназа (44/52) и молекул за усмеравање конуса раста семафорина Сема3ц (47/52). Овај КС кластер је субкластиран у КС-ВИП кластер (17 ћелија) и у КС-НГ кластер (35 ћелија). Према претходним развојним студијама, ова два кластера, КС-ВИП и КС-НГ садрже ћелије које потичу углавном из каудалне ганглионске еминенце. 9

КС-ВИП кластер изражен је високим појављивањем Вип (14/17), цалретинин ( Цалб2 ) (9/17) и ионотропни серотонински рецептор подјединица Хтр3а (8/17). Вип није изражен у осталим кластерима.

КС-НГ кластер експримира гликопротеин серин протеазу реелин Релн (28/35) и прекурсор антианалгетског пептида, проноцицептин Пноц (30/35). КС-НГ кластер садржи 40% неурона са ЛС обрасцем пуцања карактеризирано кашњењем за генерисање акционих потенцијала (Додатна табела С2). Образац испаљивања ЛС је електрофизиолошки потпис НГ ћелија 9 и никада није примећен у ћелијама из других кластера. Нпи је откривен у 31 од 35 ћелија тог кластера, али је такође откривен у великим појавама у Сст, ПВ-МП и ПВ-Сст кластерима, потврђујући да Нпи није специфичан маркер за НГ ћелије. 11

Сст цлустер изражава Сст (39/40), Цалб1 (23/40) и Нпи ( 34/40 ). Сст и ФС-ПВ интернеурони имају и ембрионално порекло у медијалној ганглионској еминентности и деле многе карактеристике. 21

На анатомским и електрофизиолошким критеријумима раније су идентификоване две главне класе ФС-ПВ интернеурона, ћелије лустера које циљају проксимални сегмент пирамида и ћелије корпе које циљају сома и проксималне дендрите пирамида. 9 У овом раду, као и у претходним радовима 10, 11 лустерских интернеурона 22 није идентификовано на препаратима.

У овом истраживању, Слц17а7 (ВГлуТ1), канонски маркер ексцитацијских неурона, откривен је у готово 20% интернеурона. Ово није неочекивано, јер је већ забележено суживот везикуларних транспортера глутамата и ГАБА у синаптичким везикулама ГАБАергичних неурона. 23 Наше опажање даје више основа за могућност да би субпопулације ГАБАергичких интернеурона могле ослободити глутамат стварајући могућу прецизну прилагодбу између инхибицијског и ексцитацијског излаза. 24

Оригиналност овог рада заиста је откриће две различите групе ФС-ПВ ћелија које приказују различите електрофизиолошке профиле и изражавају различите подскупове гена. Ћелије у ПВ-Сст кластеру које изражавају и Пвалб и Сст су више узбудљиве и празне се нижом фреквенцијом од ћелија у ПВ-МП кластеру (Табела 2). Овај последњи кластер изражава три пептидазе и такође Мибпц1 чија је улога у овом кластеру још увек непозната.

Преобликовање ПНН-а од стране АДАМТС-а и Неприлисин-а које излучују ПВ-МП интернеурони

Експресија пептидаза унутар субпопулације ФС-ПВ интернеурона може имати значајне физиолошке последице. Важност ПНН-а у критичном периоду који одређује окуларну доминацију истакли су већ 2002. године Пиззоруссо ет ал. 25 Показали су да преобликовање ванћелијског ПНН уништавањем његових главних састојака хондроитин сулфат протеогликана са хондроитиназом-АБЦ има значајан ефекат у продужењу критичног периода доминације ока у визуелном систему. У новије време пептидазе су препознате као важни актери у неуронској пластичности. 3 Број, локација и идентификација различитих пептидаза које су укључене у пластичност још увек нису добро окарактерисане. Добри кандидати су веома велика породица метзинцинских протеаза, са матрикс металопротеиназама (ММП), АДАМ и АДАМТС. Ови последњи ензими излучују се у ванћелијској течности. Породица гена Адамтс је велика са 19 чланова који се могу поделити у четири главне подгрупе. И Адамтс8 и Адамтс15 изражени у ФС-ПВ интернеуронима су чланови подфамије А. Чланови ове породице цепају главне протеогликане хрскавице агрекан и верзиканце, две главне компоненте ПНН-а. 4

Међу> 20 ММП-а, ММП9 је посебно проучаван и откривено је да је важан за успостављање касног дугорочног потенцирања. 5, 26 Тренутна хипотеза би била да ММП9 у ЦА1 хипокампуса мења облик и организацију дендритичних бодљи. У овом истраживању ММП9 није откривен у соматосензорном кортексу. Наше запажање да подразред ФС-ПВ интернеурона заробљених у ПНН-у изражава три посланика натерао нас је да предложимо да ови излучени посланици могу преобликовати протеогликане ПНН-а. Преобликовање ПНН-а утемељено је на недавном предлогу Тсиена 6 да се веома дугорочне успомене могу сачувати у обрасцу рупа у ПНН-у.

О улози металопептидаза у Алзхеимеровој болести

Специфична експресија Мме у субпопулацији ФС-ПВ интернеурона могла би имати значајан интерес за Алзхеимерову болест. Мме кодира металопептидазу цинка Неприлисин. Овај ензим сматра се главним ензимом разградње П-амилоида. Пре десет година, Ивата и др. 27 приметили су да је Неприлисин смањен у старењу и Алзхеимеровој болести. 27 С друге стране, учињено је неколико покушаја да се његова ендогена продукција регулише као могући терапеутски циљ Алзхеимерове болести. 28

Садашње опажање да се Неприлисин у можданој коре испољава у подкласи ФС-ПВ интернеурона треба да подстакне нова генетска или фармаколошка испитивања чији је циљ повећање производње Неприлисин овим ограниченим подразредом интернерона. ФС-ПВ интернеурони су у извору осцилације гама у кортексу и доприносе когнитивним функцијама. 29, 30 Превладавајућа хипотеза је да су когнитивни дефицит код Алзхеимерове болести повезани са измењеним активностима ФС-ПВ интернеурона. 31 Поновно успостављање одрживости ФС-ПВ интернеурона и повећање њихове производње Неприлисин-а може постати доступна мета за лечење когнитивног дефицита у Алзхеимер-овој болести.

О значају ПНН-а за шизофренију

Левис и др. 32, 33 такође су повезане когнитивне дисфункције у схизофренији са измењеним улазима на ФС-ПВ интернеуроне. Варетта ПНН у схизофренији недавно је истакла Беретта. 34, 35 Анатомопатологија пацијената оболелих од шизофреније показала је да је ПНН измењен у кортексу ових пацијената. С друге стране, код мишева је примећено да ПНН штити интернетске ФС-ПВ од оксидативног стреса. 14, 15

У овом извештају показујемо помоћу ВФА, специфичног маркера за ПНН, да су интернетски ПВ-МП окружени ПНН, док онај који изражава Сст, ПВ-Сст, нису. Стога се чини веродостојним да су ПВ-Сст интернеурони који нису заштићени ПНН различита класа ФС-ПВ интернеурона који су подложни оксидативном стресу изазваном развојним увредама у шизофренији. 36

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Допунска табела С1

Екцел датотеке

  1. 1.

    Додатна табела С2

Датотеке слика

  1. 1.

    Допунска слика С1

  2. 2

    надопуна Слика С2

    Додатне информације прате рад на веб локацији Молекуларна психијатрија (//ввв.натуре.цом/мп)