Дисц-1 леу607пхе алели различито утичу на централизацију пцм1 локализације и ослобађање неуротрансмитера | молекуларна психијатрија

Дисц-1 леу607пхе алели различито утичу на централизацију пцм1 локализације и ослобађање неуротрансмитера | молекуларна психијатрија

Anonim

Предпостављени ген осетљивости на шизофренију Дисрупт-ин-схизофренија 1 (ДИСЦ-1) , кодира плеиотропни протеин са многим субцелуларним локализацијама и наводним функцијама. Сматра се да је једна кључна улога, синаптичка функција, делом последица дејства на микротубуле. 1 У овом контексту недавно истраживање показало је да ДИСЦ-1 регулише перицентриоларни материјал 1 ( ПЦМ1 ; још један потенцијални ген осетљивости на шизофренију 2 ) на центросом, 3 органелу која служи као главни центар за организовање микротубула, а склоп микротубула зависи од ПЦМ1 . 4 Замена Леу607Пхе један је од ретких ДИСЦ-1 полиморфизама који су повезани са фенотиповима повезаним са шизофренијом, а који кодирају 5, 6, иако недостају директни докази за његову функционалност.

С обзиром на потенцијалне везе између ДИСЦ-1, ПЦМ1, центросома, микротубула и синапсе, желели смо да утврдимо да ли полиморфизам Леу607Пхе утиче на центросомалну локализацију ПЦМ1, динамику микротубула или ослобађање неуротрансмитера. СХ-СИ5И ћелије су изабране као људске, имају неуронски фенотип и коришћене су у неуротрансмитерским студијама. Недиференциране СХ-СИ5И ћелије су трансфектиране конструктима који садрже В5-означен Леу607 или В5-означен Пхе607 ДИСЦ-1. Двострука имунофлуоресценција анти-В5 и ПЦМ1 изведена је за процену разлике између варијанти у центросомалној имунореактивности ПЦМ1. Вестерн блот-ови су коришћени за квантификацију тирозинованог и детрозираног а-тубулина, маркера динамичких и стабилних микротубула. 7 За студије ослобађања неуротрансмитера, СХ-СИ5И ћелије су биле напуњене [3Х] норадреналином, а ослобађање је мерено у две [К + ] концентрације (5 мМ и 100 мМ). Остали експериментални детаљи доступни су у Додатном материјалу.

Иако су обе варијанте ДИСЦ-1 колокализоване са ПЦМ1 на центросому, површина колокализације изгледала је мања у СХ-СИ5И ћелијама трансфектираним Пхе607 ДИСЦ-1 (Слика 1а). Квантитативне процене потврдиле су да је имунореактивност центросома ПЦМ1 била значајно мања после трансфекције Пхе607 ДИСЦ-1 него после Леу607 ДИСЦ-1 трансфекције и у нетрансфектираним ћелијама (слика 1б). Нису откривене промене у односу тирозинованог и детоксинираног α-тубулина после трансфекције са било којом варијантом (средње вредности ± сд: Пхе607 ДИСЦ-1, 0, 92 ± 0, 18, непренесена контрола, 0, 86 ± 0, 13; Леу607 ДИСЦ-1, 0, 90 ± 0, 22, неконтролирана контрола, 0, 88 ± 0, 21). Полиморфизам Леу607Пхе такође је утицао на ослобађање неуротрансмитера, са Пхе607 ДИСЦ-1, али не и Леу607 ДИСЦ-1, смањујући ослобађање норадреналина на 5 м М [К + ] (Слика 1ц). Под овим условима, ослобађање је вероватно последица спонтане фузије везикула (види Додатни материјал). Ниједна варијанта није утицала на ослобађање норадреналина на 100 м М [К + ]. Наши резултати откривају да полиморфизам Леу607Пхе утиче на два аспекта ћелијске функције: центросомалну локализацију ПЦМ1 и спонтано ослобађање неуротрансмитера, али не мења динамику микротубула.

Image

( а ) Подручје ПЦМ1 имунореактивности у центросому нетрансфицираних СХ-СИ5И ћелија (леви панел) изгледало је веће него у ћелијама зараженим са Пхе607 ДИСЦ-1 (десни панел). Стрелице упућују на центросом. Пхе607 ДИСЦ-1 са ознаком В5: зелена; ПЦМ1: црвена; ДИСЦ-1 и ПЦМ1 колокализација: жута. Линија скале = 10 µм. ( б ) Квантитативна анализа показала је да се центросомална ПЦМ1 имунореактивна област разликује између експерименталних група (Ф 2, 209 = 16, 84, П <0, 001), смањује се у ћелијама СХ-СИ5И трансфектираним са Пхе607 ДИСЦ-1, у поређењу са нетрансфектираним ћелијама и ћелијама које су заражене са Леу706 ДИСЦ-1. Није уочена разлика у имунореактивности ПЦМ1 у центросому између непреточених ћелија и оних које су заражене Леу607 ДИСЦ-1 ( П = 0, 603). Свака тачка представља центросомалну имунореактивну област ПЦМ1 за сваку ћелију мерено подељену са просечном контролном (неефектираном) вредношћу. ( ц ) Трансфекција СХ-СИ5И ћелија са Пхе607 ДИСЦ-1 резултирала је смањеним ослобађањем норадреналина на 5 м М [К + ] у поређењу са нетрансфектираним ћелијама које се покрећу са овом варијантом ( * П = 0, 032, упарени узорак т- тест), али не после трансфекције Леу607 ДИСЦ-1 ( П = 0.207). Отпуштање на 100 м М [К + ] се није променило након трансфекције са било којом варијантом (обе П > 0.200). Погледајте Додатни материјал за додатне информације.

Слика пуне величине

Који би молекулски механизми могли бити у основи утицаја полиморфизма Леу607Пхе и могу ли се повезати промене центросомског и неуротрансмитера? Наше запажање да је ДИСЦ1 и ПЦМ1 колокализација у центросому мања код Пхе607 ДИСЦ-1 него код Леу607-ДИСЦ-1 може дати траг. Леу607 је први остатак претпостављеног мотива леуциног патентног затварача8, а налази се и унутар намотане завојнице, обе су важне у регулисању локализације у центросом. 9 Предвиђа се да ће супституција Леу607Пхе уништити и леуцин затварач и завојни домен завојнице 10, што може објаснити наше откриће смањене колокализације ДИСЦ-1 и смањења центросомске имунореактивне области њеног везујућег партнера, ПЦМ1, након Пхе607 ДИСЦ-1 трансфекција. Напомињемо, састављање осталих центросомалних протеина и микротубулозно сидрење и организација зависе од ПЦМ1, 3 што сугерише да би Леу607Пхе полиморфизам могао на овај начин утицати на функцију микротубула у недостатку промена динамике микротубула.

Као кључна компонента цитоскелета, микротубуле су укључене у многе ћелијске процесе, укључујући синаптичку функцију и ослобађање неуротрансмитера (види Додатни материјал). На пример, микротубуле делују као шине дуж којих молекуларни мотори транспортују унутарћелијски терет, укључујући и прекурсоре синаптичких везикула до терминала аксона. Дакле, измењено ослобађање неуротрансмитера примећено после трансфекције Пхе607 ДИСЦ-1 могло би бити последица промена у микротубулу повезаних са ПЦМ1 и резултирајуће промене у транспорту претектора синаптичких везикула. Међутим, из наших података није могуће утврдити да ли је смањено ослобађање неуротрансмитера директно повезано са смањеном центросомалном ПЦМ1 локализацијом након трансфекције Пхе607 ДИСЦ1, другим ДИСЦ-1 функцијама или низводно од неких других измена. Било како било, ефекат на ослобађање сугерише да генетска варијација ДИСЦ-1 може утицати на ову критичну неуронску функцију.

Укратко, наши подаци пружају доказ да је замена ДИСЦ-1 Леу607Пхе функционална варијанта, која утиче и на центросомалну и на синаптичку функцију.

Додатне информације

Ворд документи

  1. 1.

    Додатне информације

    Додатне информације прате рад на веб локацији Молекуларна психијатрија (//ввв.натуре.цом/мп)