Ер инхибитор стреса смањује губитак слуха и смрт ћелија длаке код мутираних цдх23ерл / ерл мишева | ћелијска смрт и болест

Ер инхибитор стреса смањује губитак слуха и смрт ћелија длаке код мутираних цдх23ерл / ерл мишева | ћелијска смрт и болест

Anonim

Субјекти

  • Апоптоза
  • Ћелијска сигнализација
  • Ћелијска ћелија
  • Неуролошке манифестације

Апстрактан

Губитак слуха једно је од најчешћих оштећења сензора код људи. Модели мутираних мутантица помогли су нам да боље разумемо механизме губитка слуха. Недавно смо открили да ерлонг (ерл) мутација кадхерин23 ( Цдх 23) гена доводи до губитка слуха услед апоптозе ћелија длаке. У овој студији имали смо за циљ да откријемо молекуларне путеве узводно до апоптозе у ћелијама косе како би искористили ефикасније терапије од стратегије анти-апоптозе. Наши резултати указују да је стрес на ендоплазматском ретикулуу (ЕР) најранији молекулски догађај који води ка апоптози длакавих ћелија и губитку слуха код ерл мишева. Такође извештавамо да би ЕР инхибитор стреса, Салубринал (Сал), могао да одложи напредовање губитка слуха и сачува ћелије длаке. Наши резултати пружају доказ да терапије које циљају сигналне путеве у развоју стреса ЕР спречавају апоптозу ћелија длаке у раној фази и доводе до бољих исхода од оних које циљају низ фазе, као што су дегенерација прстенастих веза и апоптоза.

Главни

Протеин кадхерин 23 (ЦДХ23) је локализован у горњем делу врха везе у ћелијама косе, где делује као кључна компонента. 1, 2, 3 Код људи, мутације Цдх 23 узрокују несиндромну аутосомно рецесивну глухоћу (ДФНБ12) и Усхеров синдром типа 1Д, УСХ1Д, коју карактерише глухоћа повезана са ретинитисом пигментозом и вестибуларном дисфункцијом. 4, 5, 6 Код мишева, мутације Цдх 23 доводе до губитка слуха са или без вестибуларне дисфункције. 7, 8, 9 Недавно смо идентификовали новоталасну мутацију (Т208Ц) Цдх 23 и ову мутацију назвали ерлонг ( ерл ). 10 Цдх23 ерл / ерл мишеви ( ерл мишеви) показали су се животињским моделима ДФНБ12. Раније смо показали да је апоптоза ћелија длаке један од патолошких механизама који доводе до губитка слуха код овог мутанта. 10 Овде смо желели да откријемо да је сигнализација ЕР стреса узводно, што води ка апоптози ћелија длаке код мишева са мутацијом ерл , и покушали смо да пронађемо потенцијалне терапије.

Поремећај хомеостазе ендоплазматског ретикулума (ЕР) доводи до накупљања неразвијених или погрешно сабраних протеина у ЕР лумена, што резултира ЕР стресом. Затим се покреће неотворени протеин протеина (УПР) да се ублажи овај стрес и обнови ЕР хомеостаза, промовишући адаптацију и опстанак ћелија. Супротно томе, ако је стрес продужен или ако адаптивни одговор не успе, започеће се пут апоптозе. 11, 12, 13 УПР се посредује кроз три ЕР трансмембранска рецептора: протеин киназа ЕР-киназа слична РНА (ПЕРК); активирање транскрипцијског фактора-6 (АТФ6); и ензим 1 који захтева инозитол (ИРЕ1). 11, 12, 13, 14 Узводно од ове мреже, протеин протеина који веже имуноглобулин који повезује ЕР капепен дјелује као главни регулатор раздвајајући се од луминалних домена ПЕРК, АТФ6 и ИРЕ1 и на тај начин активира реакције на стрес ових ефектора. Као низводни сигнал, ЦЦААТ / појачивач који веже протеин-хомологни протеин (ЦХОП) сматра се веома осетљивим показатељем стања стреса ЕР, а његова индукција углавном подстиче ћелијску смрт. 11, 13

Недавно истраживање мутаната зебрефисх открило је да усхер протеини, укључујући ЦДХ23, формирају комплекс и затим су прекомпоновани у ЕР. 15 Дефекти усхер протеина пореметили су формирање комплекса, индуковали оштећења у трговини протеинима и коначно покренули ЕР стрес и апоптозу. Стога, блокирање ЕР фактора про-апоптозе може смањити смрт ћелија код мутаната зебрафисх. 15 Будући да мутација ерл утјече на Цдх 23, исти ген који узрокује УСХ1Д код људи, оправдано је нагађати да би протеин ЕРЛ-ЦДХ23 могао претрпјети неисправну трговину, чиме покреће ЕР стрес и доводи до апоптозе ћелија длаке и оштећења слуха код ерл мутанта . У тренутној студији тестирали смо експресију ЕР капепена БиП и про-апоптотичког фактора ЦХОП у мишјим цохлеае ерл и контролним Ц57БЛ / 6 Ј (Б6). Наши подаци показују да су ЕР стрес и УПР одговор били основни узроци апоптозе у ерл- цохлеае-у, а ПЕРК је сигнал допринео. Оно што је још важније, овде извештавамо да мало молекуларно једињење ЕР инхибитора стреса Салубринал (Сал) може успорити напредовање губитка слуха и смрти ћелија длаке код ерл мишева. Ови резултати нуде потенцијалну терапију за људски ДФНБ12 и вероватно штите визуелну функцију особа са Усхеровим синдромом.

Резултати

ЦДХ23 делимично није успео да досегне врх снопа косе и ко-локализован је са БиП у субапским регионима ОХЦ-а код ерл мишева

Измерили смо дистрибуцију ЦДХ23 у кохлеарним ћелијама спољне длаке (ОХЦ) код ерл мишева и Б6 мишева. Код П4, протеин ЦДХ23 је специфично локализован на врху ОХЦ-а код Б6 мишева, што је откривено конфокалним 3Д сликама, што указује на локализацију вршних врхова у стереоцилији снопа косе (слика 1а). Супротно томе, протеин ЦДХ23 локализован из стереоцилије у језгре ОХЦ-а код ерл мишева. Делови протеина ЦДХ23 нису успели да достигну врх снопова косе и остадоше у цитоплазми ОХЦ. Имуностање је показало да је БиП ЕР капепен био лакши детектиран у готово истој регији и ко-локализован цитоплазматским ЦДХ23 у ОХЦ- има ерл миша на П6 (слика 1б), док у цитоплазми Б6 мишјег ОХЦ-а није уочена специфична БиП сигнализација. . Линијски графикони потврдили су већу експресију БиП-а и његову ко-локализацију са ЦДХ23 у цитоплазми ерл ОХЦ (слика 1ц) у поређењу са интензитетом флуоресценције ЦДХ23 и БиП.

Image

ЦДХ23 експресија и ко-локализација са БиП у ерл мишјим кохлеама. ( а ) Горњи и доњи конфокални одсеци и 3Д реконструкција конфокалних слика (к63) открили су локацију ЦДХ23 у Б6 (величина воксела 512 × 512 × 0, 045 µм 3 и укупна запремина 23, 2 × 23, 2 × 14, 9 µм 3 ) и ерл (величина воксела 1024 × 1024 × 0, 027 μм 3 и укупна запремина 27, 2 × 27, 2 × 27, 2 µм 3 ) ОХЦ на П4. Код Б6 мишева, ЦДХ23 протеин је специфично локализован на врху стереоцилије ОХЦ. ОХЦ-и ерл мишева показали су широк спектар ЦДХ23 израза (од стереоцилије до језгре). Око језгра није пронађен ЦДХ23 сигнал који се може детектирати код Б6 мишева, док су код ерл мишева детектирани многи спотови ЦДХ23 сигнала у овом региону ( н = 3 мишева по групи). Величине 5 м. ( б ) Локација и ко-локализација БиП и ЦДХ23 у Б6 и ерл- цохлеае на П6. Кохлеји Б6 мишева показали су слабе БиП сигнале и јасне ЦДХ23 сигнале, посебно на врховима ОХЦ-а. БиП је високо детектиран у ОХЦс, СГ и СтВ ерл мишева и ко-локализован је са ЦДХ23 у субапским регионима ОХЦ ( н = 3 мишева по групи). Ваге, 50 μ м (лево); 20 μм (десно). ( ц ) Линијски графикони приказују дводимензионалне графиконе сирових интензитета флуоресценције белих стрелица увучених у панеле са леве стране, како је анализирао софтвер Имаге Ј. Кс- оса представља удаљеност (пиксела) дуж линије, а И -ос је интензитет пиксела. БиП сигнали су високо експримирани у ерл мишевима и делимично се преклапају са ЦДХ23 сигналима ( н = 3 мишева по групи)

Слика пуне величине

ПЕРК-ова рука УПР-а активирана је у ерх мишјим кохлеама

ЕРП маркер БиП је регулисан у унутрашњим ушима ерл миша, у поређењу са Б6 мишевима. У мерењима мРНА изоловане из ерл мишјег цохлеае, БиП је регулисан на П12, али је регулисан на П30 (Слика 2а). Имуноизовање показује не само већу експресију БиП-а у ОХЦ-има, већ и да је БиП експримиран на вишим нивоима у спиралним ганглион (СГ) ћелијама и у стриа васцуларис (СтВ) у ерл- цоцхлеае на П6 и П12 (слика 2б и ц). У складу са конфокалним тродимензионалним (3Д) сликама, БиП сигнали су углавном локализовани у цитоплазми ОХЦ и формирали су облик шешира изнад језгара ОХЦ (слика 2б и ц). ЕР-ефект напрезања ПЕРК-ова киназна мета, фосфорилирана алфа-подјединица фактора еукариотске иницијације (еИФ2α), такође је показала снажну локализацију у перинуклеарним регионима ОХЦ-а у Ерл- цоцхлеае (Слика 3).

Image

БиП експресија у Б6 и ерл мишем кохлеју. ( а ) Нивои БП мРНА у кохлеа Б6 и ерл мишева на П12 и П30. Ниво Бип мРНА био је значајно виши код ерл мишева на П12, али се смањио на П30, у поређењу са Б6 цохлеае. Траке грешака представљају СЕМ (* П <0, 05, н = 3 мишева, т- тест). ( б, ц ) БиП ​​је показао већи интензитет у СтВ, СГ и посебно у ОХЦ-има ерл мишева, формирајући облик шешира на врху језгра ОХЦ-а на П6 и П12. Анализа интензитета линије открила је да су БиП сигнали изражени у ОХЦ подручју ерл цоцхлеае ( н = 4 мишева по групи). Ваге, 50 μ м (лево); 20 μ м (десно)

Слика пуне величине

Image

Фосфорилација еИФ2α у Б6 и ерл цохлеае код П30 . Означавање имунофлуоресценције фосфо-еИФ2α показало је снажну цитоплазматску и перинуклеарну локализацију у цохлеае ерл мишева. Анализа интензитета линија дуж стрелице приказане на табли са леве стране открила је да су п-еИФ2α сигнали изражени у подручјима ОХЦ и стриа васцуларис (СтВ) и снажно су детектовани око језгара у ерл цоцхлеае ( н = 3 мишева по група). Ваге, 50 µ м (горња); 20 μ м (доња)

Слика пуне величине

Низводно од руке ПЕРК-а, про-апоптотички фактор ЦХОП такође је изражен на вишим нивоима у ерл- цохлеае (Слика 4). На нивоу мРНА, Цхоп је задржао већи израз у ерл- цохлеае-у поређењу са Б6-цоцхлеае на П12 и П30 (слика 4а). Имуностање обављено у истој доби показало је да је ЦХОП високо детектиран у ОХЦ, СГ и СтВ ерл мишева и углавном је детектиран у перинуклеарним регионима ОХЦ-а (слика 4б и ц). Међутим, голи ЦХОП сигнал био је присутан у мишјим кахли Б6.

Image

ЦХОП експресија у Б6 и ерл мишем кохлеју. ( а ) Цхоп нивое мРНА у цохлеае Б6 и ерл мишевима на П12 и П30. Ниво ЦР- ове мРНА био је значајно виши на П12 и П30 у ерл- цохлеае него у Б6-цохлеае. Траке грешака представљају СЕМ (* П <0, 05, н = 3 мишева, т- тест). ( б, ц ) ЦХОП је одржавао већи интензитет у стриа васцуларис (СтВ), спиралном ганглиону (СГ), посебно у перинуклеарном подручју између нуклеуса и снопа косе ОХЦ-а код ерл мишева на П12 и П30 ( н = 3 мишева по група). Ваге, 50 μ м (лево); 20 μ м (десно)

Слика пуне величине

Поремећај слуха заштићен генима Цхоп и ОХЦ код ерл мишева

Да бисмо додатно потврдили умешаност Цхоп-а у апоптозу изазвану стресом у ерл мишевима, користили смо мишеве са двоструким мутантима који садрже ерл мутацију у Цдх 23 гену и поремећај у Цхоп гену. Инбред мишеви су добијени укрштањем мишева Цхоп - / - са Цдх23 ерл / ерл мишевима. Генерирано је девет генотипова мишева који имају исту генетску позадину (Ц57БЛ / 6): Цдх23 + / + Цхоп + / + ; Цдх23 + / + Цхоп +/– ; Цдх23 + / + Цхоп - / - ; Цдх23 + / ерл Цхоп + / + ; Цдх23 + / ерл Цхоп +/– ; Цдх23 + / ерл Цхоп - / - ; Цдх23 ерл / ерл Цхоп + / + ; Цдх23 ерл / ерл Цхоп +/– ; и Цдх23 ерл / ерл Цхоп - / - . Допунска слика 1 приказује генотипизацију двоструко мутантних Цдх23 ерл / ерл Цхоп - / - мишева. Измерили смо слух и цитокохлеограме Цдх23 ерл / ерл Цхоп - / - ; ерл ( Цдх23 ерл / ерл Цхоп + / + ); и Цхоп - / - ( Цдх23 + / + Цхоп - / - ) мишеве. У 10 недеља, прагови изазвани слушним реакцијама мозга (АБР) код Цдх23 ерл / ерл Цхоп - / - двоструко мутираних мишева били су значајно бољи од оних код ерл мишева (слика 5а). Припрема површине извршена у истој доби открила је мањи губитак ОХЦ у Цдх23 ерл / ерл Цхоп - / - двоструко мутираним мишевима у поређењу са Цдх23 ерл / ерл мишевима. Код ерл мишева изложено је неколико тачака губитка ОХЦ-а у базалном и средњем завоју , а неколико губитака ОХЦ-а је приказано у апикалним окретајима кохелија. Међутим, код Цдх23 ерл / ерл Цхоп - / - двоструко мутираних мишева, није нађен губитак ОХЦ у целој дужини кохлеје (Слика 5б). Квантитативно истраживање показало је да је средњи проценат губитка ОХЦ у мишевима Цдх23 ерл / ерл Цхоп - / - био значајно нижи од оног код ерл мишева (слика 5ц).

Image

Слух и очување ОХЦ код Цдх23 ерл / ерл Цхоп - / - мишева. ( а ) АБР прагови код двоструко мутантних Цдх23 ерл / ерл Цхоп - / - мишева, Цхоп - / - мишева (Цдх23 + / + Цхоп - / - ) и ерл мишева ( Цдх23 ерл / ерл Цхоп + / + ) на 8, 16 и 32 к Хз стимулисе у 10 недеља. Цхоп - / - мишеви су показали нормалан ниво слуха. Ерл мишеви су показали оштећење слуха током свих стимуланса. Цдх23 ерл / ерл Цхоп - / - двоструко мутирани мишеви показали су ниже АБР прагове од ерл мишева током свих подражаја. Траке грешака представљају СЕМ (** П <0, 01, * П <0, 05, н = 8 мишева, т- тест). ( б ) Приправци са целим раном из базалног, средњег и апикалног окрета кохлеје обојени су за Ф-актин у Цдх23 ерл / ерл Цхоп - / - мишевима и ерл мишевима у 10 недеља. Ерл мишеви су показали неке губитке ОХЦ-а у апикалном скретању и евидентне губитке ОХЦ-а у средњим и базалним завојима. Није примећен губитак ОХЦ у читавој дужини Цдх23 ерл / ерл Цхоп - / - двоструко мутираних цохлеае. Линија скале, 20 µм . ( ц ) Просечни проценти губитка ОХЦ у апикалном, средњем и базалном региону кохлеја у Цдх23 ерл / ерл Цхоп - / - и ерл мишевима у 10 недеља. Ерл мишеви су показали значајно веће проценте губитка ОХЦ-а од Цдх23 ерл / ерл Цхоп - / - мишева. Траке грешака представљају СЕМ (** П <0, 01, * П <0, 05, н = 5 мишева, т- тест)

Слика пуне величине

Сал је спречио губитак слуха код ерл мишева

Након примања одговарајућих третмана, ерл мишеви у тесту, возилу и контролним групама су били подвргнути испитивању отоакустичке емисије производа ДПРАЕ и искривљења истог узраста. АБР прагови у испитној групи били су значајно нижи од оних у возилу и контролним групама, као одговор на 16 (слике 6а и б), 8 и 32 кХз подражавања тона и клика (допунска слика 2). Није утврђена значајна разлика између возила и контролне групе. Отопротективни ефекат је даље потврђен већим амплитудама ДПОАЕ. У 8 недеља, амплитуде ДПОАЕ у испитној групи биле су значајно веће при високим фреквенцијама (допунска слика 3а). У 12 недеља, тест група је показала много веће амплитуде ДПОАЕ на готово свим фреквенцијама (слика 6ц). У 16 недеља, мишеви у све три групе су показали ниже амплитуде ДПОАЕ, док су амплитуде тест групе остале веће при малим фреквенцијама (допунска слика 3б).

Image

Сал је побољшао слух код ерл мишева. ( а ) У 12 недеља, мишеви третирани носачем показали су много више прагове АБР него мишеви третирани Сал-ом при стимулацијама од 16 кХз. Обојене линије и стрелице представљају прагове таласа. ( б ) Прагови од 16 кХз-стимулисани-АБР код мишева третираних Сал-ом били су значајно нижи од оних у ДМСО и необрађених мишева од 4 (В) до 16 недеља. Није утврђена значајна разлика између необрађених и ДМСО група. ( ц ) амплитуде ДПОАЕ код мишева третираних салом биле су много веће него код необрађених и ДМСО третираних мишева током 12 недеља. Није утврђена значајна разлика између необрађених и ДМСО група. Траке грешака представљају СЕМ (** П <0, 01, * П <0, 05, н = 5 по групи, једносмјерна АНОВА)

Слика пуне величине

Сал је заштићен од ОХЦ смрти код ерл мишева

Припрема кохлеарне површине изведена је на ерл мишевима у тесту, носачу и контролним групама током 12 недеља. Оштећење ОХЦ-а било је очигледно код возила и контролних група, док је губитак ОХЦ-а био врло минималан у испитној групи (слика 7а). У возилу и контролним групама примећено је неколико значајних суседних места губитка ОХЦ-а у базалном и средњем завоју, а неки губици ОХЦ-а примећени су у вршним окретима. Супротно томе, мишеви у испитној групи показали су само мале количине губитка ОХЦ-а у базалном завоју и ретки губитак ОХЦ-а у средњем завоју. Средњи проценат губитка ОХЦ-а у испитној групи био је значајно нижи од оног у возилу и контролним групама (слика 7б). Није утврђена значајна разлика између возила и контролне групе.

Image

Сал је спречио губитак ОХЦ у ерл мишевима. ( а ) Приправци са целим монтажом из базалних, средњих и апикалних окрета кохлеја у необрађених, мишевима третираних са ДМСО и Сал-маком током 12 недеља. У возилу и контролним групама, опажен је губитак ОХЦ-а у базалном и средњем завоју, а такви губици били су израженији у базалном завоју. У апикалном кругу, возило и контролне групе су показале неорганизоване ОХЦ обрасце, али готово да нису имали губитка ћелије. Испитна група показала је мале количине губитка ОХЦ-а у базалном и средњем завоју и нормалан распоред у апикалном завоју. Линија скале, 20 µм . ( б ) Просечни проценти губитка ОХЦ-а у апикалном, средњем и базалном региону цоцхлеае код мишева третираних Сал-ом били су значајно нижи него код необрађених и мишева третираних са ДМСО током 12 недеља. Нису примећене значајне разлике између ДМСО и необрађених група. Траке грешака представљају СЕМ (** П <0, 01, * П <0, 05, н = 4 по групи, једносмјерна АНОВА). ( ц ) морфологија ОХЦ и субцелијске структуре скенирањем електронског микроскопа са базалних окрета кохлеја необрађених и мишева који су третирани са соли 12 недеља. Необрађени мишеви су показали скоро потпуни губитак ОХЦ-а и благи губитак ћелија унутарње длаке у базалном завоју. Мишеви третирани Сал-ом показали су мали губитак ОХЦ-а и скоро нормалан распоред снопова косе. Звезде обележавају губитке ОХЦ-а. Ваге, 10 µ м (лево); 1 μ м (десно)

Слика пуне величине

Скенирајући електронски микроскоп коришћен је за анализу ОХЦ морфологије и субћелијских структура током 12 недеља (слика 7ц). Слике су показале да необрађени ерл мишеви показују скоро потпуни губитак ОХЦ-а и не откривају се субцелијска структура снопова косе у базалном завоју. Супротно томе, мишеви који су третирани Сал-ом показали су мале количине губитка ОХЦ-а и приближни нормалан распоред снопова косе.

Ер потпомогнута ЕР-ом изазвана апоптозом стреса изазвана стресом

Гени и протеини који су повезани са стресом и апоптозом су смањени након третмана салом. Нивои експресије мРНА гена БиП , Цхоп, каспаза-3 и каспаза-12 тестирани су на П30 и 12 недеља. Резултати су показали да су Бип и Цхоп смањени у групи Сал у односу на групу носача код П30, а каспаза-3 је смањена током 12 недеља (слике 8а и б). Међутим, није пронађена значајна разлика у експресији гена каспаза-12 (допунска слика 4). БиП и одцепљени протеин каспаза-3, издвојен из ерл мишјег кохлеја у носачу и испитним групама, мерен је Вестерн блотом на П30. Резултати су показали да су БиП и одцепљена каспаза-3 много мање обилне у кохли, третираном Сал-ом, него у цохлеа-третираном носачем (слике 8ц). Поред тога, ЦХОП је био имуно обележен у носачу и испитним групама на П30. Резултати су показали да су ЦХОП сигнали у ОХЦс, СГ и СтВ у кахли третираним ДМСО изразито ослабљени третманом соли, а најзначајнија разлика у експресији ЦХОП уочена је у перинуклеарним регионима ОХЦ-а (слике 8д).

Image

Сал смањује регулисање ЕР стреса и гена и протеина повезаних са апоптозом. ( а ) БиР и Цхоп мРНА су смањени у мишевима третираним Сал-ом на П30. Међутим, није утврђена значајна разлика у нивоима мРНА Цаспасе-3 (** П <0, 01, * П <0, 05, НС, није значајно, н = 3, т- тест). ( б ) У 12 недеља, ниво мРНА Цаспасе-3 био је знатно смањен у мишевима третираним Сал-ом у поређењу са мишевима третираним са ДМСО; међутим, нису утврђене значајне разлике у нивоима мРНА БиП и Цхоп (** П <0, 01, * П <0, 05, НС, није значајно, н = 3, т- тест). ( ц ) Нивои БиП и одцепљене протеине каспазе-3 у кохлеима код мишева третираних Сал су много нижи од оних код мишева третираних са ДМСО на П30. Пронађене су значајне разлике између ДМСО и Сал-третираних мишева у њиховим количинама БиП и одцепљене каспазе-3. Траке грешака представљају СЕМ (** П <0, 01, * П <0, 05, НС, није значајно, н = 3, т- тест). ( д ) ЦХОП сигнали су снажније детектовани у ОХЦ, СГ и СтВ мишева третираних ДМСО, показујући високу концентрацију у перинуклеарном подручју између нуклеуса и снопова косе ОХЦ-а, али атенуираним од Сал ( н = 3 мишева по групи) . Ваге, 50 μ м (лево); 20 μ м (десно)

Слика пуне величине

Дискусија

Као нова мутација гена Цдх 23, мишеви ерл мутирани показали су постнатални почетак губитка слуха почевши од П27, који је напредовао до потпуне глухоће на ~ П100. Ово се сматра животињским моделом за људски ДФНБ12. 10 С обзиром на временски период од иницијалног губитка слуха до потпуне глухоће, ови мутирани мишеви су идеално средство за тестирање нових отопротективних лекова. Претходно смо открили да ерл мишеви третирани еритропоетином и З-ВАД-ФМК могу бити значајно заштићени од смрти ОХЦ-а и избачени од губитка слуха блокирањем пута апоптозе код ерл мишева. 10, 16 У тренутној студији, откривено је да је узлазни одговор на апоптозу у ерл цоцхлеае релевантан за ЕР стрес и УПР.

Под надзором контроле квалитета ЕР, Голгијев комплекс може пренијети само правилно пресавијене протеине и послати их на крајња одредишта, док се растворени или погрешно савити протеини задржавају у ЕР и на крају их разгради протеолитички пут зависан од убиквитина или аутофагија . 17, 18 Акумулација и агрегација раширених или погрешно сабраних протеина у ЕР лумену повећава оптерећење ЕР и нарушава ЕР хомеостазу, што у коначници доводи до ЕР стреса. 19, 20 Под благом до умереном стимулацијом, ЕР стрес је адаптивни и ресторативни одговор који доводи до адаптације ћелије. Супротно томе, ако је стрес изнад прилагодљивог капацитета ЕР, заштитна сигнализација ће прећи на про-апоптотичке одговоре. ЕР стрес је повезан са патогенезом неуродегенеративних болести, као што су Алзхеимерова болест и Паркинсонова болест, као и са патогенезом ћелијске смрти, попут оштећења бубрежних тубула код дијабетеса. 21, 22, 23 Код мутаната зебрафисх, неисправни ЦДХ23 протеини у ћелијама косе нису успели да се пренесу и допринели су стварању Усхер протеинских комплекса, што доводи до ЕР стреса. 15 Узето заједно, ови резултати су нам понудили нови увид у патолошке механизме и потенцијалне терапије сензорнеуралне глухоће. Користећи животињски модел сисара, испитивали смо да ли се слични недостаци у накупљању протеина и активирање ЕР стреса догађају код мишева са мутацијом Цдх 23.

Предочили смо доказе да је део протеина ЕРЛ-ЦДХ23 имао ненормалну локализацију у ОХЦ (од стереоцилије до нуклеуса, слика 1а), не успевајући да досегне врх снопа косе и тако доведе до смањене миграције на врхове врхова. Поред тога, протеин ЕРЛ-ЦДХ23 у субапском региону ОХЦ ко-локализован је са ЕР цхапероне БиП (слике 1б и ц). Откривено је да је БиП протеин високо експримиран у ОХЦ, СГ и СтВ у ерл- цохлеае на П6 и П12, а БиП мРНА је регулисана на П12, али је смањена на П30 (Слика 2). Узимајући у обзир пут УПР-а, ови резултати сугерирају да је БиП дисоциран са ЕР трансмембранским рецептором, а затим комбинован са неисправним ЦДХ23 у раној фази овог одговора. Низводно од овог пута откривена је фосфорилација еИФ2α у ерл- цохлеае (слика 3), а Цхоп мРНА и протеин су регулирани на П12 и П30 (Слика 4). Ови резултати показују да је активирана ПЕРК рука УПР-а. ЦХОП је био кључни посредник када је ЕРР сигнализација изазвана стресом напредовала до апоптозе. 24, 25 Резултати слушног теста, површинске припреме и бројања ОХЦ код наших двоструко мутираних Цдх23 ерл / ерл Цхоп - / - мишева даље потврђују да би брисање Цхоп гена могло делимично заштитити слух и сачувати ОХЦ код мишева Мутација Цдх23 ерл / ерл (слика 5). Узимајући ове податке заједно са претходном студијом о индукцији гена повезаних са апоптозом у ерх мишјим кохлеама, 10 предлажемо да апоптоза представља догађај низводно од индукције УПР-а, при чему је сигнални пут ефектор ПЕРК доприноситељ. Стога смо изабрали ПЕРК крак УПР-а као терапеутски циљ.

Занимљиво је напоменути да ЦХОП не представља нуклеарну локализацију у ОХЦ-има, као што се очекивало за фактор транскрипције (слике 4 и 8). Међутим, ЦХОП нема сигнал за нуклеарну локализацију. Његова интеракција са другим факторима транскрипције изазваних стресом посредује њену нуклеарну локализацију. 26 Стога је могуће да је у ОХЦ-у ЦХОП искључен из језгра због непостојања интерактивних партнера фактора транскрипције. Такође је објављено да ћелије са цитоплазматским и нуклеарно локализованим ЦХОП дају различите профиле експресије гена. Показано је да тај цитоплазматски ЦХОП инхибира миграцију, док нуклеарни ЦХОП изазива заустављање станичног циклуса Г1. 27 У овом ерл моделу, посебно у ОХЦ-има, ЦХОП је локализован у перинуклеарним регијама између нуклеуса и снопова косе ОХЦ-а. ОХЦ развија поларизовани сноп стереоцилије који је важан за механотрансдукцију. 28 Многи протеини снопа косе прелазе према снопу косе; стога, спекулишемо да цитоплазматски ЦХОП може регулисати експресију гена повезаних са миграцијом протеина. Даље истраживање је оправдано за ЦХОП-ове улоге, осим индуковања апоптозе на дегенерацији и функционалности ОХЦ-а.

Сал је мало молекуларно једињење (480 Да) које спречава смрт ћелија од апоптозе изазване стресом селективним инхибирањем депхосфорилације еИФ2α. 29 Студије показују да Сал одолијева ћелијској смрти узрокованој стресом, побољшава опстанак ћелија и одлаже процесе болести. 30, 31, 32, 33, 34 Наши тестови слуха потврдили су нашу хипотезу да Сал може заштитити слух инхибирањем ЕР стрес-индуковане апоптозе ћелија длаке у ерл мишевима. У претходном раду смо извештавали да је прогресивни губитак слуха почео код П27 код ерл мишева. 10 У овој студији, већ након 4 недеље након порођаја, АБР прагови изазвани 32-кХз подражајем стимулисања у испитној групи били су 10 дБ бољи него у контролној групи и возилу (допунска слика 1б). У свим наредним тачкама, мишеви који су третирани Сал-ом показали су боље АБР прагове под свим стимулансима. Позивајући се на подударност између високих и ниских фреквенција и на базално-апикални градијент базиларне мембране, 35, 36, слушни тестови показују да је смрт ОХЦ-а специфично почела у базалним завојима, а затим се проширила кроз целу кохелију, која би се могла санирати лечењем соли. Наше претходне студије усмерене на лечење анти-апоптозе такође су показале отопротективне ефекте, 10, 16, али Сал је показао продужено трајање (до 16 недеља). Током нашег хистолошког прегледа приметили смо значајне сувремене и изоловане губитке ОХЦ-а у возилу и контролним групама; за разлику од тога, мишеви третирани Сал-ом показали су само мале количине губитка ОХЦ-а (слика 7). Овај резултат даје добру повезаност између наших анатомских опажања и функционалних тестова.

Након третмана Сал-ом, нерегулисана Бип и Цхоп мРНА је смањена на П30, а каспаза-3 је смањена у 12 недеља (слика 8а), што указује да су Бип и Цхоп подлегли третманом соли у раној доби и да је каспаза- Касније је утицала на мРНА. Међутим, откривено је да је одцепљени протеин каспаза-3 (детектиран Вестерн блот-ом) Сал смањен на П30. Наше одцепљено антитело каспаза-3 (Асп175) је било у стању да препозна велики фрагмент (17 кДа) активиране каспазе-3 који је резултат цепања поред Асп175, али није био у стању да детектује протеин каспазе-3 у целој дужини. Ови резултати сугерирају да је одвајање каспазе-3 блокирано на П30 третманом соли. МРНА каспазе-12 остала је непромењена на П30 и 12 недеља (допунска слика 4), што указује да каспаза-12 можда неће бити укључена у повратне информације о третману соли. БиП протеини (детектирани од Вестерн блот-а) и ЦХОП протеини (детектирани имуно-обојењем) такође су смањени након третмана салом (Слика 8). Ови резултати, заједно са претходним подацима, 10 сугеришу да се неисправни ЦДХ23 акумулирао у ЕР, а затим повећао оптерећење ЕР и уништио хомеостазу ЕР, што је довело до дисоцијације БиП од ПЕРК. Ниже регулирани ЦХОП доводи до активације каспазе и апоптозе. Ако адаптивни УПР смањи оптерећење протеина у ЕР, тада ће обнављање синтезе протеина промовисати опстанак ћелија. У супротном, ако синтеза протеина надјача обнављање протеостазе, изазиваће ћелијска смрт. 37 Сал инхибира дефосфорилацију еИФ2α, која инхибира синтезу протеина када га фосфорилира ПЕРК. Ова повећана фосфорилација еИФ2α ограничава синтезу протеина (укључујући ону ЦДХ23 и ЦХОП), олакшава оптерећење ЕР и поспешује опстанак ћелија. Недавно су описани потенцијални механизми про-апоптотичке функције неконтролисане синтезе протеина током ЕР стреса. 37, 38

Као животињски модел ДФНБ12, ерл мишеви са третманом Сал започели су у раној доби (почевши од П7) и показали су значајну заштиту слуха у дужем трајању (до 16 недеља). Размишљајући о сигналном путу апоптозе изазване стресом, предлажемо да терапије које циљају овај специфични сигнални пут могу спречити губитак ћелија длаке у раној фази и постићи ефикасније и одрживије резултате. Пацијенти са УСХ1Д који носе различите мутације истог гена ( Цдх23 ) као и ДФНБ12 показују конгениталну глухоћу и слепоту након поста. Стога претпостављамо да би рано лечење Сал-ом могло спречити офталмичку дисфункцију усхеровог синдрома, на тај начин истичући Салину примену као терапијског средства у лечењу животињских модела усхер синдрома.

Закључак

Укратко, ова студија је прва која разматра апоптозу ћелија длаке изазване стресом као кључну улогу у губитку слуха и смрти ћелија длаке са мутацијом Цдх23 . Синтеза протеина и повезани процеси сакупљања протеина рани су молекуларни догађаји у ЕР стресу и апоптози. Стога би грешке у сакупљању протеина покренуте генетским мутацијама требало сматрати најранијим терапијским циљем. Многи лекови против стреса који су одобрени од стране ФДА-а и који су одобрени од ФДА су тренутно доступни на тржишту и на тај начин могу бити замењени ради заштите.

Материјали и методе

Експериментални дизајн

Ово истраживање имало је за циљ да процени ЕР апоптозу изазвану стресним стресом у механизму губитка слуха и смрти ћелија длаке код Цдх23 ерл / ерл мутантних мишева. Мерења ЕР показатеља стреса изведена су између Цдх23 ерл / ерл мутантних мишева, контролних Б6 мишева, као и Цхоп ген кноцкоут (Ц57БЛ / 6 позадина) мишева. Инхибитор стреса ЕР Салубринал (Сал) систематски се давао Цдх23 ерл / ерл мутираним мишевима интраперитонеалном ињекцијом. Индикатори стреса, ОХЦ резервација и ЕР стрес тестови тестирани су између мишева који су били третирани салом, третираним возилом и необрађеним Цдх23 ерл / ерл мишевима.

Мишеви

Све поступке који укључују мишеве одобрио је Одбор за истраживање животиња Универзитетске медицинске школе Цасе Вестерн Ресерве (протокол Р01ДЦ009246). Сви су мишеви експериментирани у истом окружењу и у светло-мрачном кругу. Ерл мишеви прво су смештени у Јацксон лабораторији (Бар Харбор, МЕ, САД) пре него што је тај мутирани сој премештен на Универзитет Цасе Вестерн Ресерве. Мишеви са нокаутом Цхоп гена (позадина Ц57БЛ / 6) су унети из Јацксон Лабораторија (број залиха 005530). Хомозиготни ерл мишеви ( Цдх23 ерл / ерл ) су укрштени са мутирантима гена за нокаут хомозиготних Цхоп гена ( Цхоп - / - ), генерисући Ф1 са генотипом Цдх23 + / ерл Цхоп +/– . Затим је Ф1 ( Цдх23 + / ерл Цхоп +/– ) укрштен са Ф1 ( Цдх23 + / ерл Цхоп +/– ) да би се створило девет генотипова мишева: Цдх23 + / + Цхоп + / + ; Цдх23 + / + Цхоп +/– ; Цдх23 + / + Цхоп - / - ; Цдх23 + / ерл Цхоп + / + ; Цдх23 + / ерл Цхоп +/– ; Цдх23 + / ерл Цхоп - / - ; Цдх23 ерл / ерл Цхоп + / + ; Цдх23 ерл / ерл Цхоп +/– ; и Цдх23 ерл / ерл Цхоп - / - . Затим смо изабрали хомозиготни Цдх23 ерл / ерл Цхоп - / - , који су били прекрижени и одржавани као инбред миша линија. Пошто су нокаут гена Цхоп и мишеви мутације ерл потичу из Ц57БЛ / 6 позадине, изабрали смо Цдх23 ерл / ерл Цхоп - / - , Цдх23 ерл / ерл Цхоп + / + ( ерл мишеви) и Цдх23 + / + Цхоп - / - ( Цхоп - / - мишеви) за наше експерименте.

Генотипизација ерл мишева претходно је описана. 10 Генотип за Цхоп - / - одређен је полуквантитативним ПЦР коришћењем следећих прајмера: оИМР3884-5′-АТГЦЦЦТТАЦЦТАТЦГТГ-3 '(уобичајено); оИМР3885 - 5'-ААЦГЦЦАГГГТТТТЦ ЦЦАГТЦА-3 '(мутантна реверзија); и оИМР3886 - 5 '-ГЦАГГГТЦААГАГТАГТГ-3' (дивљи тип обрнуто). Реакција термичког циклуса је изведена на следећи начин: 94 ° Ц током 3 мин, а затим 35 циклуса на 94 ° Ц током 30 с, 61 ° Ц током 1 мин, 72 ° Ц током 1 мин и 72 ° Ц током 2 мин. Дивљи тип је показао један опсег (544 бп), док су хетерозиготи показали два опсега (320 и 544 бп), а мутанти један опсег (320 бп). Генотип за Цдх23 ерл / ерл Цхоп - / - одређен је генотипизирањем Цдх23 ерл / ерл и генотипизацијом Цхоп - / - .

Лечење соли

Ерл мишеви примили су различите третмане интраперитонеалном ињекцијом. Укупно је 70 ерл мишева подељено у три групе било ког пола: тест група (третирана са Сал, 0, 5 мг кг -1, Р&Д нг Цат # 2347), група са носачима (третирана једнаком запремином диметилсулфоксида, ДМСО) и контролна група (необрађена). Сви третмани почели су од постнаталног (П) дана 7, а следеће ињекције су се јављале сваког другог дана током првих 12 недеља, свака 3 дана током 2 додатне недеље, а затим једном у недељу током трајања експеримената. Доза соли одабрана је из две групе прелиминарних експеримената, које су показале да је безбедна и слушно заштитна. Почетно доба лечења је одабрано да се спречи апоптотичка регулација гена код ерл мишева откривених у нашем претходном раду. 10

ПЦР

Кохлије су брзо изоловане, а затим је ТРИзол (Инвитроген, Еугене, ОР, САД) коришћен за тоталну екстракцију РНА. За синтезу цДНА коришћен је Супер Сцрипт ИИИ систем првог синтезе (Инвитроген). Квантитативни ПЦР је извршен са реагенсом СИБР Греен ФАСТ Мастермик (КИАГЕН, Германтовн, МД, САД) на АБИ 7300 Секуенце Детецтион Систем (Фостер Цити, ЦА, УСА). Секвенце примера наведене су у табели. С1. Реакција циклуса је изведена на следећи начин: 95 ° Ц током 10 мин, 40 циклуса од 95 ° Ц током 15 с и 60 ° Ц током 1 мин, и коначно кривуља дисоцијације од 95 ° Ц током 15 с и 60 ° Ц током 15 с. Експресија гена је израчуната у односу на домаћинство гена ГАПДХ, а затим анализирана помоћу 2 -ΔΔЦТ методе. Полквантитативна ПЦР изведена је коришћењем ДНК мотора (Био-Рад, Херцулес, ЦА, САД) са горе описаном реакцијом циклуса.

Вестерн блоттинг

Кохлеје су лизиране помоћу ледено хладног РИПА пуфера. Једнаке количине протеина подвргнуте су СДС-ПАГЕ и пренесене на ПВДФ (Био-Рад) мембрану. Након тога, ПВДФ мембрана је блокирана 1 сат у 5% ЕЦЛ примарном средству за блокирање, а затим је инкубирана преко ноћи на 4 ° Ц са 1: 1000 разблажених примарних антитела: анти-БиП (Целл Сигналинг 3177, Данверс, МА, САД), анти- каспаза-3 (ћелијска сигнализација 9661) и анти-п-актин (Санта Цруз сц-130657). После испирања ТБСТ-ом, мембрана је инкубирана у секундарним антителима (1: 5000, козји анти-зечји ИгГ, Санта Цруз сц-2054). Протеинске траке су визуелизоване коришћењем ЦхемиДоц МПИмагинг система (Био-Рад) који потиче од хемилуминисценције.

Имунофлуоресцентно бојење

Унутрашње уши су фиксиране у 4% параформалдехиду (ПФА) преко ноћи, а затим декалцификоване у 10% етилендиаминетеросирћетне киселине (ЕДТА). Након дехидрације у сахарози и уградње у ткиво ОЦТ смрзавање на -20 ° Ц, исечени су континуирани одсеци од 6 µм . Ови одсеци су пермеализовани у 0, 5% Тритон Кс-100 током 30 минута, блокирани у 3% БСА током собне температуре, а затим су инкубирани преко ноћи на 4 ° Ц са 1: 200 разблаженим примарним антителом: анти-ЦДХ23 (Санта Цруз сц -26338), анти-БиП (Целл Сигналинг 3177), анти-ЦХОП (Санта Цруз сц-575), анти-еИФ2а (Целл Сигналинг 9722) и анти-фосфо-еИФ2а (Целл Сигналинг 3597). Секундарна антитела са разблаживањем 1: 400 (магарац против зечјег ИгГ, Инвитроген А31573; зечји анти-козји ИгГ, Инвитроген А11078) су додата током 1 х; одсеци су затим обојени са ДАПИ. Негативне контроле (без додавања примарних антитела) нису показале обојење.

АБР и ДПОАЕ тестирање

Рачунарски коришћени потенцијални систем (Интеллигент Хеаринг Системс, Смарт-ЕП софтвер 3.30, Миами, ФЛ, САД) коришћен је као претходно објављен. 39 Укратко, мишеви су анестезирани, а телесна температура је одржавана на 37 ° Ц. Кориштене су субдермалне електроде за иглице. Електрода за снимање је уметнута у вертекс лобање; уземљена електрода је убачена у врх носа; а референтне електроде су фиксиране близу сваког уха. Клик и 8, 16 и 32 кХз тонови су упућени кроз уметнуте слушалице. АБР праг је идентификован као најнижи ниво подражаја на коме су препознати јасни и поновљиви таласни облици (слика 2а). ДПОАЕ мерење је спроведено за чисте тонове на фреквенцијама у распону од 4, 4 до 20, 3 кХз коришћењем Интелигентног слушног система (Смарт ЕП 3.30 софтвера). Фреквенције су стечене са односом Ф2: Ф1 од 1, 22 и са примарним подражајем од 65/55 дБ СПЛ.

Припрема површине и бројање ћелија длаке

Као што смо претходно описали, 40 темпоралних костију је фиксирано у 4% ПФА, а базиларна мембрана је затим пажљиво сецирана и пресечена у три одвојена фрагмента: апикални, средњи и базални окрет. Фрагменти су пермеализовани у 2% Тритон Кс-100, обојени за Ф-актин са фалоидином (Инвитроген), и посматрани са флуоресцентним микроскопом (Леица ДМ4500 Б). Сматра се да су ћелије косе присутне ако су ћелијска тела и снопови косе у облику слова В нетакнути.

Конфокално 3Д снимање

Да би се утврдила локализација ЦДХ23 у ОХЦ-има, спроведено је имунолошко бојење целокупних базиларних мембрана унутрашњег уха 4-дневних мишева коришћењем примарног антитела анти-ЦДХ23 (Санта Цруз, сц-26338), секундарног зечјег анти-коза ИгГ, Инвитроген А11078, Алека 488 (разблажење 1: 1000), а затим је обојено са ДАПИ. Конфокалне слике снимљене су помоћу конфокалног микроскопа Леица (Немачка) СП8 са нафтним циљем × 63 / 1, 4 и ласерском линијом од 488 нм. Сликовни снимци стечени величином воксела 512 × 512 × 0, 045 µм 3 и 1024 × 1024 × 0, 027 µм 3, зависно од величине ОХЦ-а, све деконволуције су обрађене помоћу софтвера Леица Апплицатион Суите Кс (ЛАС Кс, ЛАСКС).

Скенирање електронским микроскопом

Мишеви су фиксирани са 2, 5% глутаралдехида, а затим су цели цохлеае сецирани. Коштана капсула, спирални лигамент и Реисснерова мембрана пажљиво су уклоњени да би открили цео орган Цортија. Након тога, узорци су фиксирани у 1% осмијум тетроксиду (ОсО4) 1 х три пута и у 1% тиокарбохидразиду (ТЦХ) у току 1 сата два пута (техника ОТОТО). Узорци су дехидрирани у градијентној етанолној серији, осушени у критичној тачки употребом ЦО 2, и на крају пресвучени паладијом. Затим су узорци прегледани под скенирајућим електронским микроскопом високе резолуције (ФЕИ Хелиос НаноЛаб 650, Немачка).

Статистичка анализа

Подаци су представљени као средња вредност ± СЕМ. Анализа је извршена коришћењем софтвера СПСС 18.0. Подаци су статистички анализирани користећи једносмерне АНОВА и Студентове т- тестове. П- вредности <0, 05 су сматране значајним.

Додатне информације

Ворд документи

  1. 1.

    Додатни материјал

    Додатне информације прате овај рад на веб локацији Целл Деатх анд Дисеасе (//ввв.натуре.цом/цддис)