Генетска архитектура гена људске триптофан хидроксилазе 2: постојање неуронских изоформа и значај за велику депресију | молекуларна психијатрија

Генетска архитектура гена људске триптофан хидроксилазе 2: постојање неуронских изоформа и значај за велику депресију | молекуларна психијатрија

Anonim

Апстрактан

Оштећена неуротрансмисија серотонинског мозга потенцијална је компонента дијатезе велике депресије. Триптофан хидроксилаза-2 (ТПХ2) је биосинтетски изоензим који ограничава брзину серотонина који се преферирано изражава у мозгу и узрок поремећаја преноса серотонина. Овде идентификујемо нову ТПХ2 кратку изоформу са скраћеним каталитичким доменом израженим у можданом деблу, префронталном кортексу, хипокампусу и амигдали. Истраживачка студија 166 кавкашких испитаника открила је повезаност са великом депресијом или самоубиством новог полиморфизма са једним нуклеотидом (СНП) г.22879А> Г смештеног у егзону 6 ове кратке изоформе. Овај СНП и додатни СНП откривени су систематском карактеризацијом генетске архитектуре гена ТПХ2 ради даљих генетских и функционалних испитивања његовог односа према великој депресији и другој психопатологији.

Увод

У мозгу серотонин синтетише у ћелијским телима серотонергичних неурона у језграма рапхе можданог мозга који се пројектују у већину кортикалних и поткортикалних структура. Ове регије мозга укључују префронтални кортекс, предњи цингулат, амигдалу, хипокампус и таламус, структуре које учествују у регулисању расположења, меморије и понашања и манифестују измењену активност у великој депресији. 1 Промјене у серотонергичкој функцији укључују се у патогенезу велике депресије и у дијатези за суицидно понашање. 2, 3 Будући да генетски фактори могу узрочно узроковати и велику депресију и наклоност самоубиству 4, 5 и пошто је серотонергички систем делимично регулисан генетским факторима, 6, 7 кандидат гена и за велику депресију и за самоубилачко понашање могу укључивати серотонергик систем. Иако се наводи да су нивои серотонина и / или његовог главног метаболита 5-хидроксииндолероцтене киселине ниски у самоубиствима, 8 налазимо да је неуронски триптофан хидроксилаза-2, серотонергички биосинтетски изоензим који ограничава брзину, повишен у дорзалним рапхе језграма депресивних суицида како на нивоу транскрипта 9 тако и на нивоу протеина. 10, 11 Да бисмо ускладили ова запажања, предложили смо присуство генске варијанте која може утицати на каталитичко место што резултира производњом ензима слабије активности. Ова хипотеза је у складу са недавним извештајима о таквој варијанти гена триптофан хидроксилазе-2 (ТПХ2) која изражава изоензим са ослабљеном каталитичком активношћу у мишу Балб / ц, урођеног соја који природно показује депресивни бихевиорални фенотип и има низак серотонин у мозгу. Извештава се да Балб / ц има нову варијанту кодирања у хомологном региону ТПХ2 хуманог ортолога са очигледно ослабљеном каталитичком активношћу. 12 Међутим, извештај да је ова врста варијанте присутна код 10% људи који су дијагностицирани униполарном депресијом није поновљен у другим скупинама података. 13, 14, 15, 16, 17

Истражили смо улогу ТПХ2 у великој депресији и суицидном понашању користећи колекцију случајева и контролних узорака мозга постмортем. Кроз психолошке аутопсије користећи валидиране структуриране клиничке интервјуе са члановима породице 18, добили смо детаљне клиничке информације, укључујући психијатријске дијагнозе оса И и ИИ на основу дијагностичких критеријума ДСМ-ИВ. Недавне студије извештавају о повезаности ТПХ2 са великом депресијом и самоубиством, укључујући појединачне нуклеотидне полиморфизме (СНП) у интрону 5 и егзону 11. 12, 13, 19, 20 Дакле, док смо истраживали кодирајући део гена ТПХ2 и секције сваког од њих интрон, фокусирали смо наше анализе на СНП-ове који се налазе у ова два региона у покушају да поновимо претходно пријављена позитивна открића у нашем скупу података. Поред тога, извештавамо о првом систематском испитивању варијанти гена ТПХ2 која покрива и кодирајућа и некодирајућа подручја и варијанте транскрипта у људском мозгу.

Резултати

Спровели смо истраживачку студију која је користила 166 појединаца који су генотипизирани за СНП-локусе који обухватају и интрон 5, 19, 20 и ексон 11. 12, 13 Ексон 11 је занимљив јер кодира каталитичко место ензима и може открити хипофункционалне варијанте. Стога смо секвенцирали тај регион код свих појединаца. Нисмо приметили полиморфна места у ексону 11 након опсежног секвенце 166 јединки, као што је то примећено и у другим истраживањима. 14, 15, 16 Дакле, нисмо реплицирали пријављени полиморфизам у овом региону који је повезан са измењеним нивоима серотонина у Балб / ц мишевима и извештава иста група да је присутан у 10% испитаника са дијагнозом великог депресивног поремећаја. 13 Идентификовали смо пет раније пријављених СНП-ова у интрону 5: рс11316791, рс1843809, рс11386496, рс1386494 и рс1386493 и нови СНП, г.22879А> Г. Ово је подручје ТПХ2 гена за које се предвиђа да ће се подвргнути спајању у две транскрипцијске изоформе, у кратком и дугом облику. Као што је предвиђено Аннотацијом ансамбла, ови алтернативни транскрипти, ЕНСТ00000266669 и ЕНСТ00000333850, имају 7 и 11 кодних егзона. 28 Предвиђени скраћени транскрипт заснован је на доказима добијеним из студије која карактерише све људске цДНА у библиотеци цДНА мозга. 29 Зависно од разматране напомене, варијанта, г.22879А> Г, налази се у егзону 6 кратког транскрипта или у интрону 5 дугог транскрипта. Желели смо да потврдимо постојање предвиђене скраћене ТПХ 2 транскрипције експериментално помоћу РТ-ПЦР. Примери специфични за кратке и дуге транскрипте дизајнирани су и коришћени за амплификацију сваке изоформе из цДНА припремљене из људског мозга. И дуги и кратки облици присутни су у људском мозгу (слика 1). Да би се утврдило да ли је кратки облик присутан у серотонергичким нервним терминалима, РТ-ПЦР је коришћен да појача кратке и дуге форме из префронталног кортекса, хипокампуса и амигдале из једног репрезентативног случаја. Израза кратког транскрипта је такође виђена у овим регионима (подаци нису приказани). Квантитативни РТ-ПЦР кратких и дугих облика код четири непсихијатријска испитаника открио је да у поређењу са дугим транскриптом постоји релативно мање обиље кратког транскрипта (слика 2) који изгледа невезано за ПМИ или пХ мозга.

Image

Кратке и дуге изоформе ТПХ2 у мозгу четирију не-психијатријских контролних субјеката. РТ-ПЦР је коришћен за идентификовање дугих (768 бп) и кратких (376 бп) изоформа. Секвенција прајмера специфичних за дугу изоформу (траке 1-4) је 5 '-ЦТЦТЦЦАААЦТЦТАТЦЦЦАЦТЦ-3' и реверзно 5 '-АГГЦАТЦАААТЦЦЦЦАГАТА-3'. Кратке секвенце праволинијске изоформе (траке 5–8) су: напред-5 '-АГТГГГААГЦЦЦТАТЦЦТГТ-3' и назад 5 '-ЦТТГАЦГГГГАЦТЦАТЦТГТ-3'. МВ је маркер молекуларне тежине од 100 бп.

Слика пуне величине

Image

Квантитативни РТ-ПЦР просечног кратког у односу на дуге форме мозга из четири непсихијатријске контроле (исте контроле као горе). Свака трака представља најнижи средњи број циклуса (ц (Т)) нормализован за β-актин на коме су детектовани флуоресцентни сигнали изнад позадине за кратке и дуге форме са средњим 8, 6 пута већим нивоом експресије, дугим у односу на кратак ( т = 2, 10, П = 0, 01). Разлика савијања израчунава се одређивањем разлике између најмањег броја циклуса и повећања те разлике на другу снагу. Експресија дугог облика је обилнија од кратког облика што показује нижи ц (Т).

Слика пуне величине

Пошто је популација узорка главних случајева депресије изведена из мозга постмортем, већина испитаника са великим депресивним поремећајем починила је самоубиство. Према томе, проценили смо потенцијалне повезаности између ових варијанти гена и велике депресије одвојено и заједно са самоубиством, с упозорењем да се главни узорци случајева депресије и самоубиства у две поређења значајно преклапају. Значајно је да је, према нашим сазнањима, ово једино истраживање мапирања ТПХ2 у коме се пажљиво утврђује контролни узорак за одабир субјеката код којих је дијагноза велике депресије искључена и који су умрли од других разлога. Иако узорак случаја може представљати спектар поремећаја расположења и / или суицидног понашања, овај контролни узорак је идеалан додатак. У овом истраживачком циљу настојали смо да разјаснимо потенцијални однос таквих генетских варијанти са поремећајем расположења и / или самоубиством. Користили смо један уско дефинисани и један широко дефинисани клинички модел, где су погођене особе: (1) имале дијагнозу великог депресивног поремећаја; и (2) имао је велику депресију или је умро самоубиством. Број погођених (случајева) и неизмеђених (контролних) појединаца како је дефинисан у сваком од ових модела дат је у Табели 1. Анализирали смо СНП податке спроводећи алелне тестове за придруживање и пронашли два СНП-а која дају статистички значајне резултате (Табела 1). Први је локус рс1386493 који је 2636 бп низводно од рс1386494, а локус је раније био повезан са депресијом и самоубиством. 19, 20 Друга је нова варијанта г.22879А> Г откривена у нашој садашњој студији. Најјачи докази за повезаност примећени су са главним клиничким моделом депресије (рс1386493 - П = 0, 001 и г.22879А> Г - П = 0, 05), који су остали статистички значајни након прилагођавања за више тестираних модела и маркера (глобални емпиријски П = 0, 01) . Шире клинички модел који укључује особе са или великом депресијом или самоубиством као погођеним такође је дао значајне резултате (рс1386493- П = 0, 003 и г.22879А> Г- П = 0, 05, Табела 1) са глобалним емпиријским П = 0, 04. Ово није изненађујуће, будући да само главни модел депресије и шири модел депресије или самоубиства имају висок степен преклапања. Стога смо се за наредне анализе повезаности мултилокације података усредсредили на само клинички модел депресије. За локусе са запаженим и пријављеним значајним асоцијацијама (то јест рс1386494, рс1386493, г.22879А> Г) упоредили смо укупне процењене фреквенције хаплотипа међу случајевима и контролама и пронашли статистички значајну разлику са глобалним емпиријским П = 0, 01, где је хаплотип ЦГГ који се састоји од наводних варијанти ризика, био је скоро три пута чешћи у узорку случаја, са процењеним фреквенцијама од 0, 065 / 0, 024 у контролним узорцима, односно Табела 2).

Табела пуне величине

Табела пуне величине

Да бисмо помогли процесу систематског проучавања овог гена, окарактерисали смо генетску архитектуру гена ТПХ2 систематским секвенцирањем кодирајућег региона, укључујући ексоне 1 и 7 до 11 дугог транскрипта, и целокупно подручје кодирања егзона 6 кратког транскрипта. Поред тога, секвенцирање је у потпуности завршено за 5 'УТР, а делимично је завршено за 3' УТР и интранске регије током гена. Овај напор је додатно појачан укључивањем постојећих СНП-а у јавно спремиште, укључујући 57 познатих СНП-ова равномерно распоређених по гену за максимално покривање генома. Од тога је 39 СНП показало полиморфизам у нашем узорку. Поред тога, открили смо 16 нових СНП-ова директним секвенцирањем. Укупно је око 13 000 базних парова ТПХ2 гена секвенцирано за 78 појединаца, што се састојало од 48 случајева са депресијом / самоубиством и 28 здравих контролних група. С обзиром на ову величину узорка, можемо очекивати да ћемо открити 95% полиморфних места са малом учесталошћу алела од најмање 1 и 99% места са малом фреквенцијом алела од најмање 5%. 30 Као такво, спровели смо дубинско истраживање у покушају да откријемо потенцијално ретке полиморфизме који могу променити функцију гена путем кодирања промена или других механизама. Очекује се да су полиморфизми који доприносе фенотипској варијацији углавном ретки, на пример већина кодирајућих СНП-а који доводе до промене аминокиселина имају мању фреквенцију алела испод 5%. 31, 32 Такве варијације ниске фреквенције су премало заступљене у јавним складиштима, па су ови подаци значајан ресурс за будућа генетичка испитивања депресије и самоубиства унутар популације Кавказа, из којих су узети узорци. У ту сврху, процијенили смо хаплотипску блок структуру гена ТПХ2 и генерисали таг-СНПс користећи наше контроле засноване на популацији (Слика 3). Иако су могуће бројне дефиниције блокова хаплотипа, усвојили смо конзервативнији тест од четири гамете, 33 који је дао укупно девет блокова у распону од 88 до 15 335 бп. Асоцијације са великом депресијом пријављене раније 19, 20 и у овој студији у потпуности спадају у други блок. Унутар ових блокова хаплотипа, који се протежу на 44 СНП-а, идентификовали смо 15 таг-СНП-ова (Табела 3). Упркос дефиницији блока која се користи, СНП-ови таг-а су углавном конзистентни преко 80% времена, 34 а приметили смо овај тренд и у нашим подацима приликом истраживања других дефиниција блока (подаци нису приказани). Према томе, унутар сваког блока који садржи више од једног СНП-а, само неколико таг-СНП-ова је потребно генотипизовати да би ухватили цео блок. Стога ова студија пружа хаплотипску мапу за вођење истражних испитивања других поремећаја са којима је ТПХ2 потенцијално повезан.

Image

( а ) Хаплотип блокови који представљају четири најчешћа боја хаплотипа кодирана фреквенцијама сваког хаплотипа, при чему сваки СНП одговара слову (А, Г, Т или Ц) или полиморфизму уметања / брисања (И или Д). Писма груписана у заградама су СНП-ови унутар истог блока. Ови блокови су одређени помоћу програма ХаплоБлоцкФиндер 38 са хаплотиповима који су изведени из 28 контролних субјеката са статистичким софтверским пакетом ПХАСЕ, верзија 2.1.1, 26 користећи подразумевана подешавања за 49-СНПс са мањом фреквенцијом алела 0.01. Границе блока хаплотипа дефинисане су на основу теста са четири гамете, где је блок дефинисан као регион у коме се посматра мање од четири гамете за све прегледане парове СНП-а (Д '= 1 - који одражавају доказе за потенцијално непостојање историјске рекомбинације ). 33 ( б ) Приказани као вертикалне траке узастопно лево од ЛД матрице (са парним вредностима ∣ Д ′ ∣ и р 2 ) од врха до дна, ови блокови су такође приказани у ( а ) са СНП груписањем означеним са Б1-Б9 за блокове са најмање два СНП локуса. ( ц ) Шематски приказ покривености СНП-а преко гена ТПХ2 са кутијама које означавају егзоне у распону од Е4 до Е11 са повезујућим линијама које одговарају интроничним регионима и таг-СНПс у блоковима подебљаним и курзивним тиском.

Слика пуне величине

Табела пуне величине

Дискусија

Ови резултати пружају доказ повезаности ТПХ2 са великом депресијом и / или самоубиством, пошто је већина наших случајева имала велику депресију и самоубиство, и стога подржавају претходне извештаје о асоцијацији ТПХ2 варијанте (рс1386494) и са депресијом 19 и са самоубиством 20 у два одвојена узорка депресива и самоубистава (где статус депресије субјеката самоубица није пријављен). Такође смо прегледали наше податке у клиничком моделу самоубице само и након вишеструке корекције тестирања нисмо нашли значајну повезаност (подаци нису приказани). Ово може сугерисати да ТПХ2 има улогу у великој депресији, али не и у самоубиству.

Наша открића са низу низводних варијанти (г.22879А> Г) сугерирају потенцијално важнију повезаност. То је зато што критичнија евалуација указује да повезаност с рс1386493 може бити лажна. Конкретно, правац удруживања маркера рс1386493 у овој студији, као и претходно пријављене студије 19, 20, указује на потенцијално присуство заједничког алела ризика, примећено у обрасцу алелних и генотипских фреквенција у случајевима насупрот контролама, где је главни алел је чешћа у случајевима него контрола. Овај тренд је примећен и за велику депресију и за самоубиство (на пример, 0, 93 / 0, 79 одговара случајевима / контролама у оквиру клиничког модела депресије). У моделу осетљивости на болест не би се могло предвидети да ће чешћи алел бити још чешћи у групи болести, израчунали смо моћ посматрања таквог модела болести у нашем узорку. За клинички модел депресије снага је 0, 1% за стопу грешке типа И од 0, 001, под претпоставком да је животна преваленција 5% за велику депресију 35 (конзервативна доња граница процене коришћена за преостале анализе снаге за ову расправу) и двострука повећање релативног ризика за депресију са доминантним моделом. С обзиром на рецесивни модел с истим претпоставкама, снага се повећава на само 2, 6% (остали клинички модели прате сличне трендове). За такав модел узорак потребан за 80% снаге је 9 189 500 случајева и еквивалентни број контрола, претпостављајући доминантан модел (755 је процена за рецесивни модел). Јасно је да су и ова студија и раније објављене студије 19, 20 ослабљене у откривању таквих уобичајених варијанти ризика које доприносе осјетљивости на болести с обзиром на расположиве величине узорка. Мала снага повећава могућност да би проматрани налази за ове локусе могли бити лажни. Супротно томе, нова варијанта г.22879А> Г даје снагу од 41% претпостављајући доминантни модел за релативни ризик од болести (користећи исте параметре модела горе). Да би се открила таква варијанта са 80% снаге, потребно је укупно 215 случајева и подударних контрола, далеко изведивија величина узорка од претходно објављених СНП-ова. Стога су наша открића с г.22879А> Г врло обећавајућа и захтевају истрагу у већем узорку. Поред тога, свеобухватна генетичка карактеризација гена кандидата за ТПХ2 открива да би се будуће студије велике депресије требале усредсредити на други блок хаплотипа који садржи такве варијанте интереса (Слика 3).

Испитивање врста-врста открило је да људи, шимпанза, пас, миш и штакор показују очуване некодирајуће секвенце које обухваћају хумани ТПХ2 интрон 5 регион (као што је приказано снимком очувања из УЦСЦ претраживача генома на основу нацрта људског генома из маја 2004. године) . Ово даје доказе о постојању сачуваних елемената са регулаторним потенцијалом, а од посебног интереса је наше откриће да ова новооткривена варијанта живи у очуваном геномском региону. Ова варијанта и други у овом региону могу утицати на стварање кратких и дугих изоформи ензима са функционалним последицама за каталитичку активност. Експериментално смо показали да су и кратки и дуги изоформи ТПХ2 присутни у свим испитиваним регионима мозга, укључујући мозак. Улога ових транскрипата ТПХ2 у серотонергичним циљним регионима није позната. Једна од могућности је да кратак облик делује регулаторно и да има ограничену или никакву ензиматску функцију, јер има скраћено каталитичко место. Таква скраћена изоформа може да регулише активност ТПХ2 путем пост-транскрипционих интеракција са дугом изоформом или с другим посредницима са којима се може такмичити, с обзиром да је првих 5 ексона кратких и дугих ТПХ2 изоформа идентичних. Постоје преседанти за такве интеракције скраћених производа. 36, 37 Заједно, кратки и дуги облици могу да регулишу локални ниво серотонина у серотонергичним терминалним циљевима. Даљњим истраживањима полиморфизама на спојном спојном ексоналу 6 или у кодирајућем / 3'УТР регионима кратког транскрипта, као што је г.22879А> Г, може се открити варијантна изоформа са потенцијално аберантним функционалним ефектом. Дакле, могућност да кратка изоформа може играти критичну улогу у брзини синтезе серотонина у мозгу и хомеостази, требало би да мотивира истраживање разлика у експресији гена унутар мозга и контролних субјеката, што ће се истражити у будућим студијама. Узето заједно ови резултати пружају доказ за ТПХ2 као кандидатски ген за депресију и / или самоубиство за будућа испитивања. У ту сврху смо направили хаплотипску мапу гена ТПХ2 и идентификовали таг-СНП који ће бити вредни у бројним генетским и функционалним студијама које истражују улогу ТПХ2 у етиологији болести. Поред тога, збирка 16 нових варијанти откривених у овој студији значајно ће допринети будућим студијама таквих поремећаја као што су велика депресија, биполарни поремећај, шизофренија, алкохолизам, злоупотреба дрога, агресија и самоубиство, са којима је повезан ТПХ2.