Метилација хистона и смањена експресија тркб.т1 у орбиталном предњем кортексу комплекса самоубистава | молекуларна психијатрија

Метилација хистона и смањена експресија тркб.т1 у орбиталном предњем кортексу комплекса самоубистава | молекуларна психијатрија

Anonim

Смањена експресија ТркБ и ТркБ.Т1 пуне дужине умешана је у самоубиство и велику депресију и то може бити последица епигенетског механизма. 1, 2, 3 Сматра се да метилација неких остатака хистона смањује транскрипцију у ДНК близу комплекса хистона. До данас проучени остаци укључују лизин 4, 9, 27 и 36, који су сви присутни у хистон Х3 протеину. Посебно је занимљиво за ову студију Х3 лизин 27. Показало се да је овај остатак повећао метилацију код промотора П3 и П4 БДНФ код пацова који су били подвргнути хроничном стресном стресу (животињски модел депресије) у поређењу са контролном групом. 4 Како је молекулски механизам метилације Х3 лизина 27 повезан са смањеном транскрипцијом 5, а анализа метилације хистона у мозгу постмортем је експериментално изведива, 6 одлучили смо се да тестирамо да ли је метилација Х3 лизина 27 на локалитету промотора ТРКБ повећана у орбиталној фронталној коре. комплетирања самоубистава у поређењу са контролним субјектима.

У ову студију је било укључено десет контрола и 20 комплета самоубистава. Субјекти су регрутовани у мртвачници у Монтреалу и прошли су комплетне психолошке процедуре обдукције, како је раније описано. 7 Сви су испитаници били белци француско-канадског порекла. Ниједан испитаник није коришћен са историјским психотичним симптомима, укључујући биполарни поремећај и шизофренију. Једна тема од 30 година била је женска особа. Није било значајних разлика по групама у пХ ( т 28 = 0, 87, П = 0, 40; Средња контрола = 6, 49 + 0, 08, Средње самоубиство = 6, 58 + 0, 06), старосној доби ( т 28 = 0, 83, П = 0, 41; Средња контрола = 38, 7 + 4, 3 године, средње самоубиство = 35, 2 + 2, 6 година), или ПМИ ( т 28 = 0, 50, П = 0, 62; средња контрола = 24, 9 + 1, 9 х, средња самоубиства = 26, 3 + 1, 8 х), нити су постојале корелације између статуса метилације хистона и клиничке варијабле су значајне. Шеснаест од 20 самоубистава и осам од 10 контрола у овој студији идентични су онима кориштеним у нашој претходној студији. 3

За имунопреципитацију хистона, следили смо стручно изнети овде процедуре. 6 ДНК је екстраховано из БА10 и мозак из свих субјеката. Прво смо тестирали да је ИП реакција функционисала коришћењем позитивних (ГРИН2А) и негативних (ХББ) контролних прајмера описаних од стране Хуанг ет ал. 6 Свака фракција изоловане ДНК (улазна и везана) подвргнута је квантитативној ПЦР анализи за сваки субјект.

Екстракција РНК је изведена коришћењем Киаген РНеаси сетова, а конверзија цДНА је изведена коришћењем случајних хексамер прајмера (Инвитроген, Царлсбад, ЦА, САД) према упутствима произвођача (Роцхе Молецулар Биоцхемицалс, Индианаполис, ИН, УСА). Интегритетни бројеви РНК су се кретали од 6, 0 до 8, 0.

Умешана је смеша од 10 μл, која садржи ДНК 5 μл ЛигхтЦицлер 480 СИБР Греен И Мастер и 0, 1 μМ ТРКБ смисла 5 '-ЦЦЦТАГЦАЦАЦАТГААЦАЦГ-3' и ТРКБ антисенс прајмер 5 '-АТГТАГЦЦАТТЦЦЦАГАТЦГ-3' (производ од 112 бп). у ЛигхтЦицлер капиларе (Роцхе Молецулар Биоцхемицалс). У одвојеним експериментима проценили смо промотор глутамин синтетазе. Сенсе: 5'-ГТГЦЦТТАГЦЦАЦЦАЦААТ-3 ′, антисенс 5′-ТГГГАТГТТТЦАГАЦТГГТГ-3 ′. Контрола квалитета специфичности прајмера укључивала је обезбеђивање присуства једног врха топљења праћеног сликовном анализом стандардне криве и специфичности. Реакције су поновљене у дупликату. Да би се одредиле релативне концентрације ТРКБ промотора имунопреципитиране, коришћена је стандардна крива 10-пута серијског разблажења смеше сваке од ДНК узорка да би се одредила релативна вредност Ц т на оси и и количина ДНК која је коришћена на к ос. Да би се израчунала промена савијања, релативна количина везаног удела подељена је са релативном количином уноса за сваки предмет. Примери усмерени против ТркБ.Т1 мРНА су; Напред: 5′-ГГАТААГЦЦААЦАГЦАГТЦЦ-3 ′; Обрнуто: 5′-ГГАТААГЦЦААЦАГЦАГТЦЦ-3 ′.

Претходно смо показали да је ТркБ.Т1 регулиран у предњем кортексу комплекса самоубистава у БА 10. 3 Тамо смо пронашли силазну регулацију у два различита сета ТркБ сонде која су специфична за изоформу ТркБ.Т1. Извели смо РТ-ПЦР у свим узорцима у тренутној студији да бисмо утврдили да ли пад ТркБ.Т1 може да се потврди ( т 28 = 2, 26, П = 0, 035).

Анализа метилације Х3 лизина 27 изведена је у орбиталном предњем кортексу (БА10) и у мождану. Након имунопреципитације коришћењем антитела усмерених против метилованог лизина 27 (Х3), извршили смо ДНК РТ-ПЦР на региону ТркБ промотора и на улазним и на везаним фракцијама оба можданог црева и БА10, у три примерка за сваки субјект и регију мозга. У мозгу нисмо пронашли значајну разлику у метилацији овог остатка ( т 28 = 0, 646, П = 0, 53) између самоубистава и контрола. У БА 10 пронашли смо значајну разлику у стању метилације на лизин 27 (Х3) између суицида и контрола ( т 28 = 2, 60, П = 0, 015). Метилација је повећана на Лисине 27 у самоубојству у мозгу.

Следеће смо питали да ли ће било који сегмент ДНК, за који се зна да садржи ген експресиониран астроцитима, као што је ТркБ.Т1, повезан са повећаном метилацијом лизина 27 Х3 у БА 10. С тим циљем смо извршили РТ-ПЦР у БА10 за промотор глутамин синтетазе. Нисмо пронашли значајну повезаност између метиловања хистона и фенотипа самоубице у БА10 ( т 28 = 0, 67, П = 0, 51).

Следеће смо питали да ли је ниво експресије ТркБ.Т1 обрнуто корелиран са нивоом метилације Х3 лизина 27 у БА 10. Пронашли смо конзистентне трендове значајних Пеарсонових вредности −0, 34, -0, 14, -0, 16 за сет сонде ТркБ.Т1 214680_ат, 221795_ат и 221796, респективно. Код испитаника са ниским нивоом ТркБ.Т1 (0, 5 сд испод нивоа експресије у контролама; Пеарсон = 0, 61, П = 0, 046, Н = 11 самоубистава); међутим, пронашли смо статистички значајну повезаност између повећане метилације Х3 лизина 27 и нивоа експресије ТркБ.Т1. Овај налаз сугерира да ће Х3 лизин 27 морати бити јаче метилиран пре него што се примети ефекат транскрипције.

Сукоб интереса

Аутори изјављују да нема сукоба интереса.