Хипоталамички црх неурони оркестрирају сложена понашања након стреса | комуникације природе

Хипоталамички црх неурони оркестрирају сложена понашања након стреса | комуникације природе

Anonim

Субјекти

  • Неуронска физиологија
  • Друштвено понашање
  • Стрес и отпорност

Апстрактан

Сви организми поседују урођене бихевиоралне и физиолошке програме који обезбеђују опстанак. Да би имали максималну адаптивну корист, ови програми морају бити довољно флексибилни да урачунају промене у окружењу. Овде показујемо да хипоталамички ЦРХ неурони оркестрирају еколошки флексибилан репертоар понашања који настају након акутног стреса код мишева. Оптичко утишавање ЦРХ неурона нарушава организацију понашања појединца након акутног стреса. Ти се обрасци понашања померају у складу са окружењем након стреса, али ова осетљивост околине је појачана активацијом ПВН ЦРХ неурона. Ови налази пружају доказ да су ПВН ЦРХ ћелије део раније неистраженог круга који одговара прецизним обрасцима понашања и околишном окружењу након стреса. Прекомјерна активност у овој мрежи у недостатку стреса може допринијети амбијенталности околине, резултирајући непримјереним стратегијама понашања.

Увод

У свим организмима, перципирана претња покреће специфичне промене у понашању и пратеће физиолошке одговоре како би се осигурао преживљавање 1, 2 . Темељни круг одговоран за ова брза одбрамбена понашања на почетку стреса детаљно је проучаван 3, 4 . Мање се зна о понашањима која слиједе одмах након стресног догађаја. Тренутни описи оваквих понашања указују на то да су они сложени и различити; они укључују понашања повезана са проценом животне средине, будношћу и избегавањем ризика (тј. локомотацијом, истраживањем, неофобијом) 5, али и понашања која су самостална и наизглед амбивалентна за спољне знакове (то јест само-неговање) 6, 7, 8, 9 . С обзиром на патологије понашања које се могу развити након изложености стресним ситуацијама 10, јасније разумевање основног неуронског кола који контролира понашање након акутног стреса пружиће нови оквир за проучавање клијања поремећаја повезаних са стресом.

Овде смо користили акутни, експериментални стрес (стопало) за покретање реакције на стрес, а затим проучавали целокупни репертоар понашања у различитим окружењима окружења након престанка стреса. Хипотетирали смо да су појединачна понашања након стреса део ширег обрасца понашања који се састоји од вишеструког понашања 11 који омогућава животињама да се врате у спонтана понашања. Специфично смо се фокусирали на ћелије хормона који ослобађа кортикотропин (ЦРХ) паравентрикуларног језгра (ПВН) хипоталамуса. Ове ћелије су одговорне за покретање ендокрине компоненте одговора на стрес сисара 12, али постоје индикације да могу регулисати и сложено понашање након стреса. Ову идеју подржавају извештаји да електрична активација ПВН-а и околних регија покреће самотамњење 7, 8, понашање примећено након стреса код многих врста, како у експерименталним, тако и у природним условима 8, 9, 13 . Канонски приказ ПВН ЦРХ неурона као ендокриних ћелија које иницирају хормонску каскаду за које могу бити потребне десетине минута да утичу на мождане кругове 14 не подудара се са овом улогом у покретању брзог понашања након стреса. Веродостојнији сценарио је да поред слања терминалних аксона у крвне жиле у средњем узорку, ПВН ЦРХ неурони шаљу и колатералне пројекције у суседне хипоталамичке области 15 . Ови извештаји пружају вероватну алтернативу кроз коју ПВН ЦРХ неурони могу да контролишу брзо понашање након стреса 16 .

Овде смо користили алате специфичне за ћелију да директно циљамо ПВН ЦРХ неуроне 17 и тестирамо хипотезу да ови неурони играју кључну улогу у оркестрирању сложених понашања након стреса. Наша открића показују да: (и) понашања показују организовану структуру након стреса; (ии) ова организација има изражене, али флексибилне временске карактеристике које су осетљиве на активност неурона и окружења ПВН ЦРХ; (иии) Постоји реципрочна веза између животне средине и неуронске активности ПВН ЦРХ у контроли специфичних понашања. Разумевање специфичних чворова који контролишу редослед понашања након стреса може понудити јединствене увиде који нам олакшавају разумевање како мозак помаже да се поново постави након стреса.

Резултати

Квантификација вишеструког понашања након стреса

Да бисмо испитали ефекте једне епизоде ​​стреса (стопало) на понашање миша, прво смо квантификовали сва понашања у 15-минутном периоду посматрања у кућној кавезу (ХЦ). Могли смо разазнати осам различитих понашања: истраживање, неговање, копање, ходање, жвакање, узгој, смрзавање и спавање (Сл. 1а). Ова понашања су се чинила случајним, без очигледног узорка или пристрасности које су биле очигледне током посматрачког периода (Сл. 1а – г). Друга група мишева пребачена је у комору за стопала, подвргнута је низу стопало и затим враћена у ХЦ ради посматрања. Иако је опажено исто осам понашања, постојало је неколико разлика: Конкретно, дошло је до значајног повећања сакривања (Сл. 1б – д, Допунске слике 1а, б и Додатног филма 1), узгоја (Сл. 1б, е, ф) и ходање (Сл. 1б, г, х). Дошло је до значајног смањења копања и жвакања. Геодезија, спавање и смрзавање нису утицали. Затим смо се фокусирали на временску организацију, посебно на понашање које је након стреса појачано. Пре стреса, ова понашања нису показала видљиву временску пристраност или организацију (Сл. 1ц – х); средње време за било које дано понашање није се значајно разликовало од полувремена (ХТ) периода посматрања (ХТ = 450 с; допунска слика, слика 1ц-е). Штавише, сви који одгајају, гаје и ходају показали су линеарни кумулативни пораст током посматрања. Након стреса, средње време за негу није одмакло од ХТ-а (допунска слика 1ц). Међутим, дошло је до значајног помака у средњем времену за узгој (допунска слика 1д) и ходање (допунска слика 1е) према почетку посматрачког периода. Ова запажања показују да мишеви користе исту палету понашања појединачних понашања пре и после стреса, али организација тих понашања и време додељено сваком понашању је различито. Конкретно, одмах након стреса, постоји пристраност према истраживачком понашању која се смањује током посматрачког периода и поуздан пораст неговајућег понашања. Ова анализа даје образац за образац понашања одмах након акутног стреса, који се сада може користити за истраживање неуронског круга.

Image

( а ) Квантификација понашања у 15-минутним епохама у домаћем кавезу (ХЦ) наивних мишева и мишева одмах након стопала. Осам различитих понашања видљиво је код наивних (Н, лијево) и под стресом (С, десно) мишева. Сваки ред представља по један миш. ( б ) дотјеривање (наивно: 124, 8 ± 33, 2 с, н = 9 према напрегнутом: 294, 0 ± 33, 4 с, н = 9; П = 0, 0024; т- тест), узгој (наивно: 19, 7 ± 4, 8 с, н = 9 у односу на стрес : 64, 7 ± 10, 0 с, н = 9; П = 0, 0012; т- тест) и ходање (наивно: 76, 4 ± 14, 2 с, н = 9 насупрот стресу: 171, 4 ± 27, 0 с, н = 9; П = 0, 0067; т- тест ) повећавају се након стреса. Време проведено на копању (наивно: 122, 5 ± 28, 9 с, н = 9 насупрот стресу: 7, 5 ± 5, 0 с, н = 9; П = 0, 0012; т- тест) и жвакању (наивно: 61, 5 ± 21, 1 с, н = 9 у односу на стрес: 14, 0 ± 7, 4 с, н = 9; П = 0, 0492; т- тест) се смањују. Истраживање (наивно: 369, 9 ± 65, 1 с, н = 9 насупрот напрегнутом: 282, 8 ± 31, 6 с, н = 9; П = 0, 2463; т- тест), спавање (наивно: 124, 3 ± 85, 3 с, н = 9 у односу на стрес: 59, 5 ± 44, 4 с, н = 9; П = 0, 5096; т- тест) и смрзавање (наивно: 0, 6 ± 0, 6 с, н = 9 у односу на стрес: 2, 6 ± 1, 6 с, н = 9; П = 0, 2541; т- тест) не утичу . ( ц - х ) Проценат животиња које у сваком временском тренутку показују исказано понашање и кумулативни графикони који приказују релативни опсег неговања ( ц, д ), узгоја ( е, ф ) и ходања ( г, х ). Линија за скалирање: ц - х, 20%; НС, није значајно; * П <0, 05; ** П <0, 01; Бар грешака ± сем

Слика пуне величине

Фотоинхибиција ПВН ЦРХ неурона након стреса

Претходно је пријављено снажно повећање неге након стреса 7, 18 и сугерисано је да ПВН неурони могу да контролишу тачан временски период неговања у односу на друга понашања 19 . Друге студије, међутим, извештавају да ПВН лезије не утичу на негу након стреса 20 . Да бисмо директно процијенили допринос ПВН ЦРХ неурона у његовању и сродним понашањима након стреса, користили смо мишеве који експримирају Арцхаерходопсин 3.0 у ЦРХ неуронима (ЦРХ Арцх3.0 ) 21 да конкретно ублаже пуцање у ПВН ЦРХ неуронима (сл. 2а-д). Утицај светлости на понашање увек је упоређен са контролним ЦРХ еИФП мишевима 22, 23 (Супплементарни филм 1). Прво смо помоћу кришки мозга потврдили да испорука жуте светлости поуздано инхибира пуцање на ЦРХ неуроне из ЦРХ Арцх3.0 мишева (учесталост акционих потенцијала: 7.7 ± 6.7% од почетне вредности П = 0.0168, н = 5, поновљено мери једносмерно анализа варијанце (АНОВА)). Поред тога, нисмо приметили пораст повећања активности ЦРХ неурона након престанка оптичке инхибиције (учесталост акционих потенцијала: 62, 5 ± 51, 0% од почетне вредности, П > 0, 9999, н = 5, поновљене мере једносмерне АНОВА). Затим су мишеви били изложени стопалу ногу, а континуирано жуто светло је пуштено у ПВН током посматрања ХЦ током 15 мин (Сл. 2е, Допунска слика Сл. 2а, б и Допунски филм 2). То је смањило време проведено на негу (Сл. 2ф – х и Додатно Сл. 2ц, д), повећало време проведено на узгоју (Сл. 2и – к и Додатно Сл. 2е) и ходање (Сл. 2л – н и Допуна Сл. 2ф ). Временска организација ових понашања, међутим, није била измењена (допунска Сл. 3л – н). На друга понашања није утицала фотоинхибиција ЦРХ неурона (допунска слика 2г – к). Да бисмо утврдили да ли релативне промене укупног времена проведеног на одређеном понашању одражавају једноставну прерасподелу времена или да ли су одређена понашања фаворизована након утишавања ЦРХ неурона, испитали смо релативно време проведено на узгоју или шетњи након уклањања времена додељеног дојењу. Дошло је до значајног повећања фракцијског узгоја времена (Сл. 2к) и ходања (Сл. 2н), што указује на то да се таква понашања преферирано повећавају након утишавања ПВН ЦРХ неурона. Будући да стрес повећава циркулирајуће глукокортикоиде (ЦОРТ) 12, проучили смо потенцијалну везу између ЦОРТ-а и неге. Блокирање синтезе ЦОРТ-а 1 сат пре него што је нога пригушен, ЦОРТ се повећава као одговор на стопало (допунска слика 3а, б), али није утицало на неговање (допунска слика 3ц) или узгој (додатна слика 3д). Да бисмо проценили улогу ПВН ЦРХ неурона у регулацији понашања у одсуству стреса, утишали смо ЦРХ неуроне наивних мишева. Нисмо приметили никакву разлику у обрасцу понашања мишева као одговор на оптичку инхибицију у наивном стању (допунска слика 4а-д). Узето заједно, ова запажања указују да је трајна активност ПВН ЦРХ неурона након стопала неопходна за регулисање специфичног понашања, али то се дешава независно од ЦОРТ-а.

Image

( а ) ААВ-ДИО-Арцх3.0-еИФП вирус убризган у креирање ПВН. ( б ) Схематске мапе приказују место убризгавања (лево) и место имплантације светлог ферула (десно). ( ц ) Конфокална слика приказује експресију Арцх3.0-еИФП (зелена) и тдТомато (црвена) у ПВН-у. ( д ) Достава жуте светлости на кришку (означена жутом кутијом) смањује пуцање ПВН ЦРХ неурона у тренутној стезаљци. Доњи, резимени хистограм испод акцијских потенцијала формира поновљена испитивања. ( е ) Детаљна анализа показује свих осам понашања код ЦРХ еИФП (лево) и ЦРХ Арцх3.0 (десно) у 15-минутној епохи, одмах након стопала. Сваки ред представља једну животињу. ( ф ) Хистограми приказују проценат одгајања животиња у свакој групи током периода посматрања од 15 минута. ( г ) Кумулативни граф илуструје релативну његу у сваком стању. ( х ) Збирни графикони који показују да је орезивање инхибирано током оптичке инхибиције ПВН ЦРХ неурона (ЦРХ еИФП : 181, 4 ± 28, 7, н = 10 насупрот ЦРХ Арцх3, 0 : 79, 0 ± 11, 2, н = 8; П = 0, 0080; т- тест). ( и ) Хистограми показују проценат узгоја животиња у свакој групи током периода посматрања од 15 минута. ( ј ) Кумулативни граф илуструје релативно узгој. ( к ) Време сазревања, као део свих понашања које нису неговане, повећава се током фотоинхибиције (ЦРХ еИФП : 4, 5 ± 0, 8%, н = 10 насупрот ЦРХ Арцх3, 0 : 8, 6 ± 1, 5%, н = 8; П = 0, 0229 ; т- тест). ( л ) Хистограми показују проценат ходања у свакој групи током периода посматрања од 15 минута. ( м ) Кумулативни граф илуструје релативно ходање. ( н ) Фракционо време хода се такође повећава током фотоинхибиције ПВН ЦРХ неурона (ЦРХ еИФП : 12, 2 ± 2, 0%, н = 10 у односу на ЦРХ Арцх3, 0 : 22, 0 ± 2, 7%, н = 8; П = 0, 0084; т- тест) . Ваге: ( ц ), 50 µм; ( д ), 2 Хз и 1 с; ( ф, г, и, ј, л, м ), 20%; НС, није значајно, * П <0, 05; ** П <0, 01; Траке грешака ± сем

Слика пуне величине

Фотоактивација ПВН ЦРХ неурона

Да бисмо испитали ефекте активирања ЦРХ неурона, у одсуству спољног стреса, једнострано смо изразили Цханнелрходопсин 2 (ЦхР2) у ЦРХ неуронима (ЦРХ ЦхР2 ) 21 (Сл. 3а-ц). У резинама мозга потврдили смо да плава светлост индукује унутрашње струје и шиљато у ЦРХ ЦхР2 неуроне поуздано на фреквенцијама до 20 Хз (сл. 3д). Да бисмо контролисали ЦРХ активност ин виво, имплантирали смо оптичку сонду ипсилатералну на место убризгавања (допунска слика 5а, б). Као што се очекивало, фотостимулација ПВН у ЦРХ ЦхР2 мишевима повећала је циркулацију ЦОРТ (Сл. 3е) и повећала број ц-Фос-позитивних ћелија у ПВН (допунска слика 5ц-е). Затим смо фотостимулирали наивне (нестресиране) ЦРХ ЦхР2 мишеве у опсервациону комору којој су мишеви били насељени (ХАБ). Ово је изазвало робусно дотјеривање (допунски Сл. 6а и Додатни филм 3), уз брзи почетак. Понашање је престало одмах кад је фотостимулација прекинута (допунска слика 6а). Да бисмо испитали ефекте ПВН ЦРХ активације у ХАБ окружењу и процијенили различита понашања, спровели смо додатне експерименте током којих је плаво свјетло испоручено током 5 мин (Сл. 3ф). Фотостимулација је повећала његовање (Сл. 3г – и) током периода посматрања од 5 минута. Такође је константно смањивао и апсолутно узгајање (Сл. 3ј – л и Додатно Сл. 6б) и фракционо узгој (Сл. 3л). Није било ефекта фотостимулације на ходање (Сл. 3м – о и Допунска слика 6ц) или геодетског снимања (Допунска слика Сл. 6д, е). Следеће смо питали да ли су ове промене у понашању осетљиве на промену учесталости фотостимулације. Приметили смо линеарно повећање неге са повећањем фреквенција од 1 до 20 Хз. Ово је било праћено прогресивним, фреквентно смањеним узгојем (допунска слика 6ф). Оптичка стимулација неурона ПВН ЦРХ није утицала на временску организацију ни неговања, ни узгоја ни ходања (допунска слика 6г-и). Ова запажања показују да је специфична активација ПВН ЦРХ довољна за повећање неге и смањење узгоја.

Image

( а ) Конструкција вируса ААВ-ДИО-ЦхР2-еИФП зависног од Цре. ( б ) Схематске мапе приказују убризгавање вируса у ПВН мишева ЦРХ-Цре / тдТомато (лево) и место имплантације светлог ферула (десно). ( ц ) Конфокална слика приказује експресију ЦхР2-еИФП (зелена) и тдТомато (црвена) у ПВН-у. ( д ) Оптичка стимулација у тренутној стезаљци (горе) и напонској стезаљки (доле) показује испоруку плаве светлости поуздано контролира ПВН ЦРХ неуроне. ( е ) Узорци крви узети прије и 15 мин након почетка оптичке стимулације показују пораст нивоа ЦОРТ-а, посебно у ЦРХ ЦхР2 мишевима (ЦРХ еИФП : 0, 528 µг дл −1 пораст, н = 6; насупрот ЦРХ ЦхР2 : 5, 327 µг дл −1 повећање, н = 5; П = 0, 0316; т- тест). ( ф ) Детаљна анализа показује образац осам различитих понашања примећених код ЦРХ еИФП (лево) и ЦРХ ЦхР2 (десно) током 5 мин оптичке стимулације у опсервационом комору коме су мишеви претходно били смештени у одсуству стреса. Сваки ред представља једну животињу. ( г ) Хистограми показују проценат одгајивања животиња у свакој групи током оптичке стимулације. ( х ) Кумулативни граф илуструје релативни обим неге. ( и ) Оптичка стимулација неурона ПВН ЦРХ повећала је време дојења (ЦРХ еИФП : 6, 8 ± 1, 9 с, н = 12; насупрот ЦРХ ЦхР2 : 112, 6 ± 13, 6 с, н = 11; П <0, 0001; т- тест). ( ј ) Хистограми показују проценат одгајања животиња у свакој групи током оптичке стимулације. ( к ) Кумулативни граф илуструје релативно узгој. ( л ) Време сазревања као делић ненасилног понашања се смањује фотостимулацијом ЦРХ неурона (ЦРХ еИФП : 9, 9 ± 1, 5%, н = 12; насупрот ЦРХ ЦхР2 : 5, 4 ± 1, 4%, н = 11; П = 0, 0396; т -тест). ( м ) Хистограми показују проценат животиња које ходају током оптичке стимулације. ( н ) Кумулативни граф илуструје релативно ходање. ( о ) Фракционо време хода не мења се оптичком стимулацијом (ЦРХ еИФП : 28, 8 ± 3, 4%, н = 12; насупрот ЦРХ ЦхР2 : 28, 7 ± 3, 8%, н = 11; П = 0, 9784; т- тест). Ваге: ц, 50 μм; д, Врх: 200 пА и 500 мс, Доња: 20 мВ и 200 мс; ( г, х, ј, к, м, н ), 20%; НС, није значајно, * П <0, 05; **** П <0, 0001; Траке грешака ± сем

Слика пуне величине

ПВН ЦРХ неурони циљају дискретну ћелијску популацију у ЛХ

Аксон колатерали из ПВН ЦРХ неурона су описани у латералном хипоталамусу (ЛХ) 15 . Поред тога, ПВН ЦРХ неурони такође експримирају мРНА за везикуларни транспортер глутамата 2 (ВГлуТ2) 24, пружајући супстрат за брз синаптички пренос. Да бисмо истражили претпостављени неуронски круг низводно од ЦРХ неурона, испоручили смо плаву светлост ин виво током 5 минута (Сл. 4а), а 2 сата касније убили смо мишеве и обрадили мождано ткиво за ц-Фос. Дошло је до повећања ц-Фос-позитивних ћелија у ЛХ (Сл. 4б, ц). Да би се директно испитао допринос пројекције ЛХ, једно влакно је једнострано постављено у ЛХ да стимулише аксонске терминале (Сл. 4д и Додатна Сл. 7а, б). Фотостимулација влакана повећала је његовање (слика 4д). Мрежа појачаних жутих флуоресцентних протеина (еИФП) -позитивних влакана са структурама у облику бутона била је евидентна у ЛХ (сл. 4е, ф и допунска слика 8а-ц). Није било влакана позитивних на еИФП у екстрахипоталамичким регионима за које се зна да примају улаз од ПВН 25, 26 или су умешани у неговајуће понашање 27 (допунска слика 8д-и). Да бисмо се поставили питање да ли се ПВН ЦРХ неурони који пројицирају на ЛХ разликују од ПВН ЦРХ неурона који пројицирају на средњу еминенцију, извели смо двоструки ретроградни трагачки експеримент. Убризгали смо флуороголд у репну вену (допунска слика 9а) да бисмо неуроне обележили аксонским пројекцијама које завршавају изван крвно-мождане баријере (ендокрино) и такође убризгали флуоресцентне перлице у перифорничку област ЛХ (допунска слика 9б) да би се означили. ћелијска тела која имају места отпуштања у ЛХ. Флуороголд и ретробеадс су локализовани у подскупини ПВН ЦРХ неурона, у складу са хипотезом да појединачни неурони истовремено пројицирају на средњу еминенцију и ЛХ (допунска слика 9ц). Да бисмо директно окарактерисали функционални синаптички пренос из ЦРХ аксонских влакана на ЛХ неуроне, добили смо ин витро снимке целих ћелија са ЛХ неурона (слика 4ф). На основу брзог кашњења, блокаде тетродотоксином и накнадног делимичног опоравка у присуству 4-аминопиридина 28, закључујемо да су ове везе моносинаптичне. Фармаколошки експерименти који показују комплетан блок са антагонистом АМПА / каинатног рецептора, 6, 7-динитрокиноксалин-2, 3-дионом (ДНККС), указују на то да су синапсе глутаматергичне (слика 4г-ј). Поред тога, тестирали смо ефекте ЦРХР1 антагониста на евоцираном преносу и нисмо успели да видимо било какав ефекат на појединачне ексцитаторне постсинаптичке струје или возове побудних постинаптичких струја (подаци нису приказани). Занимљиво је да нису сви тестирани ЛХ неурони реаговали на фотостимулацију. Приметили смо два различита подтипа на основу електричних отисака прстију. Ћелије са израженим кашњењем на први скок као одговор на убризгавање деполаризационе струје и линеарним односом струје и напона, нису успеле да одговоре на оптичку стимулацију ЦРХ влакана (неодговарајући, сл. 4к). Насупрот томе, ћелије са већим степеном пуцања (Сл. 4л) и изразитим „прогибом“ у мембранском потенцијалу (Сл. 4к – н) увек су реаговале на фотостимулацију (одзивачи). Ова запажања показују да ПВН ЦРХ неурони шаљу побуђујуће, глутаматергичке пројекције на електрофизиолошки различиту популацију неурона у ЛХ.

Image

( а ) Схема експерименталног дизајна. ( б ) ц-Фос-позитивне ћелије у ЛХ ЦРХ еИФП и ЦРХ ЦхР2 након фотостимулације у ПВН. ( ц ) Сумарни подаци ц-Фос у ЛХ (ЦРХ еИФП : 100, 5 ± 21, 1, н = 4 у односу на ЦРХ ЦхР2 : 318, 8 ± 60, 4, н = 5; П = 0, 0179; т- тест). ( д ) Инстицирано фотостимулација у ЛХ (20хз, 5 мин) повећава време дојења (ЦРХ еИФП : 5, 4 ± 3, 0 с, н = 3; насупрот ЦРХ ЦхР2 : 36, 9 ± 7, 3 с, н = 7; П = 0, 0264; т- тест ). ( е ) Схематска карта и експериментални дизајн снимака целих ћелија ин витро из ЛХ неурона. ( ф ) Записани неуроцити напуњени неурони у ЛХ (црвени) окружени влакнима која експримирају ЦхР2-еИФП (зелена). ( г ) У напонској стезаљци (ХП = -80 мВ), плава светлост (2–5 мс) емитује брзе унутрашње струје (латенција: 4, 7 ± 0, 3 мс) које ТТКС укида (основна вредност: 103, 1 ± 2, 0 пА у односу на ТТКС: 4, 7 ± 0, 7 пА, н = 8; П <0, 0001; поновљена мера једносмерне АНОВА) и делимично се обнавља повећањем трајања светлосног импулса (7, 5–10 мс) током примене 4-аминопиридина (4-АП) 28, 44 ( 40, 1 ± 9, 0 пА; П <0, 0001 према почетној линији; П = 0, 0222 насупрот ТТКС, н = 8; поновљена мера једносмерна АНОВА). ( х ) Узорци трагова показују ефекте оптичке стимулације на пуцање ЛХ неурона. ( и, ј ) на оПСЦ не утиче пикротоксин, али их ДНККС мотивно инхибира (почетна вредност: 90, 7 ± 12, 6 пА, пицро: 115, 1 ± 17, 6 пА, ДНККС: 11, 3 ± 3, 5 пА, н = 6; основна вредност у односу на ДНККС, П = 0, 0007; поновљена мера једносмерна АНОВА). ( к ) Тренутни снимци стезања ЛХ неурона откривају два различита електрофизиолошка профила. Ћелије приказане сивим квадратом не показују синаптичке одговоре на импулсе плаве светлости; плави круг означава ћелије са синаптичким одговорима. ( л ) Акцијски однос фреквенција-струја у ћелијама које реагују / не реагују ( н = 16; П <0, 0001; двосмерна АНОВА). ( м ) Диференцијална хиперполаризација 'прогиба' између група (неодговарајући: 0, 017 ± 0, 024, н = 8; одговор: 0, 146 ± 0, 022, н = 8; П = 0, 0016; т- тест). Израчун индекса саг: (Вм мак - Вм стабилно стање) / Вм мак, као одговор на хиперполаризацијски корак –80 пА). ( н ) Учесталост паљења (+60 пА корак) насупрот индексу прогиба у станицама које реагирају и не реагују. Линије скале: ( б ) и ( ф ), 50 μм; ( г ) и ( и ), 50 пА и 10 мс; ( х ) и ( к ), 50 мВ и 50 мс; НС, није значајно; * П <0, 05; ** П <0, 01; *** П <0, 0005; **** П <0, 0001; Траке грешака, ± сем

Слика пуне величине

Профили понашања након стреса су осетљиви на контекст

Организација понашања у организовани репертоар након стреса сугерише тешко урођену стратегију. Да би била оптимална, ова стратегија би требало да буде осетљива на промене у животињској околини. Да бисмо тестирали ову идеју, спровели смо експерименте у којима су мишеви добили стопало, а затим су смештени или у ново окружење (роман) или су посматрани у комори за стопало (слика 5а). Подаци о понашању су упоређени са животињама које су стављене у ХЦ након стопала (Сл. 1). Опет, свих осам понашања било је евидентно у новом окружењу (Сл. 5б), али у поређењу са ХЦ-ом, дошло је до смањења неге (Сл. 5ц-е, Допунске слике 10а, б и Додатног филма 4) и повећава се у гајењу (Сл. 5ф – х) и ходању (Сл. 5и – к). Следеће смо проценили временске одлике овог понашања. Иако није било разлике у расподјели дојевања у односу на ХЦ, (допунска слика 10д), узгој и ходање су дуготрајно одржавани (допунска слика 10е, ф) током периода посматрања. Мишеви који се држе у кавезу са стопалима (ФС) показали су се снажно смрзавање одмах након ударца ногом (Сл. 5 л – н, Допунска слика 10 г и Допунски филм 5). Како се ово понашање постепено расипало, дошло је до повећања ходања (Сл. 5и – к и Допунска слика 10ф). Било је мање узгоја (Сл. 5ф-х) и његовања (Сл. 5ц-е) у ножној комори. Ова запажања показују да околина има дубок утицај на образац понашања након стреса и наговештава основне разлике у стратегији коју је животиња усвојила у усклађивању своје палете понашања са контекстом.

Image

( а ) Схема експеримента која приказује два различита окружења, нови контекст (роман) и комору за ногу (ФС) одмах након стопала. ( б ) Детаљна анализа показује образац понашања које животиње показују у различитим контекстима. Сваки ред представља једну животињу. Различита окружења мењају образац понашања који изражава животиња. ( ц ) проценат дотјеривања животиња у сваком тренутку. ( д ) Кумулативни графикони приказују релативну његу у различитим контекстима, укључујући кућни кавез (ХЦ) одмах након стреса и упоређујући се са наивним мишевима (Слика 1). ( е ) Одгајање је доминантно у ХЦ-у (испрекидана линија представља средње време неге у ХЦ-у; роман: 85, 1 ± 8, 0 с; ФС: 49, 3 ± 9, 4 с; роман у односу на ХЦ П <0, 0001; ФС у односу на ХЦ П <0, 0001; н = 9 у свакој групи; једносмерна АНОВА). ( ф ) проценат узгоја животиња у сваком тренутку. ( г ) Кумулативни графикони приказују релативну количину узгоја у различитим контекстима, укључујући ХЦ непосредно након стреса и наивне мишеве (Слика 1). ( х ) Мишеви проводе више времена узгајајући се у роману (испрекидана линија представља средње време узгоја у ХЦ; роман: 120, 4 ± 16, 0 с; ФС: 18, 3 ± 8, 5 с; роман у односу на ХЦ П = 0, 0097; роман у односу на ФС П <0, 0001; н = 9 у свакој групи; једносмерна АНОВА). ( и ) проценат животиња које ходају у сваком временском тренутку. ( ј ) Кумулативни графикони приказују релативно време хода у различитим контекстима, укључујући ХЦ непосредно након стреса и код наивних мишева (Слика 1). ( к ) Мишеви проводе исту количину времена шетајући Новелом и ФС-ом ​​(испрекидана линија представља средње време хода у ХЦ-у; роман: 436, 7 ± 25, 2 с; ФС: 405, 6 ± 41, 7 с; роман у односу на ХЦ П <0, 0001; ФС у односу на ХЦ П <0, 0001; н = 9 у свакој групи; једносмерна АНОВА). ( л ) проценат животиња који се смрзава у свакој временској тачки. ( м ) Кумулативни графикони приказују релативно смрзавање у различитим контекстима, укључујући ХЦ одмах након стреса и наивне мишеве (Слика 1). ( н ) понашање смрзавања било је значајно само у ФС-у (испрекидана линија представља средње време смрзавања у ХЦ; роман: 19, 5 ± 3, 0 с; ФС: 121, 8 ± 32, 0 с; роман наспрам ФС П = 0, 0021; ФС у односу на ХЦ П = 0, 0004; н = 9 у свакој групи; једносмерна АНОВА). Траке скале: ( ц, д, ф, г, и, ј, л, м ), 20%; ** П <0, 01; *** П <0, 0005; **** П <0, 0001; Траке грешака ± сем

Слика пуне величине

Контекст утиче на понашања вођена ПВН ЦРХ фотоактивацијом

Затим смо процијенили утицај околине на понашања уочена након фотоактивације ПВН ЦРХ неурона. Фотостимулирали смо ПВН ЦРХ неуроне у новом окружењу (роман) и комори стопала (пратећи стопало) у ЦРХ еИФП и ЦРХ ЦхР2 мишевима. Фотостимулација је повећала његовање у новом окружењу (Сл. 6а-ц) и у ножној комори (Сл. 6д-ф). Следеће смо тестирали да ли је репертоар понашања као одговор на оптичку стимулацију модулисан познавањем животне средине упоређујући понашање мишева у новим кавезима и кавезима у које су били настањени. Оптички евоцирано вријеме дојења постепено се смањивало како се претпостављени ниво пријетње повећавао (Сл. 6 г, х), али је дистрибуција времена за дотјеривање била непромијењена (допунска слика 11а). Поуздано смањење понашања у дојењу од ХЦ-а до нове до стопала указује да је веће упознавање са околином вероватно позитиван сигнал за неговајуће понашање. Да бисмо тестирали ову идеју, спровели смо експерименте на две групе мишева. У првој групи, мишеви су настањени тако што су их излагали комори за тестирање сваког од пет узастопних дана. У другој групи, мишеви нису били изложени у комори. Обе групе су затим уведене у комору, а одгајање је квантификовано као одговор на испоруку плаве светлости сваког од пет узастопних дана (Сл. 6и). ХАБ животиње нису показале промену укупног пређеног растојања (Сл. 6ј и Додатно Сл. 11б) нити у времену дојења (Сл. 6к и Допуна Сл. 11ц) као одговор на фотостимулацију. Супротно томе, код животиња које нису ХАБ, дошло је до смањења укупног пређеног растојања (Сл. 6ј и Додатно Сл. 11б) и повећања неговања (Сл. 6к и Допуна Сл. 11ц) сваког од пет узастопних дана. ЦРХ еИФП мишеви показали су само безначајан ниво негованости у било ком стању (допунска слика 11д). Ова запажања показују да уочено познавање околине позитивно утиче на понашање младог према ПВН ЦРХ.

Image

( а - х ) Идентични протокол за испоруку светлости (10 хз за 5 мин) који се користи у новом окружењу (роман) и у ФС-у одмах након напрезања ногу. ( а - ц ) Фотостимулација неурона ПВН ЦРХ у роману. ( а ) Сваки ред представља појединачну животињу. ( б ) Хистограм који показује проценат дојења животиња. ( ц ) Квантификација дојења у роману (ЦРХ еИФП : 8, 9 ± 1, 2 с, н = 10; насупрот ЦРХ ЦхР2 : 85, 0 ± 10, 9 с, н = 10; П <0, 0001; т- тест). ( д - ф ) Оптичка стимулација неурона ПВН ЦРХ у ФС. ( д ) Сваки ред представља појединачну животињу. ( е ) Хистограм који показује проценат дојења животиња. ( ф ) Квантификација дојења у ФС (ЦРХ еИФП : 6, 4 ± 2, 5 с, н = 10; насупрот ЦРХ ЦхР2 : 40, 1 ± 9, 5 с, н = 10; П = 0, 0031; т- тест). ( г ) Кумулативни графикони илуструју релативни ефекат различитих контекста на оптички евоцирано орезивање, укључујући и навикнути (ХАБ) контекст (подаци приказани на слици 3). ( х ) Оптички изазвано вријеме дојења постепено се смањује како претпостављени ниво претње контекста расте (Новел: 74, 7 ± 7, 9% ХАБ, П = 0, 0405 насупрот ХАБ; ФС: 35, 8 ± 8, 3% ХАБ, П = 0, 0013 у односу на ХАБ, П = 0, 0006 насупрот роману; н = 10; поновљена мера једносмерна АНОВА). ( и ) Схема експеримента која показује ефекте хабитуације на одгајање изазвано ЦхР2. ( ј ) Повећана познаваност парадигме узрокује смањење почетне удаљености кретања у арени у не-ХАБ (дан 5: 45, 79 ± 10, 78% првог дана, н = 11; П = 0, 0004 у односу на први дан; упарени т- тест ), али није код ХАБ животиња (дан 5: 85, 13 ± 10, 62% првог дана, н = 5; П = 0, 21 у односу на дан 1, упарени т- тест; П = 0, 0431 насупрот нон-ХАБ, т- тест). ( к ) Оптички изазвано време дојења је веће петог дана код мишева који нису ХАБ (дан 5: 189, 6 ± 27, 8% у поређењу са даном 1, н = 11; П = 0, 0016; упарени т- тест). Супротно томе, ХАБ животиње показују инвариантни одговор на оптичку активацију (дан 5: 88, 5 ± 7, 7% у поређењу са даном 1; н = 5, П = 0, 323 у односу на дан 1, упарени т- тест; П = 0, 0316 насупрот Нон-ХАБ, т- тест ). Величине: ( б, е, г ), 20%; * П <0, 05; ** П <0, 01; *** П <0, 0005; **** П <0, 0001. Бар грешака ± сем

Слика пуне величине

Фотоактивација ПВН ЦРХ тупим контекстуалним понашањима

На крају, питали смо да ли је однос између околине и понашања примећен као одговор на стимулацију ПВН ЦРХ неурона реципрочно модулисан. Другим речима, да ли би могла усмеравати активацију ПВН ЦРХ неурона прекомерним сигналима окружења? Овде смо упоредили доминантно понашање у новим окружењима и окружењу стопала код ЦРХ еИФП и ЦРХ ЦхР2 животиња као одговор на фотостимулацију. Фотостимулација је смањила узгој у новом окружењу (Сл. 7а-д и Допунска слика 12а-д) и смрзавање у ножној комори (Сл. 7е-х и Допунска Сл. 12е-х). Затим смо питали да ли је та еколошка способност прекомерне вожње ЦРХ неурона ограничена на понашање које смо описали, или да ли то наговештава ширу улогу ПВН ЦРХ неурона. Да бисмо тестирали ову идеју, процијенили смо ефекте ЦРХ фотостимулације у два широко кориштена тестова понашања, отворено поље и препознавање новог објекта. У отвореном пољу, ЦРХ ЦхР2 мишеви су провели мање времена у центру отвореног поља током 5-минутног периода фотостимулације (Сл. 7и), али на кретање није утицало (Допунска слика Сл. 12и). Затим смо питали да ли ће активирање ПВН ЦРХ неурона ометати ново истраживање (Сл. 7ј). Током 5-минутног периода посматрања, природно истраживање новог предмета практично је елиминисано када су ЦРХ неурони фотостимулирани (Сл. 7к, л). Ова запажања показују да ПВН ЦРХ неурони смањују осетљивост мишева на контекстуалне знакове. За то време, мишеви посежу за само-усмереним неговањем активности уместо да показују обрасце понашања који су у складу са интеракцијом са њиховим окружењем.

Image

( а - д ) Оптичка стимулација неурона ПВН ЦРХ смањује узгој у новом окружењу (роман). ( а ) Сваки ред представља појединачну животињу. ( б ) Хистограми који показују проценат одгајања животиња. ( ц ) Кумулативни графикони приказују релативни опсег узгоја. ( д ) Одгајање времена као делић свих понашања након искључења времена утрошеног на неговање (ЦРХ еИФП : 13, 6 ± 1, 4%, н = 10; насупрот ЦРХ ЦхР2 : 9, 2 ± 0, 9%, н = 10; П = 0, 0165; т- тест ). ( е - х ) Оптичка стимулација неурона ПВН ЦРХ омета смрзавање у ФС. ( е ) Сваки ред представља појединачну животињу. ( ф ) Хистограми показују проценат замрзавања животиња. ( г ) Кумулативни графикони приказују релативни степен смрзавања. ( х ) Квантификација времена фракцијског смрзавања ако је из времена анализе искључено време сакривања (ЦРХ еИФП : 32, 5 ± 5, 7%, н = 10; насупрот ЦРХ ЦхР2 : 15, 8 ± 3, 8%, н = 10; П = 0, 0251; т- тест ). ( и ) Процена кретања током теста на отвореном терену. Репрезентативне путање путање локомотора током оптичке стимулације код ЦРХ еИФП (црни) и ЦРХ ЦхР2 (плави) мишеви. Пратећи графикон показује да ЦРХ ЦхР2 мишеви проводе значајно мање времена проведеног у средишњој зони током фотостимулације (ЦРХ еИФП : пре: 3, 9 ± 0, 5%, током: 6, 1 ± 0, 5%. После: 6, 6 ± 0, 9, н = 16; насупрот ЦРХ ЦхР2 : пре : 4.3 ± 1.0%, током: 3.3 ± 0.8%, после: 5.3 ± 0.8%, н = 14; ЦРХ еИФП током насупрот ЦРХ ЦхР2 током, П = 0.0291; двосмерна АНОВА поновљена мера). ( ј ) Репрезентативне парцеле путање локомотора током оптичке стимулације у ЦРХ еИФП (црни) и ЦРХ ЦхР2 (плави) мишеви у тесту новог објекта (зелени облик). Оптичка стимулација смањује истраживање новог предмета мерено латенцијом додира ( к, ЦРХ еИФП : 127, 7 ± 36, 4 с, н = 6; насупрот ЦРХ ЦхР2 : 259, 0 ± 35, 2 с, н = 6; П = 0, 0267; т- тест ) и време проведено у непосредној близини ( л, ЦРХ еИФП : 21, 2 ± 7, 6 с, н = 6; насупрот ЦРХ ЦхР2 : 3, 0 ± 2, 8 с, н = 6; П = 0, 0494; т- тест). Величине: ( б, ц, ф, г ), 20%; * П <0, 05; Бар грешака ± сем

Слика пуне величине

Дискусија

Акутни стрес захтева тренутни бихевиорални и физиолошки одговор 1, 2 . Овде смо комбиновали ћелијско специфично оптогенетско циљање са проценом вишеструког понашања како бисмо показали да ПВН ЦРХ неурони оркестрирају сложен репертоар понашања после акутног стреса. Овај репертоар понашања не захтева ендокрину сигнализацију, већ се ослања на ексцитацијску, глутаматергичку пројекцију на подскуп неурона у перифорничком подручју ЛХ. Надаље, иако су та понашања изузетно осјетљива на околишни околиш, селективна активација ЦРХ неурона може пренаглити околину, што резултира понашањем које се не подудара с контекстом. Ови налази пружају нови оквир за процену понашања након стреса и сугеришу да животиње деескалирају своје понашање након стреса у специфичном обрасцу на који утичу околина и активност неурона ПВН ЦРХ.

ПВН ЦРХ неурони се посматрају као канонски ендокрини контролори реакције на стрес 12, али могу такође регулисати сложена понашања након стреса 16 . Једно од најчешће проучаваних понашања након стреса је неговање 7, а у складу са претходним налазима, приметили смо поуздан пораст младожења након стреса. Уређивање, међутим, било је једно од осам различитих понашања која смо квантификовали. Код наивних животиња таква су понашања била спонтана (то јест, нема спољашњих подражаја) са јасном предрасудом према истраживању окружења ХЦ-а. Након стреса, дошло је до нагле реорганизације постојећих понашања и значајне прерасподјеле времена утрошеног на специфична понашања. Поред повећања неговања, дошло је и до повећања ходања и држања. Ова истраживачка понашања била су очита у раном периоду посматрања, али су нестала у року од неколико минута, што сугерише да могу играти улогу у процени претње након стресног догађаја 5 . Иако су сва три понашања повећана након стреса, фотоинхибиција ЦРХ неурона селективно је смањивала негу и повећала узгој и ходање. У међувремену, фотоактивација ПВН ЦРХ неурона у недостатку стреса није имитирала понашање опажено након стреса, већ је повећало негу и смањило узгој и ходање. Колективно, ова запажања сугеришу да испаљивање ПВН ЦРХ неурона, у недостатку непосредног стреса, може умањити понашање повезано са проценом ризика у корист понашања која су усмерена самима себи. У складу са овом идејом, регрутовање ових ћелија чак и у окружењима која захтевају појачану будност (ново окружење, ФС комора) повећава негу, што сугерише да су ПВН ЦРХ неурони важни у усклађивању одговарајућег понашања са окружењем окружења.

Оптичко регрутовање ЦРХ неурона повећало је циркулирајући ЦОРТ, али ек виво снимци показују да аксони тих ћелија ослобађају глутамат у синапсама у перифорничком подручју ЛХ. Наше двоструко ретроградно обележавање показује да је субпопулација ћелија у ПВН пројектима на обе мете у складу са претходним извештајем да неуроендокрини ЦРХ неурони шаљу разгранате колатерале у суседне хипоталамичке регионе 15 ; it is unclear whether double-labelling of some, but not all, CRH neurons represents an under-sampling of the population because of technical limitations, or whether this suggests that information from a seemingly homogenous population of neurons can be routed to different targets depending on the information being conveyed 29 . Our findings that PVN CRH neurons control behaviour independent of their ability to release hormone, CRH is consistent with previous work demonstrating that CRF knockout mice have a normal grooming following stress 30 . This adds to the growing body of work demonstrating that putative collaterals from neuroendocrine cell populations in the hypothalamus can modulate behaviour 31, 32, 33 ; importantly, we provide one of the first demonstrations that presumptive neuroendocrine cells not only modify, but also drive behaviour selection. This may be part of a larger theme suggesting that hypothalamic circuits participate in behaviours that extend beyond those that are strictly need based or homeostatic 34 . Indeed, it appears that the hypothalamus exerts a bottom up control of complex behaviours 35, 36, 37 and that the CRH neurons play an essential role in shifting behavioural attention away from the environment and towards behaviours that are more internally focused.

Recent efforts to establish causal links between behaviour and underlying neural substrates have been extremely fruitful; here we further these efforts but with an important distinction. Rather than examining a single behaviour in isolation, we took an approach built on observations made by early behaviouralists who commented on individual behaviours as one component of a more complex pattern or ethogram of behaviours in the animal's natural environment 11 . In some aspects, the behavioural ethogram we describe is a broader representation of microstructure of individual behaviours that has recently been demonstrated 38 . These authors conclude that the individual elements of a given behaviour represent a library of physical motifs that can be re-purposed and re-sequenced to generate distinct behaviours. As we did not observe any 'new' behaviours after stress, we would put forward a similar analogy here suggesting that individual behavioural traits are indeed re-purposed into more complex behavioural programmes. Our observations provide evidence for a distinct ethogram following stress that is controlled by PVN CRH neurons. This ethogram is exquisitely sensitive to environment, but this sensitivity is muted by activation of PVN CRH neurons.

New insights gained from approaches that establish causal links between innate behaviour and neural circuits are an important step in furthering our understanding of how the brain controls complex behaviour in a changing environment. They also set the stage for further explorations that use circuit-based approaches to better understand neurodevelopmental and psychiatric disorders 39 . By pinpointing an essential node in the brain for controlling behaviours immediately after an acute stress, our observations provide a new model that can be exploited to better understand the circuit function/dysfunction underlying stress disorders. For example, increased arousal and hypervigilance that persist after a traumatic event could be a consequence of rapid decreases in PVN CRH activity after stress. By contrast, the ability of PVN CRH neurons to dampen the impact of environmental cues suggests that increased activity in this cell population may contribute to stereotyped behaviours linked to psychiatric and neurodevelopmental disorders in which individuals eschew their environmental context and turn their focus towards self-directed or internally focused behaviours. Specifically, intense inward focus is a core feature in autism spectrum disorder, depression and anxiety. In each of these conditions, patients exhibit internally focused behaviours ranging from stereotypies to ruminations to negative thinking. Strikingly, repetitive stereotyped behaviours, particularly following exposure to stressful situations are a cardinal feature of autism spectrum disorder 10 . Recent animal models have directed attention towards the amygdala as a key structure that controls the balance between social and stereotyped behaviour 40, 41, but our findings would suggest an expanded model that incorporates PVN CRH neurons in regulating these behaviours, specifically after stress, is warranted.

Методе

Животиње

All experiments were approved by the University of Calgary Animal Care and Use Committee in accordance with Canadian Council on Animal Care guidelines. Crh-IRES-Cre ( B6(Cg)-Crhtm1(cre)Zjh/J ; stock number 012704) and Ai14 ( B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-TdTomato)Hze/J ; stock number 007914) mice, whose generation has been detailed previously 42, 43, were obtained from Jackson laboratories. Colony maintenance and genotyping was carried out as described previously 17 . For experiments, Crh-IRES-Cre +/+ mice and offspring derived from crosses of homozygous Crh-IRES-Cre and Ai14 genotypes were used. Until the first procedure mice were group-housed, then single-housed on a 12:12 h light/dark schedule (lights on at 07:00 hours) with ad libitum access to food and water.

Injection and implantation

In a stereotaxic apparatus under isoflurane anaesthesia, glass capillaries were lowered into the brain of 6- to 8-week-old Crh-IRES-Cre ; Ai14 mice (anteroposterior (AP), −0.7 mm; lateral (L), −0.3 mm from the bregma; dorsoventral (DV), −4.5 mm from the dura). Recombinant adeno-associated virus (AAV) carrying ChR2-eYFP (Addgene plasmid 20298, pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-eYFP-WPRE-HGHpA; 5 × 10 11 GC per ml; Penn Vector Core), eYFP (Addgene plasmid 20296, pAAV-EF1a-double floxed-eYFP-WPRE-HGHpA; 5 × 10 11 GC per ml; Penn Vector Core) or Arch3.0-eYFP (rAAV2-EF1a-double floxed-eArch3.0-eYFP; 5 × 10 11 GC per ml; UNC Vector Core) was pressure injected with Nanoject II apparatus (Drummond Scientific Company) in a total volume of 210 nl. Mice were allowed to recover at least 14 days before further experiments. For in vivo optogenetic experiments, mono fiberoptic cannulas (Doric Lenses) were stereotactically implanted under similar conditions (for Arch3.0: AP, −0.7 mm; L, 0.0 mm from the bregma; DV, −4.0 mm from the dura, for ChR2 AP, −0.7 mm; L, −0.3 mm from the bregma; DV, −4.0 mm from the dura; for LH stimulation: AP, −1.2 mm L, −1.0 mm from the bregma; DV, −4.2 from the dura). Animals were allowed to recover for a week and handled ca 5 min daily for 4 consecutive days before all behavioural testing.

For neural tracing experiments, 6- to 8-week-old Crh-IRES-Cre ; Ai14 mice were pressure injected with green retrobeads (Lumafluor) as described above (AP, −1.2 mm; L, −1.0 mm from the bregma; DV, −5.2 mm from the dura) in a total volume of 32 nl. One week later, mice received 100 μl ml −1 of fluorogold (4 mg ml -1 ; Fluorochrome) injection iv Mice were killed and processed for immunohistochemistry after one additional week.

Slice preparation and electrophysiology

Three to five weeks post AAV-injection, mice were anaesthetized via isoflurane inhalation and decapitated. Rapidly dissected brains were immersed in slicing solution (0–4 °C, 95% O 2 /5% CO 2 saturated) containing (in mM): 87 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 25 D -glucose, 1.25 NaH 2 PO 4, 75 sucrose. A vibratome (Leica) was used to prepared coronal hypothalamic slices (250 μm thickness), which were transferred for 1+hours before recording in artificial cerebrospinal fluid (32 °C, 95% O 2 /5% CO 2 saturated) containing (in mM): 126 NaCl, 2.5 KCl, 26 NaHCO 3, 2.5 CaCl 2, 1.5 MgCl 2, 1.25 NaH 2 PO 4, 10 glucose. Recordings were performed in artificial cerebrospinal fluid (1 ml min −1 perfusion) at 30–32 °C. The following drugs were applied via perfusion pump: DNQX (10 μM, Tocris), picrotoxin (100 μM, Sigma), 4-aminopyridine (4-AP, 500 μM, Tocris) and tetrodotoxin (TTX) (1 μM, Tocris). PVN/LH neurons were identified using differential interference contrast and epifluorescence optics (UVICO, Rapp Optoelectronics) and a camera (AxioCam MRm) on an upright microscope (Zeiss). Borosilicate electrodes (3–5 mΩ tip) were backfilled with recording solution composed of (in mM) 108 K-gluconate, 2 MgCl 2, 8 Na-gluconate, 8 KCl, 1 K 2 -EGTA, 4 K 2 -ATP, 0.3 Na 3 -GTP, 10 mM HEPES, 10 mg ml −1 biocytin. Signals were amplified (Multiclamp 700B, Molecular Devices), low-pass filtered (1 kHz), digitized (10 kHz, Digidata 1322) and recorded (pClamp 9.2) for offline analysis. After recordings, slices were fixed in 4% paraformaldehyde (PFA; 24 h), incubated with streptavidin-A555 (1:500) and cleared in 50:50 glycerol/tris-buffered saline (TBS), before mounting and confocal imaging.

Optogenetics

For in vitro recordings, a micromanipulator-attached fibre optic cable (105 μm core diameter) delivered light from a laser (for ChR2: 473 nm, OptoGeni 473, IkeCool Corporation; for Arch3.0: 593 nm, IKE-593-100-OP, IkeCool Corporation) was placed 1–2 mm away from the target area. Light intensity was calibrated by a Photodiode Power Sensor (Thorlabs). Maximally, 2.5 or 15 mW light (for ChR2 or Arch3.0, respectively) was delivered to the tissue.

For in vivo experiments, the light source (for ChR2: 473 nm, LRS-0473-GFM, Laserglow Technologies; for Arch3.0: 593 nm, IKE-593-100-OP, IkeCool Corporation) was connected to the implanted ferrule with a fibre optic cable (200 μm core diameter, Doric Lenses). The lasers were controlled with a manually programmable Master 8 unit (AMPI).

Behavioural assessment

Wild-type mice received a series of footshocks (0.5 mA for 2 s, ten times in 5 min; SMSCK, Kinder Scientific) and their activity was video-recorded for 15 min in the footshock chamber, in a novel environment or in the HC immediately after the footshock. For in vivo optogenetics experiments, mice were handled the 4 days preceding behavioural assessment. Blue light was delivered for 5 min (10 Hz, 10 ms pulse width, 15 mW; 473 nm); in LH stimulation experiments, 20 Hz was used. Yellow light (15 mW) was delivered continuously for 15 or 5 min. Behavioural video analysis was conducted by an individual blinded to subject treatment group using a macro in Microsoft Excel. Walking was noted as the animal changed its location or turned as long as the front paws moved. Freezing behaviour was noted if animal showed no movement for at least 3 s, except respiratory movements.

For c-Fos immunolabelling, animals were killed 2 h after light stimulation. For experiments with Arch3.0, after recovery mice were handled for 4 days and HAB to the experimental condition for 3 additional days. After a similar series of footshock, their behaviour was recorded in their HC under continuous yellow light (15 mW) for 15 min. For assessing the involvement of circulating CORT, metyrapone (75 mg per kg, Tocris Bioscience, dissolved in 50 μl polyethylene glycol) was administered ip 60 min before footshock. For circulating CORT level measurements, baseline blood samples were taken from the tail vein at least 2 h before light stimulation. Second sampling was done 15 min after the onset of light stimulation. CORT level was measured using an ELISA kit (Arbor Assays). To investigate social cues bedding was not replaced in the HC of mice for 10 days prior testing. Experiment subjects were at the age of 16 weeks while conspecific males were 7 weeks old.

Имунохистохемија

To prepare fixed brain tissue, mice were anaesthetized with sodium pentobarbital (30 mg kg −1 ) and transcardially perfused with phosphate-buffered saline, followed by 4% PFA in phosphate buffer (4 °C). Brains were placed in PFA 24 h followed by 20% sucrose phosphate buffer. 30 μM coronal brain sections were obtained via cryostat in three series. Rinses were performed before/between incubations with TBS containing triton (TBSt; pH 7.4, with 0.1% Triton X-100), blocking solution (5% normal donkey serum in TBSt) was pre-applied for 1 h and used in subsequent antibody incubations. Rabbit anti-c-Fos Ab5 (1:10, 000 dilution; overnight at room temperature; Calbiochem) primary antibody or rabbit anti-fluorogold (1:10, 000, overnight at room temperature; Chemicon) was used. For fluorogold and c-Fos labelling, biotinylated donkey anti-rabbit secondary antibody (1:500; Jackson ImmunoResearch) and DyLight-405-conjugated streptavidin were used (1:500; Jackson ImmunoResearch) in Crh-IRES-Cre;Ai14 animals, whereas in Crh-IRES-Cre animals, Alexa-555-conjugated donkey anti-rabbit (1:500; Molecular Probes) was utilized. Slide-mounted and coverslipped sections were imaged using a confocal microscope (Olympus BX50 Fluoview and Nikon D-Eclipse C1). For c-Fos assessment, we included the entire rostral-caudal extent of one side of the PVN and the region around the fornix. Immunolabelled nuclei were counted using ImageJ.

Analysis and statistics

Where quantification was made, data are represented as mean±standard error of the mean (sem). Statistical analysis was performed in GraphPad Prism 6 using paired and unpaired Student's t -test to for two group comparisons, whereas repeated measures one-way and two-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison post-hoc test for sequential treatment data. P values less than 0.05 were considered significant.

Доступност података

The data that support the findings of this study are available from the corresponding author upon request.

Додатне Информације

How to cite this article: Füzesi, T. et al. Hypothalamic CRH neurons orchestrate complex behaviours after stress. Нат. Commun. 7:11937 doi: 10.1038/ncomms11937 (2016).

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Додатне информације

    Supplementary Figures 1-12

Видео

  1. 1.

    Допунски филм 1

    Behavior of CRHeYFP control mice after stress

  2. 2

    Допунски филм 2

    Photoinhibition of PVN CRH neurons disrupts behavioral repertoire after stress

  3. 3.

    Допунски филм 3

    Photostimulation of PVN CRH Neurons initiate grooming

  4. 4.

    Допунски филм 4

    Behavior in novel environment after stress exposure

  5. 5.

    Допунски филм 5

    Behavior in unsafe environment after stress exposure

Коментари

Подношењем коментара пристајете да се придржавате наших Услова и Смерница заједнице. Ако нађете нешто злоупотребно или то није у складу са нашим условима или смерницама, означите то као непримерено.