Идентификација и функционална карактеризација ретких варијанти стене2 код схизофреније | молекуларна психијатрија

Идентификација и функционална карактеризација ретких варијанти стене2 код схизофреније | молекуларна психијатрија

Anonim

Субјекти

  • Генетика

Апстрактан

Недавни генетски подаци о шизофренији (СЦЗ) сугеришу да протеини постсинаптичке густине ексцитацијских синапси имају улогу у његовој етиологији. Мутације у три СХАНК гена који кодирају протеине постинаптичког скела представљају фактори ризика за поремећаје спектра аутизма и друге неуроразвојне поремећаје. Да бисмо решили да ли су варијанте СХАНК2 повезане са СЦЗ, секвенционирали смо СХАНК2 код 481 пацијента и 659 особа које нису погођене. Идентификовали смо значајно повећање броја ретких (мања фреквенција алела <1%) варијанти заблуде СХАНК2 код појединаца са СЦЗ (6, 9%) у поређењу са контролама (3, 9%, П = 0, 039). Четири од петнаест не-синонимних варијанти идентификованих у СЦЗ кохорти (С610И, Р958С, П1119Т и А1731С) изабране су за функционалну анализу. Експерименти прекомерне експресије и спасавања су изведени на култивираним примарним хипокампалним неуронима са главним фокусом на анализи морфолошких промена. Даље, испитан је утицај на полимеризацију актина у ћелијским линијама фибробласта. Све четири варијанте откриле су функционално оштећење до различитих степена, као последица промене волумена кичме и групирања у синапсама и укупног губитка пресинаптичких контаката. Варијанта А1731С идентификована је код четири неповезана пацијента са СЦЗ-ом (0, 83%), али не у ниједној од секвенцираних контрола и јавних база података ( П = 4, 6 × 10 -5 ). Пацијенти са варијантом А1731С деле рану продромалну фазу са безопасним појавом психијатријских симптома. Прекомјерна експресија А1731С снажно је смањила број синапске позитивне СХАНК2-фагосове фазе и умањила однос Ф / Г-актина. Наши резултати снажно указују на узрочну улогу ретких варијанти СХАНК2 у СЦЗ и подвлаче допринос мутација гена СХАНК2 у разним неуропсихијатријским поремећајима.

Увод

Шизофренија (СЦЗ) је сложен ментални поремећај. Према ДСМ-у (Дијагностички и статистички приручник менталних поремећаја), карактеришу га заблуда, халуцинације, неорганизован говор, грубо дезорганизовано или кататоничко понашање и негативни симптоми. Његова животна преваленција у свету износи око 1%. 1 Генетски, СЦЗ је хетерогени наследни поремећај. 2 Студије удруживања широм генома, 3, 4, 5, 6, 7, 8 анализа варијације броја копија (ЦНВ) 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и екоме - Студије 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 које су уследиле прецизно су одредиле лоцисе и гене повезане са СЦЗ. Велики део повезаних гена укључен је у стварање, функцију и пластичност ексцитаторне синапсе.

Породица протеина СХАНК састављена је од три протеина са вишеструким скелама који остају на постсинаптичкој густини ексцитацијских глутаматергичних синапси. 28, 29 СХАНК протеина је познато да формирају велике хомомерне и хетеромерне комплексе. Многобројним специфичним интеракцијама протеин-протеин, СХАНК-ови су директно или индиректно повезани са другим структуралним протеинима, молекулама ћелијске адхезије, рецепторима, јонским каналима и са протеинима који делују на протеин-пост-синтетичку густину. 30 Мутације сва три члана породице СХАНК, СХАНК1-3, већ су повезане са неуроразвојним поремећајима попут поремећаја спектра аутизма (АСД) или интелектуалног онеспособљавања (ИД). 31, 32, 33, 34

Недавно постоје докази за генетско и биолошко преклапање између АСД и СЦЗ. Поред тога, може постојати даље преклапање са другим неуропсихијатријским поремећајима у зависности од генетске позадине и изложености факторима ризика животне средине. 35 За АСД и СЦЗ изгледа да су погођени исти путеви и мреже, који се конвергирају у ексцитацијске синапсе, што можда утиче на синаптичку пластичност. Како је неколико синаптичких протеина попут неурексина и неуролигина партнери за интеракцију СХАНК-ова и повезани са оба поремећаја, поставља се питање могу ли варијанте у самим СХАНК генима бити повезане са СЦЗ.

До сада је објављено да су уобичајене варијанте гена СХАНК1 повезане са смањеном слушном радном меморијом у СЦЗ 36, а ретка де ново мутација губитка функције која утиче на СХАНК1 недавно је пронађена у великој студији секвенцирања екоме. 21 Поред тога, идентификоване су две нове СХАНК3 мутације у кохорти од 185 СЦЗ појединаца (Р536В, Р1117Кс). 37 Превелика експресија варијанте Р1117Кс у неуронима хипокампуса довела је до накупљања мутираних протеина у језгру неурона, мењајући транскрипцију неколико гена ризика од СЦЗ-а, као што су Синаптотагмин 1 и ЛРРТМ1 . 38 Ови налази пружили су прве доказе да СХАНК гени заиста могу допринети етиологији СЦЗ-а.

У овој студији фокусирали смо се на СХАНК 2, једини члан породице СХАНК за који до сада није забележено повезаност са СЦЗ-ом. Мутације СХАНК2 идентификоване су код пацијената са ИД и АСД. 32, 34, 39 Доступна су два различита СХАНК2 модела миша који приказују промене у Н- метил-Д-аспартат рецептури глутамата (НМДАР) 40, 41 и постоје добри докази да би НМДАР сигнализација могла бити ослабљена у СЦЗ. 42 Поред тога, недавне ЦНВ анализе и студије секвенцирања екоме код пацијената са СЦЗ извештавају о обогаћењу де ново мутација код чланова сигналног комплекса НМДАР. 14, 21

Стога је циљ наше студије био идентификовати варијанте гена СХАНК2 у пацијенткиној кохезији СЦЗ-а, анализирати њихов утицај на функционалном нивоу и утврдити могућу повезаност са СЦЗ-ом. У том циљу, секвенцирали смо ген СХАНК2 код 481 пацијента са СЦЗ-ом и у 659 контролних група. На основу поређења са нетакнутим контролама, фреквенцијама мутације и резултатима предикције силикона, изабрали смо четири варијанте заблуде за даље функционо тестирање.

материјали и методе

Изјава о етичности

Студију су одобриле Етичке комисије универзитета у Хеиделбергу и Бонну, Немачка.

Пацијенти

Узорак је обухватио 481 случај (275 мушкараца и 206 жена; просечна старост = 32, 6 + 10, 4 године) извучених из узастопних пријема на болничке психијатријске јединице у Немачкој. Укупно 403 случаја су испунили дијагностичке критеријуме ДСМ-ИВ (ДСМ, четврто издање) за СЦЗ, 71 за шизоафективни поремећај и 7 за схизофрениформни поремећај. Дијагностичка процјена укључивала је најбољи приступ процјени и Интервјуе за психијатријске генетске студије (ИПГС), свеобухватан попис за карактеризацију фенотипа. 43 ИПГС садржи: (и) структурирани клинички интервју за ДСМ-ИВ поремећаје; (ии) Листа оперативних критеријума за програм психотичних болести; 44 (иии) преглед медицинске документације и (ив) породична анамнеза. Нашу групу чинили су чисто шизофрени пацијенти (према дијагностичким критеријумима ДСМ-ИВ да поремећај није последица општег здравственог стања). Пацијенти са менталном ретардацијом, који би могли збунити дијагнозу СЦЗ-а, били су искључени из кохорте. Сви испитаници су били немачког порекла. Сви учесници су информисани о студији и дали су писмени информирани пристанак пре укључења у студију. Узорци четири особе са варијантом А1731С подвргнути су генотипизацији на нивоу генома као део веће студије. Користећи ове податке, израчунати су резултати идентитета по држави за геном. Одговарајуће оцјене идентитета по појединим државама су <1, 65, што указује да не постоји блиски биолошки породични однос између било које двије јединке. Кратки клинички извештаји за ове особе доступни су у Додатним информацијама 1. Као контрола коришћена је ДНК особа које нису погођене европским пореклом. 32

Секвенцирање

Секвенцијални прајмери ​​који покривају СХАНК2-СХ3 изоформу су претходно описани (допунска табела 1). 32 ПЦР амплификације изведене су са Пак5000 полимеразом (Стратагене, Ла Јолла, Калифорнија, САД) или са Екпанд Хигх Фиделити ПЦР системом (Роцхе, Маннхеим, Немачка). Генерисани производи су анализирани на агарозним геловима, пречишћени и секвенционисани директно коришћењем комплета за поистовећивање циклуса циклуса ДИЕнамиц ЕТ (ГЕ Хеалтхцаре, Минхен, Немачка) и МегаБАЦЕ 1000 система за анализу ДНК (ГЕ Хеалтхцаре).

Анализа података

Извршен је једноставан тест оптерећења за ретке СХАНК2 варијанте погрешне вредности са мањом фреквенцијом алела <1%, упоређујући њихову акумулирану учесталост у случајевима СЦЗ и контролама. Подаци су анализирани са статистичким програмом БИАС за Виндовс, користећи двострани тест χ 2 са Иатес корекцијом (Универзитет у Франкфурту / Маинз, Маинз, Немачка). Поред тога, тест заснован на ВЕГАС-у 45 примењен је на СЦЗ2 скуп података Псицхиатриц Геномицс Цонсортиум (пуни резултати нуклеотидног полиморфизма (СНП), //ввв.мед.унц.еду/пгц/филес/ресултфилес /сцз2.снп.ресултс.ткт.гз%20%20). Тест истражује доказе о повезаности на основи гена узимајући у обзир П- вредности свих СНП-а за сваки ген, укључујући 50 кб од 5 'и 3' УТР, узимајући у обзир број СНП-а по гену и неједнакост везе између маркера . Све варијанте заблуде СХАНК2 идентификоване код пацијената са СЦЗ-ом анализиране су различитим програмима предвиђања (МутатионТастер, ПолиПхен2, СИФТ; Додатна табела 2, децембар 2011). Програми предвиђања временом су се мењали и исход је био мало другачији у марту 2014. (Додатна табела 3). Варијанта А1731С је процењена за потенцијалне измене спајања помоћу Аламут Висуал Софтваре (Интерацтиве Софтваре, Роуен, Француска), који садржи алгоритме СплицеСитеФиндер, МакЕнтСцан, ННСПЛИЦЕ, ГенеСплицер, Финдер за спајање људи, ЕСЕ-Финдер и РЕСЦУЕ-ЕСЕ.

Конструкције плазмида

Сви конструкти СХАНК2 су клонирани у пЕНТР векторима (Инвитроген, Царлсбад, ЦА, УСА). пЕНТР2Б-СХАНК2-СХ3 ВТ је генерисан у нашој лабораторији. 46 пЕНТР2Б-СХАНК2-СХ3 С610И, Р958С, П1119Т и А1731С су генерисани коришћењем КуикЦханге Лигхтнинг Сите мутагенесис Кит (Стратагене). Кодирање секвенце сваког клона је секвенционирано да би се потврдила уведена мутација и искључила додатне нежељене мутације. Описани клонови изоформних СХАНК2Е створени су модификовањем одговарајућег пЕНТР2Б-СХАНК2-СХ3 плазмида коришћењем СЛиЦЕ система клонирања. 47 Све ПЦР амплифициране регије у конструктима су секвенциониране. Сханк3 је субклониран из експресионе конструкције пГВ1-ХА-Сханк3 (поклон др Ц Сала) у пЕНТР3Ц. 48 СХАНК експресијских конструката генерисано је преношењем на одговарајуће ДЕСТ векторе коришћењем Гатеваи рекомбинантне технологије (Инвитроген). Детаљан опис поступака клонирања и потпуни списак свих коришћених ДЕСТ вектора представљен је у Додатним информацијама 2. Претходно су описани мали РНА конструкти за шишање. 46 Конструкција пГФП (Ц3) -Винкулина генерисана је у лабораторији К. Хахн (Аддгене, Цамбридге, МА, УСА, Пласмид 30312). РФП-актински конструкт је био великодушан поклон Др У Енгела (НИЦ, Хеиделберг, Немачка).

Ћелијска култура и трансфекција

Ћелије ЦОС-7 и ХЕК293 су одржаване у ДМЕМ медијуму (ГИБЦО, Царлсбад, ЦА, САД) са додатком 10% серума фетуса телета, 1 м М глутамина, 100 У мл -1 пеницилина и стрептомицина. Ћелије су трансфициране липофектамином 2000 (Инвитроген) према упутствима произвођача.

Протеин, антитела и западна мрља

Изолација протеина и Вестерн блот анализа изведени су коришћењем стандардних протокола. Користили смо следећа примарна антитела: мишји анти-Сханк2 (УЦ Давис / НИХ НеуроМаб Фацилити, Давис, ЦА, САД), зечји анти-актин (Цитоскелетон, Денвер, ЦО, УСА) и зечји анти-ГАПДХ (Абцам, Цамбридге, УК) ). ИРДие 800ЦВ и ИРДие 680 (ЛИ-ЦОР Биосциенцес, Линцолн, НЕ, УСА) служили су као секундарна антитела. Сви поступци квантификације западног блот опсега изведени су коришћењем софтвера Имаге Студио Лите 3.1 (ЛИ-ЦОР Биосциенцес).

Замишљање и квантитативне анализе морфологије краљежнице и дендритичких обрана гранања

Дисоцирани примарни хипокампални неурони од штакора су припремљени и трансфицирани како је описано. 46 Да би се утврдио утицај на волумен кичме, мЦхерри-СХАНК2-СХ3 конструкти су кофефицирани ГФП-ом 10 дана ин витро (ДИВ) и обрађени за конфокалну микроскопију на 18 ДИВ. З-стак слике високе резолуције ГФП-позитивних неурона снимљене су са × 63 циљем конфокалног ласерског скенирајућег микроскопа (Царл Зеисс, Јена, Немачка). Снимање је обавила друга независна особа која је била слепа за статус узорака који контролира случај. Неурони који показују пирамидалну морфологију и позитивни су на одговарајуће маркере флуоресценције изабрани су насумично, а количине кичме су накнадно анализиране помоћу Фиџи софтвера. Нивои интензитета сигнала сваког конструкта били су слични, искључујући могућност ефеката ефикасности трансфекције. Да бисмо истражили дендритичке узорке гранања, снимили смо флуоресцентне слике насумично изабраних неурона са усправним Ни-Е микроскопом (Никон, Токио, Јапан), опремљеним Никон План Апо λ к20 циљем и ДС-Ки1Мц камером (Никон). За дигитализацију и анализу дендритне морфологије користили смо програм „Бонфире“ према његовом приручнику. 49

Квантитативна анализа хипокампних неурона штакора за анализу синаптичке густине

Примарни неурони хипокампала из ембрионалног дана 18/19 дана (Е18 / 19; штакори Спрагуе-Давлеи, Анимал Фацилити, Универзитет Улм или ЈАНВИЕР ЛАБС, Француска) припремљени су и узгајани како је описано другде. 40 После 14 дана ин витро (ДИВ14), неурони су трансфектовани са 1 µг ДНК по лежишту (30 000 ћелија по лежишту). Ћелије су фиксиране на ДИВ15 са 4% параформалдехидом, испране физиолошком отопином фосфатом и третиране Тритон Кс-100 и фетални телећи серум (алтернативно коњски серум и БСА) за пермеабилизацију и блокирање, респективно. Имуностање је извршено антитело-фазоновим антителом (1: 500–1: 800) и одговарајућим другим антителом. За обојење језгара коришћен је 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол. Слике насумично изабраних трансфектираних неурона са пирамидалном ћелијском морфологијом и нетакнутим језгром узела је друга особа флуоресцентним микроскопом при увећању к40 и ћелије су анализиране софтвером Акиовисион (Царл Зеисс). За синаптичко кластерирање СХАНК2, рачунали смо да се СХАНК2 пунцта коокализује са фаготом уз> 1 дендрит. За пресинаптичку густину рачунали смо Бассоон пунцта уз> 1 дендрит. Значајке су процењене Студентовим т- тестом са 10–17 ћелија по стању од две до четири припреме. П- вредности <0, 05 су наведене значајне (* П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001).

Живо снимање ћелија

Користили смо четвероножне Лаб-Тек ИИ коморе (Сигма-Алдрицх, Ст Лоуис, МО, САД) напуњене опти-МЕМ медијумом (ГИБЦО) допуњеним 10% феталним телећим серумом и 1 мМ глутамином за семе ЦОС-7 ћелија са густином. од 15 000 ћелија по бунару. Следећег дана ћелије су трансфициране липофектамином 2000. После 24 сата инкубације, добијање слике је извршено помоћу инвертираног Ти микроскопа (Никон, Дусселдорф, Немачка) опремљеног широкопојасном флуоресценцијом и објективним укупним светлошћу флуоресценције унутрашње рефлексије (ТИРФ). Током снимања, ћелије су задржане у инкубацијској комори на стадијуму (ТокаиХит, Схизуока-кен, Јапан) са контролом температуре, концентрације ЦО 2 и влажности. Користили смо Никон Апо ТИРФ к60 нумерички отвор 1, 49 објективи (Никон), подесив по дебљини / температури и Андор иКсон3 ДУ-897 ЕМЦЦД камеру за детекцију појединачних фотона (Андор Тецхнологи, Белфаст, Велика Британија) или Оцра АГ камеру (Хамаматсу Пхотоницс, Схизуока, Јапан) .

Однос Ф- према Г-актину

Однос Ф- према Г-актину мерен је комплетом за испитивање полимеризације актина (БК037, цитоскелет) у складу са приложеним упутством. ХЕК293 ћелије су трансфициране са СХАНК2 конструктима у пЦС2-ДЕСТ вектору без ознаке и РФП-актину. После 2 дана инкубације, ћелије су поново суспендоване у стабилизацијском пуферу Ф-актина који садржи смешу инхибитора протеазе и 1 мМ АТП. Ф-актин је гранулиран центрифугирањем на 100 000 г / 37 ° Ц током 60 минута (Оптима ЛЕ-80 к Ултрацентрифуга, СВ55Ти ротор, Бецкман Цоултер, Бреа, ЦА, САД). Квантификација актина изведена је Вестерн блотом користећи обезбеђено зечје анти-актин антитело (цитоскелет) и секундарно анти-зечје ИРДие 800ЦВ антитело (ЛИ-ЦОР Биосциенцес). Интензитети опсега Ф- и Г-актина одређени су коришћењем Одисејевог инфрацрвеног система за обраду слика (ЛИ-ЦОР Биосциенцес). Вредности Ф- и Г-актина за СХАНК2Е ВТ и СХАНК2Е А1731С су нормализоване на ниво експресије СХАНК2 коришћењем података из додатног експеримента Вестерн блот са анти-Сханк2 и анти-ГАПДХ антителома.

Резултати

СХАНК2 протеин садржи различите функционалне домене, укључујући Н-терминални анкинрин понављање, Срц хомологију 3 (СХ3), ПСД95 / ДЛГ / ЗО1 (ПДЗ) и стерилни алфа мотив Ц-терминала, који постоје у различитим комбинацијама у различитим изоформама (Слика 1а). Описане су четири различите изоформе: СХАНК2Е (АБ208025), СХАНК2-СХ3 (АБ208026), СХАНК2-ПДЗ (АБ208027) и СХАНК2-Схорт (АФ141901). 27

Image

Варијанте заблуде СХАНК2 идентификоване код особа са шизофренијом (СЦЗ). ( а ) Четири различите хумане изоформе СХАНК2 СХАНК2Е (АБ208025), СХАНК2-СХ3 (АБ208026), СХАНК2-ПДЗ (АБ208027) и СХАНК2-Схорт (АФ141901) приказане су са положајима погрешних мутација утврђених код пацијената са СЦЗ. Наведени су различити домени протеина, почевши од понављања анкирина у Н-терминалу, затим СХ3 (Срц хомологија 3), ПДЗ (постинаптичка густина 95 / дискови велики / зона оклудеенс-1) и Ц-терминални САМ (стерилни алфа мотив) домен. Варијанте одабране за функционалну анализу означене су црвеном бојом; АА, аминокиселина. ( б ) СХАНК2 варијанте заблуде које се налазе само код пацијената са СЦЗ. Геномске позиције су дате према ГРЦх37 / хг19 склопу а АА положаји одговарају НП_036441.2 секвенци. Ж, женски, м, мушки, на, нема доступних података. С / М, преношење са мајке на сина.

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Да бисмо идентификовали генетичке варијанте у СХАНК2 , секвенционирали смо егзоне, укључујући границе егзона-интрона СХАНК2-СХ3 изоформе, користећи геномску ДНК изоловану од 481 пацијента са СЦЗ-ом (од 177 појединаца родитељска ДНК и родитељске клиничке информације су доступне) и 659 контролних контрола. Укупно смо идентификовали 10 интроничних, 12 синонимних и 15 не-синонимних варијанти (допунска табела 3). Укупан број варијанти погрешног слагања у СЦЗ и контролној групи био је упоредив (Додатна табела 4). Када смо анализирали учесталост ретких варијанти погрешног слабљења (мања фреквенција алела <1%) код СЦЗ и контролних појединаца, 6, 9% СЦЗ пацијената (33/481) и 3, 9% контролних група (26/659) идентификовани су као носиоци, указујући на већа учесталост ретких варијанти заблуде СХАНК2 у СЦЗ ( П = 0, 039, χ2 тест са Иатес корекцијом; Додатна табела 5). Особе СЦЗ-а из наше студије такође су имале већу фреквенцију (3, 6%, 17/466) ретких, вероватно штетних варијанти (ПолиПхен2) у односу на контроле (2, 5%, 27/1063).

Када смо тестирали повезаност гена СХАНК2 у највећем истраживању асоцијације на читавом СЦЗ геному до сада, 3 је резултирала значајном П- вредношћу ( П = 0, 012), што указује и на допринос уобичајених варијанти СХАНК2 у СЦЗ етиологији. За анализу су узете у обзир 244 СНП-а. СНП са најбољом П- вредношћу (рс11236491, П = 0, 00012) се налазио у интрону гена.

Десет од петнаест варијанти погрешног испитивања код појединаца СЦЗ-а догодило се искључиво у групи пацијената, али не и у једној од секвенцираних контрола. Пет варијанти је наслеђено (Т438М, П1144Л, В1608И, Л1646М, А1731С, слика 1б), све са преношењем од наизглед неизређене мајке на сина шизофреног. Статус наслеђивања преосталих варијанти (Г488В, С610И, Н690С, Р958С, П1119Т, слика 1б) није могао да се утврди због недостатка матичне ДНК. Све у свему, открили смо ретке нове СХАНК2 варијанте заблуде код 2, 7% СЦЗ појединаца. Шизофренични подтип ових особа са варијантама СХАНК2 варирао је: шест пати од параноида, четири од дезорганизованих, једно од кататоничног, једно од резидуалног подтипа, а једно је класификовано са шизофактивним поремећајем (допунска табела 6 и додатне информације 1).

Најчешћа варијанта СХАНК2 у нашем истраживању била је размена аминокиселина А1731С, која је идентификована код четири неповезана пацијента са СЦЗ-ом, једина ретка варијанта идентификована више пута. Наследила га је од наизглед здравих родитеља код два од четири пацијента. Варијанта А1731С се појавила у 0, 83% СЦЗ појединаца и није откривена у 5338 контрола (ХЕВС н = 4300, ТГП н = 379, секвенциране контроле н = 659). На серверу варијанте Хуман екоме, овај регион има добру покривеност секвенци (67к) и зато овај скуп података сматрамо одговарајућом контролом. Упоређујући фреквенције између случајева СЦЗ и контрола, открили смо значајну разлику ( П = 4, 6 × 10 -5 ; двострани Фисхеров тачан тест) за А1731С.

Да бисмо одговорили на функционални значај, анализирали смо четири новооткривене варијанте СХАНК2 (С610И, Р958С, П1119Т и А1731С). Три од њих (С610И, Р958С и П1119Т) изабрана су јер су имали највећу очекивану вероватноћу за функционални ефекат три различита алата за предвиђање силикона (МутатионТастер, ПолиПхен2 и СИФТ; Додатна табела 2). Варијанта П1144Л није разматрана, упркос високом резултату предвиђања, јер се налази у близини П1119Т, а промена физикално-хемијских својстава је мање озбиљна. На нивоу секвенци, очување погођене позиције аминокиселина је главни параметар који утиче на резултат предвиђања помоћу коришћених алата. Поред тога, предвиђања заснована на структури узимају у обзир физичко-хемијске карактеристике аминокиселина и утицај дате супституције на структуру и својства протеина. Иако се предвиђало да је варијанта А1731С бенигна с неколико (али не свих) програма предвиђања, изабрана је због њене поновљене појаве код пацијената са СЦЗ-ом и непостојања контрола. На спајање није утицао А1731С као што је то предвиђало неколико алгоритама предвиђања места спајања софтвера Аламут.

Три одабране варијанте (Р958С, П1119Т, А1731С) налазе се у три главне СХАНК2 изоформе (СХАНК2Е, СХАНК2-СХ3 и СХАНК2-ПДЗ) које су већ потврђене на нивоу протеина (Слика 1а). Варијанта С610И не постоји у СХАНК2-ПДЗ нити СХАНК2-Схорт изоформама, али се локализује у високо очуваном региону између СХ3 и ПДЗ домена и додатно је пронађена код појединца са ИД из претходне студије. 32

У првом кораку смо клонирали експресијске конструкције за дивљи тип СХАНК2 и варијанте са Н-терминалном фузијом мЦхерри која одговара СХАНК2-СХ3 изоформи (слика 2а). Прекомерна експресија различитих конструката у ћелијама ХЕК293, праћена анализом Вестерн блот-а са примарним антителом специфичним за СХАНК2, открила је идентичну величину протеина дивљих врста и мутанта (слика 2а). Да бисмо проучили ефекте варијанти СХАНК2 на морфологију примарног хипокампалног неурона, кофефицирали смо четири варијанте и дивљу врсту конструкције вектором експресије ГФП-а за пуњење целих ћелија (Слика 2б). Конфокална микроскопија помоћу ласерског скенирања коришћена је за добијање з-стак слика мЦхерри- и ГФП-позитивних неурона за мерење интензитета флуоресценције ГФП-а унутар дводимензионалних пројекција, што нам је заузврат омогућило да израчунамо релативне количине кичме. Прекомерна експресија дивљег типа СХАНК2-СХ3 значајно је повећала волумен кичме, у поређењу са неуронима који су трансфицирани ГФП и празним мЦхерри-вектором (Слика 2ц). Две од четири варијанте, С610И и П1119Т, нису повећале волумен кичме у сличној мери као дивљи тип СХАНК2 (слика 2ц), што указује на нарушавање функције протеина. Такође смо измерили густину кичме и разгранавање дендритичке шупљине. Да бисмо утврдили сложеност дендритичне лучице, урадили смо Схолл анализу и анализирали укупан број тачака гранања и крајњих тачака као и укупну дужину неурита по неурону. Све тестиране четири варијанте нису показале значајне разлике у односу на дивљи тип СХАНК2, што сугерише да густина кичме и разгранавање дендрита нису утицали (допунске слике 1 и 2).

Image

Функционална анализа мутација СХАНК2 у примарним неуронима хипокампала. ( а ) СХАНК2 дивљег типа и мутантне конструкције (С610И, Р958С, П1119Т, А1731С) конструкције као Н-терминалне мЦхерри фузије. Анализа Вестерн блот-а у ћелијама ХЕК293, која показује величине различитих конструката. ( б ) Репрезентативни хипокампални неурони који су заражени ГФП и мЦхерри-СХАНК2-дивљим типом (ВТ) или мЦхерри-мутантима. ( ц ) Квантификација релативног дендритичног волумена кичме и густине кичме у примарним неуронима хипокампала прекомерно изражавајући различите конструкције СХАНК2. ( д ) Спашавање кноцкдовн-а Сханк2. Људски СХАНК2 дивљи тип протеина нормализује волумен кичме у Сханк2 нервозу, док су СХАНК2-С231И и П740Т мутант изгубили ову способност. Није примећен ефекат на густину кичме. Све вредности су приказане као средња ± стандардна девијација. Поређење средњих разлика између група извршено је двосмерном анализом теста варијансе, укључујући различите услове и контролисање реплика, а затим Сцхеффеов пост-хоц тест. ** П .010.01, *** П 0.001; ( ц и д ; н = 3 експеримента, 18 неурона за свако стање).

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Затим смо истражили способност СЦЗ мутаната да спасе морфолошке ефекте пропадања Сханк2 у примарним хипокампалним неуронима користећи претходно дизајнирану и потврђену малу РНА длаку против штакора Сханк2. 46 Почетни Сханк2 експеримент обрушавања открио је смањење волумена кичме, као и помак превладавајуће морфологије кичме са зрелих гљива на незреле, танке и сличне филоподији. Поред тога, приметили смо пораст дендритичког гранања, али без утицаја на густину кичме, као што је претходно описано. 46 Четири различита мутанта СХАНК2 и конструкти дивљег типа били су кофефицирани да би се спасио фенотип уништавања Сханк2. Мутанти С610И и П1119Т показали су значајно смањену способност спашавања малог волумена дендритичке кичме изазване укосницом у поређењу са дивљим типом СХАНК2 (слика 2д).

Да би се истражило да ли мутанти СХАНК2 идентификовани код појединаца са СЦЗ утичу на синаптичко групирање и контакте, имунолошка обојења са пресенаптичким маркером Фагот изведена су у примарним неуронима хипокампала (слика 3а). Накнадно је кокалокација Бассоон пунцта са мЦхерри-СХАНК2 дивљим типом и мутантима на синаптичким контактима квантификован. Прекомерна експресија различитих варијанти СХАНК2 показала је значајно смањење рекомбинантног кластерирања СХАНК2 у синапсама за све варијанте (Слика 3б). Приметили смо општи губитак пресинаптичких контаката који су достигли трансфектиране ћелије за све четири варијанте, што је откривено значајним смањењем фаготних пункта дуж дендрита (слика 3ц). Међутим, ефекат није примећен у омјеру СХАНК2 који садржи синапсе и фагот фактор дуж дендрита (слика 3д). Најјачи ефекат уз значајно смањење броја фагосона-позитивних синапси дуж дендрита утврђен је за варијанте Р958С и А1731С (слика 3б). Најјачи губитак пресинаптичких контаката примећен је за варијанту С610И (слика 3ц). Заједно, ови резултати сугеришу да прекомерна експресија све четири тестиране варијанте СХАНК2 у примарним неуронима хипокампала доводи до поремећаја синаптичког групирања и укупног губитка синаптичких контаката.

Image

Мутант конструкције СХАНК2 доводе до смањења пресинапса и до мање мутираних протеина локализованих у синапсама. ( а ) Хипокампни неурони штакора ДИВ14 трансфицирани су преко ноћи дивљим типом и мутираним мЦхерри конструктима ПроСАП1 / Сханк2 (црвена). Пресинапси су имуностанирани анти-фаготом (бели), језгра су визуализована са ДАПИ (плава). Ваге (зелене) представљају 20 µм. Стрелице означавају заједничку локализацију сигнала СХАНК2 и фагота. ( б ) Анализа мЦхерри-СХАНК2 фагонапозитивних синапси по декритској дужини од 10 µм. ( б, ц ) Грешке грешака представљају сем-значајну анализу са Студент-овим т- тестом са следећим П- вредностима: *** П <0, 001, ** П <0, 01, * П <0, 05. н ≥10 неурона из ≥2 препарата. ( ц ) Пребројавање фагонских пункта који достижу дендрите (по 10 µм). ( д ) Удео мЦхерри-ПроСАП1 / Сханк2-Фагона-позитивних синапси у фазону бассоон пунцта дуж дендрита (1 је једнак 100%).

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Пошто су чланови породице СХАНК и њихови партнери за интеракцију укључени у динамику актина у неуронима, друга кључна тачка наше студије била је истражити да ли различите варијанте СХАНК2 утичу на актинске структуре. 50, 51, 52, 53 Стога смо прекомерно експримирали СХАНК2-СХ3 заједно са РФП-актином у ћелијама ЦОС-7 и користили Сханк3 као контролу, јер се зна да се локализује до врха актинских филамената. 54 Ми смо користили ТИРФ микроскопију живе ћелије да бисмо посматрали локализацију коришћених конструката. СХАНК2-СХ3 протеин формирао је унутарћелијске агрегате различитих величина и није се локализовао на врховима актинских влакана. Узимајући у обзир сличност у редоследу између највеће СХАНК2 изоформе СХАНК2Е и Сханк3, одлучили смо да прекомерно изразимо СХАНК2Е. За разлику од Сханк3, приметили смо компактне агрегате СХАНК2Е који окружују врхове активних влакана (слика 4а). Даље, протеин СХАНК2Е био је смештен у близини маркеру фокалне адхезије винкулин, што сугерише могућу интеракцију са протеинима који покривају кап, који контролишу раст актинских филамента и стварање филоподије (Слика 4б). 55 Након тога увели смо четири различите варијанте у изоформе СХАНК2-СХ3 и СХАНК2Е (допунска слика 3), али нисмо добили очигледно другачију локализацију у поређењу са протеинима дивљег типа. Коначно, урадили смо тест полимеризације актина да квантификујемо однос филаментог (Ф) према глобуларном (Г) актину у ћелијама ХЕК293. Занимљиво је да је само варијанта А1731С у нашим експериментима указала на смањени однос Ф / Г-актина (Слика 4ц), што сугерише оштећење полимеризације актина. Ово оштећење вероватно може бити повезано са снажним смањењем синаптичких контаката примећеним за варијанту А1731С.

Image

Анализа ефекта СХАНК2 дивљег типа и мутаната на актинске структуре и полимеризацију. ( а ) ИФП-СХАНК2Е, ИФП-СХАНК2-СХ3 и ИФП-Сханк3 дивљи тип су кофефицирани заједно са РФП-актином у ћелије ЦОС-7. Представљене су слике епифлуоресценције живих ћелија и ТИРФ слике. СХАНК2-СХ3 дивљи тип формирао је унутарћелијске агрегате различитих величина и није се локализовао на врховима актинских влакана. ИФП-СХАНК2Е је формирао компактне агрегате око врхова актинових влакана. Иста локализација је уочена код Ц-терминала СХАНК2-СХ3-ИФП и СХАНК2Е-ИФП конструкција (подаци нису приказани). ИФП-Сханк3 је коришћен као контрола јер коокализује врхове актинских влакана. Ваге: 20 µм (главни панели); 5 μм (инсетс). ( б ) ИФП-СХАНК2Е дивљи тип је кофефициран заједно са маркером жаришне адхезије ГФП-винкулином у ћелије ЦОС-7. ТИРФ слике су представљене. СХАНК2Е протеин нагомилао се око жаришта адхезије, али се није локализирао са винкулином. Ваге: 20 µм (главни панели); 5 μм (инсетс). ( ц ) Мерења односа Ф / Г-актина за све тестиране варијанте и СХАНК2Е-ВТ у ћелијама ХЕК293. Свако стање је тестирано у три независне трансфекције са по две реплике. ( д ) Варијанта А1731С и СХАНК2Е-ВТ су додатно анализирани у три независне трансфекције са по три реплике. Резултати А1731С / ВТ су нормализовани на СХАНК2 количине протеина помоћу другог западног блота са анти-СХАНК2 и анти-ГАПДХ антителама. Све вредности су приказане као средња вредност + стандардна девијација. Wild-type value is normalized to 1. * P ≤0.05 (two-tailed paired t -test).

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Дискусија

In this study, we analyzed the sequence of the SHANK2 gene in a cohort of 481 SCZ patients and revealed an increased burden of rare SHANK2 missense variants in these individuals compared with controls. The difference in frequency of rare predicted deleterious variants between patients and controls did not reach statistical significance but a trend was noted. The assessment of rare deleterious variant frequencies may be limited by the size of our studied cohort (500 SCZ individuals) and the accuracy of the prediction tools.

Overall, 2.7% of patients harbor novel missense SHANK2 variants that were not found in our sequenced controls. These 10 rare variants are to our knowledge the first identified SHANK2 variants in patients with SCZ. As SHANK2 mutations have been previously identified in patients with ID and ASD, we first compared the variants between the different disorders. 39, 46 Previous sequencing of SHANK2 coding exons and exon–intron boundaries in ID and ASD cohorts of 851 patients yielded 1 de novo stop mutation (R462X), 1 inherited micro-duplication of 6 nucleotides and 13 rare missense variants, which were not found in 1090 controls. 27, 32 All the reported ASD missense variants were either shown to be inherited or no parental DNA was available for sequencing, similar to the findings in our SCZ cohort. One of our four functionally tested SCZ variants, S610Y, was also previously identified in an individual with ID suggesting that distinct SHANK2 mutations can contribute to the etiology of more than one brain disorder. Copy number screenings also have identified several SHANK2 de novo deletions in ASD patients 32, 39 but no CNVs of this chromosomal region have been reported in SCZ individuals so far. The SCZ patients participated also in a genome-wide CNV screen. 56 No SCZ-associated CNVs were found in cases harboring candidate SHANK2 variants.

All identified SHANK2 variants in SCZ patients were heterozygous and either inherited from apparently unaffected parents or are of unknown origin, suggesting variable penetrance (in two-thirds of the patients, parent information was not available). In all five individuals with inherited mutation, the transmission was from mother to son, similar to previous findings in ASD patients. The reasons for this gender preference are not clear.

Demonstrating the causality of rare missense variants is a common challenge in targeted gene mutation screenings. To assess the potential impact of the variants on protein function, we performed various in vitro assays using primary hippocampal neurons and cell lines (COS-7, HEK293) as a model. The four tested variants (S610Y, R958S, P1119T and A1731S) were initially selected based on in silico predictions, frequency and absence in the 1000 Genome project and Human exome variant server databases. Three of them, S610Y, R958S and P1119T, are affecting highly conserved amino-acid positions in SHANK2 with high predicted probabilities to impair protein function (Supplementary Tables 2 and 7). In contrast, the A1731S variant does not locate to a very highly conserved region and was considered to be benign by several prediction softwares (Supplementary Tables 2 and 7). A reduced number of SHANK2-Bassoon-positive synapses was measured for variants S610Y, R958S and P1119T, supporting the hypothesis that conservation of a given affected amino acid is a good indicator for a functional output. 39 Two of the variants, S610Y and P1119T, also show a reduced ability to increase dendritic spine volume. Reduction in the potential for spine enlargement was observed before for isolated SHANK2 variants in ASD and ID. 32

The A1731S variant was found four times in 481 SCZ patients and has not been detected in 5338 controls, which makes it a potent risk factor for SCZ ( P =4, 6 × 10 −5, two-sided Fisher's exact test). To reach this number of unaffected controls, we integrated our control group of German individuals with European American individuals from the Human Exome Variant Server and from the 1000 Genome project. However, A1731S was also not present in individuals with different ethnic origins in these databases. Such high frequency of detection is unique for a SHANK2 mutation found in individuals with neuropsychiatric disorders so far.

Another interesting point is the apparent overlap in the clinical picture of the four patients sharing the A1731S mutation. All four carriers share an early prodromal phase with an insidious onset of psychiatric symptoms. In addition, all these patients displayed a substantial ego disturbance (depersonalization), persecutory delusions and auditory hallucinations. Parental age at birth was high and varied between 36 and 54 years in fathers and 33 and 39 years in mothers. These findings will be interesting to replicate in a larger patient cohort. High parental age, especially high paternal age, increases the probability for additional de novo mutations, which may further contribute to the SCZ manifestation in these individuals. 57, 58, 59

To our surprise, the functional assays also underlined A1731S as a variant with strong effect among the functionally tested SCZ variants. In overexpression experiments, mCherry-A1731S showed reduced number of Shank2-Basoon-positive synapses. Another interesting finding is that A1731S was the only variant analyzed that showed a significant effect on the F/G-actin ratio in HEK293 cells. This parameter attracts attention since synapse structure and function are known to take advantage of actin as stable, but yet dynamic structural components. A diminished actin polymerization could be the explanation for an impairment in synapse formation and maintenance, which is indicated by a reduction of synaptic clustering of the overexpressed SHANK2 mutant and the reduced number of presynaptic contacts. The absence of a dendritic spine phenotype is surprising but actin also contributes to morphologically undetectable functions. Alterations in the organization of the junction scaffold components or assisting the trafficking of the whole synaptic machinery can lead to functional disturbances in neurotransmission without visible effect on spine structure. 60 Combined with its frequency in patient samples, variant A1731S sets apart from the other missense SHANK2 variants identified in different disorders. 39, 46 The in silico analysis excluded possible splice site disruptions, suggesting that the effect of this variant in patients is likely due to the amino-acid exchange. Its location in near proximity to the sterile alpha motif domain proposes a possible effect on the dendritic localization and the self-multimerization of the mutant protein, two features of SHANK2 that are highly dependant on intact C-termini. 61, 62

Regardless of its strong functional effect, A1731S resides at a position with low conservation and was predicted as benign by most prediction tools (Supplementary Table 3). The idea that SCZ pathogenesis may occur in evolutionary recent neural cell types and circuits may be an explanation for the presence of serine as a wild-type allele in some species. Comparison of functionally analyzed missense SHANK2 variants (from both our and a previous study) 39 to the corresponding in silico predictions indicates significant rates of false predictions (Supplementary Table 8). This lead us to the conclusion that analysis based only on prediction results may lose valuable information and associated rare SHANK2 missense variants should be functionally assessed independent of their prediction status.

In summary, the accumulated evidence strongly suggests that the identified variants represent risk factors for SCZ. Combined with previous data of SHANK1 and 3 , our work underlines the SHANK gene family and their allelic variants to appear in key neuronal pathways and circuits in the postsynaptic density of excitatory neurons and, when perturbing their function causing disease (for example, ID, ASD and SCZ). The exact molecular mechanisms and networks affected by SHANK2 mutations in SCZ remain unclear at this point but it is likely that alteration in NMDAR function is involved. This hypothesis is supported by two SHANK2 mouse models that carry different deletions, comparable to those identified in ASD patients. 40, 41 Further useful model systems to address these questions may include induced pluripotent stem cell lines reprogrammed into neurons to study the underlying molecular and cellular mechanisms.

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Додатне информације

Екцел датотеке

  1. 1.

    Допунске таблице

    Додатне информације прате рад на веб локацији Молекуларна психијатрија (//ввв.натуре.цом/мп)