Индуцибилна експресија мутантног људског диска1 код мишева повезана је са поремећајима у мозгу и понашању који подсећају на шизофренију | молекуларна психијатрија

Индуцибилна експресија мутантног људског диска1 код мишева повезана је са поремећајима у мозгу и понашању који подсећају на шизофренију | молекуларна психијатрија

Anonim

Апстрактан

Снажни ген кандидат за шизофренију и велике менталне поремећаје, поремећена шизофренија 1 (ДИСЦ1) први је пут описан у великој шкотској породици у којој се балансирана хромозомска транслокација одваја са шизофренијом и другим психијатријским болестима. Мутација транслокације може резултирати губитком ДИСЦ1 функције преко хаплоинсуфицијенције или доминантно-негативних ефеката предвиђеног мутираног ДИСЦ1 скраћеног протеинског производа. ДИСЦ1 је умешан у неуроразвој, укључујући сазревање мождане коре. Да би се проценили неуронски и бихевиорални ефекти мутантног ДИСЦ1, Тет-офф систем под регулисањем ЦАМКИИ промотора коришћен је за генирање трансгених мишева са индуцибилном експресијом мутираног хуманог ДИСЦ1 (хДИСЦ1) ограничених на предбрачне области, укључујући мождану кору, хипокампус и стриатум. Експресија мутантног хДИСЦ1 није била повезана са грубим неуроразвојним абнормалностима, већ је довела до благог проширења латералних вентрикула и атенуирања пораста неурита у примарним кортикалним неуронима. Ове морфолошке промене повезане су са смањеним нивоом протеина ендогених мишјих ДИСЦ1, ЛИС1 и СНАП-25. У поређењу са њиховим контролама легла подметача, мутирани хДИСЦ1 трансгени мушки мишеви су показали спонтану хиперактивност на отвореном пољу и промене у друштвеној интеракцији, а трансгени женски мишеви показали су недостатну просторну меморију. Резултати показују да су неуронски и бихевиорални ефекти мутантног хДИСЦ1 у складу са доминантно-негативним механизмом и да су слични неким карактеристикама шизофреније. Садашњи модел миша може олакшати проучавање аспеката патогенезе шизофреније.

Увод

Шизофренија је погубна психијатријска болест чији се симптоми могу поделити у три главне категорије: психотични или „позитивни“ симптоми, „негативни“ симптоми и когнитивно оштећење. 1, 2 Постоје разлике у полној доби у доби и по клиничким карактеристикама. 3, 4 Бројна испитивања генетских веза и придруживања идентификовала су регије генома које могу носити гене ризика од шизофреније, али сложена генетика и симптоматологија болести ометали су напоре у проналажењу јасних генетских одредница. 5, 6

Алтернативни приступ је проучавање породица у којима се шизофренија и сродни психијатријски поремећаји раздвајају с цитогенетским абнормалностима. 7 У овим породицама, један велики генетски недостатак може пружити осјетљивост на психијатријске болести. Идентификован је један велики шкотски родовник, 8 у коме је уравнотежени (1:11) (к42.1; к14.3) транслокациони когегрегати са главним психијатријским поремећајима (ЛОД скор = 4–7). Транслокација прекида ген назван поремећеном у шизофренији 1 (ДИСЦ1) на хромозому 1, 5, 7, 9 Повезаност и удруживање на ДИСЦ1 локусу доказано је за психијатријску болест у неколико популација, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 сугерирајући ширу релевантност ДИСЦ1.

Ендогена експресија ДИСЦ1 је сложена, а неколико изоформ протеина заузима различите подћелијске коморе. ДИСЦ1 се изражава у зубним зубима хипокампалног дентата, коре мождане коре, хипоталамусу, амигдали, церебелуму и олфакторним луковицама. 18, 19, 20 ДИСЦ1 протеин вероватно делује као скелетни протеин, са вишеструким мотивима који посредују везањем на неколико протеина и олакшава стварање протеинских комплекса. 21, 22, 23, 24 ДИСЦ1 интерактивност протеина укључује протеин који реагује на микротубуле који је повезан са фактором-3 повезаним рецептором фактора некрозе тумора, фактор-3 повезан са микротубулом, протеин 23, фатикулирање и издужавање протеина зета-1 25 и протеина сличног НудЕ (НУДЕЛ) . 21, 23 ДИСЦ1 је предложено да постоји у неуроразвијено регулисаном протеинском комплексу са НУДЕЛ и ЛИС1. 26, 27 Интеракција ДИСЦ1-НУДЕЛ-ЛИС1 била је умешана у раст неурита у ћелијама ПЦ12 и продужење аксона у примарним неуронима. 28, 29, 30 Поред тога, сугерисано је да измене у интеракцији ДИСЦ1 са фосфодиестеразом 4Б доприносе патогенези главних менталних поремећаја. 31

Могући исходи транслокације у ДИСЦ1 гену укључују хаплоинсуфицијенцију или производњу ДИСЦ1 протеина одрезаног мутантом. Хаплоинсуфикасност је предложена због смањене експресије ДИСЦ1 у целој дужини и неуспеха у детекцији мутантног ДИСЦ1 у лимфобластоидним ћелијским линијама добијених од пацијената. 31 Међутим, расположиви подаци не искључују у потпуности производњу мутантног ДИСЦ1. Неизвесно је у којој мери је експресија лимфобласта огледала експресије мозга. Поред тога, специфичност и / или осетљивост антитела која се користе могу бити недовољна за откривање мутантног ДИСЦ1 или за разликовање од осталих ДИСЦ1 изоформи. 32 Дакле, тачан резултат транслокације и даље остаје нејасан. Постоји довољан преседан за производњу абнормалних протеина као резултат хромозомске транслокације и њихове улоге у етиологији рака. Већина ових транслокација резултира производњом фузијских протеина између два генска производа, али у неким случајевима, на пример са зарезима, транслокације могу резултирати производњом абнормално скраћених протеина. 33

Скраћени хумани ДИСЦ1 (хДИСЦ1), ако постоји, може изгубити своју нормалну локализацију и повезаност са протеинима који су у интеракцији. На пример, скраћеном протеинском производу недостаје регион потребан за интеракцију са НУДЕЛ-ом. 21, 23 Пошто се мутирани протеин асоцира на ДИСЦ1 у целој дужини, предложено је да се ћелијски ефекти мутирајућег ДИСЦ1 посредују преко доминантно-негативних механизама. 24, 34 На пример, мутирани ДИСЦ1 ремети формирање протеинског комплекса ДИСЦ1 – НУДЕЛ – ЛИС1, што доводи до абнормалности у миграцији неурона, смањене сложености дендрита лукова и израслина неурита, подсећајући на налазе из узорка мозга постмортемске шизофреније. 35, 36, 37 Важно је да је показано да су ефекти мутантног ДИСЦ1 слични онима који су примећени након супресије ендогеног ДИСЦ1 са РНАи који опонаша хаплоинсуфицијенцију. 34 Дакле, претпостављено је да и доминантни негативни и хаплоинсуфикасност механизми могу ометати сличне протеинске комплексе који делују на ДИСЦ1, што доводи до губитка функције ДИСЦ1, вероватног исхода транслокације. 38, 39 У овом контексту, проучавање ефеката мутантног ДИСЦ1 на неуроразвој може пружити драгоцене механичке увиде у стање човека и патогенезу шизофреније и сродних поремећаја.

Овдје представљамо резултате карактеризације новог трансгеничног модела миша користећи индуцибилну експресију мутантног хДИСЦ1 ограниченог на подручја предњег мозга. Наши подаци показују да је експресија мутантног хДИСЦ1 довела до повишене спонтане активности зависне од пола, оштећене просторне референтне меморије и ненормалне социјалне интеракције код трансгених мишева. Уочене абнормалности у понашању повезане су са ослабљеним неуритним растом и благим увећањем бочних вентрикула. Дошло је до смањене експресије ендогених мишјих ДИСЦ1, ЛИС1 и СНАП-25. Овај модел миша може послужити као вредан експериментални систем за будуће студије патогених механизама шизофреније и сродних менталних болести.

материјали и методе

Стварање индуцибилних линија миша

Двоструки трансгени систем Тет-офф (Цлонтецх, Пало Алто, Калифорнија, САД) коришћен је за генерисање мишјег модела индуцибилне експресије мутантног хДИСЦ1 (слика 1). Да би се генерисала одговорна линија (то јест, један трансгенични хДИСЦ1 мишеви), цДНА (1971 бпс) за мутирани хДИСЦ1 су субклонирани у одговорним плазмидима који исказују интерес за интерес под контролом тетрациклин-одговорног елемента (ТРЕ ) који се налази узводно од минималног ЦМВ промотора (П мин ЦМВ) (Слика 1). Експресија мутантног хДИСЦ1 настаје када се тетрациклин-трансактиватор (тТА) веже на ТРЕ и активира ЦМВ промотор. Доксициклин (ДОКС) додан мишјој храни веже се на тТА и спречава да тТА да лицитацију за ТРЕ, што доводи до сузбијања транскрипције хДИСЦ1. Мутантни хДИСЦ1 протеин се експримира као протеин спојен са миц пептидом који се користи као ознака. Аминокиселинска секвенца мутантног хДИСЦл може се наћи у Таилор ет ал. 40 м иц је смештен узводно од Н краја хДИСЦ1 да би се добио поуздан маркер за детекцију протеина хДИСЦ1 са антимикцним моноклонским антителима (МАБ) (Роцхе Диагностицс, Индианаполис, ИН, УСА).

Image

Индуцибилна експресија мутираног хуманог ДИСЦ1 (хДИСЦ1) заснована на Тет-офф систему. ( а ) Шема Тет-офф система који се користи за генирање трансгених мишева. ( б ) Изражавање мутантног хДИСЦ1 у различитим мишјим линијама. 1-линија 1001; 2-линија 70 и 3-линија 1313Б. Мутант хДИСЦ1 (64-кДа) је визуализован анти- миц МАБ (1: 1000). Линије 70 и 1001 су коришћене у овој студији. ( ц ) Израз мутираног хДИСЦ1 који је ограничен на форебраин. Мутантни узорци миша: линија 1 - предњи део мозга, трака 2 - мозак; контролни узорци миша: линија 3 - предњи део мозга, трака 4 - мозак. Опсег 64-кДа је мутирани хДИСЦ1 као визуелно приказан анти- миц МАБ (1: 1000). ( д ) РТ-ПЦР детекција мРНА кодирања за тетрациклин-трансактиватор (тТА) код ЕД15; 1-цДНА негативна контрола без тТА гена; Позитивна контрола цДНА 2-тТА; ДНК са 3 репа од доказаног тТА трансгеничног миша; ДНК са 4 репа из миша тТА после третмана ДНК, како би се показао недостатак контаминације ДНК; 5 воде. Стрелица указује на одређене појасеве тТА производа. ( е ) регулисана експресија мутантног хДИСЦ1. Узорци 1 и 2 са мутираних мишева који су узгајани без хране доксициклином (ДОКС−); узорак 3 од мутираног миша који је 10 дана имао храну која садржи ДОКС (ДОКС +); узорак 4 са контролног миша. Имајте на уму недостатак експресије мутантног хДИСЦ1 у узорцима 3 и 4; Опсег 64-кДа је мутирани хДИСЦ1 као визуелно приказан анти- миц МАБ (1: 1000).

Слика пуне величине

Конструктивни плазмиди су дигестирани и поднесени ЈХУ трансгеничном језгру за пронуклеарне ињекције у Б6; СЈЛ мишје ћелије које су потом смештене у псеудо трудничке мишеве ИЦР соја (Тацониц, Худсон, НИ, УСА). Поједини трансгени мишеви ДИСЦ1 идентификовани су стандардним генотипским протоколом. Идентификовани Б6; СЈЛ-Тг (ТРЕ-ЦМВ-хДИСЦ1) узгајивачи су узгајани са једним трансгеничним Б6; ЦБА-Тг (Цамк2а-тТА) 1Ммаи / ј мишеви (Тхе Јацксон Лаборатори, Бар Харбор, МЕ, САД) да би се створили двоструки трансгени мишеви хибридног Б6; СЈЛ; ЦБА позадина. Индуцибилна експресија мутантног хДИСЦ1 протеина ограничена форебраом постиже се због тога што су појединачни трансгени Б6; ЦБА-Тг (Цамк2а-тТА) 1Ммаи / ј мишеви експресни тТА вођени промотором киназе ИИ-α зависне од калцијумулулина, који даје доминантни промотор који даје превладавајући експресија трансгена у неуронима предњег мозга. 41

У овом истраживању, двоструки трансгени мутантни хДИСЦ1 мишеви су укључени у мутирану групу, док су њихови појединачни трансгени тТА трансгени легло укључени у контролну групу. Одабрали смо тТА мишеве као контролне животиње, јер ова линија мишева изражава регулаторни протеин (то јест, тТА) који може потенцијално утицати на развој мозга и понашања миша. На пример, доступни подаци сугеришу да се тТА мишеви разликују од дивљег типа мишева истог соја у бројним тестовима понашања, укључујући истраживање на отвореном пољу и ниво анксиозности у кутији светло-тамно. 42, 43 Насупрот томе, наши пилот експерименти нису показали мутирани хДИСЦ1 експресије код појединачних ДИСЦ1 трансгеничних мишева и нема значајних разлика између дивљег типа мишева и појединачних ДИСЦ1 трансгеничних мишева у тестовима понашања или тестовима неуритног раста у примарним неуронима (допунске слике С1 и С2, Допунски материјали и бројке, на мрежи). Стога су у овом раду проучавани двоструки трансгени мутантни хДИСЦл (мутант) и појединачни трансгени тТА (контролни) мишеви.

Потомке парова парења одузето је након постнаталног дана (ПНД) 21, генотипизирано су и смјештене у групе које одговарају сполу од пет у стандардним мишјим кавезима у складу са ЈХУ АЦУЦ смјерницама.

Антитела

Анти-мишје ДИСЦ1 анти-пептидно антитело (Н3) узгајано против аминокиселина (аа) 176-184 мишје секвенце 40 синтетизовано је и пречишћено од Спринг Валлеи Лабораториес Инц. (Воодбине, МД, САД) као што је претходно описано. 32 Друга примењена антитела била су моноклонска на миц (Роцхе Диагностицс, Индианаполис, ИН, УСА), на ЛИС1, СНАП-25 (Сигма, Ст Лоуис, МО, САД), на ПСД-95 (Аффинити БиоРеагентс, Голден, ЦО, УСА), поликлонал зеца на Ндел1 (Абцам, Велика Британија), пилеће анти-микротубуло-повезано протеин 2 (МАП2) поликлонално антитело, зечји анти-глиални фибриларни кисели протеин (ГФАП) и антитијела против ИБа1 (Цхемицон, Темецула, ЦА, САД) .

Вестерн блот анализе

За ову анализу, мишеви су убијени на ПНД 7 и 21, и током 9 месеци (након завршетка тестова понашања) да би одразили главне прекретнице у постнаталном развоју мишјег мозга. 44, 45, 46 Регије предњег мозга, укључујући фронтални кортекс, хипокампус и стриатум, брзо су сециране у физиолошкој отопини пуној ледено фосфатом (ПБС), замрзнуте на сувом леду и држане на -80 ° Ц док се не употребе. Ткиво мозга је хомогенизовано у 10 делова пуфера (50 м М Трис, пХ 8, 0, 150 м М НаЦл, 5 м М ЕДТА, коктел комплетног инхибитора протеина (Роцхе Диагностицс, Индианаполис, ИН, САД), 1% натријум додецил сулфат ( СДС), 0, 5% ДОЦ), соницирано и центрифугирано на 10 000 г током 10 мин. Супернатанти су сакупљени за БЦА (бицинцхониниц ацид) тест протеина (Пиерце Биотецхнологи Инц., Роцкфорд, ИЛ, САД) или су кухани 5 минута на 95 ° Ц и комбиновани са 4 × ЛДС пуфером за узорке (Инвитроген, Царлсбад, ЦА, САД) . Пре растварања на геловима, узорци су загревани 5 мин на 70 ° Ц и раздвојени од 4–12% НуПАГЕ Новек Бис-Трис гелови (Инвитроген), пренети се на нитроцелулозну мембрану (Сцхлеицхер и Сцхуелл, Дассел, Немачка) на 200 мА 100 –120 мин Мембране су блокиране током 1 сата на собној температури у ТБС-0, 1% Твеен 20 који садржи 5% обраног млека у праху. Затим су мембране тестиране анти- миц антителом (1: 1000), анти-мишјим ДИСЦ1 антителом (1: 500), анти-ЛИС1 антителом (1: 1000), или анти-Ндел1 (1: 1000), или антитело против СНАП-25 (1: 5000 провера) или антитијело против ПСД-95 (1: 1000) током ноћи на 4 ° Ц. После испирања у ТБС-0, 1% Твеен-20 пуферу, мембране се инкубирају током 1 сата на РТ са антителом коњугираним са анти-врстом пероксидазом (1:10 000) (Амерсхам, Буцкингхамсхире, УК). Имунореактивни бендови детектирани су хемилуминисценцијом и излагањем ЕЦЛ филмовима (Амерсхам). Филмови су дигитално скенирани и дензитометријска анализа слике западног блота са завојима испод засићености филма изведена је софтвером ИмагеЈ (ВС Расбанд, ИмагеЈ, Амерички национални институт за здравље, Бетхесда, МД, САД; //рсб.инфо .них.гов / иј /). Оптичка густина протеинских трака на свакој од дигиталних слика нормализована је на оптичку густину контроле оптерећења (глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (ГАПДХ), 1: 100 000).

Имунолошки падавине

ХЕК 293 ћелије су трансфициране мутантним хДИСЦ1-Миц, мишјим мишићима ДИСЦ1-ХА и ГАПДХ-ХА целе дужине, користећи липофектамин према протоколу произвођача (Инвитроген). Након трансфекције (24 х), ћелије су лизиране у РИПА пуферу (50 м М ХЕПЕС, пХ = 7, 4, 150 м М НаЦл, 5 м М МгЦл2, 5 м М ДТТ, 1 м М ПМСФ, 1 мМ ЕДТА, 1 % Смеше Тритон Кс-100 и инхибитора протеазе) и фракције супернатанта добијене након центрифугирања на 10 000 г током 15 мин инкубирају се са примарним антителом и протеином Г Сефаросе (ГЕ Хеалтхцаре, Буцкингхамсхире, УК, 4 Фаст Флов). Имунопреципитати су анализирани са СДС-ПАГЕ, а затим је прошао западни блот.

Примарне културе кортикалних неурона

Културе богате неуроном припремљене су из мишјих кортикса ембрионалног дана 16 (ЕД 16) користећи стандардне технике. 47 Укратко, кортикли без менинга су изоловани, трипсинизирани и механички раздвојени проласком кроз Пастерове пипете. Опране ћелије су постављене (200 000 ћелија цм2) на поли-Л-лизин (0, 05 мг мл -1 ) и прекривене културе ткива прекривене ламинином (0, 1 мг мл -1 ) (Фисхер Бранд; Фисхер Сциентифиц, Питтсбургх, ПА, УСА) у НБМ са додацима Л-глутамина, Б-27 и П / С (комплетан НБМ). Ћелије су култивисане ин витро током 4–5 дана, затим фиксиране у хладном метанолу и обојене пилећим анти-МАП-2 антителом (1: 500) или антимикром МАБ (1: 400), праћеним или ФИТЦ-коњугованим или Ци3 -коњугирана секундарна антитела (1: 200, Цхемицон, Темецула, ЦА, УСА). Слике су гледане на Зеисс конфокалном микроскопу (Акиоскоп 2; ЛСМ 5 ПАСЦАЛ). Да би се квантитативно проценила комплексност неурита у неуронима, коришћена је Схолл анализа. 48 Концентрични прстенови са повећаним радијусом су центрирани на ћелијском телу неурона, а број пресека неуритног лука са датим прстеном црта се у односу на полумјер прстена. Свака тачка на парцели представља просек четири независне културе (најмање 50 неурона по култури) припремљених од засебних контролних и мутираних мишјих ембриона.

Хистопатолошки и имунохистохемијски тестови

По завршетку експеримената у понашању, контролни и мутирани мишеви су еутаназирани са ЕУТХАСОЛ (Диамонд Анимал Хеалтх Инц. Дес Моинес ИА, САД) и перфузирани леденим ПБС-ом (пХ = 7, 4), а затим са 4% параформалдехидом. Мозгови су уклоњени, постфиксирани током 4 х, крио заштићени и сагиттално су пререзани на пола. Мозак је сагитално пресечен у одељцима од 40 µм и сачуван у криопротективном медију на -20 ° Ц до бојења. Неки одсеци обојени су љубичастом крезилом да би се проценила укупна цитоархитектоника и стварање слојева у мишјим мозговима. Да би се проценила експресија мутантног хДИСЦ1 у различитим типовима ћелија мозга, одсеци мозга су обојени са зечјим анти-ГФАП (1: 800), или анти-Иба1 МАБ (1: 400) или анти- миц МАБ праћеним било Секундарна антитела коњугована са ФИТЦ или Ци3 (1: 200, Цхемицон, Темецула, ЦА, УСА). Слике су гледане на Зеисс конфокалном микроскопу (Акиоскоп 2; ЛСМ 5 ПАСЦАЛ). Алтернативно, поједини одсеци мозга обојени су имунохистохемијом авидин-биотин (Вецтор, Бурлингаме, ЦА, САД) коришћењем антимик МАБ праћеног биотинилираним имуниглобулином Г (ИгГ, Вецтор, Бурлингаме, ЦА, САД).

Магнетна резонанца (МРИ)

Прикупљање података

Живи мишеви који су анестезирани изофлураном снимљени су 9.4 Т скенером за нуклеарну магнетну резонанцу (Брукер Биоспин, Биллерица, МА, САД). Брзо-спин-ехо слијед коришћен је за Т2-пондериране слике са сљедећим параметрима: ТР = 4, 7 с и ефективним ТЕ = 22, 4 мс, дужина влака одјека = 4. Снимљене су вишеструке 2Д слике помоћу равне матрице 192 × 168 и видног поља 20 × 20 мм 2 . Дебљина кришки је 0, 4 мм, без размака између кришки. Број резова био је 60, покривајући цео мозак. Резолуција слике је била 0, 1 × 0, 12 × 0, 4 мм 3 . Респираторно активирање примењено је за смањење артефакта покрета узрокованог дисањем. Са шест просечних сигнала, време скенирања је било 40 мин. Скенирано је укупно седам контролних и мутираних мишева.

Анализа слике

Слике су обрађене помоћу Амире (ТГС, Сан Диего, ЦА, САД). Цео мозак и вентрикули су ручно одређени за сваку кришку и измерени су њихови 3Д обими. У сврху визуализације, створени су просечни мозгови за контролне и мутантне групе одвојено нормализацијом мозга у образац (једна репрезентативна животиња у контролној групи) користећи афинску трансформацију. Ови просечни мозгови могу показати конзистентне анатомске разлике између две групе.

Бихевиорални тестови

Спонтана локомоција

Спонтана локомоција је анализирана коришћењем Версамак система за надгледање активности животиња инфрацрвеним сноповима (АццуСцан Инструментс Инц., Цолумбус, ОХ, САД) током 24 сата у мрачном периоду од 1800 до 0600.

Новост изазвана локомоција

Активност изазвана новостима на отвореном пољу процењена је у периоду од 60 минута коришћењем комора активности са инфрацрвеним сноповима (Сан Диего Инструментс Инц., Сан Диего, ЦА, САД). Хоризонталне и вертикалне активности, стереотипне активности и време проведено у центру или дуж зидова (тигмотаксија) коморе су аутоматски бележене.

Плус-лабиринт тест

Анксиозност је процењена у тесту плус-лавиринт. Миш је постављен на почетну платформу у плусу лавиринт (Сан Диего Инструментс Инц., Сан Диего, Калифорнија, САД) и понашања миша су снимљена током 5 минута. Искусни посматрани слеп за идентитет групе касније је оценио бројеве улаза у затворене и раширене руке, време проведено у затвореном насупрот отвореном наручју, број урањања главе и истезање положаја.

Акустични одзив на старт

Две идентичне коморе за покретање (Сан Диего Инструментс Инц., Сан Дијего, Калифорнија, САД) коришћене су за мерење реактивности и пластичности покрета. Сваки миш је смештен у цилиндар од плексигласа (пречника 2 цм) унутар сваке коморе. Звучник монтиран 24 цм изнад цилиндра пружао је широкопојасну позадинску буку и звучне подражаје. Презентације акустичних подражаја контролисало је СР-ЛАБ софтверским системом и системом интерфејса, који је такође исправљао, дигитализовао и забележио одговоре са акцелерометра. Максимални напони унутар прозора за читање од 100 мс, почевши од почетка подражаја, коришћени су као мере почетних амплитуда. Нивои звука мерени су у почетним ормарима помоћу дигиталног мерача нивоа звука (Реалистиц, Танди, Форт Вортх, ТКС, УСА). Осјетљивост акцелерометра унутар сваке коморе за покретање редовно се калибрира и за њих је утврђено да остаје константна током периода испитивања.

Експериментална сесија састојала се од 5-минутног периода аклиматизације на 70-дБ позадинске буке (непрекидно током читаве сесије), а затим је уследила презентација 10-мс дасака 120-дБ белог шума у ​​интервалу стимулисања од 20 с ( сесија хабитуације). По завршетку сесије хабитуације, сваки миш је остављен у кућишту током 5 минута без презентације било каквих почетних подражаја. Одмах након тога, започела је сесија инхибиције пре импулса (ППИ). Током сваке ППИ сесије, миш је био изложен следећим врстама покуса: покус сам пулс (пробијање широкопојасне мреже од 120 дБ, 100 мс); пропуштање стимулуса (покус без стимулације); и четири комбинације пре-импулса-импулса (пре-импулса-импулса испитивања) који се састоје од 20-мс широкопојасног прага који се користи као пре-импулс и представљен је 80 мс пре импулса користећи један од четири интензитета пре импулса: 74; 78; 82; 86 и 90 дБ. Свака сесија састојала се од шест презентација сваке врсте испитивања која су представљена псеудо случајним редоследом. ППИ је процењен као проценат резултата ППИ (% ППИ): 100 × (средња амплитуда покрета на самим пулсним испитивањима - средња амплитуда стартла у покусима импулса – импулса / средња амплитуда покрета на самим пулсним испитивањима) за сваку животињу одвојено. Проценат ППИ за сваку животињу коришћен је као зависна варијабла у статистичкој анализи.

Олфакторни тестови

Како се мутирани хДИСЦ1 експримира у неуронима олфакторних сијалица, олфакција у трансгеничним мишевима процењена је коришћењем два олфакциона теста. Први тест мери латенцију проналажења комада сира сакривеног (закопаног) у кавезној постељини. У овом тесту није коришћено лишавање хране. Други тест оцењује способност миша да разликује два мириса. Тест мери време које је миш провео њушкајући около које садржи преферирани мирис, на пример, ванилија наспрам воде. За овај тест, две капи воде или ваниле стављене су у супротне углове стандардног кавеза за миша. Миш је постављен у средину кавеза и измерено је време проведено на свакој страни.

Тестови социјалне интеракције

Дијадична интеракција мушкарац и мушкарац на непознатом отвореном терену

Интеракција мушкарац и мушкарац анализирана је користећи протокол који је описао Родригуиз и др. 49 Укратко, пре тестирања, мушки мишеви су смештени појединачно током 4 дана да би се повећала друштвена мотивација. На дан тестирања, један контролни миш је био упарен са непознатим мутираним мишем у комори за активност која се користи у тесту на отвореном пољу, као што је горе описано. Коморе су очишћене пре и између сваког теста раствором МБ-10 и обрисане суве. Оба мишева истовремено су постављена на супротним странама кавеза који су подељени у два одељка чврстом картонском преградом. Након 5-минутне аклиматизације, партиција је уклоњена и животињама је остављено да слободно делују у току 10 минута. Сва понашања миша снимљена су на видео снимцима. Следећа друштвена понашања постигла су искуства искусног опажаног слепца за генотип мишева: њушкање, следење, шапе на глави, напади, уједи и звецкање репа.

Тест друштвености и социјалне склоности

Друштвена и социјална склоност процењена је као што је описано у. 50 Испитивање је изведено у стандардном кавезу за миша раздвојеним у три коморе преградама, са две велике са сваке стране и мањим средњим. Једна велика комора садржала је цилиндрично кућиште од жичане мреже са живим мишем. Супротна велика комора садржавала је исти простор са неживим предметом. Контролни или мутирани миш је смештен у централну мању комору и остављен је да доминира у експерименталном окружењу током 5 минута. Након тога, партиције су уклоњене и измерили смо 10 мин времена које је миш провео истражујући (то јест активно њушећи и / или боравећи у року од 1 цм) у кућишту са живим одраслим мишем истог пола или у затвореном простору са неживим објектом . Социјални и несоцијални подражаји варирали су у коморама и оквир је био очишћен између испитаника. Вријеме проведено око сваког кућишта аутоматски је регистрирао систем за праћење видео записа „СМАРТ“ (Сан Диего Инструментс Инц., Сан Диего, ЦА, САД).

Моррис водени лавиринт

Моррис водени лавиринт (МВМ) тест је изведен као што је претходно описано. 51 Мазе се састоји од кружног резервоара за пливање од нерђајућег челика (пречника 72 цм и дубине 15 цм) напуњеног водом непрозирним додавањем нетоксичне беле пудерасте боје из латекса. Мала платформа (5 цм квадрат) постављена је у резервоар у једном од четири квадранта. Врх платформе био је 1 цм испод површине воде. Протокол се састојао од три сесије. Прва сесија била је задатак видљиве платформе у коме је положај платформе сигнализиран присуством визуелно упадљиве 'заставе' изнад платформе. Локација платформе варира између четири могуће позиције унутар сваког блока испитивања и животиње се тестирају на три блока испитивања дневно (укупно 12 покуса) током 2 дана. Блокови испитивања одвојени су за 1 сат. Дванаест дана након завршетка сесије видљиве платформе тестирани су на верзији задатка скривене платформе (сесија скривене платформе). Током ове сесије, платформа је одржавана на фиксној локацији. Животиње су примиле три блока испитивања три дана заредом на задатку скривене платформе. Животиње су стављене у резервоар по ободу у једном од четири почетна положаја који су се користили на полу-случајни начин током четири испитивања по блоку. Мишевима је дозвољено да претражују резервоар током 60 с и оставе се на платформи 30 с. Ако се платформа није налазила у року од 60 с, они су уклоњени из воде и постављени на платформу. Поново, латенције за бијег биле су зависна варијабла. Следећег дана након завршетка сесије скривене платформе започело је тестирање. У овој сесији, платформа је уклоњена, а мишеви су постављени у средину резервоара и остављени су да пливају 3 мин. Мерено је укупно време проведено у различитим квадрантима лавиринта. Циљани квадрант идентификован је као квадрант где је скривена платформа раније била смештена.

Статистичка анализа

Утицај мутантног хДИСЦ1 на експресију различитих протеинских маркера у експериментима са западним мрљањем анализиран је Студентовим т -тестом или Вилцокон-овим непараметарским тестом, ако тест нормалне дистрибуције није успео, и Бонферронијом корекцијом прилагођавањем нивоа α у зависности од броја мерених маркера. Утицај мутантног хДИСЦ1 на раст неурита оцењен је коришћењем двосмерне анализе понављања мера (АНОВА). Главни ефекти мутантног хДИСЦ1 на понашање миша процењени су мешовитим моделом АНОВА, са генетском позадином, полом и временом тестирања (ако је применљиво) као независним променљивим. Значајни ефекти истраживани су даље нижим нивоима АНОВА и / или пост-хоц упоређивањем. П <0, 05 је коришћено за ниво значајности.

Резултати

Експресија мутантног хДИСЦл у мишевима ограничена на форебраин

Тет-офф систем је коришћен за генерисање двоструких трансгеничних мишева са индуцибилном експресијом мутантног хДИСЦ1 у предњи део мозга (слика 1а). Добијено је неколико линија (оснивача) појединих мутантних хДИСЦ1 трансгених мишева. Узгојем ових оснивачких линија са једним тТА трансгеничним мишевима генерисани су двоструки трансгени мишеви са променљивом експресијом мутантног хДИСЦ1 (слика 1б). Оснивачка линија 1001 (слика 1б, линија 1) и оснивачка линија 70 (слика 1б, линија 2) коришћени су у истраживању јер су произвели двоструке трансгене мишеве који су имали снажну (линија 1001) или слабу (линија 70) израз мутанта хДИСЦ1. Овде представљамо само оне ефекте мутантног хДИСЦ1 који су били конзистентни у две линије.

Експресија мутантног хДИСЦ1 откривена је већ ембрионалним даном (ЕД) 15 (слика 1ц). Рана експресија мутантног хДИСЦ1 у овом Тет-офф систему није била последица "цурења" Тет-офф система, јер смо такође могли да откријемо експресију мРНА која кодира тТА (Слика 1д). Такође смо показали да је Тет-офф систем код наших мишева био функционалан јер је експресија мутантног хДИСЦ1 могла бити потпуно искључена 7 дана након што смо мишевима дали храну која садржи ДОКС (Слика 1е). Мутант хДИСЦ1 протеин је експримиран у предњим мозговима мишјег мозга и био је одсутан у узорцима стражњег мозга, укључујући мозак и стабљику мозга (слика 1ц). Експресија мутантног хДИСЦ1 је претежно пронађена у неуронима олфакторних сијалица, предњем делу кортекса, пирамидалним неуронима и гранулатним ћелијама хипокампуса ЦА и стриатуму. Није примећена експресија мутираног протеина у неуронима мозга или можданог црева (Слика 2). Као што се очекивало, ни астроцити ни микроглија нису изразили мутантни хДИСЦ1 (слика 2). Колективно, резултати показују генерирање новог модела миша индуцибилних експресија мутантног хДИСЦ1 са ограниченим предбрагом и неуроном.

Image

Неуронска експресија мутираног хуманог ДИСЦ1 (хДИСЦ1). ( а ) експресија мутантног хДИСЦ1 у неуронима кортекса, стриатуму и хипокампусу; скала скале, 500 µм; анти- миц МАБ (1: 500), откриће ДАБ, мутирани миш 80 дана, линија 1001. ( б ) експресија мутирајућег хДИСЦ1 у ћелијама гранула хипокампуса из поља са кутијама а ; скала скале, 100 µм; бојење као на панелу а . ( ц ) Одсуство експресије мутантног хДИСЦ1 у неуронима можданог и можданог дебла истог мишјег дела мозга као на панелу а ; скала скале, 500 µм; ( д ) Недостатак експресије у пуркињешким ћелијама мозга из поља са кутијама ц ; скала скале, 100 µм. ( е ) Не постоји експресија мутантног хДИСЦ1 у астроцитима. Двоструко имуноизовање дентатног зида хипокампуса; црвено, антимикарско обојење (1: 500); зелено, анти-ГФАП бојење (1: 1000); скала скале, 100 µм. ( ф ) Нема експресије мутантног хДИСЦ1 у ћелијама микроглије. Двоструко имуноизовање дентатног зида хипокампуса; црвено, антимикарско обојење (1: 500); зелено, анти-Иба1 бојење (1: 400); скала скале, 100 µм. ( г ) Експресија мутантног хДИСЦ1 ограничена на форебраин. Мутант узорци миша (линија 1001): трака 1, кортекс; трака 2, хипокампус; трака 3, мозак; трака 4, стриатум. Опсег 64-кДа је мутирани хДИСЦ1 као визуелно приказан анти- миц МАБ (1: 1000); ГАПДХ - контрола оптерећења.

Слика пуне величине

Неуроразвојни ефекти мутантног хДИСЦ1

Претходне студије ин витро показале су улогу ДИСЦ1 у неуроразвоју. 25, 26, 34 Тако смо оценили ефекте мутантног хДИСЦ1 на мишји неуроразвој. Експресија мутантног хДИСЦ1 није била повезана са грубим оштећењима у развоју мишева дојиља или променама у начину размножавања и гнежђења код одраслих мишева. Нисмо пронашли разлике у телесној тежини између мутираних хДИСЦ1 двоструких трансгених мишева и њихових контрола легла (слика 3а). Мутантна хДИСЦ1 експресија није показала грубе абнормалности у морфологији мозга, стварању слојева и цито-архитектури кортекса или хипокампуса када је процењена на ПНДс 7, 21 или 80 (Слика 3б и подаци нису приказани). Супротно томе, мутирани хДИСЦл значајно је повећао волумен бочних вентрикула у мишева мерењем 9-месечним мишевима коришћењем МРИ, П <0, 05 (Слика 4). Није било ефекта мутантног хДИСЦ1 на укупни волумен мозга, П > 0, 05 (подаци нису приказани). Један од могућих узрока проширења можданих вентрикула у недостатку било какве промене укупне запремине мозга може бити смањење дендритичке арборизације у кортексу и хипокампусу. Стога су ефекти мутантног хДИСЦ1 на дендритичку морфологију процењени коришћењем примарних култура неурона. Схолл анализа показала је значајно слабљење неуритне сложености у примарним кортикалним неуронима прикупљеним из мутираних мишева у поређењу с примарним неуронима који су добијени из контрола легла. Двосмерне поновљене мере АНОВА су указивале на значајан ефекат генетске позадине, Ф (1, 116) = 8, 7, П = 0, 013, радијуса пуцања, Ф (8, 116) = 291, 5, П <0, 001 и позадине помоћу интеракције Ш радијуса, Ф (8, 116) = 2, 7, П = 0, 012 (слика 5). Пост хоц Холм-Сидак тест показао је да неурони контролних мишева постају сложенији неурити од неурона из мутираних мишева за прстенове с радијусом од 20–100 µм. Стога је експресија мутантног хДИСЦ1 повезана са значајно смањеном сложеношћу неурона неурита у примарним неуронима и значајним увећањем бочних вентрикула.

Image

Недостатак бруто ефеката мутантног хДИСЦ1 на мишји неуроразвој. ( а ) Упоредне телесне тежине код мушких мутаната и контролних (му = н ; 8; линија 1001, 4 мишева и линија 70, 4 мишева) и женских ( н = 8; линија 1001, 4 мишева и линија 70; 4 мишева) н = 8 за групе мушких и женских мишева мерено на ПНД 90. ( б ) Нема ефеката мутирајућег хДИСЦ1 на укупну цитоархитектонику или формирање слоја у кортексу (горњи панели) или хипокампусу (доњи панели); скале, 500 µм, Ниссл бојење, линија 1001.

Слика пуне величине

Image

Мутант хДИСЦ1 повећао је волумен бочних коморе у трансгених мишева. ( а ) Просечне слике мозга миша контролних и мутантних група. Дводелне пресеке извађене из 3Д слика са 60 кришки. ( б ) 3Д реконструкција мозга и вентрикула (зелена: бочни вентрикули, љубичаста: трећи и четврти клијет) из просечних слика контролних и мутираних мишева. Имајте на уму да се проширење вентрикула догађа у бочним клијетима код мутираних мишева, линија 1001. ( ц ) Квантитативна анализа ефеката мутантног хДИСЦ1 на количину бочних вентрикула. Студентов т- тест, * П <0, 05 у односу на контролне мишеве, н = 7 у свакој групи.

Слика пуне величине

Image

Мутантни хДИСЦ1 ослабио је неуритни раст примарних кортикалних неурона. Двострука имуно обојаност примарних неурона антитијелом антителом ( а, црвено) и антителом МАП-2 ( б, зелено); ( ц) спојена слика; бар скала, 20 µм. Анти-МАП-2 имуно обојаност примарних неурона добијених из контролног ( д ) или мутантних ( е ) мишјих заметака код ЕД 16. Напомена смањена је сложеност неуритне арборизације у примарним неуронима из мутираних ембриона у поређењу са контролним ембрионима. Представљене су репрезентативне слике; бар скала, 10 µм. ( ф) Детаљна анализа сложености неурита. Концентрични прстенови са повећаним радијусом су центрирани на ћелијском телу неурона, а број пресека неуритног лука са датим прстеном црта се у односу на полумјер прстена. Контрола ( н = 6) и мутирајуће неуронске културе ( н = 4, ред 70; н = 3, линија 1001) (најмање 50 неурона по култури) припремљени од засебних ембриона, * П <0, 05 за прстенове полупречника 20–100 µм .

Слика пуне величине

Ефекти мутантног хДИСЦ1 на синаптичке маркере и ДИСЦ1 интеракторе

Доступни подаци указују на то да ДИСЦ1 комуницира са различитим групама протеина који су укључени у молекуларне механизме миграције неурона, аксоналну и дендритску творбу и синаптогенезу. 36, 38, 52, 53 Да би се проценили могући молекуларни ефекти мутантног хДИСЦ1, проценили смо ниво протеина пре- (СНАП-25) и пост-синаптичких (ПСД-95) маркера и експресије ендогених мишјих ДИСЦ1, ЛИС1 и НДЕЛ1, протеини који ступају у интеракцију са ДИСЦ1. 21, 23 Код ПНД 7, експресија мутантног хДИСЦ1 значајно је смањила ниво протеина ендогених мишјих ДИСЦ1 и ЛИС1, П <0, 05 и нивоа протеина СНАП-25, П <0, 01, без ефеката на експресију НДЕЛ1 или ПСД-95 ( Слика 6). Примећено смањење експресије горе наведених протеина више није било присутно код мишева који су били стари 21 или 9 месеци (подаци нису приказани). Поред тога, наши експерименти са имунопреципитацијом показали су да се мутирани хДИСЦ1 може ин витро везати за миш ДИСЦ1 пуне дужине (допунска слика С3, Допунски материјали и бројке, на мрежи), што сугерише да би опажени ефекти могли бити посредовани доминантно-негативним ефектима мутантног протеина. .

Image

Мутант хДИСЦ1 смањио је ниво поремећене ин-схизофреније 1 (ДИСЦ1), ЛИС1 и СНАП-25 у предњи део мозга. ( а ) Вестерн блот за ендогени миш ДИСЦ1, ЛИС1; НДЕЛ1, ПСД-95 и СНАП-25. Као контрола оптерећења коришћена је глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (ГАПДХ). Приказане су репрезентативне мрље. ( б ) Квантитативна анализа нивоа протеина ендогених ДИСЦ1, ЛИС1 и НДЕЛ1 у мутантним и контролним узорцима мозга од 7-дневних мишића; * П <0, 05 у односу на контролу након Бонферрони корекције; Студентов т- тест, н = 5 узорака мозга у свакој групи, линија 1001. ( ц ) Квантитативна анализа нивоа протеина ПСД-95 и САНП-25 у мутантним и контролним узорцима мозга од 7 дана старих мишјих штенаца, * П <0, 05 у односу на контролу након Бонферрони корекције; Студентов т- тест, н = 5 узорака мозга у свакој групи, линија 1001.

Слика пуне величине

Ефекти понашања мутантног хДИСЦ1

Извели смо низ тестова понашања да бисмо проценили ефекте мутантног хДИСЦ1 на различите домене репертоара миша у понашању. Тестови су извођени на одраслим мишевима старости између 4 и 9 месеци. Нису пронађени ефекти експресије мутантног хДИСЦ1 на понашање миша у следећим тестовима: локомоција изазвана новостима на отвореном пољу, нивои анксиозности мерени повишеним плусом лавиринта, тестови олфакције или навикавања и ППИ акустичког теста реакције старта (Допунска слика С4, Додатни материјали и бројке, на мрежи).

На слици 7а приказани су подаци за спонтану активност (хоризонтална локомоторна активност) током 22-сатног периода код двоструких мутираних хДИСЦ1 трансгених мишева у поређењу са њиховим појединачним трансгеним тТА легломатерима. Прва два сата регистрације нису укључена у анализу јер вероватно представљају адаптивне одговоре мишева на ново окружење. Двосмерно поновљене мере АНОВА података за мушке мишеве показао је значајно већу спонтану локомоторну активност код мутираних мишева ( н = 8) у поређењу са њиховим одговарајућим контролама ( н = 7), позадински ефекат, Ф (1, 164) = 8, 7, П < 0, 05 и позадина временске интеракције, Ф (10, 164) = 4, 9, П <0, 05. Пост хоц Холм-Сидак тест показао је да су мутирани мушки мишеви били активнији од контролних мушких мишева током мрачног периода испитивања, П <0, 05. Код женских мишева, двосмерна поновљена мера АНОВА података за женке мишева ( н = 7 у свакој групи) није показала значајан ефекат позадине, Ф (1, 153) = 1, 4, П = 0, 25, мада, у поређењу са контролним женским мишевима, мишеви мутирани женке су у појединим временским интервалима показали нешто већу активност (слика 7а).

Image

Ефекти понашања мутантног хДИСЦ1. ( а ) Експресија мутантног хДИСЦ1 изазвала је значајну спонтану хиперактивност код мушких, али не и женских мишева. Спонтана хоризонтална активност мерена је током 22 сата. Интервали 1-6, тамно време циклуса; интервале 7–11, време светлосног циклуса. Имајте на уму повећану локомоторну активност код мушких двоструких трансгених животиња (линија 70) у поређењу са њиховим мушким контролним мишевима. ( б ) Леви панел, смањена друштвена неагресивна активност код мушких мутантних хДИСЦ1 трансгеничних мишева мерено дијадичким тестом мужјака и мушкараца. Забиљежите значајно смањење укупног времена друштвене интеракције и времена проведеног њушећи или пратећи партнера у мутираним трансгеничним мишевима (укупно н = 15, укључујући н = 7, ред 70 и н = 8, ред 1001) у поређењу са њиховим леглама тТА контроле ( н = 12). Десна плоча - значајно повећала агресивност мушких мутантних хДИСЦ1 трансгених мишева. Имајте на уму значајно повећање броја напада, уједа или звецкања репа код мутантних и тТА легла контролних мишева. * П <0, 05 у односу на контролне мишеве. ( ц ) Леви панел, нема значајних ефеката мутантног хДИСЦ1 на учење локације скривене платформе код женских мутантних хДИСЦ1 трансгеничних мишева у Моррис тесту лабиринта водом. Десни панел, просторна меморија скривене платформе током покуса сонде код женских мутантних хДИСЦ1 трансгеничних мишева. Имајте на уму да су контролне женке мишева провеле значајно више времена у циљном квадранту у поређењу са мутантима хДИСЦ1 женских мишева. * П <0, 05 у односу на контролне мишеве, н = 8 животиња у свакој групи (ред 70). Нису пронађени значајни ефекти мутантног хДИСЦ1 на просторно учење и памћење код мушких мишева (подаци нису приказани).

Слика пуне величине

Мужјаци мутирани мутанти провели су значајно мање времена у друштвеној неагресивној интеракцији са својим партнерима, мерено дијадијским тестом. Постоје значајне разлике између две групе у укупном времену друштвене интеракције, т = 2, 3, дф = 25, П = 0, 03 и времену њушкања, Манн-Вхитнеи тест, Т = 210, 5, н (мали) = 12, н (велики) = 15, П = 0, 04. Запажени пад друштвене активности праћен је повећаном агресивношћу мутираних мушких мишева (слика 7б). Било је значајних разлика између мушкараца из две групе у броју напада, Манн-Вхитнеи тест, Т = 110, н (мали) = 12, н (велики) = 15, П = 0, 005; у броју угриза, Манн-Вхитнеијев тест, Т = 119, 5, н (мали) = 12, н (велики) = 15, П = 0, 019 и броју репних звекета, Т = 129, 0, н (мали) = 12, н (велика) = 15, П = 0, 04. Ове промјене у друштвеној интеракцији мушкарац-мушкарац нису биле повезане са промјенама тестова укупне друштвености или социјалне склоности код мушких мутираних мишева (Супплементарни материјали и бројке, на мрежи).

Како је у хипокампусу био присутан снажан израз мутантног хДИСЦ1 (слика 5), МВМ је коришћен за процену ефеката мутантног хДИСЦ1 на просторно учење и меморију зависну од хипокампуса. Нисмо пронашли ефекте мутантног хДИСЦ1 на способност миша да научи локацију платформе током сесија видљиве или скривене платформе (Слика 7ц и подаци нису приказани за мушке мишеве). Међутим, експресија мутираног хДИСЦ1 ослабила је просторну меморију у покусу сонде код женских, али не и мушких мишева. Двосмерни АНОВА-и за циљни квадрант показали су значајан ефекат генетске позадине, Ф (1, 27) = 10, 2, П = 0, 009; пол, Ф (1, 27) = 14, 9, П = 0, 003 и пол по позадини, Ф (1, 27) = 7, 54, П = 0, 019. Пост хоц Холм-Сидак тест показао је да су, у поређењу са контролним женским мишевима, мутантне мишеви провели значајно мање времена у циљном квадранту где је била платформа током сесије скривене платформе, П <0, 05.

Дискусија

Генерирали смо нови ин виво модел индуцибилне експресије мутантног хДИСЦ1 у предњим мозговима мишјег мозга. Садашњи резултати показују да пренатална експресија мутантног хДИСЦ1 у неуронима кортекса, хипокампуса и стриатуму није довела до грубих оштећења у развоју код мишева, већ је довела до пригушења раста неурита и благог повећања латералних вентрикула. Поремећаји мозга били су повезани са смањеним нивоом ендогених мишјих ДИСЦ1, ЛИС1 и СНАП-25 и са повишеном спонтаном хиперактивношћу и променама у друштвеној интеракцији код мушких мишева и оштећеним просторним памћењем код женских мишева.

Пошто је експресија трансгена под контролом промотора ЦАМКИИ, мутирани протеин, као што се очекивало, детектиран је у неуронима предњег мозга, али не и у глиалним ћелијама. 41 Важна карактеристика мишјег модела је индуцибилна пренатална експресија мутантног протеина, која омогућава будућа испитивања времена деловања протеина на неуроразвојне фенотипе релевантне за шизофренију и придружене болести. Чињеница да смо били у стању да откријемо експресију мутантног протеина већ ЕД15 није у нескладу с доступним подацима, што указује да максимална активност ЦАМКИИ промотора долази у прве две постнаталне недеље. 41 У двоструком трансгеничком систему, пренатална активност ЦАМКИИ промотора је сама по себи део трансгена и на тај начин се може регулисати нешто другачије од ендогеног ЦАМКИИ промотора.

Једна потенцијална слабост модела је да су мутирани мишеви узгајани на сложеном хибридном Б6; СЈЛ; ЦБА позадини, што може повећати фенотипску променљивост. Међутим, робусни ефекти мутантног хДИСЦ1 су очигледно очигледни, што омогућава почетне студије док нису доступне конгеницне линије. Без обзира на то, прилика за регулисање експресије мутантног хДИСЦ1 је предност модела, омогућавајући проучавање времена ефеката мутантног хДИСЦ1 на развој мозга и понашања.

Мутант хДИСЦ1 није произвео грубе недостатке у развоју мишјег мозга и понашања. Међутим, експресија мутантног хДИСЦ1 била је повезана са благим увећањем бочних коморе у мишева без изразите промене укупне величине мозга. Ове промене могу настати услед измена у изради или сложености дендритата. Доследно, примарни кортикални неурони добијени из мутираних ДИСЦ1 ембриона миша у ЕД16 стварали су значајно мање сложене и разрађене неуритне луке у поређењу с примарним неуронима контролних ембриона. Неуронски ефекти мутантног хДИСЦ1 слични су неким неуропатолошким карактеристикама шизофреније, укључујући повећане количине вентрикула и смањену дужину дендрита у кортексу и хипокампусу. 35, 36, 54 Садашњи ефекти неурона такође су у сагласности с претходним ин витро експериментима и подржавају хипотезу да ДИСЦ1 може бити укључен у механизме сазревања и диференцијације неурона ин виво . 39, 55, 56

Генерирали смо нови трансгени модел да проценимо неуробехевиоралне ефекте мутантног хДИСЦ1 протеина за који је претпостављено да је протеински производ транслокације, присутан у шкотском педигреу. 9, 39, 57 Наш модел миша пружа важно запажање да је експресија мутантног хДИСЦ1 изазвала значајно смањење нивоа протеина ендогеног мишјег ДИСЦ1. С обзиром на садашње податке да се мутирани хДИСЦ1 везује за дивљи тип миша ДИСЦ1, наша открића изгледају у складу са доминантно-негативним механизмима које су изнела претходна ин витро испитивања. 34, 57

Експерименти су показали значајно смањење нивоа протеина ЛИС1, интерактивног протеина који формира молекулски комплекс са ДИСЦ1 и НУДЕЛ и који је укључен у развој неурона. 24, 26, 28 Смањење ЛИС1 експресије у нашем моделу миша слично је недавном запажању у нашем ПЦ12 стабилном моделу индуцибилне експресије, 57 што указује да се слични механизми мутантног хДИСЦ1 деловања могу појавити и у ћелијским и мишјим моделима. Други интригантни аспект смањеног нивоа ЛИС1 код трансгених мишева је његова сличност смањеној експресији ЛИС1 у можданом ткиву код пацијената са шизофренијом. 58 Да ли су промене нивоа ЛИС1 последица промене експресије ендогеног ДИСЦ1 или су последица директних ефеката мутантног хДИСЦ1, разјасниће се у будућим експериментима.

Смањење експресије СНАП-25 је у складу са атенуираним растом неурита у примарним културама и одговара подацима о постмортему човека који су показали нижи ниво синаптичких протеина код пацијената. 52, 53, 59, 60 Промјене нивоа протеина ДИСЦ1, ЛИС1 или СНАП-25 пронађене су у мишевима старијих 7 дана и више нису присутне у старијих мишева. Овај развојни образац у складу је са доступним подацима да рани и пролазни поремећаји у развојним програмима током развоја мозга могу произвести болест понашања која се манифестује у одраслој доби. 6, 61

Индуцибилна експресија мутантног хДИСЦ1 у предњем мозгу резултирала је бројним понашањима која су била повезана са шизофренијом. 1, 2, 62 Интригантно је да су ефекти понашања мутираних хДИСЦ1 били зависни од пола. Док су мутирани ДИСЦ1 трансгени мушки мишеви показали повећану спонтану локомоторну активност и измењено друштвено понашање, мутирани хДИСЦ1 трансгени женски мишеви показали су оштећење у просторној референтној меморији. Повећана моторичка активност код мушких трансгених мишева важно је обиљежје тренутних фармаколошких модела шизофреније јер је хиперлокомоција повезана са позитивним симптомима шизофреније. 63, 64 Ненормална социјална интеракција, односно смањена неагресивна друштвена активност, може бити у корелацији са негативним симптомима болести. 1, 2

Наши резултати показују да је мутирана експресија мутантног хДИСЦ1 довела до оштећења просторне меморије (покуса сонде) без значајног утицаја на перформансе мишева током тренинга. Примјећено је да испитивање сонде одражава просторно учење боље од мјере кашњења бијега током обуке. 65 Остаје нејасно зашто су само трансгенични женски мишеви показали такав селективни дефицит у когнитивном домену. Клиничка испитивања показала су значајне разлике у полној сизофренији: старосна доб, преморбидна личност, подтипови шизофреније, психосоцијалне функције и реакције на терапију. 4, 66, 67 С обзиром на улогу естрогена у развоју и функционисању хипокампуса, 68 процењујући ефекте мутантног хДИСЦ1 на ниво естрогена и експресију рецептора естрогена у хипокампусу, мождана регија са јаком експресијом мутантног хДИСЦ1, може се показати обећавајућим. за будуће студије.

Укратко, наша студија представља први модел миша индуцибилне експресије мутантног хДИСЦ1 у предњим облацима. Показујемо да експресија мутантног хДИСЦ1 није произвела грубе неуроразвојне абнормалности, већ је довела до благог проширења латералних вентрикула и атенуирања пораста неурита у примарним неуронима. Ове морфолошке промене повезане су са смањеним нивоом протеина ендогених мишјих ДИСЦ1, ЛИС1 и СНАП-25. У поређењу са њиховим контролама легла подметача, мутирани мушки мишеви су показали спонтану хиперактивност на отвореном пољу и промене у друштвеној интеракцији, док су трансгени женски мишеви показали недостатну референтну просторну меморију. Ова студија сугерира да наш мишји модел индуцибилне експресије мутантног хДИСЦ1 може бити вредан ин виво систем за будућа испитивања патогенезе шизофреније.

Додатне информације

Ворд документи

  1. 1.

    Допунски материјал

Датотеке слика

  1. 1.

    Допунска слика С1

  2. 2

    Допунска слика С2

  3. 3.

    Допунска слика С3

  4. 4.

    Допунска слика С4

    Додатне информације прате рад на веб локацији Молекуларна психијатрија (//ввв.натуре.цом/мп)