Ослобађање интрацелуларног Ца2 + кроз ријанодинске рецепторе доприноси дисфункцији митохондрија посредованој ампа рецепторима и стресу у олигодендроцитима | ћелијска смрт и болест

Ослобађање интрацелуларног Ца2 + кроз ријанодинске рецепторе доприноси дисфункцији митохондрија посредованој ампа рецепторима и стресу у олигодендроцитима | ћелијска смрт и болест

Anonim

Субјекти

  • Апоптоза
  • Метаболичке болести
  • Олигодендроцит
  • Секреција

Апстрактан

Прекомерна активација ионотропних рецептора глутамата у олигодендроцитима изазива цитосолно Ца2 + преоптерећење и ексцитотоксичну смрт, процес који доприноси демијелинизацији и мултипле склерози. Екситотоксичне увреде изазивају добро окарактерисане промене митохондрија и дисфункцију ендоплазматског ретикулума (ЕР), што није у потпуности схваћено. У овом истраживању, анализирали смо допринос ослобађања ЕР-Ца 2+ преко рјанодинских рецептора (РиРс) и инозитол трифосфатних рецептора (ИП 3 Рс) ексцитотоксичности у олигодендроцитима ин витро . Прво, приметили смо да олигодендроцити изражавају све претходно окарактерисане РиР и ИП 3 Р. Блокада Ца 2+ -индуцираног ослобађања Ца2 + од стране ТМБ-8 после α -амино-3-хидроксил-5-метил-4-изоксазол-пропионат (АМПА) рецептора посредованих рецепторима ослабила је и смрт олигодендроцита и цитосолно преношење Ца 2+ . Заузврат, инхибиција РиР-а ријанодином смањила је и преоптерећење Ца 2+, док инхибиција ИП3Р није била ефикасна. Поред тога, деполаризација митохондријалне мембране изазвана АМПА, оксидативни стрес и активирање каспазе-3, што је у свим случајевима смањено инхибицијом РиР. Поред тога, приметили смо да АМПА индукује реакцију реакције на стрес као што је откривено α подјединицом фактора еукариотске иницијације 2 α фосфорилацијом, прекомјерном експресијом ГРП-капенера и цепањем каспазе-12, зависним од РиР-а. Коначно, слабљење ЕР стреса са салубринално заштићеним олигодендроцитима од ексцитотоксичности АМПА. Заједно, ови резултати показују да ослобађање Ца 2+ кроз РиРс доприноси цитосолном преоптерећењу Ца 2+, дисфункцији митохондрија, ЕР стресу и ћелијској смрти након ексцитотоксичности посредоване АМПА рецепторима у олигодендроцитима.

Главни

Олигодендроцити, мијелинске ћелије ЦНС-а, изражавају функционалне ионотропне рецепторе глутамата, 1 који могу изазвати смрт ћелија и ин виво и ин витро. 2, 3 Стога је значај ексцитотоксичности глутамата за неуроне у акутној повреди ЦНС-а и хроничним неуродегенеративним поремећајима 4 проширен на олигодендроците и демијелинизационе болести попут мултипла склерозе (МС). 5

Митохондрије су пресудне за интрацелуларну хомеостазу Ца2 + и нагомилавање Ца2 + изазваних ексцитотоксичним увредама доводи до деполаризације митохондријалне мембране, повећане производње радикала без кисеоника и смрти олигодендроцита зависне од каспазе. 6. Заузврат, ендоплазматски ретикулум (ЕР) је такође критичан за хомеостазу Ца 2+ и његов стрес доприноси демијелинизацијским поремећајима. 7 ЕР служи као робна трговина Ца2 + која се брзо мења и доприноси каскади сигнализације цитосолне Ца2 + ослобађањем Ца 2+ углавном преко ријанодинских (РиР) и инозитол трифосфатних (ИП3Р) рецептора. 8 Породица РиР има три изоформе, све се експримирају у мозгу и има више алостеричних места везања Ца2 + која су одговорна за покретање Ца2 + -индукованог ослобађања Ца2 + (ЦИЦР) на цитосол. 9 ИП 3 Р (изоформи И, ИИ и ИИИ) се такође експримирају у мозгу и активирају Инс (1, 4, 5) П3, метаболички продукт активности фосфолипазе Ц (ПЛЦ), а регулишу се и ИП 3 -невисни путеви. 10 Ови РиР / ИП 3 Р имају централну улогу у преживљавању ћелија као и у апоптотској ћелијској смрти. 11

ЦИЦР од ЕР може активирати апоптозу зависну од митохондрије узрокованом Ца2 + преоптерећењем овом органелом. Заиста, ЕР и митохондрији су физички и функционално повезани микродоменима, који укључују РиРс и ИП 3 Рс. 12, 13 Тако сигнализација Ца2 + између ових органела може иницирати апоптозу путем митохондрија специфичних токсичних догађаја. 14 Поред тога, ЕР може да индукује апоптозу унутрашњим путевима активираним оштећењем функције ЕР. Нарочито, акумулација растворених протеина или исцрпљивање Ца2 + из ЕР покреће нераспоређени протеин протеина (УПР) 15 активирањем ПЕРК / α подјединице еукариотске фазе иницијације 2 (еИФ2) α . 16 УПР доводи до заустављања превођења и прекомерне експресије ГРП-ових цхаперона како би се вратио капацитет савијања протеина ЕР. Међутим, под јаким стресом, сама ЕР може изазвати апоптозу активирањем каспазе-12, која се активира у поремећају хомеостазе Ца 2+ и накупљања вишка протеина унутар ЕР. 17

ЕР стрес и ексцитотоксичност су повезани са демијелинизацијским поремећајима, али док је веза између ова два феномена описана у неуронима, 18, 19, остала је непозната у олигодендроцитима. У овом истраживању истражили смо допринос ослобађања ЕР-Ца 2+ у олигодендроглиалној ексцитотоксичности ин витро . У овом истраживању показујемо да активирање рецептора α -амино-3-хидроксил-5-метил-4-изоксазол-пропионат (АМПА) индукује ЕР стрес и последичну активацију каспазе-12, као и цитосолно Ца2 + преоптерећење и митохондријске дисфункције, које све зависе од ослобађања ЕР-Ца 2+ кроз РиРс.

Резултати

РиРс и ИП3Р су изражени у култивираним олигодендроцитима

И РиРс и ИП3 Рс су широко описани у ЦНС 20, 21 иако специфична расподела ових рецептора по мозгу остаје нејасна. Да бисмо потврдили експресију различитих РиР и ИП 3 Р изоформи у нашем ин витро моделу олигодендроглиал, извели смо имунофлуоресцентно обележавање за сваки изоформ и основни протеин мијелина (МБП) као специфични олигодендроглиални маркер. Олигодендроцити су показали коекспресију три изоформе ИП 3 Р (И, ИИ и ИИИ) и МБП (слика 1). Имунофлуоресценција и коекспресија су такође били позитивни за три изоформе РиР (слика 1). Двоструко имунофлуоресцентно бојење коришћењем МБП антитела открило је да се ИП 3 Р / РиР изоформа и МБП коекспресија јављају углавном дуж тела и проксималних процеса зрелих олигодендроцита који стварају мијелин. Заједно, ови резултати показују да су три изоформе ИП 3 Р и РиР присутне у нашим ин витро олигодендроцитима добивеним из оптичког нерва штакора.

Image

ИП3 Рс и РиРс су изражени у култивираним олигодендроцитима. Олигодендроцити (основни протеин мијелинског основног протеина (МБП), црвени) су обојени антителом на ИП 3 РИ, ИИ, ИИИ и на РиР-И, ИИ, ИИИ (оба зелено). Коекспресија рецептора и МБП имунофлуоресценција су приказани у спојеним сликама (жуто). Свих шест изоформи су изражени у МБП + ћелијама. Линија скале: 50 μ м

Слика пуне величине

Блокирање ослобађања ЕР Ца 2+ путем РиРс смањује цитосолно Ца 2+ преоптерећење и ексцитотоксичност у олигодендроцитима

Активација АМПА рецептора индукује пораст нивоа цитосолне Ца2 + која је довољна да покрене ексцитотоксичност у узгојеним олигодендроцитима, без захтева уноса Ца 2+ кроз напонски активиране канале нити На + -Ца 2+ измењивач. 22 Да би проучиле допринос ослобађања ЕР-Ца 2+ олигодендроглиалној ексцитотоксичности, ћелије су биле изложене повећаним концентрацијама АМПА у присуству или одсуству ЦИЦР инхибитора ТМБ-8. 23 АМПА (25–100 µМ) изазвао је ћелијску смрт 34, 1 ± 3, 6 до 52, 3 ± 3, 7% контроле (необрађене ћелије, н = 4), што је значајно смањено у присуству ТМБ-8 (слика 2а). Међутим, селективни инхибитор РиР рианодин 9 није био заштитни (Слика 2б).

Image

Инхибиција отпуштања ЕР Ца 2+ смањује ексцитотоксичност изазвану АМПА и преоптерећење цитосолним Ца2 + у олигодендроцитима. ( а, б ) Токсичност коју индукује АМПА значајно је смањена ТМБ-8, али не и ријанодином. Олигодендроцити (ДИВ 1) су претходно третирани са ТМБ-8 (50 µМ, 30 мин) или рианодином (50 µМ, 45 мин) и изложени повећаним концентрацијама АМПА у присуству ЦТЗ (100 µМ). Животна способност квантификована је 24 сата касније калцеин-АМ методом. Подаци представљају средњу вредност ± СЕМ нормализованих вредности флуоресценције калцеин-АМ за најмање н = 4 културе. Статистичка значајност процењена је т- тестом ( * П <0, 05) и двосмерном анализом варијанције (АНОВА) ( П = 0, 034). ( ц ) АМПА (25 µМ ) заједно са ЦТЗ (100 µМ) индукује брзо повећање цитосолног Ца2 +, што се значајно смањује у присуству рианодина (50 µМ) и ТМБ-8 (50 µМ) али не 2-АПБ (10 µМ ). Неурони су били напуњени са Фура-2 АМ током 30 минута пре примене лека. Трагови представљају временски ток [Ца 2+ ] и (значи ± СЕМ) током излагања агонисту три независна експеримента

Слика пуне величине

Да бисмо анализирали допринос ЦИЦР-а, нарочито РиР-а и ИП3Р-а, цитосолном Ца2 + узрокованом АМПА-ом, мерењем микрофлуориметрије измерили смо интрацелуларну концентрацију Ца 2+ ([Ца 2+ ] и ) након примене АМПА ( 25 μМ) до олигодендроцита у присуству ТМБ-8 (50 μМ), рианодина (50 μМ) и ИП3Р инхибитора 2АПБ (10 μМ). 24 У олигодендроцитима стимулираним АМПА [Ца 2+ ] повећао сам се на 841 ± 65 нМ ( н = 78 ћелија), ефекат који је у великој мери смањен у присуству ТМБ-8 (492, 3 ± 67, 4, н = 33 ћелија) и рианодина (264 ± 23 нМ, н = 96 ћелија; Слика 2ц). Међутим, инхибиција ИП3Р од 2АПБ (10 µМ) није значајно ослабила [Ца 2+ ] (Слика 2ц). Ови резултати показују да отпуштање Ца 2+ кроз РиРс, али не и преко ИП 3 Р, доприноси цитосолном преоптерећењу Ца2 + изазваном АМПА и ексцитотоксичношћу у олигодендроцитима.

Инхибиција РиРс смањује митохондријално оштећење изазвано АМПА и активирање каспазе-3 у олигодендроцитима

Унос митохондрија Ца 2+ током ексцитотоксичних увреда изазива деполаризацију мембране као и стварање реактивних врста кисеоника (РОС) у узгојеним олигодендроцитима штакора. Како митохондрија и ЕР могу комуницирати путем РиР-а, 25, анализирали смо да ли инхибитор РиР-а може ослабити митохондријску дисфункцију као последица експитотоксичности изазване АМПА.

Прво смо користили ДЦФДА за мерење гена РОС у олигодендроцитима стимулисаним АМПА (25 µМ, 5 мин) након 30 минута увреде. У тим експерименталним условима, изложеност АМПА повећала је ниво РОС до 46, 9 ± 11, 2%, н = 7 у поређењу са контролом (необрађене ћелије, 100%). Ове нивое је значајно ослабио ријанодин (10 µМ) на 11, 8 ± 6, 9%, н = 7 (слика 3а).

Image

Блокада РиР смањује оксидативни стрес, митохондријску деполаризацију и апоптозу узроковану АМПА. ( а ) Рианодин смањује настајање РПА изазваних АМПА у узгојеним олигодендроцитима. Ћелије су стимулисане АМПА (25 µМ, 5 мин) плус ЦТЗ (100 µМ) у присуству рианодина (10 µМ). РОС нивои су квантификовани на 30 мин након увреде коришћењем ЦМ-Х2ДЦФДА сонде (30 μМ). Подаци представљају средњу вредност ± СЕМ% ЦМ-ДЦФДА / калцеин-АМ н = 7 култура. ( б ) Инхибиција отпуштања ЕР Ца2 + путем РиРс смањује деполаризацију митохондријалне мембране изазване АМПА. Ћелије су стимулисане АМПА (25 µМ, 5 мин) и ЦТЗ (100 µМ) у присуству рианодина (10 µМ), а потенцијал митохондријске мембране је мерен коришћењем флуоресцентног бојила ЈЦ-1 1 х након примене АМПА. Подаци представљају нормализоване средње вредности ± СЕМ односа ЈЦ-1 црвена / зелена флуоресценција н = 6 култура. ( ц ) Расцјеп каспазе-3 се смањује у присуству ријанодина у олигодендроцитима стимулисаним АМПА. Ћелије су биле изложене АМПА (25 µМ, 5 мин) плус ЦТЗ (100 µМ) након преинкубације с рианодином (10 µМ) и сакупљене 4 х касније за детекцију пропаспазе-3 Вестерн блот-ом. Подаци представљају оптичку густину нивоа пропаспазе-3 нормализоване на вредности β -актина н = 4 културе. ( д ) Активност каспазе-3 изазвана АМПА је смањена у присуству рианодина. Ћелије су биле изложене АМПА (25 μМ , 5 мин) и ЦТЗ (100 μМ) и Цаспасе-Гло 3/7 реагенс је додат 1 сат касније. Након 2 сата измерен је луминесцентни сигнал, а подаци представљају средњу вредност ± СЕМ вредности луминесценције нормализованих на вредности животне ћелије (калцеин-АМ, 1 μМ) за свако стање н = 5 култура. # П <0, 05, ## П <0, 01 у поређењу са контролом (необрађене ћелије); * П <0, 05 у поређењу са контролом (само АМПА), упарени Студент-ов т- тест

Слика пуне величине

Следеће смо испитивали да ли је митохондријска деполаризација утицала на рајанодин после ексцитотоксичне увреде. Олигодендроцити су стимулисани АМПА (25 µМ, 5 мин) и потенцијали митохондријалне мембране су мерени 1 х касније коришћењем флуоресцентног бојила ЈЦ-1. АМПА индукује у олигодендроцитима губитак деполаризације митохондријалне мембране до 79, 01 ± 4% контроле (необрађене ћелије, н = 6), што је значајно смањено рианодином (91, 6 ± 3, 8% контроле, н = 6) (Слика 3б).

Претходне студије су показале да субмаксимална активација АМПА рецептора доводи до апоптозе у олигодендроцитима. 6 Како овом процесу углавном претходи дисфункција митохондрија и активирање каспаза, затим смо анализирали да ли ослобађање ЕР-Ца 2+ кроз РиРс доприноси овој апоптотичкој каскади. У олигодендроцитима стимулисаним АМПА (25 μМ , 5 мин) ниво протеина про-каспаза-3 (неактиван), 4 сата након стимулуса, смањен је на 57, 3% у поређењу са ћелијама које нису третиране (контрола, 100%), карактеристика која је инхибирана у присуству рианодина (107.1% контроле) (слика 3ц). Да би се потврдила активација каспаза-3, активност одцепљене каспазе-3 квантификована је луминесцентним методама. У олигодендоцитима третираним АМПА (25 μМ , 5 мин) активност одцепљене каспазе-3 повећала се на 120, 7 ± 2, 6% у поређењу са контролом (необрађене ћелије, 100%), док је лечење рианодином значајно смањило активност на 104, 3 ± 9, 8%, н = 5 (слика 3д) Ови резултати заједно показују да ослобађање Ца Ца 2+ кроз РиР доприноси митохондријској дисфункцији и последичној апоптози.

АМПА посредована ексцитотоксичност индукује одговор на стрес код олигодендроцита

Неурони се подвргавају ЕР стресу током ексцитотоксичности изазване Ца2 + дисхомеостазе, 18, 19 ефекта који може посредовати РиРс. 26 Да бисмо истражили да ли АМПА индукује ЕР стрес у култивисаним олигодендроцитима, анализирали смо фосфорилацију еИ2Ф α , низводног циља ЕР сензора за стрес ПЕРК, као и регулацију цхаперона, као што је протеин 78 регулисан глукозом (ГРП78) и ГРП94 . АМПА стимулус (25 µМ, 5 мин) произвео је снажну фосфорилацију еИФ2 α , као и тхапсигаргин (5 µМ, 30 мин), који индукује трошење складишта блокирајући уношење ЕР Ца 2+ и служи као позитивна контрола (слика 4а) . АМПА је покренуо пораст пеИФ2 α на 474, 2 ± 107, 6%, н = 4, у поређењу са ћелијама које нису третиране (контрола, 100%) (Слика 4б). Следеће смо анализирали ниво протеина ГРП78 и ГРП94 током исте ексцитотоксичне увреде и открили смо да су обе регулиране, до 169, 3 ± 38, 9 и 144, 5 ± 21, 8% контроле (нелијечене ћелије, 100%), респективно (Слика 4ц). Ови резултати указују да ексцитотоксичне увреде посредоване АМПА рецепторима индукују ЕР стрес и накнадни УПР у култивираним олигодендроцитима.

Image

АМПА индукује реакцију на стрес на олигодендроците ин витро . ( а ) Екситотоксичне увреде изазивају пораст нивоа пеИФ2 α у олигодендроцитима. Ћелије су стимулисане АМПА (25 µМ, 5 мин) заједно са ЦТЗ (100 µМ) и тхапсигаргином (5 µМ, 30 мин), фиксиране 30 мин касније и обележене антителом против пеИФ2 а . Линија скале: 50 μ м. ( б ) Укупни протеински узорци су екстраховани након инкубације АМПА (25 μМ, 5 мин, А25) и нивоа еИФ2 α и пеИФ2 α квантификовани су Вестерн блотом. Подаци представљају средњу вредност ± СЕМ оптичке густине нивоа пеИФ2 α , нормализованих на вредности β -актина н = 4 културе. ( ц ) Екситотоксичност индукује повећање регулације ГРП-апероне у олигодендроцитима. Укупни протеински узорци су екстраховани 30 мин након АМПА (25 μМ, 5 мин, А25) плус ЦТЗ (100 μМ) стимулуса и ГРП78 и ГРП94 су идентификовани од стране Вестерн блот-а коришћењем антитела анти-КДЕЛ секвенце. Подаци представљају средњу вредност ± СЕМ вредности оптичке густине нормализоване на одговарајући β- актински сигнал н = 8 култура. * П <0, 01 у поређењу са нелијеченим ћелијама; упарени Студент'с т -тест

Слика пуне величине

АМПА производи апоптозу ЕР-а изазвану стресом у олигодендроцитима

Јаки или дуготрајни ЕР стрес угрожава одрживост ћелијске смрти, механизам који може бити укључен у патофизиологију можданих болести. 27 Да бисмо анализирали да ли изазвана ЕР апоптоза доприноси ексцитотоксичности у олигодендроцитима, анализирали смо активацију каспазе-12, која борави на спољашњој страни ЕР мембране и цепа се и активира током ЕР стреса. 17 Ћелије стимулисане АМПА (25 и 100 µМ , 5 мин) подвргнуле су се цепању каспазе-12 како је назначено нивоима про-каспазе-12, који су снижени на 80, 7 ± 4%, н = 8 и 65, 4 ± 15, 9%, н = 5, у поређењу са нелијеченим ћелијама (100%), респективно (Слика 5а). У присуству рианодина, одцепљење каспаза-12 изазвано АМПА значајно је смањено на 101 ± 8, 3% контроле, н = 7 (слика 5б).

Image

ЕР-зависна апоптоза изазвана стресом доприноси ексцитотоксичности. ( а ) АМПА (25 и 100 µМ ) плус ЦТЗ (100 µМ ) индукује цепање каспазе-12 овисно о дози. Ћелије су стимулисане током 5 минута, укупни протеински екстракти су припремљени 1 сат касније и про-каспаза-12 је детектована од стране Вестерн блот-а коришћењем специфичног антитела. Подаци представљају средње вредности ± СЕМ вредности оптичке густине каспазе-12, нормализоване на вредности β- актина н = 8 и н = 5 култура. ( б ) Цепање про-каспазе-12 је смањено у присуству рианодина (10 µМ, 45 мин) у олигодендроцитима стимулисаним АМПА. Подаци представљају средње вредности ± СЕМ вредности оптичке густине каспазе-12 нормализоване на вредности β- актина н = 8 култура. ( ц ) Смрт за олигодендроглију изазвану АМПА смањује се салубринал (Сал), инхибитором апоптозе ЕР-стреса. Култивиране ћелије биле су изложене АМПА (25 μМ , 5 мин) и ЦТЗ (100 μМ ) након третирања са Сал 10 и 50 μМ током 30 минута. За одређивање ћелијске смрти, 24 сата касније коришћено је витално бојило калцеин-АМ ( н = 4 културе). Подаци представљају нормализовано средство ± СЕМ # П <0, 05; ## П <0.01 у поређењу са ћелијама које нису третиране. * П <0, 05 у поређењу са самим АМПА; упарени Студент'с т -тест

Слика пуне величине

Коначно, анализирали смо да ли је апоптоза зависна од стреса укључена у ексцитотоксичност АМПА. У том циљу тестирали смо заштитни потенцијал салубринала, инхибитора п-еИФ2 α депосфорилације, за који је доказано да олакшава ЕР апоптозу стреса. 28 АМПА индукована ћелијска смрт ублажена је са 13% контролне групе (не-третиране ћелије, 0%) на 6.4 ± 1.3 и 7.5 ± 2.6% салубриналним третманима 10, односно 50 µМ, респективно (Слика 5ц). Заједно, ови резултати сугерирају да АМПА индукује реакцију на стрес на олигодендроците, што доприноси ексцитотоксичности активацијом каспазе-12, а то зависи од РиРс.

Дискусија

ЕР Ца 2+ дисхомеостаста, ЕР стрес и неуродегенерација уско су повезани јер исцрпљивање ЕР складишта узрокује увећање ЕР маркера стреса и смрт неурона. 15 У овом истраживању показујемо да ослобађање ЕР-Ца 2+ доприноси цитосолном преоптерећењу цитосоном Ца 2+ изазваном АМПА и дисфункцији митохондрија што доводи до апоптозе у олигодендроцитима. Поред тога, показујемо да ексцитотоксичне увреде на олигодендроците изазивају ЕР стрес и активирање каспазе-12, што је ублажено блокирањем РиР-а. Ови подаци пружају нове доказе о повезаности ексцитотоксичности и ЕР стреса у олигодендроцитима.

Експресија РиР и ИП 3 Р у олигодендроцитима

ИП3 Рс и РиРс су експресионирани у неуронима и глији, а мобилизација Ца2 + путем ових рецептора има пресудну улогу у сигнализацији Ца2 + у овим ћелијама. 29 Међутим, већина претходних истраживања која се тичу експресије ових рецептора у мозгу не разликују различите изоформе или ћелијске типове. Да бисмо проценили експресију РиРс и ИП3Р у олигодендроцитима ин витро , спровели смо експерименте имунофлуоресценције да бисмо испитали присуство свих раније описаних изоформа ових рецептора у овим ћелијама. Имуно обележавање за РиРс било је позитивно за три изоформе у култивираним олигодендроцитима, налаз који потврђује и проширује оне који су извештавани у претходној студији о експресији РиР у овим ћелијама који нису разликовали различите изоформе. 21 Поред тога, открили смо да су три изоформи ИП 3 Р такође присутни у олигодендроцитима, што је у великој мери у складу са имунохистохемијским истраживањима мозга штакора. 20

Ослобађање и ексцитотоксичност ЕР-Ца 2+

Претходно смо показали 18 да ослобађање ЕР-Ца 2+ доприноси ексцитотоксичности неурона, али још увек нема снажних доказа о повезаности између ослобађања ЕР-Ца 2+ и ексцитотоксичности у олигодендроцитима. После процене присуства РиРс и ИП 3 Р у олигодендроцитима ин витро , анализирали смо допринос ослобађања ЕР-Ца 2+ у цитосолном Ца2 + преоптерећењу и ћелијској смрти индукованој ексцитотоксичном увредом. Прво, приметили смо да је прототипски интрацелуларни антагонист Ца2 + ТМБ-8, за који се показало да инхибира ЦИЦР-посредовани РиР-ом, 23 ослабио егзитотоксичну ћелијску смрт у олигодендроцитима. Овај резултат је у сагласности са претходним студијама спроведеним у узгојеним ћелијама церебеларних гранула које су ТМБ-8, 30 заштићене од неуротоксичности глутамата и сугерише да ЕР може допринети ексцитотоксичности изазивањем ЦИЦР-а у олигодендроцитима изложеним АМПА. Код неурона, ЦИЦР углавном посредује РиРс и мада рианодин смањује ексцитотоксичност у овим ћелијама18, нисмо приметили конзистентни заштитни ефекат овог антагониста у олигодендроцитима у коришћеној експерименталној парадигми. Међутим, инхибиција РиРс значајно је смањила цитосолно преоптерећење цитосолним Ца2 + изазваним АМПА у олигодендроците, у складу са претходним експериментима спроведеним у неуронима и у олигодендроцитима у којима је рР антагонист дантролен заштитио ове ћелије од каинске киселине, амилоида β - и глутамата- индукована токсичност. 31, 32, 33 За разлику од тога, показало се да се ИП 3 Р такође могу регулисати цитосолним Ца2 + 10 и стога учествовати у ЦИЦР-у. Међутим, лечење ћелија 2АПБ, најчешће кориштеним ИП3Р инхибитором 24 није утицало на преоптерећење Ца2 + узрокованим АМПА-ом у олигодендроцитима. Према томе, ови подаци, заједно са чињеницом да је ТМБ-8 смањио и преоптерећење АМ-посредованим [Ца 2+ ], сугеришу да активација АМПА рецептора изазива ЦИЦР на РиР-селективан начин у олигодендроглиалним ћелијама.

Укрштање ЕР-митохондрије у ексцитотоксичности

Показано је да су ЕР и митохондрије физички и функционално спојени у погледу сигнализације Ца 2+ . 13 Конкретно, претходни подаци сугерирају да интеракције између поддомена које укључују РиРс у ЕР и митохондрије омогућавају пренос Ца2 + сигнала између ова два органела. 25, 34 Штавише, спајање Ца 2+ између РиРс и митохондрије је укључено у активацију путева апоптозе митохондрија. Као и код неурона, масивни прилив Ца 2+ настао прекомернативацијом АМПА рецептора у олигодендроцитима доводи до деполаризације митохондрија, оксидативног стреса и цепања каспазе-3. 6 Ови карактеристични догађаји оштећења митохондрија ослабљени су инхибицијом ослобађања РиР-Ца 2+ у олигодендроцитима стимулисаним АМПА, у складу са претходним резултатима, који су показали да отпуштање Ца 2+ посредовано с РиР и ИП 3 активира апоптотски пут митохондрија у неурона изложених β-амилоиду 35 или НМДА. 18 Ови резултати показују да иако заштитни ефекат рианодина није директно примећен, он омета молекуларне механизме који доводе до смрти олигодендроцита и зато сугерирају да РиЦ-посредовани ЦИЦР доприноси оштећењу митохондрија и апоптози током екслигтоксичности олигодендроглија.

Екситотоксичност и ЕР стрес у олигодендроцитима

Јаки ЕР стрес и неуродегенерација уско су повезани јер активирање УПР и поремећај хомеостазе ЕР Ца 2+ може довести до апоптозе неурона. 15 Конкретно, ексцитотоксичне увреде изазивају ЕР стрес и последични УПР неурона. 18, 19 Штавише, ослобађање Ца Ца 2+ путем РиР-а регулише овај стресни одговор у неуронима. 18

Олигодендроцити синтетишу велику количину протеина током мијелинације и као последица тога су веома осетљиви на поремећај секреторног пута и ЕР хомеостазу. Недавно су пронађени путеви активираног ЕР стреса код неких наследних поремећаја мијелина и МС 7, али мало се зна о томе како се ЕР стрес активира у овим ћелијама у патолошким условима. Наши резултати показују да ексцитотоксичне увреде посредоване АМПА рецепторима индукују активацију УПР у олигодендроцитима, вероватно због поремећаја хомеостазе Ца 2+ . Као што је претходно описано код неурона изложених каинату 19 и НМДА, 18, приметили смо брзу активацију еИФ2 α пута, за коју се такође показало да штити од експерименталне аутоимуне енцефаломиелитиса (ЕАЕ) изазване смрти олигодендроцита и демијелинизације. 36 Примећена је и појачана регулација ГРП78 и ГРП94, што је карактеристичан догађај УПР-а повезаног са неуронским повредама, 27 који се такође налазио код МС демијелинизованих лезија 37 и у складу са резултатима добијеним од неурона који су били изложени ексцитотоксичним увредама. 18, 19

Поред УПР-а, овде објављени резултати указују да стимулација АМПА рецептора у култивираним олигодендроцитима индукује ЕР апостатску ћелију изазвану стресом. Смртоносна ћелија узрокована АМПА смањеном је у присуству салубринала, инхибитора п-еИФ2 α депосфорилације и апоптозе изазване стресом. 28 Претходно је показано да је третман салубриналом ублажио губитак и хипомијелинизацију олигодендроцита изазвану ИФН-и. 36 У складу са ЕР-узрокованом апоптозом стреса, АМПА је проузроковала цепање каспазе-12 у олигодендроцитима, догађај који је примећен у моделима неуродегенерације изазваним ЕР стресом 17, 38 и посебно у неуронима током ексцитотоксичности. 19 Надаље, инхибиција каспазе-12 током ексцитотоксичности је инхибирана када је РиРс био блокиран ријанодином, што указује да ослобађање ЕРПА-Ца 2+ изазвано АМПА може изазвати апоптозу кроз путеве независне од митохондрије.

Укратко, овде наведени резултати показују да ослобађање ЕР-Ца 2+ кроз РиР доприноси олигодендроглиалној ексцитотоксичности ин витро . Инхибиција отпуштања ЕР-Ца 2+ инхибиција отпуштања ЕР-Ца 2+ доводи до слабљења преоптерећења цитосолним Ца2 +, оштећења митохондрија и апоптозе. Поред тога, наши подаци пружају доказ да ексцитотоксичне увреде посредоване АМПА рецепторима индукују реакцију на стрес у овим ћелијама, које доприносе ексцитотоксичности активирањем каспазе-12, зависним од РиР-а, и тиме су путеви апоптозе специфични за ЕР.

Екситотоксичност глутамата је релевантна за демијелинизационе поремећаје ЦНС-а, укључујући МС. Ову идеју подржавају подаци који показују да АМПА и антагонисти каинатских рецептора ублажавају неуролошке симптоме у неколико облика ЕАЕ 39 који се користе за моделирање различитих стадијума МС. Међутим, још увек није процењен допринос ослобађања ЕР-Ца 2+ олигодендроглиалној ексцитотоксичности. Дакле, наша открића показују да ослобађање ЕР-Ца 2+ путем РиР-а и накнадни ЕР стрес након увреда глутамата доприносе ексцитотоксичности олигодендроцита. Поред тога, молекуларни посредници ЕР стреса откривени у овој студији могу представљати кандидатске мете за неуродегенеративне и демијелинизационе болести које су подвргнуте олигодендроглиалној ексцитотоксичној смрти.

Материјали и методе

Животиње

Сви експерименти су изведени под надзором и уз одобрење нашег интерног одбора за етику животиња (Универзитет Баскије, УПВ / ЕХУ). Са животињама се поступало у складу са директивом Савета Европских заједница. Учињени су сви могући напори да се смањи патња животиња и број коришћених животиња.

Реагенси

АМПА, циклотиазид (ЦТЗ) и рианодин су добијени од компаније Асцент Сциентифиц (Бристол, Велика Британија). Калцеин-АМ (калцеин ацетоксиметил естер), ЦМ-Х2 ДЦФДА и ЈЦ-1 су купљени од компаније Инвитроген (Барселона, Шпанија). ХБСС, поли-Д-лизин и ТМБ-8 су добијени од Сигме (Ст Лоуис, МО, САД), а салубринал и 2-АПБ из Цалбиоцхем (Мерцк Цхемицалс, Ноттингхам, УК).

Оптичке нервне културе

Примарне културе олигодендроцита добијене из видних нерава 12-дневних пацова Спрагуе-Давлеи (обично 8-10 животиња по култури) добијене су као што је претходно описано, 40 са модификацијама. 22 ћелије су постављене у доњој густини за сваки експериментални поступак, у плоче са 24 јажица које носе поли-Д-лизин (10 µг / мл) обложене поклопце пречника 12 или 14 мм и одржаване на 37 ° Ц и 5% ЦО 2 у хемијски дефинисаном медијуму. 40

Анализа токсичности

Испитивања ћелијске токсичности су изведена као што је претходно описано 41 са модификацијама. Ћелије (1 × 10 4 по лежишту у току 1 дана ин витро (ДИВ1) биле су изложене АМПА плус ЦТЗ (100 μМ ) у претходно описаном медијуму 40 током 5 минута на 37 ° Ц. Антагонисти су били присутни пре и током ексцитотоксичне увреде а виталност ћелије процењена је 24 сата касније коришћењем флуориметријског теста калцеин-АМ.Сви експерименти су изведени у троструком / четвороструком и добијене вредности су нормализоване средње ± СЕМ од најмање три независна експеримента.

Мерења потенцијала унутарћелијске РОС и митохондрије

Олигодендроцити (ДИВ 1; 1 × 10 4 по лежишту су стимулисани АМПА 25 μМ плус ЦТЗ 100 μМ током 5 мин у одсуству или присуству рианодина (10 μМ, 45 мин) и напуњени са 5- (анд-6 ) -хлорометил-2'7'-дихлородихидрофлуоресцеин диацетат ацетил естер (ЦМ-Х2 ДЦФДА) током 30 минута за мерење генерисаног РОС-а. Калцеин-АМ (1 µМ) коришћен је за квантификацију броја ћелија у пољу за очитавање и флуоресценција је измерена као што је претходно описано. 42 За квантификацију потенцијала митохондријалних мембрана, ћелије су напуњене 30 мин након ексцитотоксичног подражаја помоћу ЈЦ-1 боје током 15 минута и измерен је однос црвене / зелене флуоресценције. Наведене вредности су нормализоване средње ± СЕМ најмање три независна експеримента.

Квантификација активности каспазе-3

Олигодендроцити (1 × 10 4 по лежишту) су постављени на плочице са 96 јажица обложених поли-Д-лизином и после једног дана ин витро ћелије су изложене АМПА 25 μМ плус ЦТЗ 100 μМ током 5 минута у присуству или одсуства рианодина. Након 1 х, додат је Цаспасе-Гло -3/7 супстрат (Промега, Мадисон, ВИ, УСА), а после 2 х активност капаза-3 измерена је према упутствима произвођача. Сви експерименти су изведени у троструком примерку, а добијени подаци су просечна вредност ± СЕМ вредности луминесценције нормализоване на вредности животињске виталности (калцеин-АМ, 1 μМ) за свако стање.

Имуноцитохемија

За ИП3 Рс и РиРс анализу експресије 1 ДИВ олигодендроцити су фиксирани са 4% параформалдехида у трајању од 20 минута и пермеализирани у 1% БСА, 1% нормалног серума, 0, 05% Тритон Кс-100 у ПБС у трајању од 30 минута. Затим су ћелије блокиране у 10% БСА, 1% нормалног серума у ​​ПБС-у током 1 х и инкубиране прво са анти-МБП антителом (1: 500, Стенбергер Моноцлоналс Инц., Балтиморе, МД, САД) 1 х на собној температури у 1% БСА, 1% нормалног серума у ​​ПБС-у. После испирања са ПБС-ом, ћелије су обележене са Алека Флуор 594-коњугованим ИгГ (1: 200, Молекуларне сонде, Инвитроген, Барцелона, Шпанија) током 2 сата на РТ. Ћелије су испране у ПБС-у и инкубиране током ноћи на 4 ° Ц са примарним антителом: анти-ИП3 РИ (1: 1000, Аффинити Биореагентс, Роцкфорд, ИЛ, САД); анти-ИП 3 Р-ИИ (1: 50, Биотехнологија Санта Цруз, Хајделберг, Немачка); анти-ИП 3 Р-ИИИ (1: 1000, Цхемицон, Миллипоре Иберица, Мадрид, Шпанија); анти-РиР-И (1: 1000, хемикон); анти-РиР-ИИ (1: 1000, хемикон); анти-РиР-ИИИ (1: 50, Биотехнологија у Санта Црузу). После испирања са ПБС-ом, додат је секундарно антитело коњуговано са Алека Флуор 488 (1: 200, Молекуларне сонде) током 1 сата, а затим је обојено Хоецхст 33258 (5 μг / мл, 10 мин). Коначно, покривачи су испрани у ПБС-у, монтирани на средству за уградњу глицергела (Дако, Глоструп, Данска) и анализирани конфокалном микроскопијом ласерског скенирања (Олимпус Флуовиев ФВ500, Барселона, Шпанија). Контроле без примарног антитела нису показале обојење.

За квантификацију пеИ2Ф α , анти-пеИ2Ф а (1: 100, ћелијска сигнализација, Денверс, МА, САД) је коришћено као примарно антитело и бојење је изведено као горе.

Вестерн блоттинг

Ћелије (1 × 105) су испране физиолошком отопином пуферираном фосфатом (ПБС, 0, 1 М) и скупљене у 20 μл пуфера за узорке ледено хладне електрофорезе. Лизати су прокувани током 10 минута и раздвојени 10–15% СДС-полиакриламид гел електрофорезом, зависно од експеримента. Узорци су преко ноћи пренесени у нитроцелулозну мембрану (Хибонд ЕЦЛ, Амерсхам Биосциенцес, Барселона, Шпанија), блокирани у 5% обраном млеку, 5% серуму у ТТБС и протеинима откривеним специфичним примарним антителом у 5% БСА у ТТБС током ноћи на 4 ° Ц: анти-каспаза-3 (1: 1000, Биотехнологије, Санта Цруз); анти-пеИФ2 а и анти-еИФ2 α (1: 1000, ћелијска сигнализација); анти-КДЕЛ (Грп78, Грп94) (1: 1000, Стресгенски биореагенси, Анн Харбор, МИ, САД); анти-каспаза-12 (1: 1000, Цалбиоцхем); анти- П- актин (1: 2000, Сигма). После испирања, мембране су инкубиране са секундарним антителом коњугиране перексидазом из хрена (1: 2000, Сигма) у 5% обраном млеку, 1% нормалног серума у ​​ТТБС током 2 сата и развијане употребом побољшане хемилуминисценције према упутствима произвођача (СуперСигнал Вест Дура, Пиерце, Роцкфорд, ИЛ, САД). Сигнали су квантификовани коришћењем Имаге-Ј софтвера (НИХ, Бетхесда, МА, САД) и вредности су нормализоване на β- актински сигнал и дате као средња вредност ± СЕМ за најмање три независна експеримента.

Мерење [Ца 2+ ] и

Концентрација интрацелуларног Ца2 + ([Ца2 + ] и ) одређена је као што је претходно детаљно описано. 6, 43 олигодендроцита (10 4 по јажици) су претходно инкубирани фура-2 АМ (Инвитроген) на 5 µМ у медијуму за културу, 30–45 мин, на 37 ° Ц. Антагонисти су континуирано перфузирани током 5 минута пре и током стимулације АМПА плус ЦТЗ. ([Ца 2+ ] и ) процењена је методом омјера 340/380, а подаци су анализирани помоћу програма Екцел (Мицрософт; Сеаттле, ВА, УСА) и Присм (Лаке Форест, Калифорнија, УСА).

Анализа података

Сви подаци су изражени као средња вредност ± СЕМ ( н ), при чему се н односи на број испитиваних култура, а свака је добијена из различите групе животиња. У [Ца2 + ] и експериментима мерења, н се односи на број ћелија добијених из најмање три различите културе добијене из различитих група животиња. Статистичка анализа је извршена двосмерном анализом варијанције или упареним Студентовим тестером и значај је утврђен на П <0, 05.

Речник

ЕР

ендоплазматични ретикулум

РиР

рианодин рецептор

ИП 3 Р

рецептор инозитол трифосфат

АМПА

а -амино-3-хидроксил-5-метил-4-изоксазол-пропионат

ЦИЦР

Отпуштање Ца 2+ Ца 2+

РОС

реактивне врсте кисеоника

еИФ2 α

α подјединица фактора еукариотске иницијације 2

ГРП78

протеин регулиран глукозом 78

ГОСПОЂА

Мултипла склероза