Лиспро ублажава п-амилоидне и придружене патологије код алзхеимерових мишева | ћелијска смрт и болест

Лиспро ублажава п-амилоидне и придружене патологије код алзхеимерових мишева | ћелијска смрт и болест

Anonim

Субјекти

  • Алцхајмерова болест
  • Патологија
  • Фармакокинетика
  • Фосфорилација

Апстрактан

Литијум се у Сједињеним Америчким Државама продаје од 1970-их као лек биполарног поремећаја. У новије време, истраживања су показала да литијум може побољшати когнитивни пад повезан са Алзхеимеровом болешћу (АД). Међутим, тренутни препарати литијумских фармацеутских лекова који су одобрени од стране Сједињених Држава (хемијски облици карбоната и цитрата) имају уски терапеутски прозор и нестабилну фармакокинетику која без пажљивог праћења може изазвати озбиљне штетне ефекте. Овде смо истражили безбедносни профил, фармакокинетику и терапијску ефикасност ЛИСПРО (јонски кокристал литијум-салицилата и л-пролина), литијум-салицилат и литијум-карбонат (Ли 2 ЦО 3 ). Открили смо да ЛИСПРО (орални третман у трајању од 8 недеља) смањује β- амилоидне плакове и фосфорилацију тау смањујући неуроинфламатион и инактивирајући гликоген синтаза киназу 3 β у трансгеничним Тг2576 мишевима. Конкретно, цитокински профили из мозга, плазме и спленоцита сугерисали су да 8-недељни орални третман ЛИСПРО смањује про-упалне цитокине, појачава протуупалне цитокине и сузбија експресију бубрежне циклооксигеназе 2 код трансгеничних мишева Тг2576. Фармакокинетичке студије показале су да ЛИСПРО обезбеђује значајно више нивоа литијума у ​​мозгу и сталнији ниво литијума у ​​плазми и у Б6129СФ2 / Ј (двонедељни орални третман), и на трансгеничне Тг2576 (8-недељни орални третман) мишевима у поређењу са Ли2ЦО3. Орална примена ЛИСПРО током 28 недеља значајно је смањила β- амилоидне плакове и тау-фосфорилацију. Поред тога, ЛИСПРО је значајно повисио пре-синаптичку (синаптофизин) и пост-синаптичку протеину (пост-синаптички протеин 95) у мозгу од трансгених 3КСТг-АД мишева. Узето заједно, наши подаци сугерирају да ЛИСПРО може бити врхунски облик литијума са побољшаном сигурношћу и ефикасношћу као потенцијалним новим леком за модификовање болести против АД.

Главни

Алзхеимерова болест (АД) неповратно утиче на памћење и сазнање и једна је од најкритичнијих брига за јавно здравље старијих особа. Изванстанични амилоидни плакови (углавном амилоид- β , А β ) 1 и интрацелуларни неурофибриларни слојеви (НФТ-ови; упарени спирални филаменти хиперфосфорилираног тау) 2 су неуропатолошки жигови АД-а, који снажно утичу на хипокампус и неокортек. 3 Тренутно је америчка администрација за храну и лекове (ФДА) одобрила инхибиторе ацетилхолинестеразе (тј. Донепезил, ривастагмин и галантамин) и / или антагонисте Н- метил д-аспартата (тј. Мемантин) за интервенцију АД. 4 Међутим, ниједна фармаколошка или нефармаколошка интервенција није у потпуности доступна која би била ефикасна у спречавању или успоравању напредовања болести. Стога, велики број пацијената са АД и њихови пружаоци неге хитно чекају боље алтернативе.

Литијум се користи за лечење маније и депресије од средине 20. века 5. и упркос појави новијих лекова и даље се сматра златним стандардом у лечењу биполарног поремећаја. 6, 7 Иако је литијум тренутно одобрен као ФДА стабилизатор расположења за лечење биполарног поремећаја, такође се обично прописује офф-лабел за друге неуропсихијатријске симптоме, укључујући суицидност и импулзивну агресију, 6 као и неуродегенеративне болести попут АД. 8 Нунес и колеге приметили су у 18-месечној клиничкој студији да су пацијенти са АД који су свакодневно лечили микро дозама литијума изведени на конзистентном нивоу на мини-менталном статусу, што указује на заустављени пад когнитивног система у поређењу са плацебо групом. 9 Штавише, Форленза и његове колеге су у својој једногодишњој клиничкој студији известили да пацијенти са амнестичним благим когнитивним поремећајем који су лечени хроничним литијумом са ниским дозама напредују мање од АД у поређењу са плацебо групом. 7 Лечени пацијенти су радили више на когницији коефицијента АД Лествице за процену и имали су смањене концентрације фосфорилираног тауа у својој цереброспиналној течности (ЦСФ), што указује на литијум као потенцијални терапеут за АД. 7

Неколико механизама може бити основа потенцијалне неуропротективне ефикасности литијума за АД (видети слику 1). Важан механизам литијума је тај што он инхибира одређене ензиме на неконкурентски начин избацујући потребан двовалентни катион, магнезијум. 10 Клеин и Мелтон идентификовали су гликоген синтазу киназу 3 П (ГСК3 п ) као једну такву молекулску мету литијума. 11 У контексту АД, овај ензим фосфорилира тау у највише серинских и треонинских остатака у упареним спиралним филаментима. Активност ГСК3 доприноси и продукцији А β и смрти неуронских ћелија посредованих Аб. 12 П је изведен из протеина прекурсора амилоида (АПП) секвенцијалном протеолизом, катализованом ензимом 1 за одцепљивање протеина прекидача аспартил протеазе П- сита ензима 1, праћеном протеинилизом зависне од пресенилин-и-секретазе. 13 Терапеутске дозе литијума блокирају производњу А β пептида интерферирајући са цепањем АПП-а на γ-секретазном кораку, без инхибиције прераде Нотцх, циљајући на ГСК3 α . 14 Литијум такође блокира накупљање А у мозговима мишева који прекомерно експримирају АПП инхибицијом ГСК3 β , имплицирајући свој захтев за максималном обрадом АПП. 15 Како ГСК3 β такође фосфорилира тау протеин, инхибиција ГСК3 β нуди нови приступ смањењу стварања и β- амилоидних плакова и НФТ-а. Интересантно је да комбиновани трансгени мишеви који прекомерно експримирају ГСК3 β са трансгеничним мишевима који изражавају тау са троструком фронтотемпоралном деменцијом са мутацијом паркинсонизма-17 развијају префибриларне тау-агрегате које избегава литијум. 16

Image

Схематски приказ ћелијског и молекуларног механизма усмјереног према литијуму активирањем неколико неуротрофичних и придружених сигнала код Алзхеимерове болести. Литијумска активност инхибира ГСК3 (и α и β изоформу) и инозитол моно / полифосфатазу (ИМПасе, ИППасе). Инхибиција ГСК3 литијумом смањује тау фосфорилацију и производњу А β пептида интерферирајући цепање γ -секретазе АПП процесом. Поред тога, инхибиција инозитол монофосфазе литијумом може да регулише клиренс агрегираног фосфорилираног тау и А β пептида. Штавише, литијум повећава експресију БДНФ, што активира пут ЕРК / МАПК и додатно повећава експресију елемента одговора цАМП фактора нуклеарне транскрипције (ЦРЕБ). Према томе, активација БДНФ-а може појачати неурогенезу и смањити про-упалне одговоре (ИЛ-1 β и ТНФ α ) код Алзхеимерове болести

Слика пуне величине

Упркос својим лековитим предностима, познато је да тренутни литијумски лекови (тј. Хемијски облик карбоната и цитрата) одобрени од ФДА изазивају озбиљне краткотрајне и дугорочне нуспојаве код људи. Лекови имају уски терапеутски прозор (0, 6–1, 5 мМ), јер најчешће коришћене литијумске соли полако прелазе крв-мождану баријеру, 17, 18 којима је потребно више доза током дана да би се достигли сигурни нивои терапије у плазми. Штавише, потребне терапијске дозе често доводе до вишка накупљања литијум јона у периферним органима, посебно у бубрезима и срцу. Дехидратација у оквиру терапије литијумом може резултирати бубрежном и срчаном токсичношћу, хипотиреоидизмом, хиперпаратироидизмом, дебљањем и нефрогеним дијабетесом инсипидусом. 19 Литијумска интоксикација долази са суптератерапеутским концентрацијама у серуму, производећи симптоме као што су губитак свести, мишићни тремор, епилептични напади и плућне компликације. 20 Као такав, примјена литијума захтева често праћење нивоа хемије у крви и нивоа литијумске плазме, што може одвратити лекаре од прописивања литијума у ​​корист других терапија који не захтевају праћење нивоа у плазми како би се избегли уочени потенцијални нежељени ефекти. Ово се нарочито односи на старије особе које често имају низ коморбидитета за које је потребна полифармација. Због тога постоји потреба за сигурнијом и бољом формулацијом литијума за лечење АД.

Раније смо известили о развоју новог ионског ко-кристала литијума са органским анионом, салицилном киселином и л-пролином (ЛИСПРО, ЛП). Јединствена кристална структура ЛИСПРО не утиче негативно на биоактивност литијума на неколико потенцијалних терапијских циљева повезаних са лечењем АД, наиме индукцијом неуротрофичног фактора (БДНФ) који потиче из мозга из неурона, инхибицијом производње азотног оксида изазваног липополисахаридом (НО) из микроглије, неуронска диференцијација и инхибиција ГСК3 β у неуралним матичним ћелијама. Иако је ЛИСПРО надмашио ефикасност еквимоларних концентрација литијум-соли у тим циљевима ин витро , кокристал изразито модулирао фармакокинетику литијума ин виво . На пример, пацови примењени једном оралном високом дозом ЛИСПРО имали су детекцију нивоа литијума у ​​мозгу током 48 х, док они који су примили еквимоларни еквивалент конвенционалног хемијског карбонатног облика литијума нису имали. Поред тога, ЛИСПРО је створио сталну плазму литијума у ​​плазми током 48-часовног периода, док је карбонатни хемијски облик литијума створио типични плазма литијумски шиљак за који се мисли да је повезан са штетним догађајима. 21, 22 Штавише, салицилна киселина у кристалу смањује неуроинфламатион који је повезан са АД, што је активни метаболит аспирина. Ови подаци указују на потенцијал за повећан профил сигурности и ефикасности ЛИСПРО.

У овом истраживању смо детаљније проценили терапијску ефикасност и безбедносни профил ЛИСПРО за ублажавање патологије сличне АД у системима ћелијске културе и трансгеничних модела АД миша (тј. Тг2576 и 3КСТг-АД мишева). Открили смо да ЛИСПРО има врхунски фармакокинетички и безбедносни профил у поређењу са традиционалним хемијским обликом литијума, што нас промовише у даљем испитивању терапијске ефикасности лечења АД.

Резултати

Фармакокинетика литија током лечења хроничним ЛП, ЛЦ и ЛС

У нашем претходном истраживању пратили смо фармакокинетику литијума након једнократне дозе ЛП и ЛЦ оралном одмерком. Користећи мушке штакора Спрагуе-Давлеи, плазма и мождани профили мерени ААС-ом показали су да ЛП производи веома стабилан ниво литијума у ​​48 сати након третмана, док је ниво литијума готово непропознатљив после 48 сати третмана ЛЦ-ом. 21 У овом истраживању, истраживали смо фармакокинетику литијума у ​​плазми и мозгу након хроничног лечења мишевима ЛП, ЛЦ или ЛС до Тг2576 и 3КСТг-АД, као и мишевима дивљег типа Б6129СФ2 / Ј. Ниске или високе дозе ЛП, ЛЦ или ЛС, дајући литијум 1, 125 или 2, 25 мМ / кг / дан, показале су стална повећања нивоа литијума у ​​плазми и мозгу између 1 и 2 недеље лечења код Б6129СФ2 / Ј мишева, са високом дозом дајући виши ниво литијума (слике 2а и б). Нису пронађене статистички значајне разлике између третмана нивоа литијума у ​​плазми код сваке дозе. Супротно томе, после 2 недеље лечења, ЛП је донео значајно веће нивое литијума у ​​мозгу у поређењу са ЛЦ и ЛС.

Image

Фармакокинетика литијума у ​​плазми и мозгу након хроничног оралног третмана ЛИСПРО (ЛП), литијумским салицилатом (ЛС) и Ли2ЦО3 (ЛЦ) код Б6129СФ2 / Ј, Тг2576 и 3КСТг-АД мишева. ( а, б ) Б6129СФ2 / Ј мишеви ( н = 2–4 мишева / група, мужјак) у доби од 2 месеца третирани су 1 или 2 недеље (недеља) три исхране које садрже ЛП, ЛЦ или ЛС, дајући литијум у 1, 125 или 2, 25 мМ / кг / дан. ( ц, д ) Тг2576 мишеви ( н = 8, 4 женке / 4 мужјака) у доби од 6 месеци лечени су 8 недеља две диете које садрже ЛП или ЛЦ, дајући литијум са 2, 25 мМ / кг / дан. ( е, ф ) Надаље, женке 3КСТг-АД ( н = 4–8 мишева / група) у доби од 5 месеци лечене су током 28 недеља три исхране које садрже ЛП, ЛС или ЛЦ, дајући литијум са 2, 25 мМ / кг / дан, или уобичајену мишју чорбу (Теклад 2018). Ниво литијума у ​​крви и мозгу је мерен коришћењем атомске апсорпционе спектроскопије (ААС). Омјер литијума у ​​мозгу и плазми израчунава се за сваког појединог 3КСТг-АД миша ( ф ). Сви су мишеви добили нормалну воду за пиће и цхов ад либитум . Статистичка анализа извршена је коришћењем АНОВА са пост анализом са Фисхеровим ЛСД тестом (* П <0, 05; ** П <0, 01). Није било значајне разлике у нивоу литијума у ​​плазми или мозгу између мишева Б6129СФ2 / Ј третираних ЛЦ- и ЛС ( П > 0, 05). Није било детектираног литијума у ​​плазми и хомогенатима мозга код контролних мишева Б6129СФ2 / Ј, Тг2576 и 3КСТг-АД са храном за исхрану Теклад 2018 (Цтрл, подаци нису приказани)

Слика пуне величине

Код Тг2576 мишева, лечење ЛП и ЛЦ показало је стални пораст нивоа литијума у ​​плазми и мозгу током третмана у трајању од 8 недеља, са значајно вишим нивоима литијума у ​​плазми ЛЦ третманом у поређењу са ЛП само током двонедељног лечења (Слика 2ц). Међутим, након 8-недељног лечења, ЛП је обезбедио значајно више нивоа литијума у ​​мозгу у поређењу са ЛЦ (Слика 2д). Код 3КСТг-АД мишева није примећена значајна разлика ни у нивоу литијума у ​​плазми ни у мозгу након 28 недеља лечења ЛП, ЛЦ или ЛС (слика 2е). Треба напоменути да је однос литијума мозга и плазме у ЛП био већи након 28 недеља у поређењу са ЛЦ и ЛС третманом (слика 2ф), док разлика није достигла значај (ЛП и ЛС, П = 0, 98; ЛП и ЛЦ, П = 0, 84; ЛС и ЛЦ, П = 0, 85). Ниво литијума је показао неодредиве нивое и у плазми и у мозгу код нетретираних контролних мишева.

Хронични третман ЛП смањује β- амилоидне плакове код Тг2576 и 3КСТг-АД мишева

Показано је да третман са литијумом смањује стварање β ин витро, 14 док постоје и контроверзни резултати у вези са његовом способношћу да смањи производњу β ин виво. 23, 24 Утицај на п- амилоидне плакове смо утврдили хроничним третманом ЛЦ или ЛП код Тг2576 мишева и ЛЦ, ЛС или ЛП код 3КСТг-АД мишева. Код мишева Тг2576, 8-недељни третман ЛП значајно је смањио А β оптерећење (позитивно подручје β- амилоидних плакова) у поређењу са ЛЦ-третираним, као и необрађен контролни Тг2576 мишеве, што је ИХЦ утврдио коришћењем специфичних А β 17–24. 4Г8 антитело (слике 3а и б). Слично томе, третман ЛП значајно је смањио ниво растворљивог и нерастворљивог А β као што је утврђено ЕЛИСА (слика 3ц). Међутим, и А β оптерећење и Аβ нивои нису се променили након ЛЦ третмана. Код 3КСТг-АД мишева, лечење ЛП-а од 28 недеља значајно је смањило А β оптерећење, што је утврђено ИХЦ коришћењем А β 17–24 специфичних 4Г8 и А β 1-16 специфичних 6Е10 антитела (слике 3д и е), али оптерећење А је није значајно измењен после третмана ЛС или ЛЦ.

Image

Орални третман ЛП смањује п- амилоидну патологију код Тг2576 и 3КСТг-АД мишева. Тг2576 мишеви у доби од 8 месеци ( н = 9; 5 мужјака / 4 женке) и женке 3КСТг-АД у доби од 5 месеци ( н = 4–8 мишева / група) лечени су 8 или 28 недеља, респективно, дијета која садржи ЛП, ЛС или ЛЦ, која даје литијум са 2, 25 мМ / кг / дан, или нормалну мишју чоколаду како је назначено. Ове дозе су изабране да дају концентрације литијума у ​​мозгу од 0, 25–0, 50 мМ, које падају у распону клиничке терапије за АД. 7, 15 Сви су мишеви добили чорбу и нормалну пијаћу воду ад либитум . Одсеци ткива мозга и хомогенати миша припремљени су од сваког миша након третмана. ( а, д ) Коронални одсеци пола мозга анализирани су бојењем анти-А п антителом (4Г8). ( б, е ) Проценат 4Г8 позитивних плакова (средња вредност ± СЕМ) квантификован је анализом слике као што је претходно описано. 59, 60 ( ц ) Укупно растворљиви и нерастворљиви А β 1-40, 42 пептида из хомогената анализирани су ЕЛИСА анализом и представљени као пикограми А β пептида по мг укупног протеина. Третман ЛП, али не и ЛЦ значајно је смањио укупни растворљиви и нерастворљиви нивои А β 1-40, 42 . Т- тест за два узорка и једносмерни АНОВА тест за више независних узорака показали су значајне разлике између ЛП и ЛЦ ( б, ц ) и између ЛП, ЛС и ЛЦ у поређењу са контролном исхраном (Цтрл) ( е, * П < 0, 05, ** П <0, 01). Није било уочљивих нити значајних разлика и у 4Г8 позитивним А β плаковима и у церебралном растворљивом / нерастворљивом нивоу А β 1-40, 42 у одсецима мозга и хомогената између ЛЦ-третираних и контролних Теклад 2018 дијета храњених Тг2576 мишева (Цтрл, П > 0.05)

Слика пуне величине

Хронични третман ЛП смањује тау фосфорилацију кроз инхибицију ГСК3 β у Тг2576 и 3КСТг-АД мишеве

Код Тг2576 мишева 8-недељни третман ЛП значајно је смањио фосфорилацију тау-а (п-тау (Тхр 231 )) у поређењу са необрађеним контролама, што је утврђено ИХЦ и ВБ анализама (Слике 4а и б). Поред тога, третман ЛП значајно је повећао инхибиторну фосфорилацију ГСК3 β (Сер 9 ), што је одређено ВБ (слика 4ц). Међутим, тау или ГСК3 п инхибиторна фосфорилација није измењена третманом ЛЦ. Код 3КСТг-АД мишева, третман ЛП-а од 28 недеља значајно је смањио тау фосфорилацију (п-тау (Тхр 231 )) у ЦА1 како је одређено ИХЦ (слике 4д и ф). Поред тога, лечење ЛП тежило је смањењу тау фосфорилације п-тау (Тхр 231 ) у ЦА3, али ово смањење није било статистички значајно за п-тау (Тхр 231 ) (слике 4д и г) (ЛП и ЛС, П = 0, 771; ЛП и ЛЦ, П = 0, 31; ЛС и ЛЦ, П = 0, 233). Третман ЛЦ или ЛС није значајно променио тау фосфорилацију у ЦА1 или ЦА3 како је одредио ИХЦ. Поред тога, третман ЛП значајно је смањио тау фосфорилацију (п-тау (Сер 396 )), што је одређено ИХЦ (слика 4х) и тау фосфорилацију (п-тау (Сер 396, Сер 404, Тхр 181 и Тхр 231 )), као утврђено ВБ (слике 4и и ј). ЛЦ и ЛС су такође смањили тау фосфорилацију на неколико места, посебно на п-тау (Сер 396 и Тхр 231 ), иако мање од ЛП.

Image

Орални третман ЛП смањује тау хипер-фосфорилацију код мишева Тг2576 и 3КСТг-АД - репрезентативне микрографије које показују ИХЦ обојење одсека мозга са Тг2576 и 3КСТг-АД мишева орално третираних 8 и 28 недеља, диетама које садрже ЛП, ЛС или ЛЦ, даје литијум брзином 2, 25 мМ / кг / дан или контролише режим Теклад 2018, као што је детаљно приказано на слици 3 горе. Приказани су ИХЦ бојење и квантификација п-тау (Тхр 231, а, д ) и п-тау (Сер 396, е ) имунореактивности у ЦА3 од Тг2576 ( а ) и ЦА1 / ЦА3 од 3КСТг-АД одсека мозга ( д, е ). Проценат позитивних подручја п-тау (Тхр 231 ) или п-тау (Сер 396 ) (средња вредност ± СЕМ) квантификован је анализом слике у ЦА1 / ЦА3 3КСТг-АД мишева ( ф - х ). АНОВА пост-хоц анализама употребом Фисхерова ЛСД теста за више узорака открива значајне разлике у фосфорилираном тау-у између третираних ЛП и контролних мишева (* П <0, 05, ** П <0, 01). Хомогенати мишјег мозга подвргнути су се Вестерн блот (ВБ) анализирању антитела против п-тау (Тхр 231 ), п-тау (Сер 396 ), п-тау (Сер 404 ), п-тау (Тхр 181 ), тотал тау, ГАПДХ ( б, и ), пГСК3п (Сер 9 ), или укупни ГСК3П ( ц ). Као што је приказано испод ВБ, анализа дензитометрије показује омјере густине опсега п-тау-укупног тау-а ( б, доња плоча) или ГАПДХ ( ј ) и пГСК3 β у укупном ГСК3 β ( ц, доња плоча). Статистичка т- тест анализа ВБ података показала је значајно смањење односа п-тау (Тхр 231 ) према укупном тау ( б ) и пораст пГСК3 β (Сер 9 ) на укупни ГСК3 β ( ц ) у ЛП у поређењу са ЛЦ -третиране Тг2576 мишеве (** П <0.01). Једносмјерна АНОВА и пост хоц анализа откриле су значајне разлике у односу п-тау-а и ГАПДХ ( ј ) у поређењу с контролним третманом (Цтрл, * П <0, 05, ** П <0, 01). Слични резултати и имунохемијског бојања и ВБ анализа такође су добијени са ПХФ1 антителом (подаци нису приказани) код Тг2576 третираних ЛИСПРО мишевима. Није било уочљивих и значајних разлика и у нивоима п-тау (Тхр 231 ) и инактивираном пГСК3 β (Сер 9 ) у мозгу хомогената између ЛЦ и контролних Тг2576 мишева храњених исхраном ( П > 0, 05)

Слика пуне величине

Лечење ЛП смањује микроглијску упалу, истовремено појачавајући микроглијску А β фагоцитозу и аутофагију

Колико год микроглијална ЦД40 / ЦД40Л сигнализација може побољшати А β генерацију 25 и умањити А β фагоцитозу, 26 утврдили смо ефекте ЛП на експресију ЦД40, сигнализацију ЦД40 / ЦД40Л и А β фагоцитозу у примарним микроглијским ћелијама. Примарне ћелије микроглија третиране су ЛП (0–20 мМ) у присуству ИФН и (100 У / мл) и / или ЦД40 лиганда (ЦД40Л, 1 µг / мл) током 8 сати. Третман ЛП значајно инхибира експресију ЦД40-индуковане ЦД40 на начин који зависи од дозе (Слика 5б), што је утврђено ФАЦС анализом, као и ИФНγ / ЦД40Л-индуковано ослобађање про-упалних цитокина (тј., ТНФ α и ИЛ-12п70), како је утврђено ЕЛИСА (слика 5ц). Да би се проценио утицај ЛП на микроглијску А β фагоцитозу, примарне микроглијске ћелије су претходно инкубиране са 10 мМ ЛП или вехиклом (1% диметил сулфоксидом) током 6 х, а затим је уследила 1-сатна инкубација са флуоресцентним обележеним А β 1–42 ( ФИТЦ-А β 1–42 ). ЛП је значајно повећао унос А β 1-42 у примарне микроглијалне ћелије, о чему сведочи повећана ћелијска (унутарћелијска) и смањена изванстанична флуоресценција (Слика 5д). Саркар ет ал. 27 су први показали да литијум појачава аутофагију и чисти мутиране протеине (ловатин и а- синуклеин) инхибирањем инозитол монофосфатазе. Након тога, неколико ћелијских култура и студија на животињама показало је индукцију аутофагичких путева литијумом. 28 Да би се испитао утицај ЛП и ЛЦ на аутофагију, примарне микроглијалне ћелије су третиране ЛП или ЛЦ (10 мМ) током 18 х, након чега је уследила пермеализација и бојење аутофагичним маркером ЛЦ3Б антителом. И ЛП и ЛЦ третман значајно су побољшали аутофагију (Слика 5а).

Image

ЛП инхибира периферне и неуроинфламатион, истовремено подстичући микроглиалну аутофагију и А β фагоцитозу. ( а ) За одређивање микроглијске аутофагије, мишје примарне микроглијске ћелије претходно су третиране ЛП, ЛЦ, ЛиЦл или Л-пролином на 10 мМ или ПБС (Цтрл) током 18 х, након чега је уследила пермеализација, обојење са ЛЦ3Б зечје поликлонално антитело и визуализација са Алека Флуор 647 козјим анти-зечјим ИгГ (комплет за антитела ЛЦ3Б, Молекуларне сонде). Интензитет флуоресценције аутофагосома (Аутосом) и цитосола квантификовани су коришћењем софтвера за дигиталну микроскопију Слидебоок (средња вредност ± СД). И ЛП и ЛЦ третмани значајно су побољшали микроглијску аутофагију (** П <0, 01). Имајте на уму да није било значајне разлике у интензитету флуоресценције аутофагосома и цитосола између ЛЦ, ЛП и ЛиЦл ( П > 0, 05). Л-пролине није успео да промовише ниједну запажену аутофагију. Поред тога, примарне микроглијске ћелије миша су третиране ЛП (0–20 мМ) у присуству ИФН и (100 У / мл) или / и ЦД40 лиганд (ЦД40Л, 1 µг / мл) током 8 х, а затим су испитиване на про-упална микроглијска активација процењена проточном цитометријском анализом (ФАЦС) и ЕЛИСА анализом. ( б ) ФАЦС анализа показала је значајно индуковано смањење дозе у зависности од дозе у ИФН γ -индуцираној експресији ЦД40. Подаци су представљени као средњи проценат ћелија које експримирају ЦД40 (ЦД40 Екп) (± СЕМ) из два независна експеримента. ( ц ) Супернатанти микроглиалне ћелијске културе су сакупљени и подвргнути цитокину ЕЛИСА како је назначено. Подаци су представљени као средњи пг ТНФ α или ИЛ-12п70 по мг укупног ћелијског протеина (± СЕМ) из три независна експеримента. За одређивање микроглиалне А β фагоцитозе, примарна микроглијска ћелија претходно је третирана ЛП на 10 мМ или носачем (1% ДМСО у медијуму) 6 х, а затим инкубирана 1 х М ФИТЦ-А β 1-42 током 1 х ( д ). Станични супернатанти и лизати су анализирани на ванћелијски (Ектра, горњи панел) и повезани са ћелијама (Целл-Ассо, доњи панел) ФИТЦ-А β 1-42, користећи флуорометар. Подаци су представљени као релативни прегиб средње флуоресцентне промене (средња ± СЕМ), израчунато као средња флуоресценција за сваки узорак на 37 ° Ц, подељено са средњом флуоресценцијом на 4 ° Ц ( н = 4 за свако представљено стање) (** П <0, 01). Тест ЛДХ није показао значајно повећање ћелијске токсичности изазване ЛИСПРО до 20 мМ у примарним микроглијалним ћелијама (подаци нису приказани). За одређивање периферних и неуроинфламма, крвна плазма ( е ), култура која се гаји у слезени ( ф ) и хомогенати мозга ( г, х ), третирани са ЛП- и ЛЦ третираним и необрађеним Тг2576 мишевима (Цтрл) подвргнути су цитокину и сЦД40Л ЕЛИСА. Подаци су представљени као средње ± СЕМ вредности цитокина (пг / мл плазме или медијума) ( е, ф ) или кратки пораст цитокина добијених из ткива мозга или сЦД40Л за ЛЦ или ЛП третиране над необрађеним мишевима ( г, х ), н = 9 за мишеве третиране ЛП и ЛЦ; н = 6 мишева за необрађене мишеве, (* П <0, 05; ** П <0, 01). Није било уочљивих или значајних разлика у нивоу цитокина у медијуму обрађеном у плазми и спленоцитима између ЛЦ-третираних и контролних необрађених мишева ( П > 0, 05)

Слика пуне величине

Хронични третман ЛП инхибира периферне и неуралне упале код Тг2576 мишева

С обзиром да ЛП може да модификује п -патологију п- амилоидног плака у трансгеничним мишевима АД, желели смо да утврдимо да ли је смањење А β повезано са анти-упалним ефектом. Код Тг2576 мишева, 8-недељни третман ЛП значајно је повећао ниво антиинфламаторних цитокина у плазми (тј. ИЛ-4 и ИЛ-10) у поређењу са необрађеним контролама, како је утврђено ЕЛИСА (Слика 5е). Поред тога, лечење ЛП повећавало је ИЛ-10 у спленоцитима, истовремено смањујући про-упалне цитокине (тј., ТНФ α и ИЛ-12п70), мерено ЕЛИСА (слика 5ф). Третман ЛП-ом није променио ИЛ-2 или ИФНγ у плазми, што је утврђено ЕЛИСА-ом (слика 5е). Третман ЛП-ом је такође повећао ниво антиинфламаторних цитокина у мозгу (тј. ТГФ β 1 и ИЛ-10), а при томе је ослабио ниво сЦД40Л (слике 5г и х) како је анализирао ЕЛИСА. Ниједан измерени цитокин није промењен ЛЦ третманом. Узети заједно, ови налази показали су да ЛП ублажава протуупалну микроглијску активацију, истовремено промовирајући β фагоцитозу и аутофагију.

ЛП третман смањује активност ГСК3 β и тау фосфорилацију ин витро

Како је ин виво инхибирала тау фосфорилацију и повећала инхибиторну фосфорилацију ГСК3 β , даље смо истраживали ове активности ЛП ин витро . ХеЛа ћелије које су прекомерно експримирале тау дивљег типа човека (ХеЛа / тау ћелије), ћелије хуманог неуробластома СХ-СИ5И и примарне ћелије неурона третиране су ЛП у повећаним концентрацијама (0, 2, 5, 5 и 10 мМ) током 12 х, а затим анализа тау и / или ГСК3 β фосфорилације ВБ. ЛП се значајно повећао у инхибиторној фосфорилацији ГСК3 β (Сер 9 ) у ХеЛа / тау ћелијама (слика 6а). Ово повећање анти-тау фосфорилације повезано је са смањењем за 10 мМ, на шта указује ПХФ1 (препознаје фосфо-Сер 396 ) и имунореактивност фосфо-тау (Тхр 231 ) у ћелијама ХеЛа / тау (Слика 6б). Слично томе, ЛП (5 и 10 мМ) значајно је повећао инхибиторну фосфорилацију ГСК3 β (Сер 9 ) у хуманом неуробластому СХ-СИ5И и примарним ћелијама неурона (Слика 6ц). Узето заједно, ови налази потврђују да ЛП смањује тау фосфорилацију путем инактивације ГСК3 β .

Image

ЛП смањује тау фосфорилацију уз повећање инхибицијске фосфорилације ГСК3 β (Сер 9 ) у култивисаним ћелијама. Хумане тау стабилно трансфициране ХеЛа ћелије (ХеЛа / тау ћелије) ( а, б ), ћелије хуманог неуробластома (СХ-СИ5И) ( ц ), (леви панел) и примарне ћелије неурона ( ц ), (десни панел) су третиране са ЛП у назначеним концентрацијама (0–10 мМ) током 12 х, након чега следи анализа ћелијских лизата ВБ. Статус инхибицијске фосфорилације ГСК3 β детектиран је анти-фосфо-ГСК3 β (Сер 9 ) и укупним ГСК3 β антитела ( а ). Статус фосфорилације тау детектиран је анти-фосфо-тау (п-тау (Тхр 231 )) и ПХФ1 антитела као што је претходно коришћено 61 ( б ). Тау46 ( б ) је откривен укупан тау (фосфорилиран и не-фосфорилиран). Резултати ВБ репрезентативни су за два независна експеримента за пГСК3 п (Сер 9 ) и укупни ГСК3 п , и три експеримента, респективно, за ПХФ1, п-тау (Тхр 231 ) и укупно тау са троструким дупликатима за свако стање лечења. Анализа дензитометрије испод сваке плоче са сликом ВБ-а показује омјер густоће опсега пГСК3 β (Сер 9 ) и укупног ГСК3 β, као и п-тау (Тхр 231 ) према укупном тау-у. Т- тест је показао значајно повећање односа пГСК3 β (Сер 9 ) према укупном ГСК3 β и пад п-тау-а за укупан тау за ХеЛа / тау ћелије третиране са 10 мМ ЛИСПРО у поређењу са контролном скупином (0 мМ) (* П <0, 05; ** П <0, 01). Поред тога, примећено је значајно повећање односа пГСК3 β (Сер 9 ) и укупног ГСК3 β за обе СХ-СИ5И ћелије и диференциране неуронске ћелије третиране са ЛИСПРО од 5 или 10 мМ у поређењу са контролном (0 мМ) (* П <0, 05) ( ц ). Излучени А β 1-40, 42 пептиди нису могли да се примете од А β ЕЛИСА кондиционираног медијума из ХеЛа / тау ћелија са или без ЛИСПРО третмана (подаци нису приказани)

Слика пуне величине

Лечење ЛП појачава диференцијацију ћелија неурона, а хронично лечење спречава губитак кортикалних неурона и синаптичких протеина

Да би се испитао утицај ЛП на диференцијацију ћелија неурона, култивисане ћелије мишјег неуробластома Н2а третиране су ЛП и ЛЦ на 10 мМ током 24 сата, а затим је анализирала неуронске маркере (тј. Β -бубулин ИИИ и фосфо-синапсин И (Сер 62 –67 )) имуноцитохемијским (ИЦЦ) и ВБ анализама. ЛП-третиране Н2а ћелије су значајно појачане диференцијације, о чему сведочи појачана експресија β -тубулина ИИИ и фосфо-синапсина И (Сер 62-67 ) у поређењу са ЛЦ (Слике 7а-ц). Поред тога, лечење ЛП значајно је побољшало диференцијацију култивисаних матичних ћелија мишева и хуманих неурона (МНСЦ и ХНСЦ) у поређењу са ЛЦ третманом, о чему сведоче побољшани неуронски маркери (тј. МАП2 и фосфо-синапсин И). Штавише, МНСЦ ћелије третиране ЛП-ом показале су повећану експресију Тау46, укупног тау-а и МАП2 у поређењу са тим ћелијама третираним са ЛЦ (Слике 7д-г). Узето заједно, ови налази показују да је ЛП значајно повећао диференцијацију матичних ћелија неурона.

Image

ЛИСПРО значајно промовише диференцијацију ћелија неурона и спречава губитак неуронског и синаптичког протеина код 3КСТг-АД мишева. Мишеви неуробластом (Н2а ћелије, а ), матичне ћелије мишјих неурона (МНСЦ, д ) и хумане неуронске матичне ћелије (ХНСЦ, Х9-изведени, ф) третирани су ЛП, ЛЦ, ЛиЦл или Л-пролином (10 мМ) за 24 х, 4 дана, односно 14 дана, респективно. Те ћелије су затим пермеабилизоване са 0, 05% Тритон Кс-100 у трајању од 5 минута, испране и обојене мишјим моноклонским антителом анти- П- тубулином ИИИ, зечјим антифосфонапсином И (Сер 62 и Сер 67 ) поликлоналним антителом, мишјим анти -МАП2 моноклонско антитело, мишје анти-укупно тау (тау46) антитело или зечје анти-ГФАП поликлонално антитело током ноћи на 4 ° Ц. Алека Флуор 488 козји антимишеви ИгГ (зелени) коришћен је за детекцију β -тубулина ИИИ, МАП2, а укупан тау и Алека Флуор 594 ​​магарац анти-зечји ИгГ (црвени) коришћени су за детекцију фосфо-синапсина И и ГФАП ( а, д ). ДАПИ бојење је коришћено за откривање нуклеарне ДНК. Конфокалне слике снимио је Олимпус Флуовиев ФВ1000 ласерским скенирајућим конфокалним микроскопом. Паралелно, ћелије Н2а ( б ), МНСЦ ( е ) и ХНСЦ ( г ) су третиране са ЛП, ЛЦ, ЛиЦл или Л-пролином на 10 мМ, лизиране су пуфером за лизирање ћелија, а затим подвргнуте ВБ анализи П - тубулин ИИИ, фосфо-синапсин И, МАП2, укупни тау и ГФАП. Као што је назначено испод сваког ВБ панела, омјери густине опсега β -тубулина ИИИ и фосфо-синапсина И (п-синапсин И) према β -актину ( ц), МАП2, укупни тау и фосфо-синапсин И у β -актину ( е ) и МАП2 и ГФАП до β- актина ( г ) представљени су као средња вредност ± СЕМ Ови подаци представљају три независна експеримента са сличним резултатима (* П <0, 05; ** П <0, 01). Није било приметне или значајне разлике у β -бубулину ИИИ, фосфо-синапсину И, МАП2, укупној имунофлуоресценцији и ГФАП имунофлуоресценцији и ВБ између ЛЦ, ЛиЦл или Л-пролин третмана ( П > 0, 05) за све три диференциране Н2а ћелије, МНСЦ и ХНСЦ, респективно. Секције можданог ткива и хомогенати припремљени од ЛП-, ЛС- или ЛЦ-третираних, или необрађених контролних 3КСТг-АД мишева, подвргнути су ИХЦ обојењу и ВБ анализама неуронских и пре- и пост-синаптичких протеина, користећи НеуН, синаптофизин и ПСД95 антитела, респективно. Нису забележене статистички значајне, али повећане промене укупног броја имунореактивних (НеуН) позитивних ћелија код ЛП- и ЛС-лечења у поређењу са необрађеним контролним мишевима ( х ). ( и ) Међутим, нивои протеина синаптофизин (Синапто) и ПСД95 су значајно повишени код мишева који су третирани са ЛП и ЛС у поређењу са контролним мишевима третираним са ЛЦ и необрађеним. Као што је назначено испод ИХЦ и ВБ панела, проценат односа неуН имунореактивних позитивних ћелија, синаптофизин и ПСД95 у односу на ГАПДХ одређиван је анализом слике (средња вредност ± СЕМ). Подаци су анализирани једносмјерном АНОВА и пост-хоц тестирањем помоћу Фисхерова ЛСД теста (* П <0, 05; ** П <0, 01)

Слика пуне величине

Да би се испитало да ли лечење ЛП-ом може да спречи губитак неурона, петомесечни 3КСТг-АД мишеви су лечени ЛП, ЛЦ или ЛС током 28 недеља, а затим ИХЦ анализа користећи антитело против НеуН. Третман ЛП и ЛС повећао је број позитивних ћелија обележених НеуН-ом у регији неокортекса у поређењу са необрађеним контролним мишевима (Слика 7х). Поред тога, мишеви третирани ЛП- и ЛС 3КСТг-АД показали су повећану експресију пре- и пост-синаптичких протеина (тј. Синаптофизин и ПСД95) анализом ВБ (слика 7и). Колективно, ови налази сугерирају да хронично давање ЛП или ЛС мишевима 3КСТг-АД значајно спречава губитак неурона и побољшава експресију пре- и пост-синаптичких протеина.

И акутни и хронични ЛП третман не повећава експресију ЦОКС2

Претходне студије ин витро и ин виво показале су да литијум хлорид инхибира конститутивну ГСК3 β активност у бубрегу, изазивајући тако експресију циклооксигеназе 2 (ЦОКС2); производе упалу и токсичност. 29, 30, 31 Да би упоредили утицај ЛП и ЛЦ на бубрежну ГСК3 β активност и експресију ЦОКС2, култивисане ћелије хумане бубрежне проксималне тубуле (ХРПТ) третиране су ЛП или ЛЦ на 0, 10, 20 или 30 мМ током 12 х . Занимљиво је да су и ЛП и ЛЦ повећали инхибиторну фосфорилацију ГСК3 β (Сер 9 ), док је само ЛЦ повећао експресију ЦОКС2 (слике 8а и б). Због тога, ЛЦ-индукована ЦОКС2 експресија не зависи од ГСК3 β активности.

Image

ЛИСПРО не повећава експресију ЦОКС2 ин витро и ин виво - Људске примарне бубрежне проксималне ћелије тубула (АТЦЦ ПЦС-400-010) узгајане су у медијуму ИнВитро ГРО (БиорецламатионИВТ) и третиране са ЛП, ЛЦ, ЛиЦл или Л-пролином на 0 до 30 мМ током 12 х. Те ћелије су затим лизиране ћелијским пуфером за лизу и анализиране од стране ВБ на ЦОКС2, укупну експресију ГСК3 п и фосфо ГСК3П (Сер 9 и Тхр 390 ) коришћењем анти-ЦОКС2 антитела ( а ) и анти-фосфо- и укупних ГСК3 β антитела ( б ) Имајте на уму да нису биле приметне разлике у експресији ЦОКС2 или ГСК3 β фосфорилацији између третмана ЛЦ и ЛиЦл. Третман Л-пролином није изазвао промене у експресији ЦОКС2 и ГСК3 β фосфорилацији. Мушки мишеви Б6129Ф2 / Ј (тежине 20–25 г, двомесечни стари) третирани су са 3 исхране која је садржавала ЛП, ЛЦ или ЛС, или контролисали Теклад 2018 дијету, током 1 или 2 недеље, дајући литијум у 1, 125 или 2, 25 мМ / кг / дан. Сви су мишеви добили нормалну воду за пиће и цхов ад либитум . ( ц ) Бубрези су сакупљени након лечења и анализирани од стране ИХЦ-а на експресију ЦОКС2 у бубрежној медули. ( д ) Поред тога, микросомални протеини бубрега су екстраховани за процену ЦОКС2 експресије ВБ анализом. Омјер густоће опсега ЦОБ2 према П- актину ВБ одређен је ИмагеЈ анализом (средња вредност ± СЕМ) у дупликатима од шест мишева у свакој групи. Статистичка анализа је извршена коришћењем АНОВА (* П <0, 05, н = 6 за ЛП, ЛЦ и, ЛС; н = 3 за контролну исхрану). Поред тога, Тг2576 мишеви су третирани са две дијете које садрже ЛП или ЛП, дајући литијум са 2, 25 мМ / кг / дан током 8 недеља. ( е ) Бубрези су прикупљени након лечења и анализирани од стране ИХЦ-а на експресију ЦОКС2 у бубрежној медули. ( ф ) Бубрежни микросомални протеини су екстраховани за процену ВБ експресије. ( г ) Квантификација ЦОКС2 и β - актинског опсега густоће опсега ВБ међу цтрл, ЛП и ЛЦ третманима одређена је ИмагеЈ анализом. Статистичка анализа извршена је коришћењем АНОВА праћеног пост хоц Фисхер ЛСД (* П <0, 05, ** П <0, 01, н = 9 по третману)

Слика пуне величине

Да би упоредили ефекте лечења ЛП, ЛС и ЛЦ на бубрежну ЦОКС2 експресију ин виво , 6-недељни Б6129СФ2 / Ј мишеви храњени су две недеље дијетама које садрже ЛП, ЛЦ или ЛС у малим или високим дозама (1.125 или 2.25 мМ Ли / кг / дан). Као што показују анализе ВБ и ИХЦ, ни ЛП, ЛЦ ни ЛС третман не мења експресију ЦОКС2 при малим дозама, мада су Б6129СФ2 / Ј мишеви третирани ЛЦ-ом показали тенденцију повећања. Супротно томе, само ЛЦ значајно је повећао експресију ЦОКС2 при великој дози (слике 8ц и д). Надаље, да би се испитало да ли хронична примена литијума изазива експресију ЦОКС2 у контексту патолошког стања, трансгени Тг2576 АД мишеви су третирани са ЛП и ЛЦ са 2, 25 мМ Ли / кг / дан (велика доза) током 8 недеља. Као што се очекивало, и ИХЦ и ВБ анализе показале су да само ЛЦ третман показује значајно повећање експресије ЦОКС2 (слике 8е-г). Није нађена статистички значајна разлика између мишева третираних ЛП-ом Тг2576 АД и необрађених контролних група.

Дискусија

Упркос уском терапијском прозору (0, 6–1, 5 мМ) и могућности озбиљних нежељених догађаја, литијум се користи као терапија првог реда за смањење маничних епизода и суицидности код пацијената са биполарним поремећајем због недостатка бољих алтернатива. 32 Претходно смо показали да ФИТ-одобрени литијум-карбонат ствара веома оштре вршне концентрације у плазми и литијуму у мозгу након оралног дозирања, након чега следи брзи пад пацова. Супротно томе, ЛИСПРО је показао стални ниво литијума у ​​плазми и мозгу до 48 х без оштрог врха. 21 На основу ових налаза, претпостављамо да ЛИСПРО може спречити драстичну промену нивоа литијума у ​​плазми виђеном са тренутним литијумским лековима и одржавати стабилне терапијске дозе и тако ће представљати значајно побољшање у односу на тренутне литијумске лекове током жељеног времена споро ослобађање у периферној крви. Слично горе наведеним налазима, наши недавни подаци (лечење од 8 недеља код Тг2576 мишева) показали су значајно стабилне нивое литијума у ​​плазми током периода (Слика 2ц) као и виши ниво литијума у ​​мозгу у поређењу са Ли 2 ЦО 3 (Слика 2д). Још важније, Б6129СФ2 / Ј мишеви третирани ЛИСПРО показали су значајно више нивоа литијума у ​​мозгу при малим (1, 125 мМ / кг / дан) и високим (2, 25 мМ / кг / дан /) концентрацијама у поређењу са Ли 2 ЦО 3 (Слике 2а-б). Штавише, наше недавно истраживање такође је показало упоредиве нивое литијума у ​​мишјој плазми и мозгу 3КСТг-АД као резултат литијум-салицилата, Ли 2 ЦО 3 или ЛИСПРО (лечење од 28 недеља). Даље, омјер литијума од мозга и плазме у групи третираној ЛП био је нешто већи (ЛП и ЛС, П = 0, 98; ЛП и ЛЦ, П = 0, 84; ЛС и ЛЦ, П = 0, 85) у односу на групе третиране са ЛС и ЛЦ (Слике 2е-ф). Литијум је коришћен у лечењу више неуродегенеративних болести, укључујући АД. Објављено је да литијум спречава стварање А β пептида инхибирањем активности ГСК3 α , што интерферира са цепањем АПП и-секретазе. 14, 33, 34 Што се тиче ЛП-а, очекивали смо да додавање салицилата, који је примарни дериват метаболита ацетил-салицилне киселине (аспирин), може заједно да делује синергистички на побољшању сигурности и модификовању фармаколошког деловања литијума за слабљење АД патологија. Подаци студије указују на то да аспирин делује на упалне каскаде, неповратно инхибирајући ЦОКС1 и модификујући активност ензима ЦОКС2, сузбијајући производњу простагландина и тромбоксана. Иако литијум има противупална својства, неколико студија показује да хронични литијум може индуковати ЦОКС2 експресију инхибицијом ГСК3 β активности. Наши подаци су такође показали да и литијум-карбонат и ЛИСПРО инактивирају ГСК3 β , али само литијум-карбонат активира ЦОКС2 док ЛИСПРО сузбија ЦОКС2 услед противупалних својстава салицилатног аниона. Недавна епидемиолошка студија показала је да аспирин у малим дозама са литијумом има синергистичке ефекте повећавањем 17-хидрокси-декосахексанојске киселине (17-ОХ-ДХА), анти-упалног метаболизма ДХА у мозгу, што значајно смањује ризик од погоршања болести код биполарних пацијената у поређењу са другим нестероидним противупалним лековима и глукокортикоидима, ЦОКС2 инхибитором. 35 Заједно, салицилна киселина повећала је мозак 17-ОХ-ДХА, 36 а литијум редуковао неуроинфламатор, 37, 38 док је звиттерионски л-пролин значајно смањио хигроскопско својство матичне соли салицилата утицајући на стварање чврсте фазе. Под претпоставком да је горња хипотеза тачна, желели смо да истражимо биоактивност ЛИСПРО-а у смислу ублажавања патологије АД у системима ћелијске културе и трансгених (Тг2576 и 3КСТг-АД) модела миша. Показали смо да су 8-недељни ЛисПРО-третирани Тг2576 АД мишеви значајно смањили растворљиви и нерастворљиви ниво β као и А β терет у односу на Ли2ЦО3 - и контролно третиране Тг2576 АД мишеве (слике 3а-ц). Да бисмо испитали утицај ЛИСПРО на генерирање β код 5-месечних мишева 3КСТг-АД, лечили смо их ЛИСПРО, литијумским салицилатом, Ли 2 ЦО 3 и контролисали исхрану 28 недеља, са једнаким дозама литијума (2, 25 мМ / кг / дан / ). Показали смо да је ЛИСПРО третманом значајно смањио ванћелијске А β плакове, о чему сведочи бојење ИХЦ коришћењем антитела 4Г8 и 6Е10 (слике 3д и е). Узето заједно, ови налази показују да ЛИСПРО сузбија стварање и растворљивог и нерастворљивог А β у моделима Тг2576 и 3КСТг-АД на мишима.

Штавише, неколико доказа доказало је да је литијум директан инхибитор ГСК3 п и такође повећава инхибиторну серин-фосфорилацију ензима. 11, 39 Стога смо желели испитати може ли ЛИСПРО смањити тау фосфорилацију у ћелијској култури и АД мишјим моделима. Користећи хумани ХеЛа / тау, хумани неуробластома СХСИ-5И и примарне ћелијске неуронске станице, открили смо да лечење ЛИСПРО инхибира фосфорилацију тау у концентрацијама 5–10 мМ, што је повезано са повећањем инхибиторне фосфорилације ГСК3 β (Сер 9 ) (Слике 6а – ц). Узети заједно, ови налази показали су да ЛИСПРО инактивира активност ГСК3 β , и тако смањује тау фосфорилацију. Пошто је литијум погодан инхибитор за инхибирање ГСК3 β ин виво , такође смо испитали да ли је супресија ГСК3-посредоване ЛИСПРО-а повезана са слабљењем тау фосфорилације код мишева Тг2576. У овом моделу, показали смо да 8-недељни третман ЛИСПРО значајно смањује п-тау (Тхр 231 ) фосфорилацију у поређењу са Ли 2 ЦО3 и контролом (слике 4а и б). These findings were also correlated with increased pGSK3 β (Ser 9 ) inhibitory phosphorylation, indicating inactivation of GSK3 β activity (Figure 4c). To confirm these data obtained in the Tg2576 AD mouse model, we next investigated whether chronic administration of LISPRO could also reduce tau phosphorylation in 3XTg-AD mice. Thus, we treated 5-month old 3XTg-AD mice with LISPRO, lithium salicylate, Li 2 CO 3, or control diet for 28 weeks with equal doses of lithium (2.25 mM/kg/day). IHC staining using p-tau (Thr 231 ) and p-tau (Ser 396 ) antibodies as well WB analyses using multiple p-tau (Ser 396, Ser 404, Thr 181, and Thr 231 ) amino-acid residues demonstrated that LISPRO, and in many cases lithium salicylate, significantly attenuates tau phosphorylation compared to Li 2 CO 3 and control (Figures 4d–j).

Inflammatory processes are thought to have an active role in AD formation and progression. Preclinical as well as postmortem analyses of AD patient brains have provided tons of evidence indicating the dysregulation and/or uncontrolled activation of microglial and astrocytic cells, activation of complement cascade, inflammatory enzymes such as COX2, inducible nitrate oxide synthase, reactive oxygen species, and calcium dysregulation pathways in brain, CSF, and blood. 40, 41, 42 Although it is inconclusive whether these changes are initiating or secondary consequences, pro-inflammatory such as IL-1 β , IL-6, TNF α , NO, and anti-inflammatory cytokines such as IL-4, IL-10, TGF β elevated in the CSF and blood of AD patients. 41, 43, 44 Multiple lines of evidence showed that lithium down-modulates the pro-inflammatory cytokine responses in animal models and is of therapeutic benefits in several neurodegenerative diseases. 45, 46 Specifically, Nassar and Azab conclude that lithium has anti-inflammatory properties that may contribute to its therapeutic activity by down-regulation of COX2, inhibition of IL-1 β , TNF α , and upregulation of IL-2 and IL-10. 47 On the other hand, in contrast to above findings, large bodies of evidence indicated that lithium also induces pro-inflammatory cytokines production such as IL-4 and IL-6 in certain disease conditions. 48, 49 Based on these reports, we sought to examine if the efficacy of LISPRO for reducing AD-like pathology in transgenic Tg2576 mice is associated with modulation of pro- and anti-inflammatory cytokine responses. We showed that LISPRO treatment significantly increases the expression of anti-inflammatory cytokines such as IL-4, IL-10, and TGF- β 1, whereas it decreases the expression of pro-inflammatory cytokines such as INF γ , IL-12p70, and sCD40L in Tg2576 mouse brains compared with control- and LC-treated Tg2576 mouse brains (Figures 5e–h). Taken together, these findings suggest that LISPRO might reduce A β pathology at least in part via upregulated anti-inflammatory and down-regulated pro-inflammatory cytokine responses in Tg2576 mice.

We demonstrated that CD40-CD40L interaction is critical for brain pro-inflammatory responses in aggravating AD-like pathology. 50 As LISPRO treatment reduced A β production in cell culture and transgenic (Tg2576 and 3XTg-AD) mouse models, we next hypothesized that reduction of A β pathology might correlate with decreased microglial CD40 expression and/or increased phagocytosis by microglia. In this regard, we found that decreased expression of microglial CD40 and brain soluble CD40L expression by LISPRO treatment might help attenuate A β associated pathology, suggesting that disruption of CD40-CD40L signaling could also be involved in attenuation of A β pathology in Tg2576 and 3XTg-AD mouse models. As expected, LISPRO suppresses IFNγ-induced CD40 expression (Figures 5b and c) and enhances microglial phagocytosis of A β (Figure 5d) in cultured primary microglial cells. Moreover, multiple lines of evidence demonstrated that lithium enhances autophagy at low doses (10 mM). 27, 28 In this regard, we found that LISPRO treatment enhances autophagy markers LC3B in cultured primary microglial cells (Figure 5a). Collectively, our data suggest that LISPRO-mediated attenuation of A β pathology is associated with several therapeutic endpoints, including upregulated anti-inflammatory and down-regulated pro-inflammatory cytokines, suppression of CD40 that disrupts CD40-CD40L signaling, increased microglial phagocytosis of A β , and upregulated autophagy.

Furthermore, to investigate whether LISPRO treatment could modulate neuronal cell differentiation, cultured mouse neuroblastoma N2a, as well as murine and human stem cells was treated with LISPRO, Li 2 CO 3, and control. Our data from IHC staining and supportive WB analyses using β -tubulin III, phospho-synapsin I (Ser 62–67), MAP2, and total tau antibodies demonstrated that LISPRO treatment significantly promotes neuronal cell differentiation compared to Li 2 CO 3 (Figures 7a–g). Cheng and Chuang reported that lithium increases the suppression of p53 and expression Bcl-2 providing neuronal survival. 51 In addition, it has been shown that administration of lithium as well as mood-stabilizing agent valproate, increases Bcl-2 levels in the cortical region. 52 Based on these findings, we also wanted to examine whether LISPRO could prevent cortical neuronal loss in 5-month-old 3XTg-AD mice treated with LISPRO, lithium salicylate, Li 2 CO 3, or control diet for 28 weeks. Quantitative analysis of neuronal cell numbers using the neuronal marker anti-NeuN antibody, displayed that LISPRO and lithium salicylate treatments, respectively, yield an increased survival neurons in the neocortex region of 3XTg-AD mice (Figure 7h). We further examined whether LISPRO treatment could modulate the expression of synaptic proteins in 3XTg-AD mice brain, and found that LISPRO and lithium salicylate significantly increase the protein expression of synaptophysin (Pre-synaptic) and PSD95 (Post synaptic) in these transgenic mice (Figure 7i).

Finally, one of the major side-effects of lithium includes renal toxicity secondary to increased expression of COX2 and ensuing inflammation. It has been shown that acute and chronic administration of lithium could enhance COX2 expression by suppressing GSK3 β activity in renal cell lines and mouse models. 29, 30 We observed the effect of LISPRO on COX2 expression in renal cells from the Tg2576 AD as well as wild-type B6129SF2/J mouse models. We treated HRPT with LISPRO and Li 2 CO 3 . IHC staining and supportive WB data indicated that LISPRO treatment does not enhance COX2 expression in HRPT renal cells (Figures 8a and b). To further test the effect of LISPRO treatment on COX2 expression in vivo , we orally fed B6129SF2/J and Tg2576 mouse lines with LISPRO, lithium salicylate, and Li 2 CO 3 for 2, and 8 weeks, respectively, with low (1.125 mM/kg/day) and high doses (2.25 mM/kg/day). Our IHC and supportive WB findings indicated that LISPRO treatment does not increase COX2 expression (Figures 8c–g).

In sum, our data support our hypothesis that LISPRO is a better alternative formulation of lithium in terms of safety and efficacy in ameliorating AD pathology in cell culture and two different transgenic mouse models. Nevertheless, further translational research is warranted to fully validate LISPRO as a safe and effective disease modifying therapy for AD and other neurodegenerative diseases.

материјали и методе

Реагенси

For preparation of LISPRO (LP), lithium salicylate (LS) (98% pure, anhydrous, 1 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)) and L-proline (99% pure, Sigma-Aldrich, 1 mM) were dissolved in 2.0 ml of hot deionized water. The resulting solution was maintained on a hot plate (75–90 °C) to allow slow evaporation of solvent until colorless crystals had formed, which were collected and dried (evaporation at 1 atmospheric pressure). For preparation of lithium carbonate (LC), (99% ACS grade, 1 mM (Sigma-Aldrich)) were suspended in 1–2% methylcellulose (12–18 cP, 1–2% in H 2 O (20 °C) (Sigma-Aldrich)) solution.

Антитела

Primary antibodies include anti-A β 1-16 (6E10, Covance Research Products, Emeryville, CA, USA), anti-A β 17-24 (4G8, Covance Research Products), anti-p-tau (Thr 231, EMD Millipore, Billerica, MA, USA), anti-p-tau (Ser 202, AT8, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), anti-p-tau (Ser 404 ), anti-p-tau (Thr 181, AT270, AnaSpec, Fremont, CA, USA), anti-total tau (tau46, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-synaptophysin (Cell Signaling Technology), anti-GSK3 β (Ser 9, Thermo Fisher Scientific), anti-COX2 (Thermo Fisher Scientific), anti-light chain 3B (LC3B) (Thermo Fisher Scientific), anti- β -tubulin III (Thermo Fisher Scientific), anti-p-synapsin I (Thermo Fisher Scientific), anti- microtubule associated protein 2 (MAP2) (Thermo Fisher Scientific), anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) (Thermo Fisher Scientific), anti- neuronal nuclei (NeuN) (Thermo Fisher Scientific), anti- post synaptic density protein 95 (PSD95) (Thermo Fisher Scientific), and anti-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (Thermo Fisher Scientific) antibodies. Paired helical filament 1 (PHF1) antibody was kindly provided by Dr. Peter Davies (Albert Einstein University).

Ћелијска култура

HeLa cells stably transfected with wild-type 4R0N human tau (HeLa/tau cells; kindly provided by Dr. Chad Dickey, University of South Florida (USF) (Tampa, FL, USA)), human neuroblastoma SH-SY5Y cells (ATCC, Manassas, VA), murine neuroblastoma cells (N2a cells), murine neuronal stem cells (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canada), human neural stem cells (H9-Derived, ATCC) were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) with 10% fetal bovine serum, 1 mM sodium pyruvate, and 100 U/ml of penicillin/streptomycin. Kidney cells were cultured in InVitro GRO medium (BioreclamationIVT, ATCC). Splenocytes from individual mice were prepared and treated as previously described. 53 Primary neuronal cells were obtained from cerebral cortices of Tg2576 mouse embryos, between 15 and 17 days in utero , as described previously. 54 These cells were treated with LP or LC at 0, 2.5, 5, 10, 20, or 30 mM for 12 h, supernatants were collected and cells were washed with ice-cold PBS 3X and lysed with cell lysis buffer (20 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% v/v Triton X-100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β -glycerolphosphate, 1 mM Na 3 VO4, 1 μ g/ml leupeptin, and 1 mM PMSF) (Sigma-Aldrich).

In addition, murine primary culture microglia was isolated from mouse cerebral cortices, as described previously. 55, 56 In brief, cerebral cortices from newborn mice (1-day old) were isolated under sterile conditions and mechanically dissociated at 4 °C. Cells were grown in RPMI 1640 medium supplemented with 5% fetal calf serum, 2 mM glutamine, 100 U/ml penicillin, 0.1 μ g/ml streptomycin, and 0.05 μ M 2-mercaptoethanol for 14 days, after which only glial cells remained. Astrocytes were separated from microglial cultures using a mild trypsinization protocol as described. 57 Greater than 98% of these glial cells stained positive for anti-Mac-1 antibody (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis. 58

Ензимски имуносорбентни тест

Enzyme-linked immmunosorbent assay (ELISA) was performed according to the manufacturer's instruction. Total A β species, including A β 40, 42 in cell conditioned media and brain homogenates were detected by A β 1–40/42 ELISA kits (IBL America, Minneapolis MN, USA) according to the manufacturer's instructions. In addition, cytokines (TNF α , IL-10, and IL-12 (p70)) levels in brain homogenates and or in cell conditioned media were measured by ELISA (R &D Systems, Minneapolis, MN) according to the manufacturer's instructions. A β levels are represented as pg/mg (mean±SEM) of total cellular protein.

Microglial inflammatory activity analysis

To determine the effect of LP on microglial pro-inflammatory activity, primary microglial cells were treated with LP (0–20 mM) in the presence of interferon γ (IFN γ ) (100 U/ml) and/or CD40 ligand (CD40L, 1 μ g/ml) for 8 h, and then pro-inflammatory microglial activation was assessed by FACS and ELISA analyses of CD40, tumor necrosis factor α (TNF α ), and interleukin-12 protein 70 (IL-12p70). 55, 58

Phagocytosis analysis

To determine the effect of LP on microglial A β phagocytosis, primary microglia were pre-treated with LP at 10 mM or vehicle (1% dimethyl sulfoxide) for 6 h followed by incubation with 1 μ M fluorescein isothiocyanate (FITC)-A β 42 for 1 h. Cellular supernatants and lysates were analyzed for extracellular and cell-associated FITC-A β 42 using a fluorometer and data were represented as the relative fold of mean fluorescence change, calculated as the mean fluorescence for each samples at 37 °C divided by mean fluorescence at 4 °C.

Autophagy analysis

In addition, the effect of LP and LC on microglial autophagy was determined by pretreating microglial cells with LP, LC (10 mM), or phosphate-buffered saline (PBS) for 18 h, followed by permeabilization, staining with autophagic marker LC3B antibody and determination of fluorescent intensity of autophagosome and cytosol by a Slidebook digital microscopy (Version 5.0.0.1, Olympus America Inc., NY USA).

Животиње

Triple transgenic (3XTg-AD) mice harboring APP SWE, PSEN1 (PS1/M146V) and tau (P301L) mutations (3XTg-AD, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA), Tg2576 mice harboring APP SWE (Taconic, Hudson, NY, USA), and wild-type B6129SF2/J mice (the Jackson Laboratory) were housed under standardized 12 h-light/12-h dark cycle at ambient temperature and humidity with diet and water available ad libitum at the USF vivarium. The mice were allowed to acclimate for a period of one week before any treatment. All experiments were conducted in accordance with USF Institutional Animal Care and Use Committee approved protocols and guidelines of the National Institutes of Health.

Lithium treatment

Adult male B6129SF2/J mice (2-month old) were treated for 2 weeks (acute) with one of six diets, consisting of normal mice chow diet (Teklad 2018) containing low or high doses of LP (0.18 or 0.35%; equivalent to 292 or 583 mg/kg/day), LS (0.10 or 0.20%; equivalent to 162 or 325 mg/kg/day), or LC (0.025 or 0.05%; equivalent to 42 or 83 mg/kg/day), yielding 1.125 or 2.25 mM Li/kg/day, respectively, for all forms of lithium. In addition, both male and female Tg2576 (8-month old) and 3XTg-AD mice (5-month old) were fed for 8 and 28 weeks (chronic) with one of four diets, respectively, consisting of normal mice chow alone or normal chow supplemented with LC (0.05%), LS (0.20%), or LP (0.35%). These doses were chosen based on the literature and a pilot study conducted at our laboratory using low- and high doses of lithium salts.

Plasma and brain lithium measurement

After LP, LS, or LC treatment, mice were anesthetized with isoflurane, blood was collected by cardiac puncture, the heart and vasculature were carefully perfused with ice-cold PBS containing heparin (10 U/ml) and brain tissue was removed for lithium determination using atomic absorption spectroscopy (AAS). Blood was centrifuged at 1, 600 × g at room temperature for 10 min and 100 μ l plasma was diluted 10 fold in 10% isopropyl alcohol containing 5% trichloroacetic acid (IPA), vortexed, and incubated for 10 min to precipitate proteins. Supernatants were clarified at 3000 × g for 30 min prior to measuring lithium content (AA-6200, Shimadzu, Kyoto, Japan at the Interdisciplinary Research Facility at USF). Each brain was divided coronally, the front half was rinsed with PBS, weighed, suspended in an equal volume of concentrated HNO 3, heated for 1 h at 100 °C, cooled to room temperature, centrifuged at 3000 × g for 1 h, and the supernatant was diluted 10 fold in 10% isopropyl alcohol prior to measuring lithium content using AAS (Shimadzu AA-6200). Peak absorbance were determined referring to values obtained for standards 1% HNO 3 lithium solution (HIGH-PURITY STANDARDS, Charleston, SC, USA).

Вестерн блот анализа

The posterior half of each brain was equally divided sagittally and one portion (one-fourth of brain) was immediately frozen at liquid nitrogen, and stored at −80 °C for western blot (WB) analyses. Brains were homogenized (Minilys homogenizer, Bertin Technologies) in RIPA lysis buffer (Cell Signaling Technology) containing protease and phosphatase inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific) and centrifuged at 14 000 rpm for 1 h at 4 °C. For WB analyses, supernatants from cell lysates or homogenized tissue were electrophoretically separated using 10% bicine/tris gel (8 M urea) for proteins less than 5 kD or 10% tris/SDS gels for larger proteins. Electrophoresed proteins were transferred to nitrocellulose membranes (Bio-Rad, Richmond, CA, USA), washed and blocked for 1 h at room temperature in tris-buffered saline containing 5% (w/v) non-fat dry milk (TBS/NFDM). After blocking, membranes were hybridized overnight with various primary antibodies, washed and incubated for 1 h with the appropriate HRP-conjugated secondary antibody in TBS/NFDM. Blots were developed using the luminol reagent (Thermo Fisher Scientific) and densitometry analysis was performed using an ImageJ software (Java 1.6.0_20, NIH, USA) as used previously. 59, 60

Имунохистохемијска анализа

The other posterior portion (one-fourth) of each brain was fixed in fresh 4% paraformaldehyde solution for cryostat sectioning and free-floating 25- μ m coronal sections were collected and stored in PBS with 100 mM sodium azide at 4 °C. Immunohistochemical (IHC) staining was conducted according to the manufacturer's instruction using a Vectastain ABC Elite kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) coupled with the diaminobenzidine substrate. Biotinylated anti-phospho-tau antibodies against different phospho-tau residues were used as primary antibodies. Images were acquired as digitized tagged-image format files to retain maximum resolution using a BX60 bright field microscope with an attached CCD camera system (Olympus DP-70, Tokyo, Japan). Digital images were routed into a Windows PC for quantitative analyses using an ImageJ software after obtaining a threshold optical density that discriminated staining from background. Each anatomic region of interest was manually edited to eliminate artifacts and selection bias was controlled for by analyzing each region of interest in its entirety. 61

Immunocytochemical analysis

After 30 min fixation with fresh 4% paraformaldehyde solution, ICC staining was conducted by indirect method and visualized by appropriate immunofluorescence dye (ie, FITC)-labeled secondary antibodies. Images were acquired as digitized tagged-image format files to retain maximum resolution using a confocal microscope with an attached CCD camera system (Olympus DP-70).

Статистичка анализа

All data were normally distributed; therefore, in instances of single mean comparisons, Levene's test for equality of variances followed by the t -test for independent samples were used to assess significance. In instances of multiple mean comparisons, one-way analysis of variance with post hoc Fisher's LSD test was used. Alpha was set at 0.05 for all analyses. The statistical package for the social sciences release IBM SPSS 23.0 (IBM, Armonk, NY) was used for all data analyses.