Мафк позитивно регулише активност нф-κб побољшавајући цбп-посредовану ацетилацију п65 | научни извештаји

Мафк позитивно регулише активност нф-κб побољшавајући цбп-посредовану ацетилацију п65 | научни извештаји

Anonim

Субјекти

  • Ацетилација
  • Стресна сигнализација

Апстрактан

Реактивне врсте кисеоника, настале оксидативним стресом, покрећу и промовишу многе метаболичке болести активирањем / сузбијањем редокс осетљивих фактора транскрипције. НФ-κБ и Нрф2 су важни регулатори оксидационе отпорности и доприносе патогенези многих болести. Идентифицирали смо МафК, нови транскрипцијски регулатор који модулира активност НФ-κБ. МафК кноцкдовн смањује активацију НФ-κБ, док прекомерна експресија МафК-а побољшава функцију НФ-κБ. МафК је посредовао ацетилацијом п65 од стране ЦБП-а након ЛПС стимулације, омогућавајући регрутовање п65 на НФ-κБ промоторе као што су ИЛ-8 и ТНФα. У складу са овим резултатима, мишеви са осиромашеним МафК показали су продужено преживљавање са смањеним хепатичким упалним одговором након убризгавања ЛПС и Д-ГалН. Дакле, наша открића откривају нови механизам помоћу којег МафК контролише активност НФ-κБ путем ацетилације п65 посредоване ЦБП.

Увод

Нуклеарни фактор каппа Б (НФ-κБ) је фактор транскрипције са више генетских циљева и контролише различите ћелијске функције укључујући имунолошки упални одговор, ћелијску адхезију, диференцијацију, апоптозу, реакције изазване стресом, преживљавање и напредовање већине хроничних болести 1, 2, 3 . НФ-κБ се директно активира у хроничним упалним стањима као што су кардиоваскуларна, аутоимуна, кожна и неуродегенеративна обољења, као и рак 4 . НФ-κБ регулише експресију преко 500 гена који су укључени у људске болести, а сигнални пут НФ-κБ постао је мета фармаколошке интервенције 5, 6 ; међутим, није одобрен ни један блокатор НФ-κБ за људску употребу. Главни изазов је развој НФ-κБ инхибитора заснован на њиховој способности да циљају одређене путеве или ћелије код различитих болести, чиме се избегавају нежељени нежељени ефекти 7 .

Нуклеарни фактор еритроид 2 повезан фактор 2 (Нрф2) је основни леуцински затварач на редок-осетљив фактор транскрипције који регулише индукцију антиоксидативних одговора (АРЕ) индуковану фазу ИИ детоксикационих и антиоксидативних ензима 8, 9 . Када их изазивају оксиданти или електрофили, Нрф2 активира транскрипцију преко 100 гена за цитопротективу и детоксикацију, укључујући антиоксиданте феритин, глутатион-С-редуктазу (ГСР), модулатор глутамил цистеин лигазе (ГЦЛМ) и глутамил цистеин лигазе-каталитички лигазе-ГЦЛ-катализатор лигазе ) ензим оксидације лека фазе И НАД (П) Х: хинон оксидоредуктаза 1 (НКО1) и цитопротективни ензим хеме оксигеназа-1 (ХО-1) 10, 11, 12 . Нрф2 се нормално задржава у цитоплазми помоћу сложеног формирања са Кеап1 13 . У обрани тела од оксидативног, упалног или токсичног стреса, Кеап1 негативно регулише Нрф2 повећавајући брзину разградње протеасомалних Нрф2 и мења њену ћелију. Нрф2 прелази у језгро где формира хетеродимерне комплексе са другим факторима транскрипције као што су ц-Јун, АТФ3, АТФ4 и мали Мафс, и индукује експресију гена који спречавају стрес 14, 15 .

Молекуларни механизми оксидацијске сигнализације и регулације антиоксиданата укључују различите транскрипционе факторе 16 . За разлику од НФ-κБ, који игра кључну улогу у оксидативном стресу и упали, Нрф2 је главни регулатор редокс сигнализације и ћелијске отпорности на оксиданте; стога може ублажити многе болести 17, 18, 19 . Недавни докази наговештавају унакрсни разговор између Нрф2 и НФ-κБ под оксидативним стресом. Конкретно, НФ-κБ п65 подјединица потискује пут Нрф2-АРЕ тако што се надмеће за регрутовање коактиватора транскрипције ЦБП и ХДАЦ3 20 . Штавише, НФ-κБ сигнализација инхибира пут Нрф2-АРЕ кроз интеракцију п65 и Кеап121. Међутим, дефинитивни докази директне инхибиције Нрф2 сигнализације НФ-κБ нису објављени.

У овој студији смо показали да Нрф2 инхибира НФ-κБ сигнализацију под оксидативним стресом. Идентификовали смо мали маф протеин МафК као нови протеин ин витро који делује са НФ-κБ. Заправо, МафК је коактиватор или репресивац Нрф2 транскрипцијске активности и стога је позитиван регулатор НФ-κБ. Ова студија успоставља важну везу између стварања Нрф2-МафК и стварања стресног сигнала под оксидативним стресом регулисањем активности НФ-κБ.

Резултати

Нрф2 негативно регулише активност НФ-κБ

Иако Нрф2 инхибира НФ-κБ сигнализацију, прецизан механизам није у потпуности разумљив 22 . Трансфицирали смо ћелије хуманог хепатоцелуларног карцинома јетре (ХепГ2) са НФ-κБ луциферазним репортер плазмидом и контролном или НРф2-специфичном сиРНА. Срушење Нрф2 значајно је побољшало НФ-κБ транскрипцијску активност и НФ-κБ-транскрипцију као одговор на ЛПС (Сл. 1). Превелика експресија Нрф2 смањила је транскрипциону активност НФ-κБ и транскрипцију зависну од НФ-κБ (види допунску слику С1). Ови резултати сугерирају да Нрф2 посебно блокира активност НФ-κБ.

Image

(а) Нрф2 кноцкдовн од Нрф2 сиРНА. ХепГ2 ћелије су трансфициране контролном или Нрф2 сиРНА. Након 24 сата, додат је ЛПС (1 µг / мЛ) и ћелије су се инкубирали током 24 сата и скупљене за ПЦР у реалном времену. (б) Нрф2 кноцкдовн повећао је активност НФ-κБ. Новинар НФ-κБ-одговор-елемента-Луц котрансфектиран је НРф2 сиРНА у ХепГ2 ћелије. Након 24 сата, ћелије су третиране ЛПС-ом. Након 24 сата, ћелије су лизиране за одређивање луциферазе. (ц) Нрф2 оборење НРф2 сиРНА увећало је експресију НФ-κБ-осјетљивих гена. За све панеле траке грешака представљају СЕМ (н = 3). П вредности су израчунате коришћењем Студент-овог т- теста.

Слика пуне величине

Урегулирани израз МафК недостатка Нрф2

Нрф2 формира хетеродимере са малим молекулама, укључујући мале маф протеине који су укључени у коактивацију или супресију транскрипцијске активности 23 . Да бисмо идентификовали нове потенцијалне регулаторе НФ-κБ сигнализације под исцрпљивањем Нрф2, истраживали смо утицај малих маф протеина на активност НФ-κБ регулисану Нрф2. Анализирали смо експресију малих маф протеина и приметили значајно повећање нивоа МафК протеина у ћелијама оштећеним Нрф2 ХепГ2. Занимљиво је да су се нивои транскрипта МафК повећали након исцрпљивања Нрф, иако се МафК димеризира са Нрф2. Међутим, није било значајне разлике у нивоима МафГ и МафФ (Сл. 2а и 2б). Пошто се експресија МафК повећала након исцрпљивања Нрф2, поставили смо питање да ли је повећани МафК одговоран за појачани НФ-κБ одговор након обарања Нрф2. МафК и Нрф2 су истовремено испражњени и обављени су НФ-κБ извештаји. Повишена активност НФ-κБ након рушења Нрф2 спашена је исцрпљивањем МафК-а, што сугерише да МафК има кључну улогу у активности НФ-κБ-регулисаних Нрф2 (Сл. 2ц).

Image

(а и б) Мањак Нрф2 увећао је експресију МафК, али не и остале мале маф протеине. ХепГ2 ћелије су трансфициране контролном или Нрф2 сиРНА. Након 24 сата, додат је ЛПС (1 µг / мЛ) и ћелије су се инкубирали током 24 сата и скупљене за ПЦР у реалном времену или Вестерн блот. (ц) Повишена активност НФ-кБ након обарања Нрф2 спашена је исцрпљивањем МафК-а. ХепГ2 ћелије су трансфициране са НФ-κБ-вођеним репортер плазмидом и сиМафК или сиНрф2 или сиМафК и сиНрф2. После 24 сата, ћелије су третиране ЛПС и инкубиране током 24 сата, затим лизиране за тест луциферазе. За све панеле траке грешака представљају СЕМ (н = 3). П вредности су израчунате коришћењем Студент-овог т- теста.

Слика пуне величине

МафК регулише активност НФ-κБ

Хипотетирали смо да МафК индукован инхибицијом Нрф2 може директно регулисати активност транскрипције НФ-κБ. Да би се идентификовала функција МафК у регулисању НФ-κБ сигнализације, сиМафК је истовремено трансфектиран у репортер-ћелије ХепГ2-НФ-κБ-луциферазе и процењена је након индукције са ЛПС-ом зависна од НФ-κБ репортера. Као што је приказано на слици 3а (леви панел), ЛПС-индукована активација НФ-κБ инхибирана је испадањем МафК у ћелијама ХепГ2. Слични резултати добијени су са ХеЛа ћелијама (види допунску слику С2). Супротно томе, ектопична експресија МафК је значајно појачала ЛПС-индуцирану НФ-κБ активацију (п = 0, 00026, сл. 3а, десни панел). п65 и п50, подјединице НФ-кБ, коришћене су као позитивне контроле да би се потврдило да ли НФ-кБ посредује ЛПС-индукованом експресијом гена у ХепГ2 ћелијама. Трансфекција сип65 или сип50 смањила је активност НФ-κБ (види допунску слику С3).

Image

(а) Регулисање активности НФ-κБ након удара или прекомерне експресије МафК-а. Новинар НФ-κБ-одговор-елемент-Луц котрансфектиран је МафК сиРНА или МафК плазмидима у ћелије ХепГ2. После 24 сата, ћелије су третиране ЛПС и инкубиране током 24 сата, затим лизиране за тест луциферазе. Експресија репортера луциферазе кријеснице нормализована је на експресију Ренилла луциферазе. (б) Ћелије су трансфициране 48 х са МафК или контролном сиРНА. Ћелије су третиране ЛПС (1 µг / мЛ) након чега је уследило мерење експресије гена зависног од НФ-кБ у лизатима после 1, 3, и 5 х. (ц) Ћелије су трансфициране 48 х контролним плазмидима МафК. Ћелије су третиране експресијом гена зависних од ЛПС и НФ-кБ, мерено је после 1, 3, и 5 х.

Слика пуне величине

Након што смо идентификовали МафК као регулатор НФ-κБ активације, покушали смо да утврдимо да ли МафК такође регулише НФ-κБ транскрипцију неколико кључних проупалних посредника. Исцрпљивање МафК инхибира експресију мРНА-стимулисаног ЛПС-а ИЛ-8, ТНФа, ИЛ-6, Бцл2, ц-ИАП2 и ИкБα у ћелијама ХепГ2 и ХеЛа (Сл. 3б и Допуна слика С2). Да бисмо потврдили ефекат МафК, процијенили смо експресију циљаног гена НФ-κБ у ћелијама стимулисаним ЛПС-ом са ектопички експримираним МафК. Као што је приказано на слици 3ц, МафК прекомерном експресијом појачана ЛПС-индукована мРНА експресија ИЛ-8, ТНФа, ИЛ-6, Бцл2, ц-ИАП2 и ИκБα. Исцрпљивање п65 и п50 инхибира ЛПС-индуцирану експресију НФ-κБ циљних гена (видети допунску слику С3). Заједно, ови резултати сугерирају да је МафК важан фактор за активацију НФ-κБ.

МафК регулише активацију НФ-кБ путем п65 ацетилације

Затим смо покушали да утврдимо како МафК појачава сигнализацију зависно од НФ-κБ. Након стимулације помоћу индуктора попут ЛПС или ТНФа, ИκБα се фосфорилира, што резултира деградацијом и дисоцијацијом Икаса из НФ-κБ, што транслоцира у језгро и индукује експресију циљних гена 24 . Стога смо утврдили да ли МафК регулише ЛПС-индуцирану НФ-κБ активацију мењајући фосфорилацију и деградацију ИκБα. Као што је приказано на слици 4а, обустава МафК није произвела значајан инхибиторни ефекат на деградацију и фосфорилацију изазвану ЛПС-ом. Слични резултати добијени су у ХепГ2-стимулисаним ћелијама ХепГ2 који прекомерно притискају МафК (видети допунску слику С4).

Image

(а) ХепГ2 ћелије су трансфициране са МафК или контролном сиРНА и након 48 х, ћелије су третиране ЛПС (1 µг / мЛ), праћено мерењем деградације ИκБα и фосфорилацијом у лизатима после 15, 30, 60, 180 и 300 мин . (б) ХепГ2 ћелије су трансфициране са МафК или контролном сиРНА и након 48 х, ћелије су стимулисане ЛПС у току 30 мин. Нуклеарне и цитоплазматске фракције анализиране су имуноблотингом. (ц) Ћелије ХепГ2 су стимулисане ЛПС у трајању од 6 х, праћено хроматинским имунопреципитацијом коришћењем анти-п65, анти-ацетил-п65 и нормалних антитијела зечева ИгГ (контрола). Имунопреципитација хроматина је анализирана коришћењем прајмера специфичних за ИЛ-8 и ТНФа промотор регионе. (д) Недостатак МафК је потиснуо ацетилацију п65, али није утицао на фосфорилацију. Ћелије ХепГ2 су трансфициране са МафК или контролном сиРНА, а затим стимулисане ЛПС како је назначено време. (е) ХепГ2 ћелије су трансфициране 48 х МафК или контролном сиРНА, затим третиране ЛПС-ом и инкубиране током 6 х, сакупљене и лизиране у имунопреципитационом пуферу за лизу. Целоћелијски лизати су имунопреципитирани са хуманим антителом против п65 и испитивани су западним блотирањем зечјим анти-ЦБП антителама. (ф) ХепГ2 ћелије су трансфициране са МафК сиРНА, или МафК сиРНА и МафК плазмидом. Након 48 х, ћелије су третиране ЛПС и инкубиране током 6 х; ћелије су сакупљене и лизиране у пуферу за лизу имунопреципитације. Целоћелијски лизати су имунопреципитирани са хуманим антителом против п65 и испитивани су Вестерн блоттингом зечјим анти-ЦБП антителом.

Слика пуне величине

Како МафК није утицао на цитосолну НФ-κБ сигнализацију, истражили смо утицај МафК на нуклеарну транслокацију п65 и нисмо утврдили значајну разлику између контролних и МафК-срушених ћелија (Сл. 4б). Тако се у језгру дешава регулација НФ-κБ посредована МафК-ом. Пошто је везивање ДНК за НФ-κБ комплекс критичан догађај у регулацији транскрипције 25, користили смо ЕМСА да бисмо истражили утицај МафК на везивање ДНК НФ-κБ на стимулацију ЛПС. Прекомерна експресија МафК-а изазвана везањем између ДНК и НФ-κБ (видети допунску слику С5). Поред тога, истраживали смо утицај МафК на везање ДНК изазваног ЛПС-ом НФ-κБ коришћењем хроматинских имунопреципитација (ЦхИП). Везање п65 и ацетил-п65 на ИЛ-8 и ТНФа промоторе је ослабљено у ћелијама срушеним од МафК (Сл. 4ц). Наши подаци сугерирају да МафК регулише НФ-κБ-овисну транскрипцију у свом промоторском подручју, а не на точки узводно у сигналном путу НФ-κБ.

Пост-транслационе модификације, нарочито ацетилација, играју критичну улогу у НФ-κБ активацији појачавањем активности везивања ДНК п65 26, 27 . Пошто МафК може регрутовати ЦБП 20, хипотетирали смо да МафК регулише активност везања ДНК НФ-кБ повећањем ацетилације п65 у лизину 310 (К310). Заиста, п65 ацетилација на К310 је значајно смањена МафК аблацијом. Ацетилација п65 зависи од фосфорилације п65 28 и у овом истраживању је п65 ацетилација смањена, а фосфорилација на Сер536 остала је неизмерена у ћелијама срушеним од МафК (Сл. 4д). Слични резултати добијени су у ХепГ2-стимулисаним ћелијама ХепГ2 који прекомерно притискају МафК (видети допунску слику С6). ЦБП / п300 ацетилтрансфераза има главну улогу у ацетилацији п65 29, и приметили смо повећано везивање п65-ЦБП након стимулације ЛПС; овај поступак је од суштинске важности за монтажу НФ-κБ-а. Занимљиво је да је везивање између п65 и ЦБП смањено у одсуству МафК, а прекомерна експресија МафК изазвала је п65-ЦБП интеракцију (Сл. 4е, 4ф и допунска слика С6). Такође смо потврдили да п65 ацетилација од стране МафК укључује активност хистон ацетилтрансферазе (ХАТ) ЦБП / п300, која се повећала у ХефГ2 ћелијама које прекомерно експримирају. Међутим, активност ХАТ се није повећала у МафК прекомерно експримирајућим ХепГ2 ћелијама третираним ЦБП инхибитором Ц464 (видети допунску слику С6). Ови подаци показују да МафК регулише активност везања ДНК НФ-κБ побољшавајући ацетилацију п65 и регрутовањем ЦБП-а.

МафК делује у интеракцији са п65 и регулише НФ-κБ активацију

МафК регулише активацију НФ-κБ и следеће упалне реакције посредовањем активности везања ДНК НФ-κБ комплекса. Способност МафК-а да регулише активност п65 путем посттранслационе регулације довела нас је до употребе имунопреципитацијске анализе за карактеризацију интеракције између МафК, п65 и ЦБП. Егзогено експримирани МафК и п65 су међусобно деловали у ХепГ2 ћелијама (Сл. 5а, леви панел и додатна слика С7), као и ендогени МафК и п65 (Сл. 5б, леви панел). Супротно томе, п50 није комуницирао са МафК (Сл. 5а и 5б, десни панели). Занимљиво је да је МафК такође комуницирао са ЦБП-ом (Сл. 5ц). Способност МафК-а да комуницира са п65 и ЦБП довела нас је до испитивања да ли МафК контролише сложене формације између п65 и ЦБП. ХепГ2 ћелије су трансфициране са п65 и ЦБП са или без МафК и третиране са ЛПС; западно мрљање имунопреципитата показало је да п65 узајамно делује са ЦБП-ом (слика 5д). Ове интеракције су порасле у присуству МафК, сугеришући да МафК може појачати стварање п65-ЦБП комплекса, повећавајући тако ацетилацију п65.

Image

(а) Интеракција између егзогених МафК и п65 или п50. Ћелије ХепГ2 су трансфициране пцДНА3-ФЛАГ-п65 или пцДНА3-ФЛАГ-п50 и пцДНА3-ХА-МафК. Трансфектанти су сакупљени и екстракти целих ћелија (ВЦЕ) имунопреципитирани са α-ФЛАГ антителом, након чега је уследио блотно испитивање са МафК, п65, и п50 антитела. (б) Интеракција између ендогеног МафК и п65 или п50. Ћелије су сакупљене и целокупни екстракти имунопреципитирани са п65 или п50 антитела (ц) Интеракција између егзогених МафК и ЦБП. Ћелије ХепГ2 су трансфициране пцДНА3-ЦБП и пцДНА3-ХА-МафК. Трансфектанти су сакупљени и екстракти целих ћелија имунопреципитирани са α-ХА антителом, након чега је уследило западно блотирање са МафК и ЦБП антителом. (д) МафК појачава везивање између п65 и ЦБП. ХепГ2 ћелије су трансфициране пцДНА3-ФЛАГ-п65 и пцДНА3-ЦБП са или без пцДНА3-ХА-МафК. После трансфекције (48 х), ћелије су лизиране, имунопреципитиране анти-ФЛАГ и имуноблотиране са анти-МафК, анти-п65 или анти-ЦБП.

Слика пуне величине

Мањак МафК покренуо је апоптозу изазвану ТНФа

Функције ТНФа настају активирањем ТНФ рецептора, који покреће или прогурвивални пут активацијом НФ-κБ или проапоптотски пут кроз активацију каспазе 41 . МафК регулише активацију НФ-κБ модулацијом п65 ацетилације након ЛПС стимулације; МафК би такође регулисао НФ-кБ и п65 ацетилацију у ћелијама индуцираним ТНФа. Третирали смо ХепГ2 ћелије које су исцрпљене од МафК, ТНФа и открили да ТНФа третман смањује активност НФ-κБ и експресију гена зависних од НФ-κБ у ћелијама осиромашеним од МафК (видети допунску слику С8 и сл. 6а). Мањак МафК није променио разградњу и фосфорилацију изазвану ТНФа-ом (видети допунску слику С8). Да искључимо опште недостатке активирања НФ-κБ у ћелијама осиромашеним МафК, те ћелије смо третирали са ИЛ-лп, другим проупалним цитокином. Активирање НФ-κБ-индукованог ИЛ-1β било је нетакнуто у ћелијама за детекцију МафК (видети допунску слику С8). Такође смо потврдили да је редуковање ТНФа изазвано п65 редуковањем у ћелијама осиромашеним од МафК (видети допунску слику С8). Ови налази сугерирају да МафК игра улогу у ТНФа-индуцираној НФ-κБ активацији.

Image

(а) ХепГ2 ћелије су трансфициране 48 х МафК или контролном сиРНА. Ћелије су третиране ТНФ-а (10 нг / мЛ) и измерена је експресија гена зависног од НФ-кБ након 30, 60, 90 и 120 мин. (б) ХеЛа ћелије су трансфициране са МафК или контролном сиРНА. Након 48 х, троструки узорци су третирани ТНФа током 3 сата. Ћелије су испитиване фазно-контрастном микроскопијом и фотографиране помоћу СПОТ дигиталне камере и софтвера. (ц) ХеЛа ћелије су трансфициране са МафК или контролном сиРНА. Након 48 х, троструки узорци су третирани ТНФа и зВАД током 6 х. Ћелијска смрт је квантификована мерењем интрацелуларног АТП. (д) ХеЛа ћелије су трансфициране са МафК или контролном сиРНА. Након 48 х, троструки узорци су третирани ТНФ-а и зВАД током 3 сата. Ћелијски лизати су имуноблотирани антитела анти-каспаза3 и анти-каспаза-8.

Слика пуне величине

ТНФα активира НФ-κБ сигнализацију формирајући ТНФР комплекс И, што доводи до преживљавања ћелија 30, 31 и покреће експонсну апоптозу зависну од каспазе-8 преко комплекса ИИ. Стога је равнотежа између преживљавања изазваног ТНФа и ћелијске смрти занимљиво питање. Да бисмо проучили улогу МафК у апоптози изазваној ТНФα, третирали смо ТНФα контролне и МафК-оборене ћелије. Апоптоза је примећена у МафК-довндовн ћелијама 6 х након третмана ТНФа, док није било смрти контролних ћелија, што је указано микроскопијом и интрацелуларним АТП садржајем (Сл. 6б и 6ц). Инхибиција каспазе з-Вад-фмк, инхибитором пан-каспазе, потпуно је укинула смрт ћелија осиромашених МафК након стимулације ТНФа, што указује на умешаност апоптозе зависне од каспазе. Да бисмо потврдили да је ћелијска смрт заиста била апоптоза зависна од каспазе, анализирали смо цепање каспазе-3 и каспазе-8 имуноблотирањем. МафК-оборене ћелије третиране ТНФа показале су цепање обе каспазе, док контролне ћелије нису. У контролним ћелијама није примећено активирање каспазе-3 или цепање каспазе-8 (слика 6д). Ови подаци указују да исцрпљивање МафК индукује апоптозу зависну од каспазе-8 након стимулације ТНФа, сузбијајући индукцију гена за преживљавање зависних од НФ-κБ.

МафК срушени мишеви показују неисправну НФ-κБ сигнализацију

Да би се проучила способност пролазне МафК сиРНА да утиче на НФ-κБ-зависну транскрипцију ин виво , мишеви су третирани са 600 пмол ПЕИ-сложеном МафК сиРНА или с ПЕИ-сродном неповезаном сиРНА негативном контролом. Након 3 дана, ињекција МаФК сиРНА ефикасно је смањила МафК мРНА у јетри (Сл. 7а). Следеће смо проценили способност МафК-кноцкдовн мишева да монтирају одговор на ендотоксине, функцију која зависи од сигнализације од НФ-кБ. МафК-кноцкдовн и контролни мишеви третирани су ЛПС-ом након сензибилизације са Д-галактозамином (ГалН) 32, праћеним сатним надгледањем. Каплан-Мејерова завера сугерисала је да су мишеви осиромашени за МафК сиРНА (сиМафК) отпорни на ендотоксични шок (Сл. 7б). Такође смо потврдили да није било ефекта ван циља само за ПЕИ-комплекс (види допунску слику С9). Да бисмо истражили да ли исцрпљивање МафК-а такође резултира упалним одговорима, процијенили смо експресију различитих упалних цитокина код МафК-кноцкдовн мишева убризганих са ЛПС. Транскрипциона експресија већине НФ-кБ зависних цитокина смањена је у јетри мишева са недостатком МафК (Сл. 7ц). Експресија цитокина је такође смањена код ЛФ-индуцираних МафК мишева (Сл. 7д). У складу са овим резултатима, исцрпљивање МафК-а побољшало је токсичност јетре код мишева изазваних ЛПС-ом (видети допунску слику С9). Закључујемо да функционални МафК регулише НФ-κБ-зависну сигнализацију ин виво .

Image

(а) Ефекти исцрпљивања МафК на нивое мРНА у јетри. Мишеви су трансфектирани са назначеним МафК сиРНА током 72 х, а узорци јетре су анализирани помоћу ПЦР у реалном времену. (б) Мишеви са недостатком МафК били су отпорни на ендотоксични шок. Мишеви су сензибилисани ГалН (700 мг / кг), праћен ЛПС (50 µг / кг) изазовом и праћени сатно. Кривуља преживљавања представљена је као проценат преживјелих током времена изазивача. (ц) МафК-срушени мишеви су неисправни у експресији гена зависних од НФ-кБ. МафК-кноцкдовн мишеви су сензибилизовани са ЛПС (15 мг / кг) изазовом и анализирана је експресија гена. Наведени гени су мерени помоћу ПЦР у јетри РНА у реалном времену. Вриједности су репрезентативне за најмање три независна експеримента. (д) МафК-срушени мишеви су осетљиви на изазов ЛПС (15 мг / кг) и анализирана је експресија цитокина. Наведени цитокини у крви су мерени ЕЛИСА.

Слика пуне величине

Дискусија

Значај НФ-κБ за антиоксидативно деловање је добро утврђен. Активирани НФ-κБ јавља се у неколико врста оксидативног стреса и подстиче упалу индукујући експресију гена који посредују пролиферацију ћелија, преживљавање и оксидативни стрес 33, 34, 35 . Нрф2 је такође кључни регулатор анти-оксидативне активности посредством АРЕ-посредоване експресије гена фаза ИИ-детоксикациони и антиоксидативни ензими 8, 9, 10, 11, 12 . Многи детаљи молекуларних механизама Нрф2 и НФ-κБ транскрипцијске активности и сигнализације су објашњени 17, 18, 19 . Међутим, нејасно је како се регулише транскрипциона активност НФ-кБ интеракцијом Нрф2 и сродних молекула као што су мали маф протеини. У овој студији пружамо изравне доказе да МафК регулише сигнализацију зависну од НФ-κБ у ХепГ2 ћелијама и у ин виво моделу миша. Занимљиво је да је МафК експресија индуцирала НФ-κБ-зависну сигнализацију, која је појачала п65 ацетилацију и на тај начин повећала активност везања НФ-κБ на ДНК и упални одговор. Показали смо да МафК појачава ЛПС-индуцирану НФ-κБ активацију индукујући п65 ацетилацију кроз ЦБП. Овај резултат може пружити нови увид у улогу МафК-а у регулисању упалних реакција зависних од НФ-κБ и НФ-κБ (Сл. 8).

Image

(а) Као одговор на стимулисе који активирају НФ-κБ, ИκБ протеини се разграђују фосфорилацијом посредованом ИКК-ом, реакцијом коју МафК не модулира. Међутим, интеракција МафК-ЦБП је неопходна за ацетилацију подјединице п65. Модификовани п65 је ефикасан индуктор експресије транскрипције циљних гена.

Слика пуне величине

Посебно је занимљиво у овој студији идентификација МафК-а као новог регулатора инфламаторних инфламаторних реакција зависних од НФ-κБ ин витро и ин виво . За МафК је речено да је активатор или супресор транскрипционе активности Нрф2 11, 36 . Нрф2-мали маф хомодимери сузбијају АРЕ-вођену транскрипцију гена; мали маф хомодимери надмећу се са Нрф2 за АРЕ, потискујући тако АРЕ-вођену транскрипцију гена 37 . Стога предлажемо да се МафК учествује у НФ-κБ регулацији као активатор транскрипције. Као фактор транскрипције, МафК има потенцијал да комуницира са компресорима и коактиваторима и укључен је у бројне сигналне путеве који регулишу гене 38 ћелијског циклуса. Међутим, нема извештаја који би показао улогу МафК-а у регулисању активности НФ-κБ и накнадног упалног одговора. У овом истраживању показујемо да МафК регулише активацију НФ-κБ и упални одговор ин витро и ин виво .

Главни налаз ове студије је да МафК појачава активност везања ДНК НФ-κБ интеракцијом и појачавањем ацетилације п65. Хетеродимер п65 и п50 подјединица регулише различите физиолошке и патолошке процесе, укључујући пролиферацију, диференцијацију, преживљавање, туморигенезу и упалу 1, 2, 3 . У неактивном стању, НФ-κБ се налази у цитоплазми и формира мултипротеински комплекс са инхибицијском подјединицом, ИκБ. Након активирања спољашњим стимулансима, инфламаторни сигнал се укључује и активира скуп ИКБ киназа, које фосфорилирају НФ-кБ, циљајући га за протеасомалну деградацију. Једном ослобођен из комплекса ИκБα, НФ-κБ транслоцира у језгро, где веже ДНК и подстиче транскрипцију проупалних посредника, као што су цитокини и молекули адхезије, играјући тако критичну улогу у упалном одговору 24 . Наше студије показују да МафК не регулише активацију НФ-κБ независно од фосфорилације или деградације ИκБα (Сл. 4а), већ зависи од инхибиције везања ДНК комплекса НФ-κБ (Сл. 4ц). Супротно томе, НФ-κБ комплекс мора проћи додатне посттранслационе модификације. Међу свим познатим посттралацијским модификацијама п65, ацетилација је критична за контролу трајања и снаге НФ-κБ и његових различитих биолошких функција, укључујући везивање ДНК и трансактивацију 39, 40 . Наши подаци показују да МафК директно веже п65 и појачава ацетилацију п65 (Сл. 4д и Сл. 5а).

Хипотетизирали смо да МафК индукован инхибицијом Нрф2 може директно регулисати НФ-κБ транскрипцијску активност; потврдили смо да је функционална улога Нрф2 за транскрипцијску активност НФ-κБ-зависну од МафК-а и укљученост за п65 и МафК-комплекс. Иако Нрф2 није успео у интеракцији са п65, исцрпљивање Нрф2 појачало је ацетилацију п65, а да није утицало на деградацију ИκБα (видети допунску слику С10). Ови резултати нису били довољни да дефинишу функцију Нрф2 у транскрипцијској активности НФ-κБ-зависне од МафК, али сугерирају да Нрф2 индиректно регулише НФ-κБ могуће путем супресије МафК. Потребне су додатне студије да би се размотрило како Нрф2 доприноси активностима НФ-κБ зависним од МафК.

Закључно, ова студија представља почетни напор да се покаже како МафК делује као активатор НФ-κБ, чиме регулише регулаторну активност транскрипције НФ-κБ и ћелијски антиоксидативни капацитет. НФ-κБ игра важну улогу у великом броју људских болести, али да ли његова улога зависи од Нрф2 регулације ћелијског антиоксидацијског капацитета захтева даљње истраживање. Ови резултати такође сугерирају да инактивација МафК путање може представљати ефикасан генетски приступ против оксидативних стресова изазваних људским болестима.

Методе

Ћелије и реагенси

ХепГ2 ћелије рака рака јетре култивисане су у Дулбеццовом Модификованом медијуму орлова (ДМЕМ) који садржи 10% фетални говеђи серум (ФБС; Гибцо), осим ако није другачије назначено. Ћелије су одржаване на 37 ° Ц у влажној атмосфери са 5% Ц02. Антитела за имуноблотинг укључују п-актин, Нрф2, МафК, МафФ, МафГ, фосфорилирани п65 (Сер 536), фосфорилирани ИкБα (Сер 32), ацетилирани п65 (К310), и ИкБα су из Абцам; п65 и ЦБП су из биотехнологије СантаЦруз; Ламин Б, Цаспасе-3 и Цаспасе-8 су из ћелијске сигнализације. Сва антитела су разблажена 1: 1000. ТНФ-а (Сигма) је коришћен при 10 нг / мЛ, а ЛПС (Сигма) је коришћен у 1 µг / мЛ. Диметил сулфоксид је био из Сигме.

Пласмид

пцДНА-ХА-МафК је конструисана од пОТБ7-МафК и субклонирана у пцДНА-ХА. пОТБ7-МафК је купљен од Опен Биосистемс. Вектор за извештавање елемената за одговор НФ-кБ купљен је од Промеге.

Трансфекција сиРНА

Хумани сиРНА олигонуклеотиди су набављени од Интегратед ДНА Тецхнологиес. Ћелије ХепГ2 су трансфициране сиРНА олигосом липофектамином РНАи мак (Инвитроген). Двадесет и четири сата после трансфекције, ћелије су третиране ЛПС (1 µг / мЛ), а затим су сакупљене. СиРНА секвенце олиго секвенце су биле следеће: Контрола, 5′-УУЦУЦЦГААЦГУГУЦАЦГУТТ-3 ′; сиНрф2-1, 5′-ГГААЦГУГАУГЦУУЦГЦААТТ3- '; сиНрф2-2, 5′-АГГГААГУУУГ ГУЦААУЦАТТ-3 ′; сиМафК-1, 5, 5'-ГЦЦАТАЦГЦГУУУГТТЦАУТТ-3 '; и сиМафК -2, 5′-ГГАТЦЦГААУГТТГГГАЦТ-3 ′.

Анализа луциферазе

ХепГ2 ћелије су додате у плочу са 6 јажица. Извештач елемента одговора НФ-κБ котрансфектиран је репортер-ом Ренилла и сиРНА плазмидима коришћењем Липофецтамине 2000 (Инвитроген). Ћелије су лизиране пасифним пуфером лизе (Промега), а релативна активност луциферазе одређена је мерењем активности луциферазе лептира и нормализацијом активности Рецила луциферазе помоћу система испитивања дуалног луциферазе репортера (Промега).

Квантитативни ПЦР у реалном времену

РНА је изолована коришћењем комплета РНеаси Плус (Киаген). цДНА је припремљена коришћењем комплета за синтезу АМВ Реверсе Трансцриптасе (Промега), према протоколу произвођача. Квантитативни ПЦР (кПЦР) изведен је са КуантиТецт СИБР Греен ПЦР комплетом (Киаген). кПЦР је изведен на Киаген Роторгене К (Киаген) коришћењем упоредне методе квантификације Цт. П-актин је појачан као интерна контрола. Секвенце темељних премаза доступне су на захтев.

Нуклеарна и цитоплазматска фракција

Ћелије су сакупљене у ледено хладном ПБС-у, ресуспендоване у хипотоничном пуферу за лизу (10 мМ ХЕПЕС при пХ 7, 9, 1, 5 мМ МгЦл2, 10 мМ КЦл, инхибиторима протеазе и фосфатазе) и инкубиране на леду 4 мин. Ћелије су гранулисане на 2000 × г током 3 мин и цитоплазматска фракција је уклоњена у нове епрувете. Пелет је испран једном хипотоничним пуфером. Нуклеарна фракција је лизирана у имунопреципитационом пуферу за лизу (10 мМ Трис при пХ 8, 170 мМ НаЦл, 0, 5% НП40 и инхибиторима протеазе) на леду у трајању од 30 минута. Лизат је разјашњен центрифугирањем и 1 мг сваке фракције је коришћено за имунопреципитацију.

Иммуноблоттинг

Ћелије су лизиране у РИПА пуферу (150 мМ НаЦл, 1% Тритон Кс-100, 1% натријум деоксихолат, 0.1% СДС, 50 мМ Трис-ХЦл, пХ 7.5 и 2 мМ ЕДТА) на леду у трајању од 30 минута. После центрифугирања на 4 ° Ц током 20 мин (12, 000 × г ), супернатант је сакупљен. Концентрације протеина су одређене БЦА тестом (ГенДЕПОТ). Једнаке количине екстракта раздвојене су са 12, 5% СДС-ПАГЕ и пренесене на мембране поливинилидене дифлуорида (ПВДФ) (Био-Рад). The membranes were blotted with antibody and detection was performed with an ECL system (Pierce) according to the manufacturer's instructions.

ЦхИП

ChIP was performed with HepG2 cells treated with LPS for 60 min. Briefly, the cells were fixed with 1% formaldehyde and whole-cell lysates were sonicated to generate fragments of 200 to 500 bp. The sonicated lysates were used for ChIP with anti-p65, anti-acetyl-p65, or IgG control antibodies. After washing, the protein-DNA crosslinks were reversed; the DNA was eluted in 100 μl and used as a PCR template. Quantitative PCR was used to evaluate the ChIP eluates for binding to NF-κB-dependent promoters. GAPDH served as the negative control promoter.

Endotoxin challenge and Kaplan-Meier survival curve

Control and MafK knockdown-mice were sensitized with GalN (700 mg/kg) for 20 min and challenged with intraperitoneal injection of 50 μg/kg LPS in PBS; survival was monitored every hour for 30 h.

Тест ћелијске смрти

Cells were added to duplicate 12-well plates and incubated for 24 h, then treated with TNF-α and z-VAD for 6 h. Cell viability was measured with Promega CellTiter Glo. Cell death is presented as the percentage of dead cells in each well.

статистичке анализе

Statistical analyses were performed with SPSS statistical software (version 12.0). The data represent means ± SEM from three independent experiments except where indicated. Statistical analyses were performed by student's t -test at a significance level of P < 0.05.

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Додатне информације

    Додатне информације

Коментари

Подношењем коментара пристајете да се придржавате наших Услова и Смерница заједнице. Ако нађете нешто злоупотребно или то није у складу са нашим условима или смерницама, означите то као непримерено.