Мцпх1 / брит1 ограничава појачавање центросома изазваног јонизујућим зрачењем | онкогена

Мцпх1 / брит1 ограничава појачавање центросома изазваног јонизујућим зрачењем | онкогена

Anonim

Субјекти

  • Центросоме
  • Оштећења и поправка ДНК
  • Геномска нестабилност

Апстрактан

Мицроцепхалин ( МЦПХ1 / БРИТ1 ) је потенцијални супресор тумора који се локализује у центросом, формира нуклеарно жариште изазвано јонизујућим зрачењем (ИРИФ) и укључује у контролне тачке оштећења ДНК које обезбеђују стабилност генома. Овде извештавамо о утицају поремећаја Мцпх1 на хипер-рекомбиногени ДТ40 ћелијски низ. Мцпх1 - / - ћелије су биле способне за живот и размножавале се истом брзином као и контроле дивљег типа. Ћелије са недостатком Мцпх1 имале су нетакнуте реакције Г2-до-М после третмана јонизујућим зрачењем (ИР), али су показале умерену радиосензибилност. Светлосна и електронска микроскопија указивале су на нормалне центросомске структуре у нуклеарним ћелијама Мцпх1 , али ИР је индуцирала масовно увећање броја центросома у одсуству Мцпх1. Мцпх1 нулте ћелије формирале су γ-Х2АКС и Рад51 ИРИФ, али су их разрешиле спорије од ћелија дивљих врста. Недостатак Мцпх1 узроковао је трајну Цхк1 фосфорилацију након ИР-а, дисрегулирајући активност Цдк2. Ови налази показују да Мцпх1 контролише центросомне бројеве након оштећења ДНК, што може указивати на нови механизам супресије тумора за микроцефалин.

Увод

Садашњи модели карцинома позивају на губитак интегритета генома као главни корак ка трансформацији. Да би заштитили овај интегритет, ћелије поседују сложену и координисану мрежу одговора на оштећење ДНК, који се могу створити током нормалног метаболизма или бити индуковани егзогеним стресом (Јацксон и Бартек, 2009). Потпуно функционална мрежа оштећења ДНК на тај начин представља значајну рану баријеру за тумоуригенезу (Барткова ет ал., 2005; Горгоулис и др., 2005).

Анеуплоидија и хромозомска нестабилност уско су повезани са вишком центросома, главним центром за организовање микротубула у животињским ћелијама. Аберантни центросомски бројеви често се примећују у туморима, а мултиполарне митотичке бројке виде се у ћелијама са вишеструким центросомима (Д'Ассоро ет ал., 2002; Нигг, 2002). Дуго се сугерише да мултиполарне митозе могу изазвати абнормалну хромозомску сегрегацију и анеуплоидију, доприносећи томе развоју рака (Бринклеи, 2001). Недавни рад наговестио је механизам којим је погрешна сегрегација хромозома резултат успостављања меротелних кинетохора у прилогу на оба пола вретена током прелазне мултиполарне фазе (Ганем ет ал., 2009). У оба ова модела, центросомски број је важна одредница стабилности генома.

Микроцефалин (МЦПХ1 / БРИТ1) је саставни део мреже оштећења ДНК која се такође локализује у центросоме. МЦПХ1 је првобитно описан као транскрипциони репресив хумане теломеразне реверзне транскриптазе, БРИТ1 , за БРЦТ-поновљени инхибитор хТЕРТ експресије (Лин и Елледге, 2003). Његова ознака МЦПХ1 произилази из запажања да је МЦПХ1 ген мутиран у аутосомно рецесивној болести, примарној микроцефалији (ОМИМ 251200; Јацксон ет ал., 2002). МЦПХ1 мутације се такође јављају у синдрому преурањене кондензације хромозома (ОМИМ 606858), у коме се митотички хромозоми кондензују рано у иначе неуређеном ћелијском циклусу (Тримборн ет ал., 2004).

МЦПХ1 има неколико улога у одржавању стабилности генома и сузбијању тумоуригенезе. МЦПХ1 је нађен у нуклеарним жариштима изазваним јонизујућим зрачењем (ИРИФ) са МДЦ1 / НФБД1 и фосфорилираним Х2АКС (γ-Х2АКС) (Ксу ет ал., 2004; Лин и сар., 2005). Исцрпљивање МЦПХ1 у људским ћелијама блокира формирање ИРИФ-а НБС1, 53БП1, фосфорилираним АТМ-ом и МДЦ1, али не γ-Х2АКС (Раи ет ал., 2006), постављајући МЦПХ1 низводно од фосфорилације Х2АКС у одговору оштећења ДНК. Такође је блокирана повезаност кроматина изазваног оштећењем ДНК неколико протеина са оштећењем ДНК и примећен је висок ниво аберација хромозома након пада МЦПХ1 (Раи и сар., 2006). Студије интерференције РНА на људским ћелијама показале су да МЦПХ1 посредује контролне тачке С-Г2-М фазе које реагирају на оштећење, контролишући ниво БРЦА1 и киназу контролне тачке, ЦХК1 (Ксу и сар., 2004; Лин и сар., 2005) чија субцелуларна локализација такође је контролисана од МЦПХ1 (Тибелиус ет ал., 2009). МЦПХ1 оборене ћелије и мишеви и ћелије Мцпх1 - / - такође показују повећану радиосензибилност (Пенг ет ал., 2009; Лианг ет ал., 2010). Дефектна хомолошка рекомбинација и оштећење кондензације хромозома примећене су у Мцпх1 - / - мишјим ћелијама (Воод ет ал., 2008; Лианг ет ал., 2010; Тримборн и др., 2010) и улогу МЦПХ1 у контроли хомологне рекомбинације. је описано у људским ћелијама (Пенг ет ал., 2009; Ву и сар., 2009). Недавни рад је показао да МЦПХ1 регулише ремоделирање хроматина у зависности од аденосин трифосфата СВИ – СНФ комплекса, мењајући структуру хроматина као одговор на оштећења ДНК ради лакшег поправљања ДНК (Пенг ет ал., 2009). Ови подаци показују да МЦПХ1 доприноси и контролним тачкама и поправљању ДНК.

Ми и други смо показали да се МЦПХ1 локализује у центросом, кључни центар за организам ћелија животињских ћелија (Јефферс ет ал., 2008; Раи и сар., 2008). Даље, описане су центросомске аномалије у лимфобластоидним ћелијама добијеним од пацијената са микроцефалијом (Алдертон ет ал., 2006). Митотичке неправилности описане у ћелијама са недостатком МЦПХ1 сугеришу да је нормално функционисање митотичког вретена делимично контролисано МЦПХ1 (Раи ет ал., 2008). Занимљиво је да су МЦПХ1 и перицентриоларни скелетни протеин, перицентрин потребни за нормалну центросомалну локализацију ЦХК1 и регулацију уласка митотика путем активације Цдк1 (Тибелиус ет ал., 2009). У складу са важним улогама у стабилности генома и митози, експресија МЦПХ1 се значајно смањује у туморима дојке и јајника у поређењу с нормалним узорцима, а убрзана метастаза примећена је код пацијената са ниским нивоом МЦПХ1, што сугерише да је МЦПХ1 супресор тумора (Раи ет ал., 2006). Заједно, ова запажања указују на вишеструку улогу МЦПХ1 у контроли ћелијског циклуса и одржавању генома. Овде користимо обрнуту генетику у хипер-рекомбиногеној ДТ40 ћелијској линији да бисмо истражили улоге Мцпх1 у контроли центросома и пратећих активности.

Резултати

Да бисмо испитали како Мцпх1 контролише ћелијски циклус и центросомални одговор на оштећење ДНК, усмерили смо се на Мцпх1 у хипер-рекомбиногеној ћелијској линији ДТ40. Циљни вектори су припремљени коришћењем геномског ПЦР-а (слика 1а), а трансфектанти су анализирани од стране Соутхерн блот-а за циљану интеграцију конструкције поремећаја гена (слика 1б). Као што је приказано на слици 1ц, циљање локуса Мцпх1 укинуло је експресију гена. Мцпх1 - / - ћелије су се размножавале сличном брзином као и ћелије дивљег типа (слика 1д), показујући да овај ген није потребан за ћелијску одрживост или напредовање ћелијског циклуса.

Image

Циљана пилетина Мцпх1 . ( а ) локуса Мцпх1 и вектора циљања. Пилеће ДТ40 Б ћелије су култивисане, трансфициране и анализиране са Соутхерн блот-ом као што је претходно описано (Таката ет ал., 1998). Таргетирање руке биле генерисан са ПЦР он ДТ40 геномске ДНК коришћењем КОД Хот Старт Полимерасе (Мерцк, Дармстадт, Немачка) са прајмерима 5'-ГАЦГТЦТТЦАГАЦТЦАААГАТГАГЦГЦТЦТГ-3 'и 5'-ЦГГГАТЦЦЦГГГГЦЦЦГТАЦТЦЦАГТТТЦТЦГАЦАТЦТГТГ-3' за 5 'руку и 5'-ЦГГГАТЦЦЦГТТТГГААЦТГТТАЦАТЦАААГАГАЦАГ- 3 'и 5'-ГАЦГТЦГГЦЦАГГТТААГАААТАААТЦЦАГААГ-3 'за 3' крак, затим клонирани у пГем-Т Еаси (Промега, Мадисон, ВИ, УСА) и секвенционирани. Вектори који садрже касете које су дале отпорност на пуромицин и бластицидин коришћене су за секвенцијалне рунде циљања гена. ( б ) Потврда јужног блота за циљање Мцпх1 . Сонда је припремљена помоћу ПЦР коришћењем секвенци прајмери ​​5'-ЦГГГАТЦЦЦГГГАГТЦЦГТГЦТГАААГГТАГ-3 'и 5'-ЦГГГАТЦЦЦГГТГГАЦАЦТГТГАГЦГГТАЦГ-3'. ( ц ) ПЦР анализа реверзне транскриптазе Мцпх1 експресије изведена коришћењем прајмера против Мцпх1 пуне дужине, као што је претходно описано (Јефферс ет ал., 2008). Контролни прајмери ​​против β-актина били су 5'-АТГГАТГАТГАТАТТГЦТ-3 'и 5'-ГЦЦАЦАГЦТГЦЦТЦТАГЦ-3 '. ( д ) Анализа пролиферације ћелија дивљег типа и Мцпх1 са недостатком.

Слика пуне величине

Затим смо тестирали да ли је мањак Мцпх1 утицао на способност ћелија да одговоре на оштећења ДНК. Испитивали смо способност Мцпх1 - / - ћелија да преживе генотоксични стрес користећи клоноген тест преживљавања (Слика 2а). Видели смо само умерену разлику у преживљавању између дивљих врста и Мцпх1 - / - ћелија у два независна клона испитана након третмана јонизујућим зрачењем (ИР), показујући да Мцпх1 није главна одредница опстанка ћелије после ИЦ третмана. Да бисмо проценили функционисање контролних тачака од Г2 до М, индуцирали смо оштећење ДНК у ћелијама контролних и Мцпх1 недостајућих станица које смо заробили у М фази користећи кокцемид. Необрађене ћелије су показале пораст митотичког индекса током времена, што је одређено проточном цитометријом фосфо-хистона Х3 за квантизацију митотичких ћелија (слика 2б), што указује на потпуно функционалну контролну тачку монтаже вретена у ћелијама са недостатком Мцпх1. Кашњење уласка у М фазу након оштећења ДНК примећено је у истој мери у ћелијама Мцпх1 - / - као и у дивљом типу (слика 2б), што указује да је контролна тачка Г2 до М индукована у одсуству Мцпх1. Проток цитометрије ћелија дивљег типа третиране ИР показао је све већи број ћелија са садржајем 2Ц ДНК до 12 х после ИР, што сугерише хапшење у Г2, са повишеним нивоом 1Ц и мртвим ћелијама видљивим после 24 сата -ИР (слика 2ц), у складу са ћелијама које поново улазе у циклус или умиру. Мцпх1 - / - ћелије су показале заустављање до 8 х и почеле су да се враћају у свој ћелијски циклус до 12–24 х, мада, повратак у нормалан ћелијски циклус није завршен за 48 сати, што сугерише недостатак у опоравку контролне тачке (Слика 2ц; Допунска слика 1). Узето заједно, ови подаци показују да ћелије са недостатком Мцпх1 имају нетакнуту контролну тачку Г2 до М и робусну способност реаговања на генотоксичну увреду, упркос томе што показују атенуирану резолуцију заустављања ћелијског циклуса изазваног оштећењем.

Image

Одговори ћелијског циклуса на станицама са недостатком Мцпх1. ( а ) Клоногени тестови преживљавања клона који су третирани ИР изведени су као што је описано (Таката ет ал., 1998). Ефикасност наношења Мцпх1 - / - ћелија била је ∼ 50% од дивљег типа. ( б ) Анализа контролне тачке Г2 до М. Ћелије су обојене поликлоналним антителима на фосфо-хистон Х3 (06–570; Упстате / Миллипоре, Царригтвохилл, Ирска) и митотички индекси су процењени проточном цитометријом. Ћелије су блокиране у 0, 1 µг / мл колоцемида од почетка експеримента, када су третиране са 2 Ги ИР, као што је назначено. ( ц ) Анализа проточне цитометрије ћелија назначеног генотипа изведена у назначено време после 5 Ги γ-озрачивања из извора 137 Цс. Ћелије су фиксиране у 70% -тном етанолу и обојене пропидијум-јодидом (40 µг / мл) у физиолошком раствору са фосфатом који садржи РНасе А (100 µг / мл) и сортиране на ФАЦСцалибур (БД Биосциенцес, Ерембодегем, Белгија).

Слика пуне величине

Наше следеће питање било је да ли је Мцпх1 потребан за интегритет центросома. Испитивали смо центросоме у Мцпх1 - / - ДТ40 ћелијама помоћу имунофлуоресцентне микроскопије. Као што је приказано на слици 3а, центросомски маркери γ-тубулина, центрина, аурора-А и Цеп76 (Тсанг ет ал., 2009) локализовани су у нормалне и ИР-појачане центросоме и у ћелијама дивљих врста и са Мцпх1-недостатним ћелијама. Затим смо користили електронски микроскоп да бисмо даље сецирали ултраструктуру центросома. И у ћелијама дивљег типа и у Мцпх1 - / - центриоле су садржавале типичне девет трочланих микротубулских структура распоређених у бачви (Слика 3б). Пречници барела су били дивљих врста: 100 ± 10 нм ( Н = 3) и Мцпхл - / - : 100 ± 10 нм ( Н = 3). Закључујемо да су центросомске структуре нормалне у ћелијама Мцпх1 - / - . Међутим, анализа лимфобласта блокираног ноцодазолом мутираним МЦПХ1 показала је висок ниво ћелија са> 2 центросома (Алдертон ет ал., 2006). МЦПХ1 обрушавање узроковало је амплификацију центросома и митотичке абнормалности у У2ОС ћелијама (Раи ет ал., 2008). Када смо израчунали центросоме у Мцпх1 - / - ћелијама, нисмо пронашли повећање базалног броја, већ значајну прекомерну појединост након ИР лечења. До овог повећања дошло је и у броју ћелија са појачаним центросомима и у броју центросома по ћелији (слика 3ц; допунска слика 2). Оно што је важно, ИР-индуковано хиперпојачавање може бити потиснуто трансгеничном експресијом Миц-Мцпх1 (слике 3д и е), показујући да је обележено ДНК проузрочено оштећењем центросома, виђеног у Мцпх1 - / - ћелијама, специфично за губитак Мцпх1 . У складу са овом опажањем, такође смо открили да ИР индукује високе нивое амплификације центросома у хуманим МЦПХ1 мутантним лимфобластоидним ћелијама (Алдертон ет ал., 2006; Супплементарна слика 3).

Image

Центросомски састав и амплификација у ћелијама са недостатком Мцпх1. ( а ) Имунофлуоресцентна микроскопска анализа центросома изведена је као што је описано (Додсон ет ал., 2004; Боурке ет ал., 2007). Примарна антитела која су коришћена била су против аурора-А (35Ц1; Абцам, Цамбридге, УК), центрина (# 628802; Биолегенд Витхоорн, Холандија), Цеп76, γ-тубулина (моноклонални ГТУ88 и поликлоналног Т3559; Сигма, Даблин, Ирска). Спојене слике микрограма показују γ-тубулин у црвеној боји, ДНК у плавој боји, а други маркер у зеленој боји. Линија скале, 10 µм. ( б ) Ћелије су обрађене за пренос електронске микроскопије помоћу утврђеног протокола (Липтрот и Гулл, 1992) који се састојао од: примарне фиксације у мешавини 2% глутаралдехида и 2% параформалдехида у 0, 1 М какодилатском пуферу, а затим осмикација у 2% осмијума тетроксид, дехидратација и уграђивање у Агар смолу са ниском вискозношћу (Агар Сциентифиц, Ессек, Велика Британија). Одсеци су исечени на микротому Реицхерт-Јунг Ултрацут Е (Леица, Ветзлар, Немачка), обојени уранилом ацетатом и оловним цитратом, а затим су прегледани на електронском микроскопу Х-7000 (Хитацхи, Маиденхеад, Велика Британија). Вага, 100 нм. ( ц ) Центрозомно појачавање изазвано 5 Ги γ-зрачењем квантитативно је било у дивљим и Мцпх1 - / - ћелијама у назначено време после озрачења . Центросоми су квантификовани коришћењем имунофлуоресцентне микроскопије за γ-тубулин. Точке података показују средњу вредност ± сд три одвојена експеримента у којима се најмање 100 ћелија броји слепо по временској тачки. ( д ) Анализа имуноблота коришћењем мишјег моноклонског анти-миц 9Е10 и зечјег анти-актина А2066 (Сигма) Мцпх1 - / - ћелија стабилно трансфицираних експресијским конструктима за Миц-Мцпх1 (Јефферс ет ал., 2008). ( е ) Супресија амплификације центросома трансгеничном експресијом Миц-Мцпх1. Ћелије су фиксиране 24 сата након 5 Ги γ-зрачења и центросома квантификованих микроскопском анализом γ-тубулина као што је описано у ( а ). Точке података показују средњу вредност ± сд три одвојена експеримента, у којима су најмање 200 ћелија бројане слепима. Извршен је т- тест упареног ученика да би се показала значајна разлика између сваког Мцпх1 - / - клона и његових субклона који експримирају Миц-Мцпх1 (** П <0, 02; *** П <0, 005).

Слика пуне величине

Прекомерна компликација након инфрацрвене реакције честа је посљедица аберантног одговора на оштећење ДНК (Додсон ет ал., 2004; Лоффлер ет ал., 2006). Нагађали смо да, упркос снажној способности наших Мцпх1 - / - ДТ40 ћелија да преживе зрачење, одговор оштећења ДНК у тим ћелијама може бити неисправан, што сугерише одложен опоравак од оштећења ДНК приказаног на слици 2ц. Мцпх1 - / - ћелије ефикасно формирају γ-Х2АКС ИРИФ (слика 4а), у складу са претходним запажањима стављања Мцпх1 низводно од Х2АКС фосфорилације (Раи ет ал., 2006; Јефферс ет ал., 2008). Занимљиво је да смо такође приметили Рад51 ИРИФ (слика 4а), који су били ометани РНА интерференцијом МЦПХ1 у људским ћелијама (Ву ет ал., 2009). Квантификовали смо ове ИРИФ и открили смо да, иако су ћелије са недостатком Мцпх1 формирале жаришта с кинетиком сличним ћелијама дивљих врста, разлучивање γ-Х2АКС жаришта, и у мањој мери жаришта Рад51, је било спорије од оне која се види код дивљег типа ћелије (слике 4б и ц). Ова запажања су у складу са контролном тачком продуженог ћелијског циклуса након оштећења ДНК. С обзиром да су наши претходни резултати укључивали Цхк1 као кључни сигнал у омогућавању амплификације центросома након ИЦ-а (Боурке ет ал., 2007), тестирали смо како је мањак Мцпх1 утицао на Цхк1 сигнализацију. Као што је приказано на слици 4д, фосфорилација Цхк1 индуковане ИР-ом у ћелијама дивљих врста била је најјача 0, 5-1 х након озрачивања и одсутна је 4 сата после ИР-а. У Мцпх1 - / - ћелијама, међутим, ова фосфорилација је и даље откривена до 6 х након озрачивања, пружајући даље доказе за одлагање резолуције контролне тачке. Важно је да је експресија Миц-Мцпх1 у Мцпх1 - / - ћелијама олакшала ово кашњење и проузроковала да се ниво фосфо-Цхк1 врати у нормалу са кинетиком дивљих врста (Слика 4е). У складу са сталном сигнализацијом контролне тачке која води до фосфорилације и активације Цдк2 Тхр-160 (Боурке ет ал., 2010), открили смо да су ћелије дефицитарне Мцпх1 показале снажну индукцију активирања Цдк2 фосфорилације раније након ИР третмана него што је то примећено у дивљом типу ћелије (слика 4ф). Ови налази сугерирају да Мцпх1 суздржава амплификацију центросома након оштећења правовременим уклањањем Цхк1 сигнала који настаје током реакције оштећења ДНК и покреће умножавање центросома активирањем Цдк2.

Image

Одржавани сигнали оштећења ДНК у ћелијама са недостатком Мцпх1. ( а ) Имунофлуоресцентне микрографије које показују γ-Х2АКС и Рад51 ИРИФ у дивљим типовима и Мцпх1 - / - ћелијама пре и 4 сата након 5 Ги γ-зрачења. ДТ40 ћелије су фиксиране и обојене моноклонским анти-γ-Х2АКС (црвени; ЈБВ301, Миллипоре) и зечјим поликлоналним анти-Рад51 (зеленим; ПЦ130, Цалбиоцхем / Мерцк, Дармстадт, Немачка) антитела као што је претходно описано (Боурке ет ал., 2007 ). ДНК је обојен са ДАПИ (плава боја). Линија скале, 10 µм. ( б ) Количење γ-Х2АКС ИРИФ откривено микроскопијом као у ( а ), пре или у назначено време после 5 Ги ИР. Графикон приказује средњу вриједност ± сд три експеримента у којима је рачунато 200 ћелија по временској тачки. ( ц ) Квантитација Рад51 ИРИФ откривена микроскопијом као у ( а ), пре или у назначено време после 5 Ги ИР. Графикон приказује средњу вриједност ± сд три експеримента у којима је рачунато 200 ћелија по временској тачки. ( д ) Имуноблотска анализа фосфорилације Цхк1 изведена је пре или у назначено време после 5 Ги γ-зрачења коришћењем зечјег анти-фосфо Цхк1 С345 (2348; ћелијска сигнализација, Беверли, МА, САД), са моноклонским мишјим анти-Цхк1 ( Ц9358; Сигма) и делује као контрола утовара. ( е ) Имуноблотска анализа фосфорилације Цхк1 изведена под истим условима као у ( ц ), у клоновима Мцпх1- / - који експримирају Миц-Мцпхл- / - који се користе на слици 3е. ( ф ) Имуноблотска анализа фосфорилације Цдк2 изведена је пре или у назначено време после 5 Ги γ-озрачивања помоћу зечјег анти-фосфо Цдк2 Т160 (2561; ћелијска сигнализација), са поликлоналним козјим анти-Цдк2 (сц163 г; Санта Цруз, Хеиделберг, Немачка) и делују као контроле утовара.

Слика пуне величине

Дискусија

Експерименти интерференције РНА на људским ћелијама и експерименти са поремећајем гена у мишјим ћелијама нису показали смртност која је резултат исцрпљивања МЦПХ1, у складу са виталношћу Мцпх1 - / - ДТ40 ћелија (Ксу ет ал., 2004; Лин и др., 2005; Ианг ет ал., 2008; Тибелиус и др., 2009; Лианг и др., 2010; Тримборн и сур., 2010). Није опажен утицај пролиферације нити на митотички индекс у ћелијама Мцпх1 - / - ДТ40. Митотско кашњење је описано након пада МЦПХ1 у ћелијама У2ОС (Раи ет ал., 2008; Тибелиус ет ал., 2009), али друге групе које такође користе У2ОС ћелије нису пријавиле митотичке недостатке након исцрпљивања МЦПХ1 (Ксу и сар., 2004 Лин и др., 2005). Интерференција РНА МЦПХ1 у ћелијама лимфобластоида није утицала на митотички индекс (Алдертон ет ал., 2006). Поремећаји кондензације хромосома примећени су у два модела мишева са недостатком Мцпх1, али још увек нису извештене детаљне митотичке анализе (Воод ет ал., 2008; Лианг ет ал., 2010; Тримборн и др., 2010). Анализа мутаната Дросопхила Мцпх1 открила је синцицијску ембрионалну леталност која је повезана са митотичким хапшењем, али такав одрасли мух није примећен (Брунк ет ал., 2007; Рицкмире ет ал., 2007). Узето заједно, ови подаци сугерирају да Мцпх1 није потребан за нормално напредовање ћелијског циклуса у соматским ћелијама.

Срушење сиРНА МЦПХ1 у људским ћелијама У2ОС смањује индукцију контролне тачке Г2-М и доводи до радиосензибилности (Ксу и сар., 2004; Лин и сар., 2005). Лимфобласти са скраћеним МЦПХ1 мутацијама такође показују аберантно хапшење Г2-до-М контролне тачке (Алдертон ет ал., 2006). Мишеви и ембрионални фибробласти из експеримента циљања гена, у којем је мишеви Мцпх1 локуса поремећен у егзону 2, били су радиосензибилни и показали су повишен ниво ИР-индукованих кромосомских абнормалности (Лианг ет ал., 2010). Ова запажања добро се слажу са активирањем и формирањем ИРИФ-а Мцпх1 у одговору на оштећење ДНК (Ксу ет ал., 2004; Лин и сур., 2005; Воод и сар., 2007; Јефферс ет ал., 2008). Одсуство израженог утицаја мањка Мцпх1 на активацију контролне тачке Г2 до М и радиорезистенцију у ДТ40 ћелијама било је неочекивано, мада су наше ИРИФ и контролне тачке откриле одлагање у решавању оштећења ДНК у мутираним ћелијама Мцпх1 које би могле имати значајније утицај током развоја. Занимљиво је да мутација Мцпх1 у Дросопхили није повећала радиосензитив ларве, а именске диск-ћелије диска из очију-антена из Мцпх1 мутанта показале су нетакнут хапшење Г2-М-М након ИР третмана (Рицкмире ет ал., 2007). Стога, вишак или ткиво специфично за вишак у одговору на оштећење ДНК може бити једно од објашњења различитих ефеката губитка Мцпх1 у различитим системима. Даље, губитак Мцпх1 активности у одговору на оштећење ДНК може се избалансирати смањењем МцАл1 усмерених про-апоптотичких активности, попут оних посредованих од Е2Ф1 (Ианг ет ал., 2008).

Приметили смо нормалну центросомску структуру и број у необрађеним Мцпх1 нулл ДТ40 ћелијама, са упечатљивим нивоом амплификације центросома који се види приликом зрачења. Занимљиво је да смо такође видели повишене нивое амплификације центросома изазване ИР-ом у људским ћелијама оштећеним МЦПХ1, што је у складу са амплификацијом центросома описаном у неоштећеним митотичким ћелијама које су ухапшене нокододазолом код микроцефалијских пацијената (Алдертон ет ал., 2006). Центросомске неправилности описане су у обрушеним У2ОС ћелијама МЦПХ1, али аутори ове студије су закључили да је ово настало услед неуспеха у цитокинези (Раи ет ал., 2008), познатом механизму амплификације центросома (Мералди ет ал., 2002). Без назнака полиплоидизације или митотичког затајења, наша анализа сугерише да мањак Мцпх1 омогућава појачавање центросома дисрегулацијом сигнала активације Цдк2 који је контролисан од Цхк1 (Боурке и др., 2010), у складу са недавно описаном регулацијом центросомалног Цхк1 од Мцпх1 (Тибелиус и др., 2009).

Хромозомске аберације описане у ћелијама оштећеним МЦПХ1 и корелација нестабилности генома са падом нивоа МЦПХ1 у карциному људи указују на то да МЦПХ1 може бити укључен у супресију тумора (Раи ет ал., 2006). Осигуравањем нормалне функције контролне тачке и поправком ДНК утврђене су могућности за тумор супресивне улоге МЦПХ1. С обзиром на растуће разумевање како прекомерна примена центросома може допринети митотским проблемима и нестабилности хромозома (Бринклеи, 2001; Нигг, 2002; Ганем ет ал., 2009), наша демонстрација хиперпојачања центросома након оштећења ДНК у ћелијама са недостатком Мцпх1 сугерира друго механизам којим Мцпх1 нормално одржава стабилност генома и противи се ћелијској трансформацији.

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Додатне слике 1-3

Ворд документи

  1. 1.

    Допунске слике легенде

    Додатне информације прате рад на веб локацији Онцогене (//ввв.натуре.цом/онц)