Метастатске ћелије рака дебелог црева св620 су припремљене за смрт кад се одвоје и могу се осетити на аноикис помоћу бх3-миметиц абт-737 | ћелијска смрт и болест

Метастатске ћелије рака дебелог црева св620 су припремљене за смрт кад се одвоје и могу се осетити на аноикис помоћу бх3-миметиц абт-737 | ћелијска смрт и болест

Anonim

Субјекти

  • Апоптоза
  • Терапија рака
  • Канцер дебелог црева
  • Метастасис

Апстрактан

Аноикис, апоптоза зависна од Бака, изазвана одвајањем од ванћелијског матрикса, често се инхибира у ћелијама метастатског карцинома. Употребом неколико изогених ћелија линија карцинома људског рака дебелог црева које су изведене или из примарног тумора (СВ480) или из метастазе на лимфним чворовима (СВ620), открили смо да су само ћелије СВ480 осетљиве на аноикис. Урегулација бима, али не и Мцл-1 деградација, утврђена је као критични фактор иницијације аноикиса у СВ480 ћелијама. ЕРК-посредована фосфорилација циља Бим за свеприсутну употребу и протеасомалну деградацију. МЕК инхибитор (ПД0325901) је био у стању да повећа Бим експресију у ћелијама СВ620 и да сензибилише ове ћелије на аноикис. Дакле, у обе ћелијске линије аноикис је под контролом протеина из породице Бцл-2. Оно што је најзанимљивије, откривено је да БХ3-миметички АБТ-737 не само да повећава ниво апоптозе у суспендованим ћелијама СВ480 већ и да сензитивише СВ620 ћелије на аноикис. Према томе, за обе ћелијске линије које су култивисане у суспензији пронађено је да се примају за смрт, што је утврђено детекцијом Бцл-2: Бим и Бцл-кЛ: Бим комплекса. Супротно томе, адхезивне ћелије СВ480 и СВ620 биле су резистентне на АБТ-737. Ово указује да, без обзира да ли су подвргнуте аноикису или не, ћелије рака дебелог црева које су се одвојиле од ванћелијског матрикса могу проћи кроз пролазно стање, где су осетљиве на миметике БХ3. То би једињењима као што је Навитоцлак или АБТ-199 омогућило терапеутски прозор у којем могу имати антиметастатски потенцијал.

Главни

Аноикис је посебна апоптотска смрт услед губитка одговарајуће ћелијске адхезије, 1, 2, 3 и туморске ћелије које стекну метастатски потенцијал развиле су механизме за отпор против аноикиса. 4, 5 Упркос својој јединственој дефиницији, аноикис је у основи апоптотски процес. У складу са класичном апоптозом, аноикис укључује или својствени пут, због поремећаја митохондријске хомеостазе, или вањски пут који покрећу рецептори ћелијске површинске смрти. 3, 6

Протеини из породице Б-ћелија леукемије / лимфома 2 (Бцл-2) кључни су арбитри за посвећеност апоптози на митохондрију. 2, 7 Ова породица се састоји од про-и анти-апоптотичких чланова, који сви деле хомологију секвенци у својим Бцл-2 хомологним (БХ) доменима. Анти-апоптотички протеини, укључујући Бцл-2, Бцл-2 сродни ген, дугу изоформу (Бцл-кЛ), Бцл-в и леекемију мијелоидне ћелије 1 (Мцл-1) садрже БХ домене 1–4. Обично се налазе на спољној митохондријској мембрани, где делују да инхибирају про-апоптотичке Бцл-2 протеине. Про-апоптотички протеини су подељени у мулти-домене ефектори Бцл-2-придружени к протеин (Бак), Бак и Бок (који садрже БХ домене 1–3) или протеине само за БХ3, који садрже само домен БХ3. Про-апоптотички протеини са више домена Бак и Бак промовишу пермеабилизацију спољне мембране митохондрија. 8 Протеини једини за БХ3, попут агониста смрти домена који утичу на Бцл-2 (Бид), Бим и ПУМА делују или као директни активатори про-апоптотичких Бак-а и Бак-а, или као супресори анти-апоптотичких протеина. 9, 10 Именовани су активаторима. Друга класа протеина само за БХ3, као што су Бад, названи сензибилизатори, покреће апоптозу везањем на анти-апоптотичке протеине и избацивањем активаторних протеина само за БХ3.

АБТ-737 је рационално дизајниран мали молекул који се са високим афинитетом веже за Бцл-2 и Бцл-кЛ, али не и за Мцл-1, и спречава њихову анти-апоптотичку функцију. 11, 12 Показано је да АБТ-737 обрће стечени резистенцију паклитаксела у ћелијским линијама карцинома дојке. 13 У комбинацији са рапамицином, АБТ-737 повећава радио осетљивост не-ситних ћелијских тумора. 14 Комбинација АБТ-737 и МЕК инхибитора доводи до регресије тумора у различитим моделима тумора миша КРАС мутантних ћелија. 15 У ћелијским линијама хумане мијелоидне леукемије и ксенографт моделима АБТ-737 синергира са инхибиторима ПИ3К / АКТ / мТОР путање. 16 Навитоцлак (АБТ-263), орално доступна варијанта АБТ-737, тренутно се процењује у фази 2 клиничких испитивања. Упркос обећавајућим прелиминарним подацима, тромбоцитопенија ограничава способност повећања концентрације лекова. Од тада, показало се да АБТ-199, селективни инхибитор Бцл-2 без дејства на Бцл-кЛ, постиже антитуморску активност као једно средство код хроничне лимфоцитне леукемије, док штеди тромбоците. 17 БХ3-миметички АБТ-737 и сродна једињења делују као појединачни агенси за индукцију апоптозе само у ћелијама рака које су за преживљавање зависне од Бцл-2 или Бцл-кЛ. 18, 19 Чини се да је та зависност у корелацији са секвестрацијом протеина активатора БХ3 само анти-апоптотичким протеинима и такве ћелије су дефинисане као „припремљене за смрт“. БХ3 миметици, избацивањем активирајућих БХ3 само протеина из Бцл-2 или Бцл-кЛ, омогућавају њихову интеракцију са и активирање Бака или Бака. У ћелијама у којима Бцл-2 и Бцл-кЛ нису примати, често се показало да изложеност хемотерапеутским агенсима индукује експресију протеина који активирају БХ3 само доводећи до синергије између ових агенса и миметика БХ3.

Објављено је да, када се узгаја у суспензији, неке ћелије осетљиве на аноикис индукују експресију Б3 ћелијског лимфома 2 само за БХ3 који делују у интеракцији посредника ћелијске смрти (Бим) 20 или Бмф. 21 Стога смо закључили да се може извести паралела са ефектима хемотерапеутика и истраживати да ли је, кад се одвоје, осетљивост ћелије на БХ3 миметике измењена. У ту сврху користили смо пар изогених ћелијских линија карцинома дебелог црева: СВ480 добијене из примарног Дуке-овог карцинома дебелог црева и СВ620 изведене из метастазе мезентеричних лимфних чворова код истог пацијента. 22 ћелије СВ480 су осетљиве на аноикис, док су ћелије СВ620 резистентне. Откривено је да је Бим регулиран суспензијом у ћелијама СВ480 и да је бар делимично посредовао њихову осетљивост на аноикис. Најзанимљивије је да су обе ћелијске линије угинуле у присуству АБТ-737 када су култивисане у суспензији, док су биле отпорне на ово једињење у адхезивним условима. Према томе, самостојеће ћелије рака дебелог црева су припремљене за смрт, без обзира да ли су осетљиве на аноикис или не, и једињења попут АБТ-263 или АБТ-199 могу имати антиметастатска својства.

Резултати

СВ480 ћелије су осетљиве на аноикис за разлику од ћелија СВ620

Ниво аноикиса током времена је упоређен у ћелијама СВ480 и СВ620 после културе у суспензији. Као што је приказано на слици 1а, проценат апоптотских ћелија СВ480 повећавао се са временом. Супротно томе, апоптозу у СВ620 ћелијама је било тешко уочити. Да би се проверило да ли је смрт ћелије СВ480 настала због класичне апоптозе, ћелије су култивисане у присуству или одсуству инхибитора пан-каспазе К-ВД-ОПХ. Резултати приказани на слици 1б показују да је овај инхибитор у потпуности заштитио ћелије СВ480 од ћелијске смрти изазване одвајањем. Такође смо пратили активацију каспазе-3 у суспендованим ћелијама СВ480 детекцијом п20 (интермедијарних) и п17 (зрелих) фрагмената активне каспазе анализом вестерн блота. Фрагмент п20 и неки п17 фрагмент откривени су за 24 х (слика 1ц) и каспаза-3 је 48 сати потпуно зрела. Присуство К-ВД-ОПХ тотално укинуте активације каспазе-3 (Слика 1ц).

Image

Аноикис осетљивост у ћелијама СВ480 и СВ620. ( а ) Временски ток апоптотске ћелијске смрти у суспендованој ћелијској популацији СВ480 и СВ620. ( б ) Временски ток апоптозе у суспендованим ћелијама СВ480, узгајаних без (цтрл) или са инхибитором пан-каспазе К-ВД-ОПХ (10 µМ). ( ц ) Кинетика активације каспазе-3 у адхезивним (А) или суспендованим ћелијама СВ480, култивисаних без (цтрл) или са К-ВД-ОПХ (10 µМ) детектоване помоћу западног блота са анти-цепљеном каспазом-3 антитело (п20 и п17 фрагменти). Звездица означава неспецифични појас. За све графиконе на свим сликама, траке грешака означавају СД од најмање три независна експеримента

Слика пуне величине

Аноикис је приписан унутрашњем 23 или вањском апоптотском путу 24, 25 . Стога смо из кинетике проучавали цепање и активацију каспазе-8 и каспазе-9. Као што се може видети на слици 2а, открили смо слабашан појас цепања за обе каспазе чим је 5 сати културе суспензија. Да бисмо додатно испитали која иницијацијска каспаза је била на врху апоптотске сигнализације, користили смо два клона СВ480 ћелија стабилно трансфектирана експресијским плазмидом који кодира за Бцл-2. 26 Оба клона била су резистентна на аноикис (слика 2б) и, што је најважније, активирана је сва каспаза у тим клонима (слика 2ц) што указује да се активирање каспазе-8, приказано на слици 2а, догађа низ митохондријске догађаје. Да би се даље документовало да вањски пут није укључен, ћелије СВ480 су стабилно трансфициране експресијским плазмидом који кодира доминантно негативан облик Фасд-повезане домене смрти (ФАДД) (ФАДД-дн) и три клона (Слика 2д). Сви клонови показали су отпорност на апоптозу изазвану ТРАИЛ-ом, као што је приказано на слици 2е за клон 4. Међутим, сви клони су били осетљиви на аноикис, као што је приказано на слици 2ф за клон 4, искључујући вањски пут.

Image

Аноикис у СВ480 ћелијама започиње на митохондријама. ( а ) Кинетика активације каспазе иницијатора у ћелијским линијама СВ480 и СВ620, култивирана у суспензији. Откривени су каспаза-8 или цепајући (43/41 кД) каспаза-8 и целовита (47 кД) или одцепљена (35 кД) каспаза-9. ( б ) Проценат аноикиса у празном вектору или Бцл-2 трансфектираним клоновима СВ480. ( ц ) Недостатак детекције активације каспазе у клон-трансфицираним Бцл-2 током културе у суспензији. Неспецифични појас је представљен са *. ( д ) Ћелијски екстракти клонова СВ480 трансфектирани са ФАДД.дн (клони 1, 4 и 12) или с празним вектором (пцДНА3) избрисани су као што је описано у Материјалима и поступцима анти-ФАДД антителом ( е, ф ) СВ480 ћелије које су трансфициране са празним вектором (СВ480 пцДНА3) или са експресијом ФАДД.дн (клон 4) или су култивисани у присуству рекомбинантног ТРАИЛ-а (25 нг / мл) ( е ) или култивисани у суспензији ( ф ), а апоптоза је квантификована у разним временима

Слика пуне величине

Отпорност ћелија СВ620 на аноикис није последица епитела-мезенхималне транзиције

Епителијско-мезенхимална транзиција (ЕМТ) није само кључни догађај да епителне ћелије стекну покретљиви фенотип, већ омогућава ћелијама рака да избегну аноикис. 27 Током ЕМТ процеса губи се експресија е-кадхерина, док је експресија Н-кадхерина регулисана, процес који се назива "кадхерински прекидач". 28 И губитак Е-кадхерина 29 и стицање експресије Н-кадхерина 30 изгледају важни за стварање сигнала преживљавања. СВ480 ћелије показују епителну морфологију, док ћелије СВ620 имају морфологију заобљеног или фибробласта која подсећа на ћелије које су претрпеле ЕМТ. 31 Експресија различитих епителијских и мезенхималних маркера је стога проучавана у обе ћелијске линије. Као што је приказано на слици 3, експресија Е-кадхерина је лагано умањена у ћелијама СВ620 у поређењу са ћелијама СВ480, али цитокератин 18, други епителни маркер је увелико повећан у ћелијама СВ620. Што се тиче мезенхималних маркера, виментин је био присутан у обе ћелијске линије, али није изражен ни Н-кадхерин, ни фибронектин, док су обојица пронађена у мишјим миелобластима. Према томе, изгледа да ћелије СВ620 нису мезенхимске.

Image

Експресија различитих епителијских или мезенхимских маркера у ћелијама СВ480 и СВ620. Ћелијски екстракти су избрисани разним антителима која препознају епителијске (Е-кадхерин, Цитокератин 18) или мезенхимски (виментин, Н-кадхерин, фибронектин) маркери. Мишеви милалобласти од мишева коришћени су као позитивна контрола за мезенхимске ћелије

Слика пуне величине

Бим једини протеин Бим има улогу у смрти ћелије СВ480 због аноикиса

С обзиром да митохондријском апоптозом управљају чланови породице Бцл-2, кинетика експресије неколико ових протеина је проучавана и у ћелијским линијама СВ480 и СВ620, пратећи њихову културу у суспензији. Као што је приказано на слици 4а, анти-апоптотички Бцл-2 и Бцл-кЛ су изражени на упоредивим нивоима у обе ћелијске линије и њихова експресија није варирала током културе у суспензији. Мцл-1 експресија се није мењала током културе у СВ480 ћелијама за разлику од недавног извештаја који је установио значајно смањење Мцл-1 експресије у НИХ3Т3 ћелијама током аноикиса. 32 Свеукупно, у нашој студији, СВ620 ћелије резистентне на аноикис су изражавале мање Мцл-1 од СВ480 ћелија и, из непознатих разлога, чини се да је ниво његове експресије понекад флуктуирао током културе. Овај резултат може бити последица врло кратког полуживота Мцл-1 (40 мин). 33 Међу про-апоптотичким протеинима, ниво експресије Бак и Бида био је стабилан у суспендованим ћелијама. Супротно томе, експресија протеина Бим само за БХ3 се значајно повећала током културе у суспензији ћелија СВ480 и у року од 5 сати након одвајања ћелија. Треба приметити чињеницу да је углавном Бим-ЕЛ варијанта 34 откривена у овим ћелијама и током студије се назива Бим. Експресија бима је повећана у СВ620, али у мањем степену.

Image

Испитивање експресије породице Бцл-2 протеина у ћелијама СВ480 и СВ620, култивираним у суспензији. ( а ) Анализа временског тока експресије неколико чланова породице Бцл-2, анализираних Вестерн блотом у адхезивним (А) или суспендованим ћелијама СВ480 и СВ620. ( б ) Ефикасност нокаута Бим-а у адхезивним (А) или суспендованим ћелијама СВ480 третираним (сиРНА Бим) или не (цтрл) са специфичном Бим сиРНА праћеном Вестерн блотом помоћу специфичног антитела против Бим-а. ( ц ) Проценат апоптозе у СВ480 ћелијским популацијама, узгајаним у суспензији, било нетрансфектирано (цтрл) или након трансфекције специфичном Бим сиРНА (сиРНА Бим) или сиРНА до небитног циља (сиРНА ирр). ( д ) Анализа Бим експресије у лизатима целих ћелија и у цитосолним (цито) или мембранско / органеларним (мито) обогаћеним фракцијама у адхезивним ћелијама (А) или након 24 х суспензије (С). ( е ) Анализа временског тока експресије Бим-а у СВ480 прекомерном притиску Бцл-2 (СВ480 Бцл-2 4, СВ480 Бцл-2 14) или адхезивном (А) или узгојеном у суспензији. ( ф ) Бим експресија у малигним колоректалним ХТ-29 и ХТ-116 ћелијским линијама култивираним у суспензији

Слика пуне величине

Укинули смо Бим експресију у ћелијама СВ480 са специфичном РНА мале интерфере. Као што је приказано на слици 4б, Бим експресија је у потпуности инхибирана овим третманом кроз културу у суспензији. Откривено је да недостатак Бима у великој мери, али не и потпуно штити ћелије СВ480 од аноикиса (Слика 4ц). Стога можемо закључити да је Бим укључен у осетљивост ћелија СВ480 на аноикис. Бмф је умешан у смрт због аноикиса неколико типова ћелија. 21, 35, 36 Међутим, Бмф анализом вестерн блот-а нисмо успели да откријемо ни у једној од две ћелијске линије (није приказано).

У здравим ћелијама, Бим-ЕЛ може да се одвоји у моторни комплекс повезан са микротубулом везањем на ЛЦ8. 37 Одређени апоптотички стимулуси прекидају интеракцију између ЛЦ8 и динеин моторног комплекса, ослобађајући Бим и на тај начин омогућавајући његову транслокацију у митохондрије. Стога смо желели да утврдимо да ли поред Бим нивоа у суспендованим ћелијама могу да постоје и разлике у његовој локализацији у ћелијама СВ480 у поређењу са ћелијама СВ620. Микротубули се деполимеризирају у року од неколико минута на собној температури и на 4 ° Ц, те их стога не могу изоловати центрифугирањем. Користили смо други приступ са употребом „комплета за фракцију ћелија“ како је описано у Материјалима и методама. Екстракти ћелије које смо добили су чисти, пошто је мономерни тубулин нађен искључиво у фракцији обогаћеној цитосолним протеинима, док је АИФ, митохондријски протеин, детектован искључиво у мембрани и фракцији обогаћеној протеинима протеина (Слика 4д). Занимљиво је да је Бим у адхезивним ћелијама СВ480 пронађен углавном у мембрани и фракцији обогаћеној органеларним протеинима, а у истој фракцији детектиран је и нерегулирани Бим у суспендованим ћелијама. Стога, повећана количина Бима коју налазимо у одвојеним ћелијама СВ480 углавном је локализована у митохондријама. Супротно томе, откривено је да је Бим равномерно распоредио цитосолне и мембранске фракције обогаћене протеинима у адхезивним и суспендованим ћелијама СВ620. Ови резултати сугерирају да би могла бити мање ефикасна транслокација Бима у митохондрије у ћелијама СВ620.

Затим смо тестирали два Бцл-2 експримирајућа СВ480 клона за која смо открили да су отпорни на аноикис. Оба клона регулисана Бим-ом када су култивисана у суспензији (слика 4е) истим редоследом величине у поређењу са родитељским ћелијама (слика 3а). Према томе, осетљивост ћелија СВ480 на аноикис не диктира само ниво експресије Бим-а, већ однос Бим-а и Бцл-2.

Најзад, користили смо још две малигне колоректалне ћелијске линије да проверимо да ли је Бим урегулација у суспендованим ћелијама општа особина. Као што је приказано на слици 4ф Бим експресија је повећана и у ХТ-29 и ХЦТ-116 ћелијама током културе у суспензији, а то је праћено значајном станичном смрћу услед аноикиса.

Инхибиција ЕРК у ћелијама СВ620 враћа Бим експресију у одвојеним ћелијама и њихову осетљивост на аноикис

Експресија Бима је контролисана и транскрипцијским и посттранскрипционим механизмима. 38 Фактор транскрипције сличан вилици ФОКСО3а (кутија вилице О3а) је кључни регулатор транскрипције Бима и његова активност се сузбија помоћу фосфорилације помоћу Акт. Као што је приказано на слици 5а, блокирање ПИ3К / Акт путање није сензибилизирало СВ620 ћелије на аноикис. Поред тога, анализа западног блот-а употребом антитијела за фосфо-Акт показала је врло малу количину активираног Акт у ћелијама СВ620 (није приказано).

Image

Регулација експресије Бим протеина. ( а ) Проценат апоптозе у суспендованим ћелијама СВ480 и СВ620, култивисаних у присуству (Ли294002) или одсуству (цтрл) ПИ3К инхибитора Ли294002 (10 μМ). ( б ) Проценат апоптозе у суспендованим ћелијама СВ480 и СВ620, култивисаних у присуству (ПД0325901) или одсуству (цтрл) МЕК инхибитора ПД0325901 (10 µМ). ( ц ) Вестерн блот анализа експресије п-ЕРК, Бим и укупног ЕРК у адхезивним (А) или суспендованим ћелијама СВ480 (горњи панел) и СВ620 (доњи панел), култивисаних у присуству (ПД0325901) или одсуству (цтрл) од ПД0325901 (10 µМ). Анти-Хсц-70 коришћен је као контрола оптерећења. ( д ) Анализа Вестерн блот експресије Бим-а у ћелијама СВ620 третираним ПД0325901 ћелијама инкубираним са или без Бим сиРНА. ( е ) Временски ток нивоа аноикиса у ћелијама СВ620 третираним ПД0325901 инкубираним или не Бим сиРНА

Слика пуне величине

С друге стране, фосфорилација посредована ЕРК-ом циља на Бим за свеприсутност и протеасомалну деградацију. Инхибитор МЕК (ПД0325901) био је веома ефикасан у сензибилизацији СВ620 ћелија на аноикис, истовремено повећавајући ниво ћелијске смрти у СВ480 ћелијама култивираним у суспензији (Слика 5б). У ћелијама СВ620 (слика 5ц) базална активност ЕРК-а, процењена западном блот анализом фосфорилираног ЕРК-а (п-ЕРК), била је ниска и повећана на крају културе, налаз који смо више пута приметили. МЕК инхибитор је био веома ефикасан у укидању ЕРК активности и то је праћено повећањем Бим експресије почевши од 24 сата у корелацији са аноикисима примећеним у тим временским тачкама.

Шутјели смо експресију Бим-ове интерференције РНА у суспендованим ћелијама СВ620, узгајаним у присуству ПД0325901 (слика 5д). Као што је приказано на слици 5е, изумирање Бим експресије смањило је проценат апоптозе за око половину у 72 х третмана ПД0325901 што указује да је Бим укључен у сензибилизацију на аноикис овим једињењем. Ови подаци такође указују да су додатни механизми одговорни за преосталу ћелијску смрт. Изненађујуће, активност ЕРК је била висока и одржавана у контролним ћелијама СВ480 у целој култури у суспензији (слика 5ц), али није спречила регулацију Бим експресије у контролним ћелијама СВ480 почевши од 5 х. Инхибиција МЕК-а индуцирала је јачу повећање Бим-ове експресије (слика 5ц). У овим условима, Бим електрофоретска покретљивост је повећана због чињенице да је Бим дефосфорилиран. Бим није откривен у касним временским тачкама, опажање за које верујемо да је повезано са веома високом стопом смрти, што утиче на квалитет ћелијских екстраката. Исто тако, укупни Ерк и Хсц-70, контрола оптерећења, умањени су у овим касним временским тачкама.

АБТ-737 сензитиви и СВ480 и СВ620 ћелије на аноикис

Поновно регулирање Бима у СВ480 ћелијама узгојеним у суспензији довело нас је до испитивања да ли је, као што је показано за бројне хемотерапеутске лекове који се користе заједно са Навитоцлак-ом, 39 пронађена синергија између суспендованог стања и АБТ-737. Као што је приказано на слици 6а, адхезивне ћелије СВ480 биле су потпуно отпорне на АБТ-737 (1 µМ). Међутим, у суспендованим ћелијама откривено је да присуство АБТ-737 значајно повећава ниво аноикиса. Иста врста експеримената изведена је у ћелијама СВ620 (слика 6б). Опет су адхезивне ћелије биле резистентне на АБТ-737. Изненађујуће, ћелије СВ620, узгајане у суспензији, упркос отпорности на аноикис, умрле су у значајном броју у присуству АБТ-737. Стога смо проверили да ли присуство АБТ-737 може да промени експресију неких чланова породице Бцл-2 у овим ћелијама. Као што је приказано на слици 6ц, то није био случај. Ова опажања су посебно важна у вези са Ноком, пошто је објављено да је овај инхибитор Мцл-1 изазван третманом АБТ-737 у ћелијској линији глиома. 40

Image

Анализа СВ480 и СВ620 ћелијске осетљивости на БХ3-миметички АБТ-737. ( а, б ) Проценат апоптозе у адхезивним или суспендованим ћелијама СВ480 ( а ) или СВ620 ( б ), култивисаних у присуству (АБТ-737) или у одсуству (цтрл) АБТ-737 (1 µМ ). ( ц ) Анализа експресије члана Бцл-2 у ћелијама СВ620 током културе у суспензији у присуству или одсутности АБТ-737. ( д ) ћелије СВ480 (горњи панели) и СВ620 (доњи панели) или адхезивне (Адх) или суспендоване током 24 х у присуству (Сусп + АБТ) или у одсуству (Сусп) АБТ-737 (1 μМ ) лизиране су у ЦХАПС пуфер. Очишћени лизати су или анализирани директно (ћелијски лизат) или након имунопреципитације са анти-Бим антителом (ИП Бим) и имуноблотираним (ВБ) за Бцл-2 и Бим како је описано у Материјалима и поступцима. ( е ) Ћелије су третиране као у д и анализиране на Бцл-кЛ ко-имунопреципитацију. ( ф ) Адхерентне ћелије СВ480, култивисане у присуству или одсуству АБТ-737 током 24 х, лизиране су као у д и анализиране на Мцл-1 ко-имунопреципитацију

Слика пуне величине

Станице осетљиве на АБТ-737 требало би да се примере на смрт са Бцл-2 и / или Бцл-кЛ сложеним у активаторне протеине само за БХ3. 41 Имуноблотс Бим и Бцл-2 или Бцл-кЛ су стога изведени у лизатима целих ћелија и у анти-Бим имунопреципитатима у СВ480 и СВ620 ћелијским линијама. Као што је приказано на слици 6д, детектирани су Бцл-2: Бим комплекси у обе ћелијске линије које су култивисане у суспензији. Формирање ових комплекса је прекинуто у присуству АБТ-737, што указује на то да је ово једињење избацило Бим из Бцл-2 (слика 6д). Најважније је да су Бцл-кЛ: Бим комплекси такође откривени у суспендованим ћелијама СВ480 и СВ620 и преместили их АБТ-737 (слика 6е). Бцл-2: Бим комплекси су такође пронађени у адхезивним ћелијама СВ480 (слика 6д) упркос њиховој неосјетљивости на АБТ-737 у овим условима културе. Могуће је да, у недостатку регулације Бима, количина таквих комплекса је прениска да би се компензирала анти-апоптотичка функција Мцл-1 42, која је високо изражена у ћелијама СВ480 (слика 3а). Обавили смо имунопреципитацију Бим-а у адхезивним ћелијама СВ480 третиране или не АБТ-737, што је открило присуство Бим: Мцл-1 комплекса у оба стања (Слика 6ф). Према томе, верујемо да је, пошто је ниво Бима у адхезивним ћелијама СВ480 низак, Мцл-1 у стању да ухвати малу количину протеина измештених из Бцл-2 / Бцл-кЛ помоћу АБТ-737.

Дискусија

Аноикис је у основи анти-метастатски процес и отпорност на овај облик ћелијске смрти корелира са агресивношћу рака. 4

У овом истраживању користили смо ћелијске линије СВ480 и СВ620 које су потврђене као модел прогресије рака дебелог црева од примарног тумора (СВ480) до метастатских ћелија (СВ620) 31, и показују да су током ове прогресије туморске ћелије стекле аноикис -резистентни фенотип Показало се да је ЕМТ важан феномен за стицање отпорности на аноикис 43 ; међутим, нисмо пронашли никакве доказе да се овај процес догодио у ћелијама СВ620 упркос њиховој сугестивној морфологији налик фибробластима. Остаје могуће да су ове метастатске ћелије прошле пролазну ЕМТ праћену мезенхимско-епителијском транзицијом након што су колонизирале своје секундарно место, као што је сугерисано код инвазивног карцинома дебелог црева. 44

Међу тестираним про-апоптотичким протеинима, Бим је био једини који је био високо регулиран у суспендованим ћелијама СВ480. Важно је да је утишавање Бим-ове експресије потврдило да је овај протеин само за БХ3 учествовао у смрти ћелије СВ480 од аноикиса. Међутим, ниво апоптозе се кретао од 38% у контролним ћелијама до 15% у ћелијама третираним Бим кратком интерферирајућом РНА (сиРНА) што указује да би други пут могао да буде умешан у ову преосталу ћелијску смрт. Утврдили смо да импликација Бмф-а није вероватна.

Оно што је најзанимљивије, када је процењен утицај АБТ-737 на суспендоване ћелије, откривено је да ово једињење појачава аноикис не само у ћелијама СВ480, које регулису Бим суспензијом, већ и у ћелијама СВ620, које то помало чине. Извршено је неколико студија како би се утврдио начин деловања АБТ-737. Једна од ових студија, у акутној мијелоидној леукемији, указује да АБТ-737 делује индуцирајући дисоцијацију Бцл-2: Бак комплекса и индукује апоптозу на начин овисан о Баку, али Бим-независан. 45 Међутим, ми нисмо били у стању да откријемо такве комплексе било у ћелијској линији у адхезији или у суспензији (није приказано). С друге стране, у обе ћелијске линије које су култивисане у суспензији, Бцл-2: Бим и Бцл-кЛ: Бим комплекси су имунопреципитирани и ови комплекси су поремећени од стране АБТ-737. Наши подаци су, дакле, у складу са резултатима добијеним у хроничној лимфоцитној леукемији, где ослобађање Бима из Бцл-2 помоћу АБТ-737 доводи до активације Бака. 19 Дакле, Бим-ова окупација Бцл-2 и Бцл-кЛ у суспендованим ћелијама је прајмирала СВ480 и СВ620 ћелије за смрт, а АБТ-737 је деловао ослобађањем Бим-а. Бцл-2: Бим или Бцл-кЛ: Бим комплекси су тешко откривени у адхезивним ћелијама СВ620, вероватно објашњавајући зашто су били отпорни на АБТ-737. Супротно томе, адхезивне ћелије СВ480 су приказале Бцл-2: Бим комплексе, док ове ћелије нису биле осетљиве на АБТ-737. Показано је да је Мцл-1 кључна одредница отпорности на АБТ-737 45, 46 и СВ480 ћелије које испољавају високе нивое Мцл-1. Стога, чак и ако су Бцл-2: Бим комплекси били поремећени од стране АБТ-737 у тим адхезивним ћелијама, расељени Бим би могао да буде везан Мцл-1, одржавајући опстанак. Заиста, могли бисмо открити Мцл-1: Бим комплексе у адхезивним ћелијама СВ480 третиране или не АБТ-737. Урегулација Бим-а у суспендованим ћелијама СВ480 требало би да створи више Бцл-2: Бим комплекса. У овом случају, количина Бим-а ослобођеног од стране АБТ-737 би субвертирала пуферни капацитет Мцл-1, чиме би ћелије биле осетљиве на БХ3-миметик.

Ниво стабилног стања регулише се фосфорилацијом зависном од ЕРК1 / 2, која га циља за разградњу протеасомом. Нађено је да инхибиција МЕК-а појачава Бим експресију у обе ћелијске линије и да сензибилизира ћелије СВ620 на аноикис. Стога су ћелије СВ620 у суспензији осетљиве на Бпто-индуковану апоптозу под условом да је овај протеин само за БХ3 присутан у довољним количинама. Међутим, изгледа мало вероватно да је пут ЕРК искључиво одговоран за недостатак регулације Бима у суспендованим ћелијама СВ620, јер нисмо приметили строгу негативну корелацију између нивоа п-ЕРК и Бим израза. Заиста, активност ЕРК-а је у овим ћелијама мала и повећава се тек у каснијим временским тачкама. С обзиром на наше резултате да пут ПИ3К-Акт такође није укључен, вероватно је да ће се у регулисању Бим-ове експресије играти и други пут, који тек треба да се идентификује.

Ниво Мцл-1, висок и стабилан током културе у суспензији ћелија СВ480, био је нижи и понекад је флуктуирао у ћелијама СВ620. Занимљиво је приметити да је деградација Мцл-1 неопходна за индукцију аноикиса код неких модела. То очигледно није случај у ћелијама СВ480. Кратак полуживот Мцл-1 приписан је његовој фосфорилацији од стране ГСК-3 након чега је уследила његова свеприсутна употреба и деградација од стране протеасома. 48 ГСК-3 инхибира пут ПИ3К-Акт. Пронашли смо врло мало Акт активности у СВ620 ћелијама, па је ГСК-3 можда одговоран за смањену количину Мцл-1 изражену од СВ620 ћелија. У сваком случају, очекивало би се да ће низак ниво Мцл-1 осетити ћелије СВ620 на аноикис, што није оно што смо приметили.

Закључно, без обзира да ли су подвргнути аноикису, суспендоване ћелије рака дебелог црева су осетљиве на БХ3-миметички АБТ-737. Ово указује да ћелије рака које су се одвојиле од ванћелијског матрикса могу проћи кроз пролазни прозор где их могу убити једињења као што су Навитоцлак или АБТ-199, која би овим анти-метастатским својствима дала анти-метастатска својства.

Материјали и методе

Ћелијске линије и реагенси

СВ480 и СВ620 ћелијске линије карцинома дебелог црева су добијене из Америчке колекције култура типова (АТЦЦ). Они су рутински одржавани у Дулбеццо-овом минималном есенцијалном медијуму (ДМЕМ) (Гибцо, Саинт Аубин, Француска), допуњеном 10% топлотним инактивираним феталним серумом говеда, 1% натријум-пируватом, 0, 1 мг / мл стрептомицина, 100 У / мл пеницилина на 37 ° Ц у атмосфери са 5% ЦО2. За културе у суспензији, 2 јединице / мл диспазе (Роцхе, Меилан, Француска) су додаване у медијум за добијање суспензија са једним ћелијама. Диспаза је бактеријска неутрална протеаза са благим протеолитичким деловањем, која се углавном користи за изолацију и рутинско пасирање примарних ћелија. Такође може одвојити адхезивне ћелије из посуде 49 културе вађењем ванћелијског матрикса 50 и дисоцијацијом ћелијских агрегата. 51 Диспаза неактивира серум и, с обзиром на то да нема токсичности, је веома ефикасно средство за задржавање адхезивних ћелија у једноћелијској суспензији.

ТРАИЛ осетљивост клонова СВ480 је тестирана узгајањем ћелија у присуству рекомбинантног рекомбинантног ТРАИЛ (25 нг / мл) (Алекис Биоцхемицалс, Виллеурбанне, Француска) и антитела (М2) антитела (Сигма Алдрицх, Лион, Француска) за разна времена.

Основни раствори К-ВД-ОПХ (Биовисион, Нантерре, Француска), Ли294002 (Цалбиоцхем, Дармстадт, Немачка) и ПД0325901 (Сигма Алдрицх) припремљени су у ДМСО на 10 мМ и коришћени у крајњој концентрацији од 10 μМ. АБТ-737 (Селлецкцхем, Соуффелвеиерсхеим, Француска) је такође припремљен у ДМСО на 10 мМ и коришћен у крајњој концентрацији од 1 μМ.

The following antibodies were used: anti-Bax (N-20, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Heildelberg, Germany), anti-Bid (R&D Systems, Lille, France), anti- cleaved caspase-3 (Cell Signaling, Saint Quentin en Yvelines, France), anti-Hsc70 (B-6, Santa Cruz Biotechnology, Inc), anti-Mcl-1 (S-19, Santa Cruz Biotechnology, Inc), anti-Bcl-2 (H-100, Santa Cruz Biotechnology, Inc), anti-Bcl-xL (BD Transduction Laboratories, Le Pont de Claix, France), anti-Bim (Cell Signaling), anti-pErk (Cell Signaling), anti-Erk total (Cell Signaling), anti-actin (MBL, Nanterre, France) and anti-FADD (BD Transduction Laboratories).

Анализа проточне цитометрије апоптотских ћелија

Suspended cells maintained in culture from 24–72 h were washed in PBS (phosphate-buffered saline), fixed in 70% cold ethanol and stored at −20 °C for at least 12 h. After two washes in PBS, cells were resuspended and stained in 0.5 ml of PBS containing 50 μ g/ml propidium iodide. The fluorescence intensity of propidium iodide was assessed with a FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, France) and analyzed using the CellQuest (Becton Dickinson) software. The percentage of cells with apoptotic nuclei, distinguished by their hypodiploid DNA content (sub-G0/G1 peak), 52 was assessed for each histogram.

Western blotting and immunoprecipitation

Cells were lysed with ice-cold NP40 lysis buffer (30 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10% Glycerol, 10 mM NaPP and 1% NP40) containing 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride, 1 mM sodium orthovanadate (Na 3 VO 4) and 1/100 protease cocktail inhibitors (Sigma, Lyon, France). All lysates were clarified by centrifugation at 15 000 × g for 15 min at 4 °C. Protein concentrations were assessed using the Bradford assay (BioRad, Hercules, CA, USA). Proteins amounting to 50 μ g were prepared in loading Laemmli's buffer (60 mM Tris-HCL pH 6.8, 0.18 M β -mercaptoethanol, 2% SDS, 10% glycerol and 0.005% bromophénol blue), boiled for 5 min, subjected to sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis and transferred on ice for 1.5 h to polyvinylidenedifluoride membrane (Amersham Hybond-LFP, GE healthcare, Velizy-Villacoublay, France). After blocking for at least 1 h in Tris-buffered saline supplemented with 5% BSA and 0.5% Tween-20 (TBS-T), membranes were probed with the appropriate primary antibodies in TBS-T overnight. Proteins were visualized by using Lycor secondary antibodies and Odyssey detection material.

For immunoprecipitation experiments, cells were lysed with CHAPS lysis buffer (30 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10% Glycerol, 10 mM NaPP and 1% CHAPS) containing 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride, 1 mMsodium orthovanadate (Na 3 VO 4 ) and 1/100 protease cocktail inhibitors). Nuclear pellets and debris were removed by centrifugation, at 15 000 × g for 15 mn at 4 °C. Six milligrams of proteins from cell lysates were incubated for 1 h at 4 °C with the anti-Bim antibodies. Protein-G beads were added to the immune complexes for 45 min and washed five times with ice-cold CHAPS lysis buffer. Purified immunoprecipitates, immobilized on protein-G beads, were mixed with an equal volume of Laemmli's buffer 2x, boiled for 5 min and further analyzed by means of western blot for both Bim and Bcl-2 content.

Small-interfering RNA-mediated silencing of Bim

In 3 ml of culture medium, 3 × 10 5 cells were transfected with Bim siRNA or irrelevant siRNA (Ambion Life Technologies, Saint Aubin, France). Each siRNA was used at 20 nM final concentration. INTERFERin (20 μ l, Polyplus transfection, Ozyme, Saint Quentin en Yvelines, France) was incubated with siRNA duplex in 800 μ l of DMEM without serum for 20 min at room temperature. The mixture was then added to the cells, which were transferred to culture plates and incubated at 37 °C. Seventy-two hours after transfection, cells were detached with culture medium containing 2 units/ml of dispase, cultured in this medium for 24, 48 or 72 h and the percentage of apoptotic cells was quantified as described above. Extinction of Bim expression by the Bim siRNA was monitored by means of western blot throughout the culture in suspension.

Stable transfection of FADD.dn in SW480 cells

The pcDNA3/ FADD.dn vector encodes for a truncated form of FADD protein deleted of its two DED domains and thus unable to recruit caspase-8. SW480 cells were transfected 5 μ g of either pcDNA3/FADD.dn or pcDNA3 empty vector with the use of JetPei (Polyplus transfection). Transfected cells were selected with neomycin (400 μ g/ml) and then cloned.

Фракционација ћелија

We used the 'cell fractionation kit' (catalog no. 9038) from Cell Signaling Technology according to manufacturer's instructions. This methodology is detergent-based 53 and is performed on ice. Cell pellet is resuspended in a first, digitonin-based, buffer for 5 mn followed by a centrifugation at 500 × g . The supernatant is the cytosolic protein-enriched fraction. The pellet is resuspended in a second, triton-based buffer for 5 mn and centrifuged at 8000 × g . The supernatant is the membrane and organellar protein-enriched fraction, which contains, among others, mitochondria-associated proteins. The remaining pellet, which we did not use, contains the actin cytoskeleton and the nuclear proteins. Given that microtubules depolymerize within minutes on ice, tubulin and all associated proteins, including dynein motor complex-bound Bim for our purpose, end up in the cytosolic fraction.

Речник

Бцл-2

B-cell leukemia/lymphoma 2

Бак

Bcl-2-acssociated x protein

Бцл-кЛ

Bcl-2-related gene, long isoform

Mcl-1

myeloid cell leukemia 1

Понуда

Бцл-2 агонист смрти домена у интеракцији

Бим

B-cell lymphoma 2 interacting mediator of cell death

сиРНА

кратка интерферирајућа РНА

ЕМТ

epithelial–mesenchymal transition

ФАДД

Fas-associated death domain