Мицрорна-18а-5п делује као онкоген директно усмеравајући ирф2 код рака плућа | ћелијска смрт и болест

Мицрорна-18а-5п делује као онкоген директно усмеравајући ирф2 код рака плућа | ћелијска смрт и болест

Anonim

Субјекти

  • Аутопхаги
  • Ћелијска сигнализација
  • миРНА
  • Нон-ћелијски карцином плућа

Апстрактан

Рак плућа је главни облик рака који резултира смртношћу повезаном са раком широм света. МикроРНА су ендогени мали некодирајући једноланчани РНА који могу учествовати у регулацији експресије гена. У овом истраживању, миР-18а-5п значајно је регулиран у не-ситном ћелијском карциному плућа (НСЦЛЦ) и НСЦЛЦ ћелијским линијама, што сугерише онкогену функцију код рака плућа. Поред тога, миР-18а-5п може промовисати канцерогенезу директним циљањем на интерферонски регулаторни фактор 2 (ИРФ2). Даљи експерименти су показали да ИРФ2 може повећати апоптозу ћелије, инхибирати ћелијску пролиферацију и способност миграције. Наше истраживање показује да миР-18а-5п промовише аутофагију у НСЦЛЦ. Колективно, ови резултати показују да миР-18а-5п не може само промовисати НСЦЛЦ сузбијањем ИРФ2, већ ће и у блиској будућности бити обећавајући циљ.

Главни

Рак плућа је један од најчешћих малигних тумора, нови случајеви чине 13% укупног карцинома и водећи узрок смрти од рака. 1 Не-ситноћелијски карцином плућа (НСЦЛЦ) доприноси скоро 80% карцинома плућа, а његова укупна 5-годишња стопа преживљавања је ниска, док стопа рецидива остаје висока. 2 За ове факторе потребно је даље разумевање механизама који су укључени у туморигенезу НСЦЛЦ и напори да се открију и промовишу потенцијални терапеутски циљеви за напредак у лечењу ове распрострањене болести.

МикроРНА (миРНА) су ендогене мале некодирајуће једноланчане РНА, које регулишу експресију гена везањем на 3'-нетрансловани регион (3'-УТР) мРНА. 3, 4 На биолошке процесе, укључујући раст, диференцијацију, апоптозу, покретљивост и малигну трансформацију дубоко утичу миРНА. 5 Неколико студија је показало ектопичну експресију миР-18а-5п код карцинома као што су карцином дојке, хепатоцелуларни карцином, рак простате и други карциноми. 6, 7, 8, 9

Породица протеина интерферона (ИРФ) је кључни фактор адаптивног имунитета и модулисаних ћелијских одговора који су укључени у туморигенезу. 10, 11 ИРФ2 је члан породице ИРФ која има могућност да врши анти-онкогене активности. Као што је горе описано, повишени нивои експресије ИРФ2 довели су до смањене ПД-Л1 експресије и повезани са смањеним пролиферативним потенцијалом. 12 Конзистентно, прекомерна експресија ИРФ2 довела је до драматичног одговора смрти ћелије апоптозом у хепатоцелуларном карциному. 13

У овој студији истражили смо потенцијалне механизме миР-18а-5п у НСЦЛЦ. Истовремено, наши експериментални подаци открили су да миР-18а-5п значајно поспјешује раст и миграцију тумора НСЦЛЦ путем циљаног ИРФ2. Наши резултати пружили су нови потенцијални смер за дијагностику НСЦЛЦ и терапијску интервенцију.

Резултати

МиР-18а-5п је регулисан у НСЦЛЦ

Да би се истражила улога миР-18а-5п у карциногенези плућа, ниво експресије детектиран је у 63 случаја пацијената са НСЦЛЦ. Подаци су показали да је у поређењу са одговарајућим не-туморским плућним ткивима, миР-18а-5п регулисан (Слика 1а). У тим болесничким ткивима повишени нивои експресије ИРФ2 вероватно су повезани са величином тумора ( П = 0.052383, слика 1б), али нису повезани са сполом (слика 1ц) и патолошким стадијем (слика 1д). Такође је испитана експресија миР-18а-5п у НСЦЛЦ ћелијским линијама, БЕАС-2Б ћелијска линија је била контролисана. Очигледно је био регулисан у ћелијама А549, Х1299, Х23 и Х1650 (Слика 1е). Ови резултати указују да миР-18а-5п може промовисати канцерогенезу НСЦЛЦ.

Image

МиР-18а-5п је регулисан у НСЦЛЦ ткивима и ћелијским линијама ( а ) Ниво релативне експресије добијен кРТ-ПЦР резултатима миР-18а-5п у туморским ткивима (Т) и одговарајућим нетуморским ткивима (НТ). У6 је коришћен за нормализацију. ( б - д ) Изражавање миР-18а-5п везано за величину тумора, пол и патолошки стадијум. ( е ) Релативни ниво експресије миР-18а-5п у ћелијским линијама рака плућа и ћелија БЕАС-2Б (контрола) је мерен помоћу кРТ-ПЦР ( н = 3 независна експеримента). Траке грешака представљају средњу вриједност ± СЕМ * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001

Слика пуне величине

МиР-18а-5п промовише ћелијску пролиферацију и миграцију НСЦЛЦ

Да би се проучио утицај миР-18а-5п на НСЦЛЦ ћелијску пролиферацију, ћелије Х23, Х1299 и А549 су трансфициране миР-18а-5п мимиком / инхибитором и подвргнуте квантитативној ПЦР (кРТ-ПЦР) анализи у реалном времену, резултати из који је потврдио да трансфекција миР-18а-5п мимиком / инхибитором повећава / смањује његов ниво у три ћелијске линије (допунска слика С1). Пролиферација НСЦЛЦ ћелија је процењена помоћу Кит за бројање ћелија-8 (ЦЦК-8) (Слике 2а и б). Подаци ћелијске пролиферације показали су да трансфекција мимиком миР-18а-5п показује значајно повећање раста ћелије након 72 х, док инхибитор миР-18а-5п значајно смањује ћелијску пролиферацију у истим условима културе. Даље, Флов Цитометри је проценио да је стопа апоптозе у три ћелијске линије, трансфициране миР-18а-5п мимиком / инхибитором, видљиво смањена / повећана (Слике 2ц и д). Поред тога, 48 сати након трансфекције миР-18а-5п мимиком, резултати зарастања рана и Трансвелл показали су да је миграциона способност ћелија изразито повећана (Слике 2е и ф). Ови резултати су показали да миР-18а-5п може промовисати способност пролиферације и миграције, инхибирати апоптозу НСЦЛЦ ћелија.

Image

МиР-18а-5п може промовисати ћелијску пролиферацију и миграцију НСЦЛЦ ћелијских линија. ( а, б ) Ћелије Х23, Х1299 и А549 су трансфициране са НЦ или миР-18а-5п мимичним / НЦ или миР-18а-5п инхибитором, а ћелијска пролиферација је одређена ЦЦК-8. ( ц, д ) Дистрибуције апоптозе ћелија Х23, Х1299 и А549 су трансфициране са НЦ или миР-18а-5п мимиц / НЦ или миР-18а-5п инхибитором у трајању од 48 х, а затим су откривене проточном цитометријом. ( е, ф ) 48 х након инфекције са мимиком / НЦ или миР-18а-5п мимиком / инхибитором миР-18а-5п, резултати испитивања зацељења рана и Трансвелл тестова у ћелијама Х23, Х1299 и А549. н = 3–4 независна експеримента, траке грешака представљају средњу вредност ± СЕМ * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001

Слика пуне величине

МиР-18а-5п директно циља ИРФ2

Користећи програме предвиђања ТаргетСцан (ввв.таргетсцан.орг), ИРФ2 је изабран као потенцијални циљ миР-18а-5п. Да бисте проверили да ли је ИРФ2 директна мета миР-18а-5п или не, ИРФ2 дивљи тип 3'-УТР (ИРФ2 ВТ 3'-УТР) је клониран у вектор пГЛ3 (пГЛ3-ИРФ2 ВТ 3'-УТР), низводно од отвореног оквира за читање луциферазе. Да бисмо потврдили циљану специфичност, мутирали смо места везивања миР-18а-5п (слика 3а) и спровели мутагенезу усмерену на локацију за ИРФ2 ВТ 3'-УТР користећи КуикЦханге мутагенесис кит. Резултати су показали значајно смањење од више од 30% у односу на релативну активност луциферазе у репортер гену у ХЕК293Т ћелијама ко-трансфицираним мимиком пГЛ3-ИРФ2 ВТ 3'-УТР и миР-18а-5п. Супротно томе, ко-трансфекција миР-18а-5п пГЛ3-ИРФ2 мут 3'-УТР резултирала је неприметном променом активности луциферазе, што сугерише специфичност миРНА циља 3'-УТР (Слика 3б). Даље, приметили смо да миР-18а-5п смањује експресију ИРФ2 у ћелијама (слика 3ц).

Image

ИРФ2 је директна мета миР-18а-5п. ( а ) ИРФ2 ВТ 3'-УТР садржи предвиђена места везивања миР-18а-5п. Слика приказује поравнавање миР-18а-5п са ИРФ2 ВТ 3'-УТР, са стрелицама које указују на нуклеотиде мутагенезе. ( б ) Двоструки тест новинарке луциферазе. ХЕК293Т ћелије су кофефициране репортер конструктима луциферазе који садрже пГЛ3-ИРФ2 ВТ 3'-УТР (ИРФ2 ВТ) и пГЛ3-ИРФ2 мут 3'-УТР (ИРФ2 мут) са мимиком миР-18а-5п или мимиком НЦ. Приказује се релативна експресија луциферазе лептира, нормализована на експресију Ренилла луциферазе, н = 3 независна експеримента. ( ц ) Имуноблотинг анализа нивоа ИРФ2 у ћелијама Х23, Х1299 и А549, трансфектиране са мимиком НЦ мимиц / миР-18а-5п или инхибитором НЦ / миР-18а-5п током 48 х. ( д ) Релативна експресија ИРФ2 мРНА из кРТ-ПЦР одговарајућих не-туморских ткива (НТ) и туморских ткива (Т). За нормализацију је коришћено 18 С. ( нпр. ) Изражавање ИРФ2 везано за величину тумора, пол и патолошки стадијум. ( х ) Релативна експресија ИРФ2 мРНА у ћелијским линијама рака плућа или ћелијској линији плућног епитела, н = 3 независна експеримента. ( и ) Утицај нивоа експресије ИРФ2 на укупни проценат преживљавања код пацијената са карциномом плућа 1926. године (интернетска база података Каплан-Меиер Плоттер) анализиран је и плоче Каплана-Мејера генерисане помоћу плотера Каплан – Меиер (//ввв.кмплот.цом) . ( ј ) МиР-18а-5п је имао негативну корелацију са ИРФ2 према Пеарсоновом коефицијенту корелације. Траке грешака представљају средњу вриједност ± СЕМ * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001

Слика пуне величине

Да би се утврдило да ли је експресија ИРФ2 повезана са миР-18а-5п у НСЦЛЦ или не, експресија ИРФ2 је истраживана у истим паровима ткива. Резултати су показали да је експресија ИРФ2 смањена у ткивима тумора (слика 3д) и вероватно се односила на величину тумора ( П = 0, 080892, слика 3е), али негативну корелацију са полном и патолошком стадијом (слике 3ф и г). Тада су нивои експресије ИРФ2 мРНА измерени у неколико НСЦЛЦ ћелијских линија и открили су да је експресија ИРФ2 у НСЦЛЦ ћелијама много нижа од БЕАС-2Б контролних ћелија (Слика 3х). Према томе, према резултатима анализе користећи Пеарсонов коефицијент корелације, претпоставили смо да је миР-18а-5п негативно корелиран са ИРФ2 (слика 3ј).

Да бисмо анализирали ефекат ИРФ2 експресије на пацијенте са карциномом плућа, користили смо интернетску базу података Каплана-Мејеровог плотера (ввв.кмплот.цом/аналисис) да бисмо генерисали криву преживљавања НСЦЛЦ пацијената са ниском или високом експресијом ИРФ2 (Слика 3и ). Од случајева из 1926. открили смо да су НСЦЛЦ болесници са ниском експресијом ИРФ2 имали нижи степен преживљавања.

ИРФ2 функционише за сузбијање НСЦЛЦ

Да би се утврдило да ли су биолошки ефекти ИРФ2 и миР-18а-5п исти или не, ИРФ2 је оборен користећи сиРНА и тада су откривени пролиферација ћелија, апоптоза и способност миграције. Након 48 х, експресија ИРФ2 мРНА и протеина смањена је за 50% у ћелијама трансфектираним сиИРФ2 (допунске слике С2А и С2Б). Штавише, резултати испитивања ЦЦК-8 показали су да је способност пролиферације НСЦЛЦ ћелија значајно повећана након третмана сиИРФ2 (слика 4а). У складу са тим, стопа апоптозе је инхибирана (слика 4б). Резултати су такође показали да је способност миграције ћелија побољшана 48 сати након рушења ИРФ2 (слике 4ц и д).

Image

ИРФ2 функционише за сузбијање НСЦЛЦ. ( а ) Ћелије Х23, Х1299 и А549 су трансфициране сиНЦ или сиИРФ2, а ћелијска пролиферација је одређена ЦЦК-8. ( б ) Дистрибуција апоптозе Х23, Х1299 и А549 ћелија је трансфектирана сиНЦ или сиИРФ2 током 48 х, а затим је откривена проточном цитометријом. ( ц, д ) 48 х након трансфекције сиНЦ или сиИРФ2, резултати испитивања зацељења рана и Трансвелл тестова у ћелијама Х23, Х1299 и А549. ( е, ф ). Х1299 и А549 ћелије су трансфектиране миР-18а-5п мимиком и пцДНА3.1 / пцДНА3.1-ИРФ2 вектором, а затим способност миграције ћелије подложна испитивању трансвелл миграције и инвазије, а ћелија апоптоза је откривена 48 х касније анализом проточне цитометрије. . н = 3–4 независна експеримента, траке грешака представљају средњу вредност ± СЕМ * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001

Слика пуне величине

Да бисмо истражили да ли су ефекти миР-18а-5п посредовани преко ИРФ2, трансфектирали смо негативну контролу (пцДНА3.1) или експресијски вектор ИРФ2 (пцДНА3.1-ИРФ2) у ћелије А549 или Х1299, које су прекомерно изражене миР-18а-5п. Експресија протеина ИРФ2 је повећана након трансфекције у ћелијама А549 или Х1299 (допунска слика С2Ц). Такође смо анализирали ефекте прекомерног експресије ИРФ2 на ћелијску апоптозу и способност миграције. Драматично, резултати су показали да ИРФ2 преокреће функцију прекомерне експресије миР-18а-5п, која сузбија апоптозу и промовише способност миграције у ћелијама А549 и Х1299 (слике 4е и ф). Закључно, ови подаци сугерирају да ефекти ИРФ2 сузбијају НСЦЛЦ промовишући ћелијску апоптозу, инхибирајући ћелијску пролиферацију и способност миграције.

МиР-18а-5п промовише аутофагију у НСЦЛЦ

Аутофагија има двострани ефекат код тумора. 14 То је разлог зашто смо истраживали утицај миР-18а на аутофагију. Као што је приказано на слици 5а, прекомерна експресија миР-18а-5п значајно је индуцирала тачку накупљања ГФП / мРФП-ЛЦ3. Приметно, појачана је липидна коњугација слободног ЛЦ3-И са ЛЦ3-ИИ повезаном са аутопхагичном мембраном и појачана БЕЦН1 у екстрактима ћелија након прекомерне експресије миР-18а (Слика 5б). Супротно томе, нивои експресије СКСТМ1 су смањени (Слика 5б). Такође смо открили аутофагију ин виво имунохистохемијом која је указивала да је ЛЦ-3Б-ИИ у туморским ткивима ксенографта повишен (Слика 6е). Да би се утврдило да ли миР-18а-5п регулише стварање аутофагосома или проток аутофагије, у експериментима је кориштен Бафиломицин А1 (Баф А1), који је познати инхибитор последњих фаза аутофагије. Интересантно је да је ефекат миР-18а-5п на аутофагију мање очигледан (слике 5а и б). Сходно томе, такви налази су показали да миР-18а повећава не само аутофагосомско стварање већ и аутофагијски ток.

Image

МиР-18а-5п промовише аутофагију у НСЦЛЦ. ( а ) МиР-18а-5п је појачао тачку накупљања ГФП / мРФП-ЛЦ3 у ћелијама А549. Али, Баф А1 инхибирао је функцију МиР-18а-5п. Ћелије су трансфициране мимиком НЦ или миР-18а-5п и третиране са 100 н М Баф А1 током 24 х ( б ) Имуноблотинг анализа протеина нивоа миР-18а-стабилно-прекомерно експресијујућих А549 ћелија третираних за 100 нМ Баф А1 за 24 х. н = 3 независна експеримента, траке грешака представљају средњу вредност ± СЕМ * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001

Слика пуне величине

Image

МиР-18а-5п повећава раст тумора и метастазе ин виво . ( ац ) МиР-18а-стабилно прекомерно експримирајуће А549 ћелије (пЛенти-миР-18а) и контролне ћелије (пЛенти) су убризгане у голе мишеве. Кривуља раста тумора приказана је на слици 6а. Тумори ксенографта на голим мишевима приказани су на слици 6б, а тежина тумора приказана на слици 6ц. ( д ) Експресија миР-18а-5п је детектована кРТ-ПЦР у миР-18а стабилно прекомерно експримирајућим А549 ћелијама и негативним контролним ћелијама. ( е ) Експресија Ки67, Е-кадхерина, ЛЦ3Б-ИИ и ЕГФР у туморским ткивима је мерена имунохистохемијом. ( е ) Експресија ИРФ2 у ткивима тумора процењена је Вестерн блот-ом. ( ги ) Плућа мишева са метастазним чворовима приказана су на слици 6г. Тежина плућа и метастаза приказани су на сликама 6х и и. ( ј ) Хистопатологија метастаза индукованих мишјим плућним ткивима са обојењем хематоксилином и еозином. Траке грешака представљају средњу вриједност ± СЕМ * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001

Слика пуне величине

МиР-18а-5п повећава раст тумора и метастазе ин виво

На основу улоге миР-18а-5п у НСЦЛЦ ћелијама, његове функције су такође испитиване ин виво . Голи мишеви убризгавани су супкутано А549 ћелијама (5 × 106) стабилно прекомерно експримирајући миР-18а (пЛенти-миР-18а) или контролни (пЛенти) 7 недеља касније, следећи тумори су анализирани. Резултати су показали да су ксенографти А549 значајно порасли у расту тумора. МиР-18а-5п ћелије које су прекомерно експримирале такође су повећавале величину и тежину тумора после 7 недеља након имплантације (Слике 6а и ц). Поред тога, у ткивима тумора из пЛенти-миР-18а групе примећена је уочљива регулација у експресији миР-18а-5п (слика 6д) и смањен ниво експресије ИРФ2 (слика 6ф). Експресија Ки67, Е-кадхерина и рецептора епидермалног фактора раста (ЕГФР) у туморским ткивима ксенографта је мерена помоћу имунохистохемије. Резултати су показали значајну регулацију Ки67 и ЕГФР-а у туморским ткивима стабилно прекомерно експримирајући миР-18а, праћено смањењем експресије Е-кадхерина (Слика 6е).

Да би истражили како миР-18а утиче на метастазе тумора ин виво , ћелије су убризгане у репну вену голих мишева. Након 7 недеља убризгавања репне вене, приметили смо да су групе прекомерне експресије које стварају масивне и спојене метастатске чворове, контролна група генерисала фине и раштркане метастатске чворове (слике 6ф-х). Обојење хематоксилином и еозином показало је да туморска гнезда изведена из прекомерних експресијских група показују велико подручје уништавања и / или некрозе плућног ткива, док је контролна група формирала мање и мања гнезда тумора (Слика 6и). Ови подаци су указивали да миР-18а-5п може поспешити раст тумора, метастазе и аутофагију.

Дискусија

МикроРНА играју важну улогу у пролиферацији ћелија и канцерогенези. Неки микроРНА функционишу као онкогени, док други као супресорски гени. Наша лабораторија потврдила је да миР-34а, 15 миР-32 16 и миР-486-5п 17 могу бити гени за супресију тумора, док миР-150 18 може бити онкоген. Они су укључени у много сложенију мрежу регулације у туморигенези рака плућа.

У овој студији потврдили смо да миР-18а-5п подстиче пролиферацију ћелија и смањује миграцију директно циљајући ИРФ2. Пошто је дисрегулација сигнала за пут ИРФ једна од најчешћих промена које се налазе код карцинома и болести код људи, укључујући 20 НСЦЛЦ. ИРФ2 се сматра једним од најпожељнијих мета терапије рака. 21, 22, 23

У последње време се обично наводи да аутофагија има кључну улогу у различитим људским болестима, пре свега у раку. 24, 25 Као веома важан физиолошки процес ћелија рака, аутофагија је укључена у ћелијски циклус, раст ћелије, инвазију ћелија и метастазе. 26, 27, 28, 29 Открили смо да је миР-18а-5п као аутофагија индукована онкогеном у НСЦЛЦ. Што је више потврђена аутофагија у вези са раком, може открити нове стратегије за терапију тумора. ЕГФР је важан фактор који учествује у напредовању НСЦЛЦ-а. 30, 31 ЕГФР утиче на бројне системе који су укључени у онкогенезу. 32 Предложен је као атрактиван и обећавајући циљ за лечење против рака. 33 У нашим случајевима, прекомерна експресија миР-18а је била регулација аутофагије и позитивна корелација са експресијом ЕГФР ин виво .

Укратко, наша студија се фокусирала на механизам миРНА-18а-5п и његов потенцијал као дијагностички биомаркер у НСЦЛЦ. 34 Наши подаци подржали су хипотезу да миР-18а-5п може промовисати канцерогенезу да анти-миРНА може бити потенцијално ново лечење за НСЦЛЦ. Одвојена студија објавила је да миР-18а-5п повећава раст ћелија тумора, 35, 36, 37 што је поткрепио концепт да миР-18а-5п може бити мање специфичан за тумор од осталих миРНА, што га чини поузданијом терапијском стратегијом. 38

Свеукупно, на основу ових резултата закључили смо да миР-18а-5п може потицати рак директним циљањем ИРФ2 (слика 7), а могао би имати и блиску повезаност између сигналног пута п53 и НФ- κ Б (допунска слика С3). 39, 40, 41 Наши налази пружили су потенцијално разумевање механизма како миРНА утичу на онкогенезу карцинома плућа, који би у будућности могли да се користе као лекови за дијагностику и терапијски третман.

Image

Модел који приказује ефекат миР-18а-5п на НСЦЛЦ. МиР-18а-5п потиче онкогену функцију у НСЦЛЦ путем смањивања ИРФ2. Прекомерна експресија миР-18а-5п значајно је индуцирала аутофагију и позитивну корелацију са нивоима ЕГФР-а

Слика пуне величине

материјали и методе

Ћелијска култура

Линија ћелија људског епитела плућа БЕАС-2Б и хумана НСЦЛЦ ћелијска линија А549 добијени су из ћелије ћелија, Кинеска академија наука (Шангај, Кина). Х23, Х1299 и Х1650 ћелијске линије су добијене из Америчке колекције култура типова (АТЦЦ, Манассас, ВА, УСА). Све ћелије А549 култивисане су у медијуму ДМЕМ (Цорнинг Целлгро, Манассас, ВА, САД) са додатком 10% феталног говеђег серума (ФБС, Гибцо, Гаитхерсбург, МД, САД). Ћелије Х23, Х1299 и Х1650 култивисане су у медијуму РПМИ 1640 (Цорнинг Целлгро) са 10% ФБС-а (Гибцо). БЕАС-2Б ћелије су култивисане у ЛХЦ медијуму (Гибцо) са додатком 10% ФБС (Гибцо). Услови културе за све ћелије били су на 37 ° Ц у влажној атмосфери 5% Ц02.

Узорци ткива

Шездесет и три пара хуманих НСЦЛЦ узорака добивено је из шангајске болнице за прса повезане са шангајским универзитетом Јиао Тонг и уз одобрење етичког одбора шангајске болнице на грудима. Детаљи свих узорака кориштених у овом раду наведени су у Додатној табели С1.

Трансфекција

Ћелије Х23, Х1299 и А549 су пролазно трансфициране мимиком миР-18а-5п, мимиком негативне контроле (НЦ), инхибитором миР-18а-5п, ИРФ2 сиРНА (сиИРФ2) или негативном сиРНА (сиНЦ) (РИБОБИО, Гуангзхоу, Кина) ) коришћењем Инвитроген ™ Липофецтамине 2000 (Лифе Тецхнологиес, ​​Њујорк, САД), према препорукама произвођача. После 24–48 х после трансфекције, ћелије су коришћене за наредне експерименте, укључујући испитивања за пролиферацију и анализу ћелијског циклуса.

Изолација РНА, обрнута транскрипција и квантитативни ПЦР у реалном времену

Укупна РНА је изолована коришћењем Тризол реагенса (Сангон Биотецх, Шангај, Кина) и синтеза цДНА је изведена са СИБР ПримеСцрипт миРНА РТ-ПЦР Кит и ПримеСцрипт РТ Мастер Мик (Такара Биотецх, Отсу, Јапан), следећи упутства произвођача за сваки реагенс или кит. Анализа миРНА и мРНА помоћу кРТ-ПЦР коришћењем СИБР ГреенИИ (Такара Биотецх) изведена је према протоколу произвођача, са ЦФКС96 ТМ системом у реалном времену (Био-Рад, Калифорнија, САД). Релативна квантификација миР-18а-5п добијена је нормализацијом до нивоа експресије У6, а релативно квантификовање ИРФ2 добијено је нормализацијом до 18 нивоа експресије С рРНА. Нивои експресије мРНА и миРНА су одређени методом 2 -ΔΔЦт за релативно квантификацију експресије гена. ΔЦт и ΔΔЦт израчунати су користећи следеће формуле: ΔЦт = Цт миР-18а-5п - Цт У6 или Цт ИРФ2 - Цт 18С и ΔΔЦт = ΔЦт случај - ΔЦт контрола .

Изградња вектора рекомбинантне експресије

Укратко, секвенца при-миР-18а је дигестирана са БамХ И и Ксхол И, затим је клонирана у пЛенти вектор (Инвитроген, Царлсбад, ЦА, САД) и названа пЛенти-миР-18а. ЦДС секвенце ИРФ2 су клониране у пцДНА3.1 (-) плазмид, формирајући пцДНА3.1-ИРФ2. Секвенце прајмера коришћене у овом истраживању приказане су у Додатној табели 2.

Анализа ћелијске пролиферације

Пролиферација ћелија мерена је тестним китом ЦЦК-8 (Дојиндо, Токио, Јапан). Шест сати након трансфекције, ћелије су стављене у микроплочу са 96 јажица (Цорнинг Инцорпоратед, Нев Иорк, УСА) и инкубиране на 37 ° Ц у 5% ЦО2. Свака тачка података представља мерење три поновљена бушотина. Након 24, 48 и 72 х културе, 8 μл раствор ЦЦК-8 је додато у сваку јажицу са 100 μл медијума без серума, а затим је инкубиран током 90 мин. Коначно, апсорбанција је измерена на 450 нм коришћењем мултифункционалног ензимски везаног анализатора, ФЛк8 (БиоТек, Вермонт, САД).

Тест ћелијске апоптозе

После 48 сати трансфекције, ћелије Х23, Х1299 и А549 су сакупљене за испитивање. У складу са упутствима произвођача коришћен је прилог за детекцију апоптозе В-флуоресцеина изотиоцијаната (ФИТЦ) (БД Пхарминген, Сан Дијего, Калифорнија, САД) да би се одредио ниво апоптозе ћелија. Апоптотске ћелије су анализиране коришћењем МоФло КСДП проточног цитометра (Бецкман Цоултер, Инц., Бреа, ЦА, УСА).

Тест ћелије миграције

Миграција ћелија Х23, Х1299 и А549 ин витро тестирана је коришћењем Трансвелл коморе (Цорнинг Инцорпоратед, Нев Иорк, УСА) са поликарбоничном мембраном (величине поре 8 μм). Након 24 сата трансфекције, 1 × 105 ћелија је додато у горњу комору са 100 μл медијума без серума, а 600 μл медијума са 10% ФБС је додато у доњу комору. Ћелије су култивисане током 24 сата на 37 ° Ц. Затим су коморе два пута испране од ПБС-а. На крају пребројите број ћелије након бојења кристално љубичастом бојом.

За испитивање зарастања рана, трансфициране ћелије су сејане у 24 јажице и култивисане до 100%. Затим је стерилним врхом пипете направљен ране са једном огреботином у средини лежишта. Станични остаци су уклоњени испирањем са ПБС, а ћелијама је остављено да расту у медијуму без серума. Удаљеност миграције ћелија процењена је и фотографирана 24 часа микроскопом (Никон, Токио, Јапан).

Двоструки тест луциферазе

Конструкција луциферазе ИРФ2 ВТ 3'-УТР кријесница (пГЛ3-ИРФ2 ВТ 3'-УТР) је генерисана уметањем фрагмента од 1502 бп до 1775 бп људског ИРФ2 3'-УТР у Ксба И / Ецо РИ локације пГЛ3 вектор извештаја луциферазе. Конструкција пГЛ3-ИРФ2 мут 3'-УТР генерисана је мутацијом комплементарне семенске секвенце везивања миР-18а-5п региона. ХЕК293Т ћелије су трансфектиране са 150 нг пГЛ3-ИРФ2 ВТ 3'-УТР или пГЛ3-ИРФ2 мут 3'-УТР луциферазе репортер, и 15 нг ренилла луциферазе репортер (пРЛ), и коначна концентрација 100 н М миРНА НЦ или миР-18а-5п опонаша коришћењем Инвитроген ™ Липофецтамине 2000 (Лифе Тецхнологиес). Ћелије се инкубирају током 48 сати, а активност луциферазе се тестира Орион ИИ микроплочинским илуминометром (Титертек-Бертхолд, Јужни Сан Франциско, Калифорнија, САД) према упутствима произвођача. Јединице луциферазе Фирефли су нормализоване у односу на јединице луциферазе Ренилла да би се контролирала ефикасност трансфекције. Релативне активности изражене су као промена активности луциферазе.

Вестерн блот анализа

Укупни протеин је екстрахован коришћењем РИПА пуфера за лизирање (ЦВБИО, Пекинг, Кина) и квантификован Брадфорд тестом. 42 Једнаке количине протеина из сваког узорка подвргнуте су СДС-ПАГЕ електрофорези и пребачене су на поливинилиден флуоридну мембрану (Миллипоре Цорпоратион, Биллерица, МА, САД). Мембрана је затим натопљена физиолошком отопином пуферираном трисом са Твеен-20 (ТБСТ, 150 м М НаЦл, 20 м М Трис-ХЦл пХ 8, 0, 0, 05% Твеен-20) који садржи 5% говеђег серумског албумина током 1 сата на собној температури, праћено њежним мућкањем и накнадном инкубацијом са специфичним антителом против ИРФ2 или П- актина (1: 1000, Целл Сигналинг Тецхнологи, Данверс, МА, УСА) на 4 ° Ц током ноћи. Након тога, мембрана је испрана и инкубирана 1 х на собној температури са секундарним антителом повезаним са хромом пероксидазом (ХРП) (1: 10000, Санта Цруз Биотецхнологи, Санта Цруз, ЦА, САД). Појас протеина је детектован помоћу хемилуминисцентног ХРП супстрата (Миллипоре Цорпоратион) и анализиран помоћу Имаге Лаб софтвера за анализу (Био-Рад). ИРФ2 је нормализован на П- актин и изражен је у проценту од контроле.

Изградња и инфекција Лентивируса

пЛенти-миР-18а или пЛенти вектор је кофефициран у ХЕК293Т са псПАКС2 и пМД2Г. Вирусне честице су сакупљене 48 х и 72 х касније, центрифугиране су их заједно при 4000 рпм током 5 мин на 4 °, а затим филтриране кроз 0, 45 μм филтере. Ћелије су трансфициране пЛенти-миР-18а или пЛенти и сортиране за зелену флуоресценцију проточном цитометријом.

Анализе аутофагије конфокалном микроскопијом

Четрдесет осам сати након инфекције миР-18а-5п мимиком и пГТЛВ-ЕГФП-мРФП-ЛЦ3 вирусом пребројили су укупни број трансфицираних ћелија у тачки ГФП-ЛЦ3. Ћелије посматране под конфекционом микроскопом за ласерско скенирање (Оццулт Интернатионал Лтд, Немачка) бројале су број позитивних ћелија ГФП-ЛЦ3.

Теста тумора ксенографта / метастатски тест ин виво

Шест недеља старе женке голе мишеве купљене су у лабораторијском центру за животиње СЛРЦ (Шангај, Кина). Животиње су смештене насумично у две групе, а сваком голим мишевима убризгано је супкутано у десни бок са 1 милион А549 ћелија стабилно прекомерно експримирајућим миР-18а (пЛенти-миР-18а) или контролним (пЛенти) у 100 μл медијуму ДМЕМ за успостављање модел ксеноплафта поткожног тумора. Тумори су мерени седмично калибарима, а запремина тумора је израчуната као формула: запремина = дужина × ширина 2/2. Милион ћелија у 100 µл ДМЕМ медијума убризгано је у репну вену, а 7 недеља касније мишеви су убијени и изолована су плућна ткива. Процена тежине плућног ткива коришћена је за квантификацију метастаза. Ткива плућа подвргнута су серијском пресеку и обојењу хематоксилином и еозином. Патолошке промене примећене су под светлосним микроскопом (Никон, Токио, Јапан). Сви експериментални протоколи одобрени су од стране Институционалног одбора за бригу и употребу животиња Универзитета у Шангају (Шангај, Кина). Животиње коришћене у овом истраживању су хумано третиране.

Имунохистохемија

Раст тумора процењен је имунохистохемијским бојењем Ки-67, Е-кадхерина и ЛЦ3-ИИ. Биопсије тумора су фиксиране формалином, уграђене у парафин и исечене на одсеке од око 4 μм. Затим су узорци депарафинисани и дехидрирани ксилоном и степеним алкохолима, а потом рехидрирани деминерализираном водом. Имунохистохемија је изведена коришћењем микроталасне предходне обраде клизача за проналазак антигена. Примењена су примарна антитела против Ки-67, Е-кадхерина и ЛЦ3-ИИ (1: 500, технологија ћелијског сигнализације), заједно са антитијем коњугираним козјим анти-зечјим ХРП, а протеини су визуелно приказани ин ситу са 3, 3'- раствор диаминобензидин реакција.

Статистичка анализа

Статистичке анализе су извршене коришћењем софтвера СПСС в.19.0, а презентације графова завршене су коришћењем ГрапхПад Присм 5 софтвера. Резултати су представљени као средња вредност ± СЕМ, а разлика између две експерименталне групе процењена је коришћењем Студент-овог т- теста, са статистичком сигнификантношћу дефинисаном као П <0, 05.

Додатне информације

Ворд документи

  1. 1.

    Допунске слике легенде

  2. 2

    Допунска табела 1

  3. 3.

    Додатна табела 2

Датотеке слика

  1. 1.

    Допунска слика 1

  2. 2

    Допунска слика 2

  3. 3.

    Допунска слика 3

    Додатне информације прате овај рад на веб локацији Целл Деатх анд Дисеасе (//ввв.натуре.цом/цддис)