Мир455 је повезан са сигнализацијом хипоксије и дерегулиран је у прееклампсији | ћелијска смрт и болест

Мир455 је повезан са сигнализацијом хипоксије и дерегулиран је у прееклампсији | ћелијска смрт и болест

Anonim

Субјекти

  • Биомаркери
  • Ћелијска сигнализација
  • миРНА
  • Прееклампсија

Апстрактан

Прееклампсија је озбиљан поремећај повезан с трудноћом и водећи узрок смртности мајки и плода у свету. Стога је рана идентификација пацијената са повећаним ризиком за прееклампсију један од најважнијих циљева у акушерству. Овде идентификујемо два повезана људска микроРНА као потенцијални биомаркер за откривање трудноће у ризику. Доказано је да су миР455-3П и миР455-5П значајно смањени у плаценти код пацијената са прееклампсијом, док остали микроРНА специфични за плаценту остају нетакнути. предвиђање и валидација микроРНК открила је потенцијалну везу миР455-3П са сигнализацијом хипоксије. Заједно са нашим запажањем да су нивои експресије миР455-3П и миР455-5П регулисани током диференцијације трофобласта, наши резултати сугерирају модел у којем миР455-3П потискује одговор хипоксије који би у супротном могао спречити диференцијацију цитотрофобласта од синцтиотрофобласта. Укратко, наш рад открива сигнализацију аберантне хипоксије у прееклампсији која се може објаснити дерегулираном експресијом миР455. Како је пронађено да се миР455 налази у циркулирајућој крви, могуће је развити неинвазивне пренаталне тестове који омогућавају рану дијагнозу прееклампсије.

Главни

Постељица повезује плод у развоју са стијенком материце и омогућава размену гасова, уношење храњивих материја и елиминацију отпадних производа преко мајчине крви. Штавише, постељица има ендокрино деловање, производећи различите хормоне повезане са трудноћом и фактори раста који регулишу раст фетуса и мајчин одговор на трудноћу. 1 Аберантна функција или развој плаценте повезан је са многим компликацијама трудноће, укључујући прееклампсију (ПЕ). ПЕ је мултисистемски поремећај повезан са трудноћом са инциденцијом од 2–5%, што је главни узрок морбидитета и смртности мајки и плода. 2 Иако тачна етиологија ПЕ остаје нејасна, плацента има централну улогу. 3 У првом и другом тромесечју, локалне апсорптивне имунолошке интеракције фето-мајке унутар стијенке материце доводе до оштећења инвазије артеријских зидова од стране ћелија трофобласта. Ово доводи до неуспеле трансформације спиралних артерија материце и касније смањене перфузије плаценте. 3 Хронична хипоксија или алтернативни периоди хипоксије / реоксигенације унутар интервиллозног простора покрећу ткивно оксидативни стрес и повећавају апоптозу и некрозу плаценте. 4 Након тога, крхотине постељице и абберантна експресија про-упалних, антиангиогених и ангиогених фактора доводе до системске дисфункције ендотелних ћелија и до претјераног упалног одговора. 5, 6, 7, 8, 9 Занимљиво је да се честице које исијавају на површини плаценте пуштају у мајчину циркулацију, а њихов садржај, ДНК, као и микроРНА (миРНА), могу послужити као неинвазивни биомаркери за поремећаје у вези са трудноћом. 10, 11

МикроРНА су велика породица пост-транскрипцијских регулатора експресије гена, дужине око 21 нуклеотида (нт), који контролишу многе развојне и ћелијске процесе у еукариотским организмима. МикроРНА се обрађују из молекула прекурсора (при-миРНА), који су или преписани из независних миРНА гена или представљају интроне гена који кодирају протеине. При-микроРНА се пресавијају у чепове за косу које се нуклеарним РНАза ИИИ ензимом Дросха секвенцијално обрађује у пре-миРНА од н 70 нт. Након извоза у цитоплазму, пре-миРНА се даље обрађује Дицер-ом до дуплекса са 21-бп миРНА / миРНА *. Један прамен овог дуплекса, који представља зрелу миРНК, је тада инкорпориран у миРНА-индуковани пригушивачки комплекс (миРИСЦ). 12. За многе миРНА гене, једна зрела миРНА изведена из 5 'или 3' крака пре-миРНА длаке је пожељно уграђена у миРИСЦ. Међутим, око 10–15% миРНА гена изражава обе зреле миРНА. Они се напомињу помоћу суфикса -5п и -3п. 13, 14, 15

Као део миРИСЦ-а, зрели миРНА-ови базни пар са секвенцама у 3'-УТР циљне мРНА и усмеравају њихову транслацијску репресију и / или мртвачење и деградацију мРНА. Такође је предложено 12 микроРНА да циљају кодирајућу секвенцу неких мРНА као и 5'УТР мРНА која кодира рибосомални протеин, што доводи до инхибиције или активације циљева. 16, 17 Већина животињских миРНА несавршено базираних парова са циљаним мРНА. Ипак, ефикасно циљање мРНА захтева континуирано упаривање базе миРНА семенске секвенце (нт 2-8). 18 Пошто је комплементарност опсежнија од спаривања семена код животиња необична, предвиђање рачунања мРНА за миРНА је и даље изазов. Без обзира на то, развијено је неколико рачунарских алата за предвиђање потенцијалних циљева миРНА. 18

Профилирање експресије миРНА открило је да се неке миРНА испољавају универзално, а друге специфично. 19 Акумулациони докази показују да су миРНА често дерегулиране у људским малигнитетима и да могу деловати као онкогени или гени-супресори тумора. 20, 21 У хуманој постељици два велика кластера миРНА гена су кодирана на хромозому 14 (Ц14МЦ) и хромозому 19 (Ц19МЦ). 22, 23 Занимљиво је да је експресија одређених миРНА специфичних за плаценту дерегулирана у ткивима рака, мада су њихове функционалне улоге остале недостижне. 23, 24 Неколико миРНА специфичних за плаценту су повезане са поремећајима плаценте као што је ПЕ. 25 На пример, неколико студија је открило да је миРНА миР210 у плаценти повећана код пацијената са ПЕ. 26, 27, 28, 29, 30 Међутим, већина ових студија била је ограничена недостатком узорака плаценте потребним за експресију миРНА, њиховом хетерогеношћу и / или малим бројем проучених миРНА. 26, 30 Дакле, није јасно у којој се мери миРНА осим миР210 различито изражавају код пацијената са ПЕ.

Трофобласти су специјализоване ћелије плаценте које имају важну улогу у имплантацији ембриона и интеракцији са мајчином матерницом. Два различита путања диференцијације трофобласта доводе до развоја плаценте. 31 Екстраливним путем ћелије се диференцирају или у интерстицијске екстратилне трофобласте који упадају у децидуа и део миометријума, или у ендоваскуларне екструИЛозне трофобласте који преуређују матичне судове. На вилусном путу ћелије цитотрофобласта (ЦТ) спајају се у вишеједрни слој синцтиотрофобласта (СЦТ) који покрива целокупну површину плаценте. 31 Овај синцицијум је у директном контакту са мајчином крвљу и на тај начин олакшава размену хранљивих материја, отпада и гасова између система мајке и фетуса. Предложено је да дефектна диференцијација од ЦТ до СЦТ буде укључена у етиологију ПЕ. 32

Да бисмо проучавали експресију миРНА током диференцијације вилусног трофобласта, користили смо утврђени ин витро модел који рекапитулира диференцијацију ЦТ ћелија у СЦТ и профилисану експресију миРНА следећом генерацијом секвенција малих РНА. Ова анализа открила је два сродна миРНА (миР455-5П / -3П) која су репродуктивно регулисана након ЦТ и СЦТ диференцијације. Резултати анализе предвиђања и валидације показују да миР455-3П обуздава хипоксијски одговор који би у супротном спречио диференцијацију ЦТ-а и СЦТ-а. Оно што је важно, открили смо да је експресија миР455 значајно смањена у 15 случајева ПЕ у поређењу са 14 здравих давалачких контрола, док нивои осталих миРНА специфичних за плаценту остају непромењени. Стога су миРНА миР455 потенцијални биомаркери за рану дијагностику трудноће у ризику.

Резултати

Ин витро реконституција цитотрофобласта до диференцијације синцитиротроблабласта

Пошто је постељица сложен и хетероген орган, детаљно молекуларно проучавање механизама који стоје у основи биологије плаценте је врло изазовно, ако не и немогуће. Због тога је употреба одговарајућих ћелијских модела повољна. Да бисмо проучавали миРНА током диференцијације ћелија вилусног трофобласта, искористили смо успостављену ћелијску линију сличну ЦТ (БеВо). Показано је да су ћелије БеВо синцитизоване након лечења форсколином (ФСК), активатором аденилата циклазе и цикличним индуктором АМП (слика 1а). 33 Заиста, бојење контролно третираних ћелија са ДАПИ заједно са антителом које препознаје маркер плазма мембране Е-кадхерин потврдило је да су БеВо ћелије мононулиране. Међутим, третман са 10 µМ ФСК је подстакао формирање вишеједричастих ћелија, показујући тако формирање СЦТ (слика 1б).

Image

миР455 се индукује ин витро синцитијализацијом. ( а ) Шематски дијаграм диференцијације цито- (ЦТ) до синцтиотрофобласта (СЦТ). ( б ) Фузија БеВо ћелија после третмана ФСК. Ћелије су фиксиране и имуно обојене коришћењем антитела анти-Е-кадхерина (зелено). Нуклеи су супротстављени ДАПИ (плави). Леви панел: БеВо ћелије су третиране вехиклом (ДМСО) 48 х и остале су као мононулиране (ЦТ) ћелије. Десни панел: ћелије су почеле да се фузују након 48 х ФСК третмана, стварајући вишеједрне (СЦТ) ћелије (бела стрелица). Линија скале, 100 µм ( ц ) Изражавање СЦТ маркера. РНК је екстрахована у различитим временским тачкама после ФСК третмана. нивои мРНА три гена специфична за СЦТ су мерени помоћу кРТ-ПЦР. Подаци су нормализовани на РПЛП0 мРНА и упоређени са контролним третманима (средња вредност ± СЕМ за три независна експеримента). ( д ) индукција миР455 у СЦТ у односу на ЦТ. Након 48 х контролног или ФСК третмана, екстрахирана је укупна РНА, а мале РНА подвргнуте секвенцирању са високом пропусношћу. Нормализовани нивои миРНА контролних ћелија и ФСК-третираних ћелија приказани су као лог 2 скала на к и и осе. Свака миРНА представљена је крстом. Дерегулиране миРНА миРНА означене су црвеним крстовима. Приказани су резултати једног репрезентативног биолошког реплика. ( е и ф ) индукција пресађивања миР455-3П (Е) и -5П (Ф) након 48 х ФСК третмана одређена је малим секвенцирањем РНА или кРТ-ПЦР (средња вредност ± СЕМ од четири и три независна експеримента, респективно) . ( г ) Структура укосница транскрипта пре-миР455 прекурсора. ( х ) Анализа експресије при-миР455, миР455 и домаћина гена ЦОЛ27А1 . РНК је екстрахована у назначеним временским тачкама после ФСК третмана и анализирана кРТ-ПЦР коришћењем ТакМан тестова. Подаци су нормализовани на У6 сНРНА или РПЛП0 мРНА и упоређени са контролним третманима (средња вредност ± СЕМ три независна експеримента)

Слика пуне величине

Да бисмо даље потврдили прелаз ЦТ у СЦТ након третмана ФСК-ом, пратили смо експресију гена индукованих током синцитијализације коришћењем квантитативне РТ-ПЦР. Бета хорионски гонадотропин хормон (ЦГБ) је маркер формирања СЦТ-а. 34 ФСК третман је постепено повећавао ниво ЦГБ мРНА до максимума након 60 х. Слично томе, експресија ЕРВФРД-1 и МФСД2А је снажно индуцирана након ФСК третмана (слика 1ц). ЕРВФРД-1 је ендогени ретровирусни ген који кодира за синцитин2 протеин, а МФСД2А кодира за синцитин2 рецептор. Оба протеина су неопходна за синцитијализацију. 33, 35 Ови резултати потврђују ефикасну индукцију синцитијализације након третмана ФСК-ом и потврђују БеВо ћелије као погодан модел за проучавање диференцијације ЦТ-СЦТ.

миР455 се различито изражава током синцитијализације

Да бисмо истражили да ли процес синцитијализације прате промене у експресији миРНА, изолирали смо мале РНА из четири независна експериментација диференцијације ин витро и створили библиотеке за секвенцијално осветљење. Након обраде података о секвенцирању и филтрирања за миРНА означене у миРБасе (//ввв.мирбасе.орг/), упоредили смо профиле експресије миРНА за различите биолошке реплике. Експресија микроРНА била је високо повезана између све четири биолошке реплике, и за ћелије третиране контролном и ФСК (допунска слика 1). Потврђујући трофобластично порекло БеВо ћелијске линије, открили смо да је 50% свих миРНА секвенционисаних из ћелија третираних контролним или ФСК-ом изведених из кластера хромозома-19-миРНА (Ц19МЦ) (Додатна табела С1). Ц19МЦ кодира за 59 миРНА које се експримирају углавном у хуманој плаценти. 23 Поређење експресије Ц19МЦ у ћелијама третираним ФСК-ом у односу на контролно ћелије није показало значајну разлику у експресији ових миРНА специфичних за плаценту (допунска табела С1). Поред тога, укупни профили експресије миРНА били су изузетно слични у узорцима третираним ФСК-ом и контролним узорцима (слика 1д и допунска слика 1). Међутим, повишени нивои миРНА миР455-3П и миР455-5П доследно су примећени у ћелијама третираним ФСК-ом. Да бисмо потврдили ово запажање, процијенили смо миР455-3П и миР455-5П експресију кРТ-ПЦР користећи валидиране тестове ТакМан. У складу са малим подацима о секвенцирању РНА, нивои миР455-3П и миР455-5П су побољшани ца. петоструко када су ћелије третиране ФСК током 48 х (слике 1е и ф).

Зрели миРНА миР455-3П и миР455-5П потичу од пре-миРНА шишке кодиране у интрону 10 колагена гена ЦОЛ27А1 (слика 1 г и допунска слика 2). Дакле, повишени нивои две зреле миРНА могу бити резултат повећане транскрипције ЦОЛ27А1 гена домаћина. У складу са тим, приметили смо снажно повећање нивоа мРНА ЦОЛ27А1 након ФСК третмана БеВо ћелија. Нивои мРНА ЦОЛ27А1 били су највиши 24 сата након третмана ФСК-ом и постепено опадали (Слика 1х). Оно што је важно, приметили смо врло сличан профил експресије за транс-транскрипт при-миР455 након третмана ФСК-ом, иако није тако висок као максимални ниво мРНА ЦОЛ27А1 (слика 1х). Поред тога, пораст зрелих миРНА миР455-3П и миР455-5П догодио се касније него транскрипт прецурсора при-миР455. Приметили смо максимално повећање зрелих миР455 ца. 48 х након лечења ФСК-ом, упоредо са падом при-миР455 (Слика 1х). Ови резултати показују да третирање БеВо ћелија са ФСК стимулише експресију ЦОЛ27А1 гена и на тај начин доводи до повећане производње при-миР455. Стога, иако се не може искључити повећана обрада прекурсора или стабилност миРНА, посматрано повишење зрелог миР455 након ФСК третмана БеВо ћелија може се приписати повећаној експресији ЦОЛ27А1 гена.

Дерегулација миР455 у плацентама код пацијената са ПЕ

Предложено је да ПЕ укључује неправилно разликовање од ЦТ до СЦТ. 32 Да бисмо истражили да ли је миР455 изражен у плаценти и потенцијално погрешно регулисан у ПЕ, прикупили смо узорке плаценте из 15 случајева ПЕ и 14 здравих донорских контрола. Главне клиничке карактеристике пацијената приказане су у Табели 1. Примерено да се доб две мајке, индекс телесне масе и проценат нуллипарности нису значајно разликовале између две групе пацијената. Међутим, пацијенти са ПЕ показали су тенденцију ка интраутерином успоравању раста, повећању крвног притиска (систоличког и дијастоличког) и протеинурији, и родили су у просеку 4 недеље раније од контролне групе. Плаценте су сециране са стабла вилуса одмах након порођаја. Да бисмо надокнадили интра-плаценталну варијабилност, екстрахирали смо укупну РНК од 3–4 независна узорка по плаценти (слика 2а), дајући укупно најмање 45 ПЕ и 42 контролних узорака РНА.

Табела пуне величине

Image

миР455 и миР210 се дерегулишу у плацентама прееклампсије (ПЕ). ( а ) Шематски дијаграм обраде плаценте. Око 3–4 комада (црвена кутија) сецирани су из унутрашњег дела сваке постељице (Кс) да би се ограничила контаминација мајке. Укупна РНА је екстрахована из сваког дела плаценте (Кс.1 до Ксн) и нивои експресије миРНА мерени у три техничке копије помоћу кРТ-ПЦР коришћењем ТакМан тестова. ( б ) Експресија У6 снРНА у ПЕ и контролним (Цтрл) плацентама. Ниви У6 снРНА су мерени помоћу ТакМан кРТ-ПЦР. Вредност прага циклуса (Цт) добијена за У6 снРНА приказана је као графичка кутија шапама 5.-95. П- вредност је израчуната Манн-Вхитнеи тестом. ( ц ) миРНА изражена у плаценти. Експресија шест одабраних миРНА је одређена помоћу ТакМан кРТ-ПЦР у контролним плацентама. За сваку миРНА, експресија се нормализовала на У6 снРНА и цртала на лог2 скали коришћењем сликовног оквира вискија 5-95. ( д ) МикроРНА која се не контролишу различито у односу на ПЕ плаценте. ( е ) нивои миР-210 су већи у ПЕ у односу на контролне плаценте. ( ф ) Ниво миР-455 је нижи у ПЕ у односу на контролне плаценте. ( д – ф ): П- вредности су израчунате Манн-Вхитнеи тестом

Слика пуне величине

кРТ-ПЦР анализа открила је да се нивои експресије У6 мале нуклеарне РНА (снРНА) нису значајно разликовали између две групе пацијената (Слика 2б). Даље валидирајући квалитет наших узорака, открили смо миР526Б, миР518Б и миР517А, три репрезентативна миРНА кодирана у Ц19МЦ специфичним за плаценту, као и миР210, миРНА за коју је претходно показано да се у плаценту увећава код пацијената са ПЕ, 26, 27, 28 (Слика 2ц). Важно је да смо такође открили миР455-3П и миР455-5П, који су обојице обилнији од У6 снРНА и миР210 у контролним РНА узорцима (слика 2ц).

Поређење обиља миРНА у узорцима из две групе пацијената није показало значајне разлике у миР526Б, миР518Б или миР517А, показујући да експресија Ц19МЦ није значајно утицала на пацијенте са ПЕ (слика 2д). Међутим, миР210 је значајно регулиран у плаценти код пацијената са ПЕ (слика 2е), у складу са претходним извештајима. 26, 27, 28, 29, 30, 36, 37 Насупрот томе, нивои миР455-3П и миР455-5П били су значајно нижи у ПЕ него у контролним узорцима (слика 2ф).

Укратко, зрели миРНА миР455-3П и миР455-5П су изражени у људској плаценти. Док на експресију миРНА из Ц19МЦ за плаценту није утицао, ниво миРНА миР455 је био значајно нижи у плаценти у односу на контролне болеснике. Супротно томе, миР210 је био обилнији у узорцима ПЕ.

миР455 миРНА су део функционалног миРИСЦ-а

Као део миРИСЦ-а, зрели миРНАс базни пар циљају мРНА и усмеравају њихову репресију. Пошто су миР455-3П и миР455-5П релативно обилна и у узорцима ћелија БеВо и у постељици, они могу имати важну улогу у регулисању путева релевантних за физиологију плаценте. Да бисмо тестирали да ли су миР455-3П и миР455-5П део функционалног миРИСЦ-а и да верификујемо предвиђене циљеве миР455, усвојили смо двоструки тест новинарских активности на основу луциферазе. 38 Овај тест садржи вектор експресије сисара који кодира репортерске гене ренилла луциферазе (РЛ) и луциферазне лептирице (ФЛ). РЛ репортерски ген се спаја са претпостављеном циљном секвенцом миРНА и тако надгледа активност миРНА. ФЛ репортерски ген користи се као контрола нормализације (слика 3а).

Image

миР455 је део функционалног миРИСЦ-а у БеВо ћелијама. ( а ) Схема двоструког теста луциферазе коришћене у овој студији. Тачне комплементарне секвенце миР455-3 П и -5П, или 3'УТР осам потенцијалних циљних гена миР455, клониране су 3 'ренилла луциферазом (РЛ) ОРФ (горње траке). Наведени су положаји потенцијалних места везивања миР455-3П (црвена) или миР455-5П (плава). БеВо ћелије су трансфициране и третиране током 48 х било ФСК (висок ниво миР455), било ДМСО (низак ниво миР455). ( б ) ФСК нема утицаја на експресију ренила луциферазе. Вектор без циљних секвенци клонираних 3 'ренила је трансфектиран у БеВо ћелије. Након 48 х третмана, ћелије су лизиране и мерене су РЛ и ФЛ активности. РЛ / ФЛ односи су израчунати за ћелије третиране са ДМСО- и ФСК. П- вредности су израчунате непараметарским Т- тестом. ( ц и д ) Вектори са миР455-3П или -5П циљаним секвенцама клонирани 3 'ренила су трансфицирани у БеВо ћелије. РЛ / ФЛ односи су израчунати за ћелије третиране са ДМСО- и ФСК. П- вредности су израчунате непараметарским Т- тестом. ( е и ф ) 3'УТР од осам потенцијалних мета миР455 су клонирани у дуални плазмид луциферазе. Дан након трансфекције, ћелије су третиране 48 х ФСК или ДМСО. РЛ / ФЛ односи су израчунати за ћелије третиране са ДМСО- и ФСК. Процентуална репресија за одговарајуће извештаче за миРНА израчуната је нормализацијом омјера РЛ / ФЛ након ФСК третмана у РЛ / ФЛ дијелове након контролног третмана. П- вредности су израчунате непараметарским Т- тестом

Слика пуне величине

Прво смо трансфицирали БеВо ћелије са репортерски плазмидом који недостаје миРНА циљане секвенце. После трансфекције, ћелије су третиране или ДМСО или ФСК да би се индуцирала синцитизација. Приметили смо омјере активности РЛ / ФЛ који се нису значајно разликовали у ћелијама третираним контролним и ФСК, показујући да на активност луциферазе не утиче процес синцитилизације или третман ФСК сам по себи , у недостатку миР455 циљне секвенце (Слика 3б ). Међутим, РЛ активност је значајно смањена лечењем ФСК када је РЛ репортер спојен у комплементарну циљну секвенцу миР455-3П (Слика 3ц). Слично томе, РЛ спојен са комплементарном циљном секвенцом миР455-5П је потиснут након ФСК третмана (слика 3д). Ови резултати показују да су обе миР455 миРНА део функционалног миРИСЦ у БеВо ћелијама и да тест миРНА активности поуздано извештава активност миР455-РИСЦ.

МУЦ1 мРНА је физиолошка мета миР455-3П

Да бисмо идентификовали потенцијалне миР455 циљане мРНА, користили смо софтвер ми предвиђање миРНА миРецордс. 39 Састављајући спискове потенцијалних мета за миР455-3П и -5П, приметили смо најмање осам гена који су повезани са сигнализацијом хипоксије (Слика 3а). Ово је изазвало наше интересовање јер је експресија миР210 подстакнута факторима индуцираним хипоксијом (ХИФ), 40, 41, 42 што сугерише потенцијалну повезаност хипоксије између три миРНА за које смо открили да се различито изражавају у узорцима ПЕ.

Да бисмо потврдили предвиђене миР455-3П и -5П циљане мРНА, прво смо урадили репортери двоструке луциферазе миРНА у БеВо ћелијама. Спојили смо комплетне 3'УТР-ове предвиђених мРНА-а са извештачем РЛ-а и тестирали репресију која је посредована миР455 у ФСК-у насупрот условима контроле (Слика 3а). За разлику од РЛ извештача спојеног на комплементарно вежуће место миР455 (слике 3ц и д), ФСК третман није резултирао значајном репресијом РЛ када је спојен на 3 'УТР било ЦУЛ3, ЕИД1, СИРТ1, или СТЕАП3 (Слике 3е и ф). Међутим, 3'УТР-ови ЕГЛН2, МУЦ1, ФИХ1 или АРНТ су произвели значајну репресију РЛ-а након третмана ФСК-ом (слике 3е и ф). Ови резултати потврђују предвиђена места везивања миР455-5П у 3'УТР АРНТ-а и места везивања миР455-3П у 3'УТР ЕГЛН2, МУЦ1 и ФИХ1.

Да бисмо тестирали да ли су ендогене мРНА ендогених ЕГЛН2, МУЦ1, ФИХ1 и АРНТ под негативном контролом миРНА миР455, процијенили смо ниво мРНА и протеина помоћу кРТ-ПЦР и западног блотирања. За ЕГЛН2 и АРНТ, ниво мРНА и протеина нису се значајно променили након ФСК третмана БеВо ћелија (слика 4а и допунска слика 3). ФИХ1 је био само мало потиснут (слика 4а и додатна слика 3). Супротно томе, МУЦ1 је снажно потиснут и на нивоу мРНА и протеина (слике 4а и б и додатна слика 3). Да потврдимо репресију МУЦ1 мРНА посредовану миР455-3П, независно од третмана ФСК, ми смо трансфицирали БеВо ћелије синтетичким миРНА5 миРНА. Као што се очекивало, нивои мРНА и протеина МУЦ1 су смањени трансфекцијом синтетичких миР455-3П, али не и миР455-5П (Слике 3ц и д). Дакле, закључујемо да је МУЦ1 мРНА доброверна миР455-3П мета која се снажно потискује током ФСК-индуковане синцитилизације БеВо ћелија.

Image

МУЦ1 је доброверна мета од миР455-3П у БеВо ћелијама. ( а ) Експресија потенцијалних миР455 циљаних мРНА у БеВо ћелијама третираним ФСК-ом. Експресија назначених потенцијалних миР455 циљаних мРНА је анализирана помоћу кРТ-ПЦР. Вредности су нормализоване на РПЛП0 и приказане у односу на ћелије третиране са ДМСО. ( б ) Нивои МУЦ1 протеина се смањују ФСК третманом. Нивои МУЦ1 и ТБП протеина анализирани су Вестерн блотингом 48 сати након третмана. ( ц и д ) МУЦ1 је потиснут са миР455-3П, али не и миР455-5П. БеВо ћелије су трансфициране синтетичким миРНА у две концентрације (5 и 20 нМ). Узорци РНК и протеина прикупљени су 48 х након трансфекције. Нивои мРНА мУЦК и протеина одређивани су кРТ-ПЦР ( ц ) и Вестерн блот ( д ). Један западни блот представник трансфекције са 20 нМ синтетичком миРНА представљен је у д . ТБП је служио као контрола оптерећења

Слика пуне величине

миР455-3П ограничава ХИФ2А посредовану сигнализацију хипоксије

МУЦ1 је приписан активирању као и репресивним активностима у сигнализацији хипоксије. 43, 44 У складу са извештајима који описују МУЦ1 као активатор ХИФ-а, открили смо да срушење мРНА посредовано сиРНА резултира смањењем нивоа протеина ХИФ2А (ЕПАС1), али не и обрнуто , постављање активности МУЦ1 узводно од ХИФ2А (Слика 5а и Додатна Слике 4А и Б). ХИФ2А је фактор транскрипције који индукује експресију циљаног гена као одговор на ниску концентрацију кисеоника. 40, 45 Тако, МУЦ1 позитивно утиче на хипоксијске реакције посредоване ХИФ2А у ћелијама БеВо. Интригантно је да је миР210 добро позната мета ХИФ2А 40, 42 и, стога, могло би се очекивати да одговори на МУЦ1 регулацију. Заиста, опазили смо смањене нивое миР210 не само након обарања ХИФ2А, већ и након пада МУЦ1 (слика 5б). Пошто је МУЦ1 потиснут са миР455-3П, миР210 нивои се тако индиректно проверавају миР455-3П (Слика 5ц).

Image

МУЦ1 и ХИФ2А се дерегулишу у ПЕ плацентама. ( а ) МУЦ1 позитивно регулише ХИФ2А. БеВо ћелије су трансфициране сиРНА против ХИФ2А или МУЦ1 мРНА у две концентрације (5 и 20 нМ) и сиРНА Алл Стар Негативе Цонтрол. 48 сати након посттрансфекције, ћелије су сакупљене и узорци протеина анализирани Вестерн блоттингом. ( б ) миР210 је регулисано ХИФ2А и МУЦ1. Ћелије су скупљене 48 х послетрансфекције и миР210 експресија анализирана ТакМан тестима. Вредности су нормализоване у У6 снРНА експресију (средња вредност ± СЕМ за три независна експеримента). ( ц ) Шематски приказ миР455-3 П / миР210 сигналног пута. ( д ) Нивои МУЦ1 и ХИФ2А протеина су регулирани у ПЕ плацентама. Протеини су екстраховани из две контролне и две ПЕ плаценте и анализирани. Вестерн блот-ови су тестирани узастопно антитела која препознају назначене протеине. За МУЦ1 су коришћена два различита антитела. Антитела и молекуларна тежина сваке изоформне протеине МУЦ1 су назначени са леве и десне стране, респективно

Слика пуне величине

Горњи резултати су у складу са миР210 и миР455 нивоима за које смо установили да су негативно корелирани у узорцима плаценте ПЕ и контролних пацијената (слике 2е и ф) и сугерирају да су нивои МУЦ1 и ХИФ2А већи у ПЕ него у контролним узорцима. Као што је раније речено, открили смо да се ХИФ2А изражава у плаценти, али до знатно виших нивоа ПЕ у контролним узорцима (слика 5д). Оно што је важно, такође смо открили виши ниво протеина МУЦ1 у плаценти ПЕ пацијената. У складу са репресијом МУЦ1 мРНА посредованом миРНА, различите МУЦ1 протеинске изоформе повећале су се у истој мери (Слика 5д). Закључно, пацијенти са ПЕ показују активирану ХИФ2А посредовану сигнализацију хипоксије у плаценти, што може бити узроковано дерегулираном експресијом миР455-3П.

Дискусија

ПЕ је озбиљан поремећај повезан са трудноћом у 2–5% трудноћа у случају несреће, али комплицира до 10% трудноћа у земљама у развоју, где је хитна помоћ често неадекватна или јој недостаје. Сходно томе, ПЕ је водећи узрок смртности мајки и фетуса / новорођенчади у свету широм света. Стога је рана идентификација пацијената са повећаним ризиком за ПЕ један од најважнијих циљева у акушерству. Ова студија показује да употреба ћелијских модела може у великој мери допринети постизању овог циља. На основу нашег прелиминарног рада у ћелијској линији културе ткива трофобласта, открили смо измењену експресију трију хуманих миРНА и два протеина у плаценти код пацијената са ПЕ. Механичка испитивања ових фактора наговештавају потенцијално погрешно сигнализирање хипоксије која може допринети патогенези ПЕ. У наставку разматрамо значај наших налаза за физиологију постељице и за развој тестова за дијагнозу трудноће која је изложена ризику.

Претходне студије усмерене на идентификацију неправилне експресије миРНА у плаценти код пацијената са ПЕ откриле су повећани ниво миР210. 26, 27, 28, 29, 30, 36, 37 Наши резултати су у складу са овим налазима и стога потврђују миР210 као робустан биомаркер за ПЕ. Поред миР210, миР455 смо идентификовали као даљу прогностичку миРНА. Важно је да су за разлику од повишених нивоа миР210, миР455-3П и миР455-5П нивои значајно нижи у ПЕ плаценти него у контролним групама. Таква негативна корелација могла би бити повољна за развој дијагностичких тестова. Будући тестови који процењују омјере миР210 / миР455-3П и миР210 / миР455-5П могу предвидјети ПЕ с високом специфичношћу (допунска слика 5). Употреба миРНА као дијагностичких маркера је занимљива из два разлога. Прво се могу развити врло осетљиви РТ-ПЦР тестови. Друго, нуклеинске киселине без ћелија, укључујући миРНА, пронађене су у мајчиној плазми. 46 Изразито, сугерисано је присуство миР455-3П у циркулацијској крви. 47 Дакле, мерење односа миР210 / миР455 у мајчиној плазми може понудити неинвазивни, високо специфични и осетљиви тест ризика од ПЕ у раној трудноћи.

За разлику од већине других миРНА, пре-миР455 укосница ствара две зреле миРНА, миР455-3П и миР455-5П. Ми показујемо да су обе миР455 миРНА део функционалног миРИСЦ-а у БеВо ћелијама, да су релативно обилне у плаценти и да се њихова експресија повећава током ин витро синцитилизације трофобласта. Према томе, две миР455 миРНА вероватно ће бити умешане у регулаторна кола која су важна за развој и физиологију плаценте.

Мало се зна о могућим регулаторним активностима миР455. 48, 49, 50, 51 Док физиолошка циљна мРНА од миР455-5П остаје непозната, идентификовали смо МУЦ1 мРНА као бона фиде миР455-3П циљ. Потврђујући наше резултате, недавно је показано да је МУЦ1 такође регулисан миР455-3П у ћелијама плућа. 52 Занимљиво је да су и плућне ћелије и ћелије трофобласта изложене променљивом окружењу кисеоника и на тај начин могу постојати механизми који делују против флуктуације у напетости кисеоника. 53 Наше откриће да миР455-3П изазива смањење нивоа протеина ХИФ2А индиректно потискивањем МУЦ1 мРНА (слика 5а) снажно указује да миР455-3П може допринети таквом пуферирању.

Недовољна синцитијализација ћелија виллуса ЦТ резултира субоптималном перфузијом плаценте и тиме хроничном хипоксијом, што је карактеристично за ПЕ. У првих 10 недеља гестације, цонцептус се налази у релативно хипоксичној атмосфери 54, 55 и ограничавање активирања хипоксијског одговора, што би могло да спречи синцијализацију, било би од виталног значаја. Стога је могуће да миР455-3П делује као реостат који ограничава хипоксијски одговор који би у супротном могао спречити диференцијацију ЦТ-а и СЦТ-а. Важно је да смањена експресија миР455 у ПЕ узорцима вероватно неће бити само последица ниске напетости кисеоника, јер култивација БеВо ћелија под хипоксичним условима није изазвала значајну промену у експресији миР455 (подаци нису приказани). Стога, експресија миР455 сама по себи може већ бити нередовна, у раној трудноћи ПЕ пацијената и на тај начин допринети патогенези. У том погледу, биће веома интересантно истражити регулацију ЦОЛ27А1 , гена који кодира протеин колагена и који је домаћин миР455 гена.

Закључно, иако је идеја да је смањена експресија миР455 узрочно повезана са развојем ПЕ-а интригантна, очекују се додатни експериментални докази који би подржали овај модел. Ипак, верујемо да треба настојати развити дијагностику користећи миРНА као биомаркере за предвиђање ПЕ, без обзира на даљи механички увид у функцију миР455.

Додатне информације

Екцел датотеке

  1. 1.

    Допунска табела 1

  2. 2

    Додатна табела 2

Ворд документи

  1. 1.

    Додатни подаци

Речник

миРНА

микроРНА

ПЕ

прееклампсија

нт

нуклеотид

при-миРНА

примарна микроРНА

пре-миРНА

прекурсор микроРНА

миРИСЦ

МикроРНА индуковани глухи комплекс

УТР

непревођена регија

Ц14МЦ

хромозом 14 микроРНА кластера

Ц19МЦ

хромозом 19 микроРНА кластера

ЦТ

цитотрофобласт

СЦТ

синцтиотрофобласт

ФСК

форсколин

ДМСО

диметилсулфоксид

ДАПИ

4 ', 6'-диамидино-2-фенилиндол

ЦГБ

бета хорионски хормон гонадотропин

снРНА

мала нуклеарна РНА

РЛ

ренила луцифераза

ФЛ

фирефли луциферасе

х

сати

ХИФ

фактор индуциран хипоксијом

ТБП

ТАТА везујући протеин

Цтрл

контрола

Цт

праг циклуса

РТ-ПЦР

реверзна транскрипција-полимеразна ланчана реакција

Додатне информације прате овај рад на веб локацији Целл Деатх анд Дисеасе (//ввв.натуре.цом/цддис)