Моделирање функционалне геномике аутизма помоћу људских неурона | молекуларна психијатрија

Моделирање функционалне геномике аутизма помоћу људских неурона | молекуларна психијатрија

Anonim

Апстрактан

Људски неуронски потомци из разних извора представљају нове могућности за моделирање аспеката људске неуропсихијатријске болести ин витро . Такви ин витро модели пружају предности људске генетске позадине у комбинацији са брзом и лаком манипулацијом, што их чини врло корисним додацима на животињским моделима. Овде смо испитали да ли се систем културе хуманог неурона може користити за процену транскрипционог програма који је укључен у неуролошку диференцијацију и да се моделирају неке молекуларне карактеристике неуроразвојног поремећаја, попут аутизма. Примарни нормални хумани неуронски потомци (НХНП) диференцирани су у пост-митотичко неуронско стање додавањем специфичних фактора раста и експресија гена целог гена испитивана је током временског трајања диференцијације неурона. Након 4 недеље диференцијације, значајан број гена повезаних са поремећајима спектра аутизма (АСД) или се индукује или потискује. Ово укључује ген осјетљивости на АСД неурексин 1 , који је показао различит узорак од неурексина 3 ин витро , а који смо ин виво потврдили у људском мозгу фетуса. Користећи анализу мрежне анализе коекспресије гена, визуализовали смо мрежну структуру транскрипцијске регулације, показујући овом непристрасном анализом да је значајан број гена-кандидата АСД-а координирано регулисан током процеса диференцијације. Како су НХНП генетски следљиви и манипулисани, они се могу користити за проучавање ефеката мутација у вишеструким АСД генима на диференцијацију неурона и експресију гена у комбинацији са ефектима потенцијалних терапијских молекула. Ови подаци такође пружају корак ка бољем разумевању путова сигнализације поремећених у АСД.

Увод

Генетски напредак у неуропсихијатријским условима човека пружио нам је нови прозор кроз који можемо да почнемо да проучавамо и разумемо ове сложене болести. Можда је то најочитије код поремећаја спектра аутизма (АСД) у којима су недавна истраживања идентификовала бројне релативно ретке моногене узроке АСД, као и неке уобичајене варијанте повезане са болешћу. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Ове студије су откриле да је аутизам, као и други неуроразвојни поремећаји генетски врло хетероген, укључује много потенцијалних мутацијских механизама и потенцијално различите молекуларне путеве. 2, 4, 8

Иако се ова сложеност у почетку може чинити застрашујућом, студија моногених гена ризика од АСД показала се као важна за разумевање основне биологије ових гена током развоја мозга. Стога, иако су многи од више менделских облика АСД-а ретки, они пружају важну прилику за разумевање нормалне функције ових гена и локуса ризика од аутизма путем њихове манипулације трансгеним мишевима. 9, 10, 11 Модели миша служе важној функцији у разумевању улоге ових гена ризика у развоју мозга и очувања особина понашања. Иако је изузетно користан за разумевање моногених поремећаја, један недостатак употребе миша као модела је изазов пертурбира више гена да опонаша генетику болести. Поред тога, дуготрајно размножавање и гестацијско време такође могу учинити експериментални дизајн продуженим и мање подложним сцреенингу са великом пропусношћу. С друге стране, модели попут зебре ( Данио рерио ) омогућавају брзи и високо пролазни ин виво скрининг гена и малих молекула. 12

Дакле, иако су животињски модели неопходни за испитивање кругова и корелационог понашања, вероватно је да ниједан модел сложене неуроразвојне болести неће у потпуности рекапитулирати људски поремећај. У ствари, проучавање путева експресије гена пружа потврдан доказ да људи и миш имају значајна подручја дивергенције. Поређење глобалних разлика у коекспресији гена између људи и миша открило је многе случајеве људског специфичног обрасца изражавања; неколико ових модула повезано је са људским неуродегенеративним поремећајима који су изазов за моделирање код мишева. 13 Штавише, специфично поређење сигналних путева људи и чимпанзе низводно од ФОКСП2, фактора транскрипције који је укључен у говор и језик, поново је идентификовао диференцирану експресију гена и коекспресију која би се могла окарактерисати ин витро . 14 Стога су и најсимпатичније врсте за људе, чимпанзе, у неким случајевима развиле различите сигналне мреже. Стога би се употреба модела заснованих на људским системима требала сматрати важним додатком за потпуно разумевање неуропсихијатријских поремећаја који укључују вишу спознају и понашање људи. Поред тога, обе горе поменуте студије 13, 14 и многе друге 15, 16, 17, 18, 19, 20 истичу како идентификација мрежа гена коекспресије може открити нове функционалне увиде - укључујући гене који су укључени у неуродегенерације или гене укључен у људски језик и спознају. Стога је примјена мрежног приступа било којем скупу података о генској експресији генерираном из система људског модела значајан корак ка потпуном разумијевању начина интеракције гена за промоцију одређене функције.

Један нови приступ за моделирање фенотипа повезаних са болешћу у људском ткиву је употреба индукованих плурипотентних матичних ћелија. 21 Овом техником фибробласти пацијената се претварају у ћелије које вас занимају и анализирају настали фенотипи. Барем једна студија је користила индуковане плурипотентне матичне ћелије за проучавање Реттовог синдрома, поремећаја унутар спектра аутизма. 22 Такав процес је корак у правом смеру, јер су ћелије од човека и потичу из специфичне популације пацијената. Међутим, рад са овим ћелијама може бити изазован јер се њима треба генетски манипулисати да се репрограмира у плурипотентно стање, а конверзија у неуроне може бити дуготрајна и ниска у ефикасности. 23 Нема сумње да ће темељна компаративна студија профила експресије гена неурона од индукованих плурипотентних матичних ћелија до неуронског ткива од истих особа бити веома корисна.

Други потенцијални систем модела који такође није добро тестиран, јесу људске ћелије које су добијене из можданог ткива и узгајане ин витро . За проучавање неуроразвојних поремећаја, коришћење ембрионалног можданог ткива из раног развоја мозга даје предност ухватању тачних временских тачака у развоју када се сматра да генетске и околинске увреде узрокују. 24, 25, 26 Стога смо развили људски неурални систем прегенератора да проценимо функционалну геномику и нормалног људског неуронског развоја и аутизма користећи хумано ткиво феталног мозга. Ови нормални хумани неуронски потомци или нормални хумани неуронски потомци (НХНП), потичу из раних хуманих ембриона у ∼ 8–19 гестационих недеља. Ове ћелије су раније коришћене за испитивање неуронских фенотипа током Внт сигнализације, 27 као и циљева транскрипционог фактора ФОКСП2, рекапитулирања образаца примећених ин виво . 14 Овде налазимо да су током процеса диференцијације НХНП-а многи гени који су претходно повезани са АСД високо коекспримирани, што је процењено коришћењем читавих микрорачуна генома. Штавише, одређени број АСД гена показује сачуване обрасце коекспресије гена током временског диференцијације. Како се мало зна о транскрипцијском програму који прати диференцијацију хуманог неурона, свеобухватна анализа експресије гена која је овде представљена пружа основно средство за процену интеракције бројних каскада сигнала у патофизиологији АСД и других неуроразвојних поремећаја. Способност да се лако манипулише експресијом гена у овим ћелијама 14 такође чини НХНП атрактивним за проучавање функционалних последица измењених сигналних путева који су укључени у АСД у људским неуронима.

Резултати

Прво смо проценили изводљивост коришћења НХНП-а као модела модела за проучавање диференцијације неурона. ННПП са малим пролазом коришћени су за све експерименте, и када су ћелије биле снабдевене сигналима који индукују раст у облику епидермалног фактора раста и основног фактора раста фибробласта, одржавале су пролиферативно стање (слика 1а; видети Материјал и методе). Иако је време удвостручавања ових људских ћелија продужено у поређењу с ембрионалним неуронским потомцима глодаваца, НХНП се могу задржати у култури у пролиферативном стању најмање годину дана, ако не и дуже (подаци нису приказани). Затим смо тестирали карактеристике НХНП-а након добијања знакова диференцијације, што је постигнуто заменом епидермалног фактора раста и основног фактора раста фибробласта ретиноичном киселином како би се унапредио излазак из ћелијског циклуса (види Материјали и методе). Поред тога, медијум смо допунили неуротрофичним фактором који потиче из мозга, неуротрофином-3 и КЦл да би обезбедили подржавајуће факторе раста и одговарајуће проводљиве јоне за неуроне. Под тим условима, открили смо троструко смањење пролиферативних, Ки67 + ћелија после 2 недеље (Слика 1б).

Image

Карактеризација нормалних хуманих неуронских претходника (НХНП). ( а ) НХНП су митотички активни у одсуству фактора раста диференцијације. Кривуља раста ћелија које се размножавају. Ступци грешке су ± сем, н = 5. ( б ) НХНП-ови се могу индуковати до пост-митотичког стања коришћењем праве комбинације диференцијационих сигнала. Број Ки67 + ћелија смањује се најмање троструко у року од 2 недеље. Ступци грешке су ± сем, н = 3. ( ц - е ) НХНП приказују маркере и морфолошке карактеристике неурона са диференцијацијом од нула недеља ( ц ) до две ( д ) и 4 недеље ( е ). Зелено је нестин-позитивно обојење које означава неспутане потомке. Црвено је Туј1-позитивно бојење који обележава неуроне, а плаво 46-диамидино-2-фенил индол. ( ф ) Проценат нестин-позитивних ћелија значајно опада са диференцијацијом од 4 недеље док се проценат Туј1-позитивних ћелија повећава. Звездица означава П 0.005, двострука звездица означава П 0.001, а траке грешака су ± сем (анализа варијанце, н = 4). ( г ) Табела која приказује број гена који се мењају у свакој поређењу временских тачака користећи микроартере са праговима лажне стопе откривања (ФДР) 0.01 и променом савијања ± 1.5.

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Следеће смо проценили да ли можемо створити неуроне под овим условима диференцијације. Спровели смо имуно обојавање за нестин, маркер пролиферативних потомства, 34 Туј1, маркер незрелих неурона, 35 МАП2, маркер зрелих неурона; 36 и ГФАП, маркер глије. 37 Открили смо значајно смањење нестин-позитивних ћелија и значајно повећање и Туј1 и МАП2-позитивних ћелија са 4 недеље диференцијације (Слике 1ц-ф и подаци нису приказани). Туј1-позитивне ћелије представљају око 50% ћелија у култури током 4 недеље (Слика 1ф), док је број ГФАП-позитивних ћелија остао конзистентан током диференцијације (подаци нису приказани). Према томе, користећи наше услове диференцијације, можемо ефикасно разликовати хумане неуронске потомке у пост-митотичке неуроне. Поред тога, на основу профилирања експресије гена (види доле), НХНП се могу разликовати у више типова неурона, укључујући и ексцитацијске и инхибиторне неуроне. Ово је доказано повећањем експресије гена као што су ДРД3, ДРД4, ГАББР1, ГАБРБ3, ГАД1, ГАД2, ГРИК1, ГРИН1, ГРМ2, ГРМ3, СЛЦ23А1 и СЛЦ6А1 ( на пример, Додатна табела 2).

Даље, окарактерисали смо овај процес диференцијације спровођењем анализа читавог гена микрораста на временском току диференцијације НХНП-а. Изабрали смо четири временске тачке за процену: време 0 или недиференциране ћелије, 2 недеље, 4 недеље и 8 недеља диференцијације (Т0, Д2, Д4 и Д8). Ове временске тачке изабране су из следећих разлога: Д2 јер смо приметили значајно смањење пролиферације у овом тренутку (слика 1б), Д4 јер је у овом тренутку дошло до значајног повећања Туј1 (слика 1ф) и Д8 јер је представљао период у времену двоструко дужем од Д4 за директно упоређивање са прелазом Д2 у Д4 током сазревања неурона. Четири биолошке реплике из сваке временске тачке биле су укључене у анализу. Хијерархијско групирање показује да су биолошке реплике сједињене једна с другом и да је временска тачка која се највише разликује од остале три када се разматра експресија свих гена била она која садржи недиференциране ћелије (допунска слика 1А). Када су анализирани само топ 500 најразличитијих гена, Т0 и Д2 су групирани одвојено од Д4 и Д8 (допунска слика 1Б), што сугерише да гени који се током времена највише мењају представљају различите обрасце експресије између ране и касне фазе диференцијације . Овај образац такође сугерира да се неуронска спецификација може увести у тачку Д4.

Да бисмо истражили могућност да је Д4 критична временска тачка у диференцијацији НХНП-а, испитали смо гене који се мењају на Д4 у поређењу са Т0. Користећи критеријуме лажне стопе откривања 0, 01 заједно са променом набора од ± 1, 5, 2218 гена се повећало у изобиљу, а 2209 гена се смањило на Д4 у поређењу са Т0 (Слика 1г). Познати кључни маркери диференцијације неурона повећали су се у овом тренутку, укључујући МАП1Б , 38 ПАКС6 , 39 СНАП25 , 40 ефрина ( ЕФНБ3 , ЕФНБ1 ), 41 и семафорине ( СЕМА5А , СЕМА5Б , СЕМА6Ц ). 42 Поред тога, образац експресије гена у НХНП-у је у складу са ћелијама које потичу из претходних мозгова. На пример, СП8 и СХХ су експримирани у размножавајућим ћелијама 43, док су РЕЛН , СОКС5 , ТБР1 , БЦЛ11Б (ЦТИП2) , ЦАЛБ2 и НГФР индуковани диференцијацијом. 44 Додатна табела 2 наводи све гене који се мењају у временској тачки Д4. ГО анализа је открила да су најзначајније обогаћене категорије за регулисане гене били развој нервног система, неурогенеза, диференцијација неурона и синаптогенеза, мада су оне за регулисане гене били ћелијски циклус и митоза (Табела 1 и Додатна табела 3), у складу са престанком пролиферативног стања. Подаци о придруживању болести такође су изведени из ДАВИД базе података заснованих на ГО класификацијама (види Материјали и методе). Сви ови подаци изведени су из профилирања гена у једној ћелијској линији. Међутим, нашли смо значајно преклапање ( П <3, 73Е-85- П = 0, 0) користећи сличне параметре диференцијације са две различите линије НХНП-а (ред 4, Додатна табела 1 и додатна трећа линија, подаци нису приказани).

Табела пуне величине

Следеће смо упоредили гене који се мењају на Д4 и оне који су се променили најмање 1, 3 пута у људском мозгу ин виво између 18 и 23 гестацијске недеље 45 да бисмо утврдили у којој мери су ин витро промене рекапитулирале оне примећене ин виво . Од потенцијалних 575 гена који су доступни за упоређивање преклапања користећи наше критеријуме за промену набора, 167 гена је повећано ( П = 7.56Е-89), а 202 је смањено ( П = 5.64Е-114) под оба услова сазревања (Додатна табела 4), преклапање од око две трећине. Ови подаци су још упечатљивији имајући у виду да су употребљени микрорачуни различити, представљен је само релативно кратак период ин виво развоја, а ин виво подаци за поређење састоје се од обједињених података који укључују подкортикалне области. Стога, ови подаци подржавају хипотезу да 4 недеље диференцијације НХНП-а рекапитулира одговарајући временски период за робусну диференцијацију неурона у људским ћелијама и ткивима и одражава молекуларне процесе релевантне за ин виво развој.

Да бисмо проценили да ли би овај модел модела могао да буде примерен за разумевање АСД-а, укрстили смо две листе гена који имају снажне доказе за повезаност са АСД 8, 46 са генима који се мењају током Д4 (стопа лажне откриће 0.01 и промена набора ± 1.3). Од укупно 28 гена који су укључени у АСД, открили смо значајно преклапање гена који иде и према горе (седам гена; П = 2.6Е-02) и доле (седам гена; П = 2.4Е-02) на Д4 (Табела 2 ). Затим смо испитали да ли можемо да самостално потврдимо промену гена на микрорачунима користећи ПЦР у реалном времену квантитативну реверзну транскриптазу. Коришћењем прага од 1, 5 пута, потврдили смо ∼ 80% тестираних гена (Табела 2). Због тога, микрорачуни указују на то да је значајан број гена кандидата за АСД регулисан током диференцијације хуманог неурона ин витро .

Табела пуне величине

Једно занимљиво запажање било је да се неурексин 1 ( НРКСН1 ), ген осетљивости на аутизам и шизофренију и једна сонда за неурексин 3 ( НРКСН3 ) мењају у супротним смеровима на микрорачунима. Касније смо потврдили квантитативном ПЦР реверзном транскриптазом да је НРКСН1 регулисан током диференцијације НХНП (слика 2а), у складу са његовом познатом улогом у синаптичкој функцији. 47, 48 Међутим, користећи три различита пара прајмера у различитим НРКСН3 изоформама, открили смо да је НРКСН3 смањен (Слика 2а). То је било помало изненађујуће, јер није било претходних сугестија да су ова два високо хомолошка гена имала различите функције или обрасце експресије у људском мозгу. Да бисмо видели да ли ово одговара ин виво ситуацији, извели смо ин ситу хибридизацију у људском мозгу плода, што је на изванредан начин потврдило ове резултате. НРКСН3 је експримиран у областима ћелија потомства људског феталног мозга, док је НРКСН1 изражен у областима пост-митотичких неурона (слике 2б-и). Инспекција података хибридизације миша ин ситу у Аллен Браин Атлас такође показује сличан образац користећи различите сонде (//ввв.браин-мап.орг/). Овај доказ принципа показује како се једноставан ин витро људски систем може користити за вођење откривања ин виво . Ови конкретни подаци указују на то да НРКСН3 има непознату улогу у биолошкој неуролошкој потомки, за разлику од каноничне функције неурексина у синапси, која је вероватно сачувана од мишева до људи.

Image

Обрасци обрнуте експресије НРКСН1 и НРКСН3 . ( а ) Квантитативни ПЦР НРКСН1 и НРКСН3 обрнуте транскриптазе показује пораст НРКСН1 и смањење НРКСН3 са диференцијацијом у НХНП- у од 4 недеље. Коришћена су три различита пара прајмери ​​који појачавају или 5 'изоформ 2 и 3 или изоформу 1, и 3' крај свих изоформа НРКСН3 . Ин ситу хибридизација НРКСН1 ( б - е ) и НРКСН3 ( ф - и ) у људском мождану фетуса показује обогаћивање НРКСН1 у областима пост-митотичких неурона док је НРКСН3 изражен у пролиферативним областима. Гестацијска недеља старости ткива је 18 недеља ( б, ф ), 19 недеља ( ц, е, г, и ) и 20 недеља ( д, х ). Коришћени су и коронални ( б, ц, ф, г ) и сагиттални ( д, е, х, и ). ЦП, кортикална плоча; ГЕ, ганглионска еминенција (Л, бочна; М, медијална); Хп, хипокампус; Стр, стриатум; Тх, таламус. Величине = 5 м М.

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Иако су различите разлике у експресији гена важни параметри било ког ћелијског процеса, почели смо да схватамо да скупови података о генској експресији садрже друге својствене обрасце коекспресије гена који се могу минирати како би се достигли нови функционални увиди. 49 Конкретно, користили смо анализу мрежне коекспресије гена за експресију 50 као што је претходно описано 14, 15 да бисмо пружили приказ на нивоу система организације неуронског транскрипта. Гени који су изразито коекспримирани групирани су у „модуле“. Усклађеност модула са различитим аспектима функције, као што су фенотипи неурона, карактеристике узорка (болест у односу на контролу) или ћелијске органеле, одређује се анализом еигенгене модула или прве принципне компоненте. 15, 50 Поред тога, централни или 'хуб' гени могу се идентификовати унутар модула. 15, 20

Анализом мрежне коекспресије гена временског течаја диференцијације НХНП-а идентификовано је укупно 22 модула, од којих је 14 лако бити окарактерисано (допунска табела 5). Четири модула су јасно била повезана са диференцијацијом током времена током Т0 до Д8. Четири друга модула најбоље су у корелацији са недиференцираним ћелијама (Т0), иако је један модул аутогена био високо корелиран са Д2, а други са Д8. Занимљив је модул чија је својствена повезаност са Д2 (зелени модул) јер су ти гени вероватно они који учествују у дефинисању почетка неуронске спецификације и престанка пролиферације и деобе ћелија. Д8 или морски зелени модул може садржавати гене који учествују у сазревању неурона и одржавању фенотипа. Коначно, четири друга модула представљали су прелазак са Д2 на Д4. Хипотетирали смо да ови модули вероватно садрже гене који су критични за процес диференцијације, јер је Д4 био тачка када је примећено значајно повећање позитивних ћелија Туј1 (слика 1) и ГО гена који се мења у Д4 обогаћен је за диференцијацију ЦНС-а.

Затим смо покушали да утврдимо да ли могу постојати заједнички биолошки процеси или путеви између различитих гена ризика од АСД на непристран начин користећи анализу мрежне анализе коекспресије гена. Да бисмо проширили број гена који су доступни за ову анализу, упитали смо базу података СФАРИ гена за најексклузивнију листу гена који имају однос према АСД (//гене.сфари.орг). Иако многи од ових гена тренутно могу имати слабу повезаност са АСД-ом, укључивање што више гена у ову анализу требало би да створи мреже гена са највећим потенцијалом за коекспресију гена повезаних са АСД-ом и пружа непристран поглед. Користећи базу података СФАРИ, разграничили смо 224 гена с потенцијалном улогом у АСД-у. Деведесет ових гена преклопило се са првих 6000 најчешће повезаних гена у тренутном скупу података о експресији гена и били су укључени у мрежну анализу. Иако је ових 90 гена дистрибуирано кроз 17 модула (допунска табела 6), постојала су четири модула са одређеном концентрацијом АСД гена: краљевско плави модул (са 18 АСД гена), ружичасти модул (са 17 АСД гена), тиркизни модул (са осам АСД гена) и црни модул (са 7 АСД гена) (слика 3). Ова случајна концентрација гена унутар ове групе модула сугерирала је неке заједничке путеве и претходно непризнате везе између гена осетљивости на АСД.

Image

Мрежна визуализација модула који садрже гене поремећаја спектра аутизма (АСД). ( а ) Краљевско плави модул. ( б ) Пинк модул. ( ц ) Црни модул. ( д ) Тиркизни модул. Називи боја насумично су додијељени сваком модулу у описне сврхе. АСД гени су у плавој боји, а гени за хуб су приказани љубичастом бојом. Линије представљају спојне ивице у мрежи засноване на тополошком преклапању. Приказано је првих 250 веза, а дужина и дебљина линија су произвољни.

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Модул својства краљевско плавог модула повезан је са Т0; према томе, ови гени су највише повезани са пролиферативним стањем неуронских претходника. Стога није изненађујуће да најбоље обогаћене ГО категорије за модро краљевски плави укључују адхезију ћелија, развој нервног система и неурогенезу (допунска табела 3). Иако ниједан од АСД гена није "хуб" (или са највише повезаних) гена у краљевско плавом модулу, најмање четири кандидатна АСД гена, ЦБС , ДЛКС2 , РИМС3 и ПРКЦБ1 , укључена су у првих 250 веза унутар овог модула (Додатна слика 2А).

Роза модул садржи гене повезане са диференцијацијом током читавог временског трајања. Због тога су ови гени највише повезани са процесом диференцијације. Ружичасти модул садржи гене који су обогаћени у ГО категоријама ћелијског циклуса ( П = 2, 29Е-05) и аксонско вођење ( П = 1, 74Е-02) (допунска табела 3). Визуализацијом високо повезаних гена у ружичастом модулу откривају се АБАТ , ПЛАУР и СЦН1А , сви АСД кандидатски гени, као један од најчешће повезаних гена у модулу (слика 3б). Занимљиво је да је МЕТ , још један АСД ген који вероватно координира с ПЛАУР-ом за пренос сигнализације фактора раста хепатоцита, 8, 51, такође смештен у модулу ружичасте боје, али не ствара одсек за визуелизацију.

Црни и тиркизни модул садрже гене укључене у прелазак Д2 на Д4; стога су ти гени вероватно важни за рану диференцијацију неурона. Црни модул обогаћен је генима укљученим у трансдукцију сигнала ( П = 4, 53Е-07). Два од седам АСД гена кандидата, НРКСН1 и ГЛРА2 , могу се визуализовати међу најчешће повезаним генима у црном модулу (слика 3ц). Најзначајније ГО категорије за тиркизни модул су пројекција неурона ( П = 1, 27Е-06) и развој нервног система ( П = 5, 41Е-06). И НРКСН1 и СЛЦ9А6 су високо повезани унутар тиркизног модула (слика 3д). Запањујуће, од скоро 600 генских веза са АСД генима унутар четири АСД модула, свега седам, или 1%, раније је било познато или би се могло претпоставити на основу литературе, мада је преосталих 590 нових, што показује снагу ове анализе.

Други начин да се идентификују потенцијално нови АСД путови сигнализације је фокусирање на међусобно повезаност само познатих АСД гена. На пример, након филтрирања само познатих веза повезаних са АСД генима у тиркизном модулу, нису само АСД гени увек повезани једним чвором или мање, већ су и други гени приоритетни, као што су гени ћелијске адхезије ЦТННА2 и ТАГЛН (Допунски Слика 2А). Користећи идентичан приступ са краљевско плавим модулом, приказује укључивање 17 од 18 АСД гена у модулу (допунска слика 2Б). Поред тога, добро окарактерисани гени као што су СЕМА5Б и ГФАП могу се лако идентификовати као повезани међу овим АСД генима. Овај ниво повезивања није случајан, јер је средњи укупни степен мрежне повезаности 17 пута мањи од самог АСД гена, а анализа пермутације (види додатне методе) показује да је повезаност гена за АСД много значајнија у поређењу са рандомизованом листом гени исте величине ( П = 0). Ово показује да су у сложеном и огромном процесу диференцијације неурона специфични аспекти и путеви јасније повезани са АСД.

Да бисмо потврдили да ли је дошло до повећања генетских асоцијација у ова четири модула, прво смо испитали литературу помоћу ГО. Краљевско плави модул обогаћен је за гене са генетском повезаношћу са шизофренијом (мада та вредност П није достигла наш праг значајности; П = 5, 86Е-02). Ови подаци имају смисла у светлу неких преклапања у генетском пореклу шизофреније и АСД-а. 52, 53, 54 Насупрот томе, други неуролошки гени нису значајно обогаћени, на пример, деменција ( П = 1.1Е-01), Паркинсонова болест ( П = 3.9Е-01) или биполарни поремећај ( П = 4.9Е-01 ). Роза модул такође садржи гене који су обогаћени код шизофреније ( П = 2.12Е-02). Црни модул обогаћен је генима укљученим у аутизам ( П = 2, 45Е-02), биполарни поремећај ( П = 2, 50Е-04) и Алзхеимерову болест ( П = 4, 05Е-02). Занимљиво је да ГО анализа извештава о четири додатна гена у категорији аутизма који нису укључени у базу гена СФАРИ као потенцијални гени кандидати за АСД ( БДНФ , ТХ , ХЛА-ДРБ4 и НРГ1 ). Ово наглашава да критеријуми за укључивање као 'ген за аутизам' могу варирати међу базама података. Коначно, тиркизни модул је обогаћен генима укљученим у панични поремећај ( П = 1, 28Е-02) и поремећај недостатка пажње ( П = 1, 56Е-02). Стога ови подаци илуструју да постоји вјероватно да се током развоја мозга преклапајуће сигналне мреже које су поремећене у различитим пермутацијама и доводе до великог броја неуропсихијатријских поремећаја.

Недавне студије су показале да иако студије асоцијације широм гена не могу открити снажно повезане гене са великим димензијама ефекта код неуропсихијатријске болести, свеукупно може постојати слабији сигнал који се шири по многим генима, као што је показано код шизофреније и биполарног поремећаја. 6, 7, 55 Стога се сугерише да би идентификација потенцијално узрочних путова могла бити средство којим би се повећала снага за откривање генетске асоцијације. Да бисмо додатно проценили да ли постоје неовисни генетски докази за обогаћивање пута, тестирали смо да ли су побољшани сигнали генетске асоцијације за АСД унутар четири горе дефинисана модула. Када су гени коришћени за мрежну анализу анализирани на генетску асоцијацију на АСД, преко 50% гена са П вредношћу <1.0Е-02 пало је у један од ова четири модула (допунска табела 6). Иако овај проценат гена није статистички обогаћен, он пружа још један ниво информација за одређивање приоритета неозначених гена који су у овим модулима веома повезани са познатим АСД генима.

Дискусија

Употреба хуманих неуронских прогенера је важно средство за откривање генских образаца експресије у нормалној диференцијацији хуманог неурона и за проучавање неуропсихијатријских болести. Ове ћелије рекапитулишу морфологију и маркере диференцијације које су примећене у другим системима модела. Међутим, употреба неколико ћелијских маркера ограничава, а скрининг ћелија по један ген у исто време на могућу корисност у проучавању одређене болести је напоран. Профилирање експресије целог гена је моћно средство за преглед целокупног програма транскрипције системског модела под различитим условима. Прописивање транскрипције показало се изузетно информативним у проучавању многих болести ЦНС-а, као и у разумевању развоја и еволуције мозга. 49, 56 Зато смо користили модел система хуманих неуронских ћелија у комбинацији са профилирањем читавог генома и приметили обогаћивање експресије гена и сигналних путева који су укључени у АСД, а у мањој мери и друге психијатријске поремећаје са неуроразвојним пореклом, као што је као шизофренија. Експресија многих ових гена је модулисана током диференцијације неурона, нарочито у раној фази пролиферације и преласку на пост-митотички неурон (Т0, Д2 и Д4), пружајући непристрасну подршку неуроразвојном пореклу АСД-а. 57 Штавише, АСД гени се групишу насумично у модуле гена коекспресије што доводи до потенцијалне идентификације додатних гена с везама на АСД. Лакоћа којом се експресијом гена може управљати у овим ћелијама 14 чини их привлачним алатом за проучавање сигналних путева који су укључени у АСД и друге неуроразвојне поремећаје.

Као што је горе поменуто, образац експресије гена као што су СХХ и РЕЛН у НХНП-има сугерира да су ћелије изведене од претинаца. С обзиром да се сматра да је једна од основних патологија АСД синдром развојне прекида који укључује фронтални-кортикални и фронтално-поткортикални пут, 25, 58, 59, употреба ћелија добијених из људског кортекса фетуса пружа потенцијално моћан и ефикасан метод испитивања сигнализације путови поремећени у болести. Штавише, такође је постављено да је АСД поремећај раста аксона и / или миграције неурона услед броја молекула ћелијске адхезије који су умешани у поремећај. 60, 61 У складу с тим, пронашли смо значајно обогаћивање гена који учествују у ћелијској адхезији који се мењају диференцијацијом (допунска табела 3), као што су ЦДХ1 , ФБЛН2 , НРГ1 , неколико ламинина и бројни протокадерини. Поред тога, гени ћелијске адхезије такође су високо обогаћени у сва четири идентификована АСД модула, а ћелијска адхезија је најзначајније обогаћена категорија биолошког процеса у модулу краљевско плаве боје (Додатна табела 7), која је такође обогаћена генима осетљивости на АСД кандидата. Разврставање података о експресији гена ради идентификације група гена укључених у одређену ћелијску функцију требало би да се покаже корисним јер су откривени генетски узроци многих подтипова АСД. На пример, ови подаци се могу повезати са будућим генима повезаним са имуном дисфункцијом или опсегом главе у АСД. Уз то, пертурбација АСД гена може открити потенцијалне заједничке путеве унутар рубрике нормалне топологије мреже.

Овде проучавамо АСД као прототипични неуроразвојни поремећај за испитивање сигналних путева. Многи гени повезани са АСД имају познате улоге у нормалном развоју мозга и повезани су са другим неуропсихијатријским болестима као што је шизофренија. 54, 62, 63 Стога би овај модел модела требало да служи и за проучавање других неуроразвојних поремећаја као што су епилепсија или интелектуална инвалидност. У том циљу открили смо бар један модул коекспресије гена који садржи обогаћивање гена за епилепсију, 64 розе модул, који је такође један од идентификованих АСД модула (допунска табела 6). Ово није изненађујуће с обзиром на високу коморбидитет ових неуроразвојних поремећаја, при чему између 10-25% болесника са АСД-ом доживи нападаје или епилепсију. 65 Поред тога, генетски подаци подржавају уобичајене узрочне етиологије ових поремећаја у неколико случајева. 66, 67, 68, 69, 70 Поред тога, ГО анализе указују на обогаћивање гена познатих асоцијацијама на шизофренију или друге неуропсихијатријске поремећаје.

Примјена мрежне анализе на овим подацима може дати важне биолошке увиде. Анализа мрежне анализе коекспресије гена не само да указује на међусобну повезаност познатих АСД гена у овом моделном систему (допунска слика 2), већ такође открива и потенцијално нове гене који могу бити погођени поремећајем. Проводећи сопствену анализу јавно доступних података о асоцијацији АСД-а, показујемо да је већина најзначајнијих СНП-а повезана са генима у наша четири АСД модула (Додатна табела 6; Види Материјали и методе). Ови подаци илуструју да је комбинација генетских и генских података снажно средство за идентификацију нових гена у поремећају, посебно за оне који можда не чине статистички праг користећи само једну од метода. На пример, иако је ЦТННА2 и раније био повезан са шизофренијом 71 и хиперактивним поремећајем дефицита пажње, 72, она нема познату повезаност са АСД. Међутим, налазимо да је експресиониран са пет АСД гена у тиркизном модулу ( ЦАЦНА1Ц, ФРМПД4, ХС3СТ5, НРКСН1 и СЛЦ9А6 ) и показује сугестивни сигнал асоцијације са АСД (4.77Е-04). Стога би наша анализа сугерисала да ЦТННА2 има велику вероватноћу да има улогу у АСД-у и добар је кандидат за поновно секвенционирање код погођених пацијената. Поред коришћења података о генетској асоцијацији за одређивање приоритета код гена кандидата, будуће студије могу користити богатство информација о дозирању гена у АСД-у који постаје доступан (нпр . 1, 2 ) за даље рангирање гена у смислу потенцијалне патогености.

Поред тога, раније смо показали да се коекспресија може користити за напомену функције гена. 15, 17 На пример, високо коекспримирани гени у транскриптима људског мозга су такође физички коекспримирани на нивоу протеина у ниши неуронских матичних ћелија одраслог човека. 15 Кроз принцип повезивања кривице можемо идентификовати и напоменути нове функције гена. Ово се заснива на хипотези да су слични нивои експресије међу највише коекспресираним генима у модулу резултат заједничких регулаторних механизама. Стога је вероватно да су неки гени коекспримирани са АСД генима у НХНП-овима такође кључни физички партнери АСД гена у обављању одређених интринзичних неуробиолошких карактеристика ин виво . Ово се уклапа у моделе синапсе и развојне дисконекције АСД. Гени у корелацији са познатим АСД генима који су пронађени у синапси, као што су НРКСН1 73 и РИМС3 74, и сами би могли бити кључни играчи у биологији синапсе. На пример, и НРКСН1 и СЛЦ9А6 су експресионирани са ФЉ30596 (или ц5орф33 ). Тренутно се не зна ништа о биологији ФЉ30596 , међутим, израз СЛЦ9А6 у ендосомалним везикулама 75 и НРКСН1 током синапсе сугерира да ФЉ30596 такође може имати неку улогу у синаптичкој функцији. Невероватно је, такође, да НРКСН3 показује обратан образац експресије НРКСН1 , што сугерише улогу у биологији претинача , која је ин виво потврђена у људском мозгу плода. У сличној вени, гени који су у корелацији са познатим АСД генима који су саставни део аксоновог путања и стога кортико-кортико везе као ЕПХА6 , 76 НРП2 , 77 и СЕМА5А 78 (допунска табела 6) могу и сами бити укључени у такве процесе. Дакле, мрежни приступ анализи експресије гена не само да може идентификовати нове гене повезане са болешћу, већ такође може указивати на функционалну улогу претходно не-карактеристичних гена.

Једна област неуропсихијатријских истраживања којима је потребна већа иновација је откриће нових терапија. Разумевање гена који су укључени у поремећај је неопходан први корак; међутим, одговарајући модел унутар којег се тестирају нови лекови је следећи критични корак. Употреба НХНП система испуњава оба критеријума. Овде смо показали да постоје снажне промене експресије гена током процеса диференцијације које прате оно што се познаје ин виво код других моделних организама као и у развоју људског феталног мозга. Иако смо пронашли значајно преклапање са овим системима модела и ин виво експресијом, експресија неких гена који се не слажу (на пример, гени који иду у супротном смеру у Додатној табели 4) може пружити увид у ограничења овог системског модела и такође би требало узети у обзир у будућим функционалним студијама. Конкретно, ефекти процеса попут утискивања на култивисане ћелије насупрот нетакнутог или дисоцираног ткива важан су знак ове студије који би се могао изузети помоћу ових информација. Без обзира на то, многи гени у сагласју нису само важни за нормално разликовање, већ су и поремећени или су експресионирани са генима који су поремећени у АСД. Комбиновање ових података са претходно објављеним 6 и текућим студијама асоцијације на ширем геному код АСД и других неуропсихијатријских болести 79 учврстиће улогу одређених гена и путева у болести. Штавише, како се ћелије генетски могу следити модификовањем лентивирусном прекомерном експресијом или оборењем, више гена може да се модификује истовремено да опонаша генетску хетерогеност болести као што је АСД. Тада се заједно са хемијским прегледима из хемијске библиотеке може брзо тестирати 80 терапија за одређене генетске потписе. Овај комбинаторни приступ је стога нарочито повољан у односу на животињске моделе где се само један или неколико гена може истовремено модификовати, или је хемијски скрининг са високом пропусношћу дуготрајан.

Комбинација ових људских алата са нечовечним моделима јасно даје синергистички приступ за расветљавање сигналних каскада важних како за нормалан развој људског мозга, тако и за неуропсихијатријске поремећаје. Скупови података попут овог који су представљени овде ће идентификовати нове гене везане за болест и представити могућности за тестирање и развој персонализованих терапија.

Приступања

ГенБанк / ЕМБЛ / ДДБЈ

  • ГСЕ28046

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Додатне информације

    Додатне информације прате рад на веб локацији Молекуларна психијатрија (//ввв.натуре.цом/мп)