Молекуларне студије већих депресивних поремећаја: епигенетска перспектива | молекуларна психијатрија

Молекуларне студије већих депресивних поремећаја: епигенетска перспектива | молекуларна психијатрија

Anonim

Апстрактан

Главни депресивни поремећај (МДД) је чест и високо хетероген психијатријски поремећај који обухвата спектар симптома који укључују дефицит на низ когнитивних, психомоторних и емоционалних процеса. Као што је норма за етиолошке студије већине психијатријских фенотипа, посебан фокус је пао на међусобну интеракцију генетских и околишних фактора. Постоји, међутим, неколико епидемиолошких, клиничких и молекуларних карактеристика повезаних с МДД-ом тешко је објаснити користећи традиционалне приступе засноване на генима и животној средини. Наш циљ у овој студији је приказати предности гледања изван уобичајених етиолошких парадигми 'ДНК + окружење' и 'ДНК околина'. Епигенетски фактори - наслеђене и стечене модификације ДНК и хистона који регулишу различите геномске функције које се дешавају без промене нуклеарне ДНК секвенце - нуде нове увиде о многим не-менделовским карактеристикама велике депресије и пружају директан механички пут кроз који околина може да комуницира са геномом. Проучавање епигенетике, посебно код сложених болести, релативно је ново поље истраживања, а оптималне лабораторијске технике и методе анализе се још увек развијају. Укључивање епигенетског истраживања у етиолошке студије МДД-а представља низ методолошких и интерпретативних изазова које је потребно решити. Упркос овим потешкоћама, проучавање метилације ДНК и модификација хистона има потенцијал да трансформише наше разумевање о молекуларној етиологији сложених болести.

Увод

Главни депресивни поремећај (МДД) дефинисан је епизодама депресивног расположења које су дуже од две недеље праћене додатним симптомима, укључујући поремећен сан и апетит, смањену концентрацију и енергију, претерану кривицу, успорене покрете и суицидне мисли. 1 Депресија је изузетно уобичајен поремећај, који се налази на другом месту по глобалном терету болести, 2 с укупним ризиком за животни развој МДД-а за живот у свету процењен је на 16, 2% у укупној америчкој популацији. 3 Друштвене и економске посљедице депресије су огромне, што помрачује посљедице многих других менталних и соматских болести, па су као резултат тога агенције за финансирање широм свијета уложиле огромне своте новца у етиолошка истраживања.

Као што је норма за етиолошке студије већине психијатријских фенотипа, посебан фокус је пао на међусобну интеракцију генетских и околишних фактора. Међутим, користећи ове традиционалне истраживачке парадигме, напредак у разумијевању неуробиологије МДД је спор. На удаљености смо од нашег крајњег циља откривања јасних фактора ризика који могу помоћи у дијагностици, превенцији и лечењу велике депресије. Прве студије генетике депресије започеле су пре више од 30 година. 4, 5, 6, 7, 8 Од тада је више пута доказано да се афективни поремећаји одвијају у породицама, са одређеним полиморфизмима гена и стресом из окружења који су постављени да повећају подложност. Упркос значајном напретку у нашем разумевању могућих узрока МДД-а, ипак смо још увек на удаљености од идентификације доказаних етиолошких ризика за депресију и разумевања механизама који стоје иза њиховог деловања.

Савремене теорије о узроцима депресије обично одвајају наслеђене биолошке факторе од дејства опасне изложености животној средини. Уобичајена претпоставка је да су „гени“, односно варијанте секвенци ДНК и „околине“ једини скупови фактора који утичу на осетљивост и да ништа што није изазвало прво мора бити последица другог. Тек недавно су се истраживачи почели удаљавати од ових традиционалних етиолошких модела и гледали ван улоге једноставних адитивних генетских и утицаја на животну средину. Кохортно засноване студије су почеле да решавају проблем зашто само поједини појединци - носиоци неких специфичних генетских варијанти - изложени вјероватном ризичном окружењу заправо развијају депресију, проналазећи доказе за интеракције између одређених животних чинилаца и генотипа. 9

У ствари, постоје бројне клиничке и епидемиолошке посебности повезане с великом депресијом које је тешко објаснити - не само у смислу традиционалних генетских и окружења, већ и интеракције генско-животне средине. Ако су промене у редоследу нуклеарне ДНК и излагање одређеним 'ризичним окружењима' једино важно, зашто је толико идентичних близанаца одгојених на исти начин нескладних за симптоме депресије? Зашто је преваленца МДД код жена приближно двострука у поређењу с мушкарцима након пубертета? Зашто депресија слиједи тако упечатљив развојни пут код жена, с наглим порастом учесталости након пубертета? Зашто се чини да неки гени повећавају ризик од развоја депресије само ако су наслеђени од једног родитеља, али не и од другог?

Наш циљ у овој студији је приказати предности гледања изван уобичајених етиолошких парадигми 'ДНК + окружење' и 'ДНК околина' које доминирају у истраживању МДД-а. Укратко смо прегледали тренутно стање традиционалних молекуларно-генетских и еколошких истраживања МДД-а и показали да је (1) тачно могуће проценити релативни допринос гена или животне средине у МДД-у; (2) граница између генетских и околишних фактора је мање јасна него што се широко верује и околина може заправо бити посредник сложенијег скупа појава који садржи значајну наследну компоненту; (3) наследна, биолошка компонента осетљивости на МДД може да садржи много више од једноставне варијације секвенце ДНК; и (4) епигенетски фактори, односно наслеђени и стечени механизми који регулишу функцију гена који се дешавају без промене нуклеарне ДНК секвенце, могу понудити нова сазнања о многим не-менделовским карактеристикама МДД-а, укључујући несклад идентичних близанаца, полних и ефекти родитељског порекла, као и неки контроверзни налази традиционалних генетских студија (видети Табелу 1). Наше је мишљење да се фокусирањем само на секвенцу 'генома' и утицај 'окружења', значај трећег скупа етиолошких утицаја, наиме оних који делују на 'епигеноме', у великој мери занемарује.

Табела пуне величине

Гени и окружења: ограничења традиционалног истраживачког приступа

Генетика и МДД: напредак, али мало је убедљивих лоцираних ризика

Јасно је да се МДД агрегира у породицама, а метаанализа квантитативних генетских студија открива релативни ризик од 2, 84 за родбину погођених сироваца првог степена. 10 Конвенционалних анализа близанаца закључило је да је велики део овог породичног групирања последица наслеђених фактора. На пример, недавна метаанализа пет близаначких студија закључила је да је наследност депресије 37%, 10 са тешким, понављајућим и раним појављивањима поремећаја који показују повишен генетски допринос. Још један начин да потврдимо допринос генетских и околишних фактора у етиологији МДД-а је испитивање учесталости депресије код биолошких и усвојених рођака усвојеника са МДД-ом у поређењу са подударним посвојеницима. За депресију је урађено само неколико студија усвајања, и иако оне трпе одређене методолошке проблеме, 10 пружају додатне доказе који указују на јаку генетску етиологију у МДД (нпр. Вендер ПХ и др. 11 ). Иако генетичке студије у понашању углавном пријављују сличне насљедности за мушкарце и жене, неколико аутора наводи значајно већу насљедност код жена (види нпр. Биерут и др. 12 и Кендлер и остали, 13 ), потенцијално занимљиво запажање с обзиром на значајно већу преваленцију МДД-а код жена . Такође треба приметити значајну породичну коморбидност која је примећена између МДД-а и других афективних поремећаја, укључујући анксиозност и биполарни поремећај, што сугерише да ти услови могу бити етиолошки повезани и да могу имати заједничке наслеђене факторе ризика. 14

Наизглед јасан допринос наслеђених фактора МДД-у довео је до раног оптимизма у истраживачкој заједници психијатријске генетике да ће лоци који су укључени у етиологију лако идентификовати. Као што је случај с истраживањима других облика психопатије, можда најзначајније шизофреније, уложен је значајан напор на студије генетске повезаности и удруживања с истраживачима широм света, које је прогутала плима ентузијазма изазваног брзим напретком људског генома Пројекат крајем деведесетих. Убрзо је постало очигледно да ниједан главни МДД ген неће бити идентификован класичним приступима „ген гена“ или „целим повезивањем генома“ који су се обично користили у овим истраживањима. Као и код других психијатријских стања, и данас је широко прихваћена етиолошка доктрина улогу гена много сложенија, укључујући бројне локусе малог ефекта који епистатички међусобно делују и са низом патогена из окружења. Иако је недвојбено постигнут одређени напредак у идентификацији ових локуса ризика, још смо далеко од могућности да коначно докажемо улогу одређених молекуларних фактора у етиологији МДД.

Упркос објављивању бројних скенирања генетских веза и низа студија о удруживању, напредак у идентификацији локуса ризика за МДД и даље је спор. Резултати бројних студија повезаности генома за МДД указали су на потенцијалне регије осјетљивости, иако постоје бројне недосљедности између студија (за свеобухватни преглед погледајте Цамп и Цаннон-Албригхт 15 ). Можда најцјеловитија студија МДД-а до данас истраживала је повезаност у 110 великих проширених родовника, који се састоји од 1890 јединки, са јаком породичном историјом велике депресије. 16 Утврђена је значајна повезаност с великом депресијом код мушкараца на маркеру Д12С1300 (мултипотентна хетерогеност ЛОД-а 4, 6; П = 0, 00003) што сугерира постојање гена предиспозиције специфичног за пол према депресији у 12к22-к23.2. Остале студије, међутим, које се састоје од мањих узорака, истакле су велики број различитих хромосомских региона, при чему је целокупна слика изгледала врло компликовано. Укратко, све што се може узети од досадашњих истраживачких напора на везама у МДД-у јесу бројни велики хромозомски региони који показују релативно ниске ЛОД резултате, али показују одређени степен преклапања између студија (нпр. 1п, 2к, 3центр, 8п, 12к, 15к и 18к). Иако ове регије могу бити кандидати за будућу дисекцију позиционирањем клонирањем, интерпретација доступних података о повезивању је тешка због значајне хетерогености између студија које су резултат разлика у дизајну студија, запошљавању узорака и коришћеним аналитичким методама.

Студије удруживања априори кандидатских гена у истраживањима МДД су се превасходно фокусирале на гене укључене у серотонинергички систем. Образложење овог приступа је да значајни докази имплицирају да је дисрегулација овог система најважнија у развоју депресије. Посебно треба истаћи ефикасност селективних инхибитора поновне похране серотонина (ССРИ), који блокирају поновни унос серотонина у синапси, у лечењу депресије. Студије су такође показале значајно оштећење серотонинергичке функције у великом броју регија мозга код особа са великом депресијом. 17 СЛЦ6А4 , смештен на хромозому 17к, кодира транспортер серотонина, примарни циљ ССРИ-а и неколико студија је укључен у етиологију МДД-а. Постоје реплицирани докази о повезаности полиморфних варијанти у СЛЦ6А4 и МДД, посебно са кратким алелом поновљеног полиморфизма у промоторској регији гена. Метаанализа која укључује податке о неколико хиљада пацијената са МДД показује да је укупни ефекат овог полиморфизма релативно мали, с укупним коефицијентом шанси код појединаца хомозиготних за кратак алел 1, 16. 18 Парадоксално је да ова повезаност с кратким алелом СЛЦ6А4 у депресији супротставља ономе што би се могло предвидјети из функционалних студија полиморфизма. Кратки алел опћенито је повезан са смањеном активношћу транспортера и нижом експресијом СЛЦ6А4 19 - управо функционалним ефектом ССРИ који се користе за лијечење депресије - иако је недавно истраживање које је истраживало алелну експресију гена за транспорт серотонина пронашло повезаност између нивоа експресије и полиморфизма промотора. . 20 Остали гени који су се вероватно повезивали са МДД укључују оне који кодирају триптофан хидроксилазу, 21 неуротрофни фактор који потиче из мозга, 22, 23 катехол- О- метил трансферазе, 24 фосфолипазу А2, 25 глукокортикоидни рецептор 26 и серотонински рецептор 1А, 27 иако ови налази и даље чекају убедљиву репликацију у другим узорцима (видети Левинсон 28, недавни преглед).

Утицаји околине: скромни докази за директне узрочне утицаје

С обзиром на то да су процене наследности за МДД знатно испод 100%, већина квантитативних генетичара тврди да су поред генетских фактора утицаји околине вероватно важни и у етиологији поремећаја. 10 Заиста постоје експлицитни докази који повезују изложеност низу специфичних психосоцијалних патогена из окружења с развојем депресије. Они укључују изложеност стресним животним догађајима, смрт супружника или блиског рођака, дуготрајне медицинске болести и повреде, инвалидитет и функционални пад и социјалну изолацију. 29 Једно упозорење о проучавању узрока МДД у животној средини односи се на стварни укупни допринос који околина даје. Главни принцип квантитативне генетске теорије тврди да фенотипске варијације које се не могу приписати генетским факторима морају бити порекла животне средине. На овај начин, тврди се, све фенотипске разлике примећене између монозиготских близанаца (МЗ), којима је заједнички читав њихов геном, морају бити последица неподељених фактора животне средине. С обзиром да је пробна МЗ сагласност за МДД само 31% за мушкарце и 48% за женке МЗ близанце, 30 ова теорија предлаже веома велики не-заједнички допринос животној средини етиологији МДД-а. Међутим, недавни преглед бројних студија понашања којима се мере окружења близанаца и не близанки и браће и повезују их са разликама у резултатима њиховог развоја, показао је да док преко 50% фенотипске варијанце припадају факторима који се приписују 'не „заједничко окружење“, стварне измерене променљиве животне средине представљају само врло мали проценат ове променљивости. 31 Поред тога, неколико других студија алудира на спознају да разлике у понашању које примећују близанци МЗ-а можда нису потпуно еколошког порекла. На пример, нормални МЗ близанци који су одрасли заједно показују сличне корелације за различите карактеристике понашања као и МЗ близанци који су одгајали одвојено. 32, 33 Студије усвајања такође показују да узгојно окружење може бити секундарно наслеђено од фактора у посредовању осетљивости на МДД. 11 То се сигурно односи и на друге психијатријске поремећаје, често повезане етиолошки са депресијом, у којима су изведене боље контролисане студије - на пример, показано је да се ризик од шизофреније не смањује ако дете рођено од погођеног родитеља одрастао у здравој породици. 34

Други проблем је да иако су одређени фактори животне средине као што су озбиљна болест, развод, насилни злочин и сексуални напад снажно повезани са МДД, није јасно да ли су они директно узрочни у њиховом деловању. Као резултат, одрезавање њиховог дејства осим дејства гена може бити теже него што се често реализује. Показано је да на појединачно излагање стресорима из окружења снажно утичу генетски фактори, односно да предиспонирани појединци могу одабрати 'ризична' окружења. 35, 36 Наслеђени фактори ризика за неке факторе из окружења повезаних са МДД-ом, посебно стресне животне догађаје, у ствари су у корелацији са онима који утичу на подложност депресији 37, што указује да су исти гени вероватно укључени у оба. Дакле, иако су изложеност стресним животним догађајима и развој депресије готово дефинитивно повезани, можемо закључити релативно мало о узрочно-последичној вези иза ове везе. Други пример је урбаност, 'еколошки' фактор који се обично повезује са МДД, шизофренијом и другим облицима психопатологије. 38 Стопа преваленције депресије очигледно је већа код особа које бораве у урбаним срединама, а бројна истраживања извештавају о наводно јасној узрочно-последичној вези између живота у граду и депресије, опажања која се често приписују социјалној изолацији, повећаном стресу, сиромаштву и смањеној улози породична јединица. 39 Међутим, изгледа да се тамо где људи живе не може увек сматрати истинским „еколошким“ фактором. Најновија истраживања указују да међу одраслим особама у Аустралији заправо постоји јасан наследни допринос месту где људи одлуче да живе. 40 Интересантно је приметити да овај налаз није универзалан и можда није применљив у неким густо насељеним земљама, попут Холандије 41, наглашавајући сложеност етиолошких истраживања зависних од контекста.

Главна дилема са којом се суочавају епидемиолози који истражују утицај патогена из окружења на развој сложених поремећаја јесте да је изузетно тешко покренути добро дизајнирану, потпуно контролисану студију. Огроман број збуњујућих променљивих значи да је тешко истражити специфичне факторе из окружења, посебно код људи. Најснажнија метода којом се може проценити допринос окружења етиологији МДД-а била би путем лонгитудиналних рандомизованих покусних експеримената у којима су испитаници насумично изложени факторима ризика и њихов исход је праћен у односу на контроле. Из очигледних етичких разлога, такви приступи нису одрживи у истраживању променљивих као што су тешки стресни животни догађаји, па стога нису доступни чврсти емпиријски докази који директно повезују изложеност исходу. Иако су нам истраживања на животињама дала драгоцени увид у неурохемијски одговор на стресоре из окружења, није познат степен до кога се ови налази могу екстраполирати од лабораторијских глодара до стварних људи.

Интеракције гена и околине: потребни су узрочни механизми

Већина генетичара у понашању би се сложила да је традиционална идеја "природе" и "неговања" као различитих ентитета застарела, а ни гени ни животна средина не би могли да делују изоловано да повећају подложност. Проучавање ефеката интеракције генско окружење је још увек у повојима, а први директни докази за такву интеракцију у етиологији депресије су известили Цаспи и сар. 9 који су открили да полиморфизам гена за транспорт серотонина регулише ефекат стресних животних догађаја на подложност депресији. Наводећи доказе који показују да транспортер серотонина умањује биолошки одговор на стресна искуства, открили су да је ефекат стресних животних догађаја на депресију био значајно јачи код појединаца који су носили барем један 'кратак' алел 5-ХТТЛПР полиморфизма у великој, епидемиолошкој болести утврђени узорак кохорте рођених. Сличне налазе су касније извештавале и друге групе (нпр. Кендлер и др. , 42 Вилхелм и др. 43 ), мада се обе студије на различите начине разликују од оригиналног извештаја Цаспи и сур. 9

Иако су извештаји о интеракцијама гена и животне средине уврстили нови живот у етиолошка истраживања, требало би узети у обзир неколико важних упозорења приликом тумачења резултата ових студија. Прво, имајући у виду тренутно висок ниво интересовања за анализе интеракције генско окружење и потенцијал за лажно позитивне налазе, веродостојност треба дати само пажљиво планираним истраживањима која су заснована на хипотезама. Потребна је репликација налаза интеракције ген-околина пре него што се донесу чврсти закључци, али биће изузетно тешко с обзиром на јединствену природу узорака који се користе за тачно откривање ових ефеката. С тим у вези, важно је да се студије које извештавају о интеракцијама између гена и околине провјере ради одговарајуће научне строгости и да слиједе јасно дефинисан скуп стратегија попут оних које су изнели Моффитт ет ал. 44 Друго, као што је горе поменуто, показано је да гени могу утицати на ризик од развоја депресије посредством осетљивости појединца на стресне животне догађаје. С обзиром на вероватни генетски допринос излагању животне средине, вероватно је да су барем неке посматране интеракције ген-околина заправо резултат интеракције ген-ген, при чему је дотично окружење прокси наследних фактора. Другим речима, улога животне средине у интеракцијама гена и околине може се преплавити, а закључци у вези са стратегијама интервенције у животну средину могу бити преурањени. Треће, важно је признати да статистички докази о интеракцији измереног гена и измереног окружења не дају никакве трагове о молекуларним механизмима који стоје иза интеракције. Разјашњење прецизних механизама (механизама) преко којих дјелују интеракције ген-околина је од виталне важности ако би се постигла било каква дијагностичка, терапијска или превентивна корист. Иако је напредак у препознавању узрока депресије без сумње побољшан истраживањем интеракција између гена и околине, верујемо да релативно неистражено подручје епигенетике може пружити нове увиде и нове експерименталне стратегије за откривање молекуларних механизама иза МДД (види слику 1).

Image

МДД је резултат комбинације генетских, околишних и епигенетских фактора који међусобно делују.

Слика пуне величине

Епигенетика: од основних механизама до етиологије људске болести

Епигенетика се односи на наследну, али реверзибилну регулацију различитих генских функција посредованих претежно променама метилације ДНК и структуре кроматина. 45 Епигенетски процеси су неопходни за нормалан ћелијски развој и диференцијацију и омогућавају регулисање функције гена преко не-мутагених механизама. Посебно је занимљив феномен метилације цитозина, који се појављује на положају 5 прстена цитозин пиримидина у ЦпГ динуклеотидима. Овај процес је суштински повезан са регулацијом експресије гена, при чему многи гени показују обрнуту везу између степена метилације и нивоа експресије. 46 Метилација ових ЦпГ места, прекомерно представљена на ЦпГ острвима у регулаторним областима многих гена, прекида везивање фактора транскрипције и привлачи протеине који везују метил који су повезани са ушутјивањем гена и сабијањем хроматина. Модификација хистона, друга главна врста епигенетског механизма који посредује експресију гена, утиче на структуру кроматина кроз процесе ацетилације хистона, метиловања хистона и фосфорилације хистона. 47 Интересантно је да ове две широке врсте епигенетског механизма нису међусобно искључиве и да делују на више начина. На пример, метил-везивни протеин МеЦП2 се специфично везује за метилиране цитозине, привлачећи хистонске деацетилазе, које хипоацетилирају хистоне. 48 Транскрипционо компетентни хроматин је генерално обогаћен ацетилираним хистонима, али транскрипцијски тихи хроматин је нормално деацетилиран. 49

Као и ДНК секвенца, епигенетски профил соматских ћелија наслеђује се од мајчинске до кћерне хроматиде током митозе. За разлику од ДНК секвенце, која је стабилна и снажно се чува, епигенетски процеси су веома динамични чак и код појединца: могу бити ткивно специфични, развојно регулисани и индуковани излагањем низу околинских фактора. Поред тога, стохастички фактори су важни у одређивању епигенетског миљеа генома. Експерименти који прате наслеђивање епигенетских трагова кроз генерације генетски идентичних ћелија у култури ткива указали су да постоји знатна неверност у одржавању образаца метилације у ћелијама сисара и да су де ново- метилациони догађаји прилично чести током митозе. 50 Верност обраде метилације варира у зависности од генома, при чему неметилирани региони показују вишу стопу грешке у односу на претежно метилиране регионе, нарочито у областима генома изван региона промотора. 51 Закључно, док ДНК секвенце показују готово потпуну интерклоналну верност, епигенетски профил ћелијске лозе може да показује знатне међугенерацијске разлике. Пошто су процеси попут метилације ДНК интегрални у одређивању када и где се одређени гени изражавају - прецизна координација експресије гена је пресудна за правилан развој било ког организма - ова епигенетска метастабилност могла би имати дубоке ефекте. Док ДНК секвенца организма диктира физичку структуру протеина, епигенетски механизми контролирају количину, локацију и време експресије гена.

Традиционално се верује да се епигенетски профили ресетују и бришу током гаметогенезе, чиме се спречава мејотски пренос епигенетских информација између генерација. Међутим, постоје докази да епигенетске ознаке барем неких сисаваца нису у потпуности избрисане током мејозе и могу се преносити с генерације на генерацију. 52 Изгледа да такав мејотички пренос епигенетских алела или „меко наслеђивање“ може бити прилично уобичајена појава у великом броју еукариотских организама. 53 Иако је процес епигенетског насљеђивања очигледно мање стабилан од насљеђивања ДНК секвенце, он пружа још један, често занемарен, механизам путем којег се информације могу пренијети трансгенерацијски. Ово има очигледне последице за традиционалне приступе мапирању гена болести у којима се претпоставља да све наслеђене особине потичу преношењем измена у секвенци ДНК и могу делимично објаснити зашто је истраживачима тешко утврдити специфичне полиморфизме узрочних гена у очигледно врло наследним поремећајима као што су МДД.

Епигенетска истраживања показују да је регулација активности гена од пресудног значаја за нормално функционисање генома. Гени, чак и они који не носе мутације или болести који предиспонирају полиморфизме, могу бити бескорисни или чак штетни ако се не изразе у одговарајућој количини, у право време ћелијског циклуса или у правом одељку језгра. Ћелије раде нормално само ако обе ДНК секвенце и епигенетске компоненте генома правилно функционишу. 46 У вези с тим, епигенетске неправилности су добро окарактерисане у неколико ретких болести као што су Прадер-Вилли, Ангелман и Бецквитх-Виедеманн синдроми. 54 Други синдроми за које се сматра да имају епигенетску етиологију укључују: имунодефицијенцију, нестабилност центромерне регије, синдром фацијалних аномалија (ИЦФ) који је изазван мутацијама у гену ДНК-метилтрансферазе 3Б (ДНМТ3Б); 55 Реттов синдром, неуролошки поремећај који се јавља код жена и који је узрокован мутацијама гена који веже метилцитозин (МеЦП2); 56 Кс-везани синдром α -таласемије / менталне ретардације (АТРКС), изазван мутацијама гена Кс-хромозома АТР-Кс што резултира хипометилацијом понављаних секвенци; 57 и Фрагиле-Кс синдром, што је узроковано комбинацијом генетских и епигенетских механизама. 58 Све је јасније да су епигенетски процеси важни за развој рака. Код различитих карцинома постоји одређени степен епигенетске погрешне регулације, укључујући глобалну хипометилацију на геномском нивоу и хиперметилацију гена за супресију тумора ЦпГ острва. 59 Комплексна немалигна обољења, попут МДД, тешко су истражена из епигенетске перспективе. Као што ће бити дискутирано у даљем тексту, делимична стабилност епигенетских сигнала током мејозе и њихова делимична нестабилност током митозе проистекла од мноштва догађаја у развоју, животној средини и стохастичности, чини епигенетику атрактивним етиолошким кандидатом за такве болести (видети Слику 2).

Image

Епигенетски модел МДД. ( а ) Традиционални етиолошки модели МДД разматрали су само генетске полиморфизме и факторе из окружења. ( б ) Епигенетски модел МДД постулира да епигенетске промене могу бити последица окружења, хормоналних и случајних стохастичких фактора како би се повећала осетљивост на МДД.

Слика пуне величине

Значај епигенетике за етиолошке студије МДД

Несклад МЗ близанаца и утицај на животну средину

Двоструке студије имају снажне импликације генетских фактора у етиологији МДД-а, али као што је случај за сва сложена психијатријска стања, опажа се да су МЗ-близанци значајно мањи од 100%. У класичном приступу истраживања близанаца, у којем се сматра да су близанци МЗ генетски идентични, било каква несклад између МЗ близанаца приписује се искључиво 'не-заједничким' факторима животне средине. Алтернативно објашњење је, међутим, да неке од посматраних фенотипских разлика између МЗ близанаца могу бити резултат епигенетских фактора. 60, 61 Недавно истраживање Фрага и сур. 62 је показао да се прилично дубоке епигенетске разлике по геному јављају током живота МЗ близанаца, истичући динамичку природу епигенетских процеса. Занимљиво је да су се у местима ЦпГ-а појавиле разлике у метилирању близанца МЗ у великом броју специфичних гена који су повезани са психијатријском болешћу, укључујући допамин Д2 рецептор ( ДРД2 ) ген 63 и катехол- О- метилтрансферазу ( ЦОМТ ) ген. 64 Слично томе, показало се да генетски идентичне инбредне животиње показују значајне епигенетске разлике које могу бити повезане са разликама у експресији гена што резултира у изразитој фенотипској варијацији. 65 Све је очитије да су многе од посматраних епигенетских разлика између МЗ близанаца и инбред животиња можда резултат случајних стохастичких догађаја. 60 Може се замислити да се такве стохастичке епигенетске „мутације“ могу нагомилати током милиона милиотских подела које су се догодиле током живота два близанца МЗ-а и могле довести до дубоких промена експресије гена ако постоје у регулаторним областима генома. Предложено је да такве стохастичке епигенетске варијације могу бити важније у сложеним психијатријским поремећајима него што је то тренутно препознато, можда представљајући део ризика који се тренутно приписује факторима животне средине. 66

Of course, the fact that epigenetic differences exist between MZ twins does not rule out the role of environmental factors in disease susceptibility. In fact, there is growing evidence that the environment can itself influence the epigenetic status of the genome – either globally or at specific loci. 67 It is becoming increasingly apparent, for example, that a range of environmental toxins, both chemical and psychosocial, can lead to long-lasting alterations to the epigenetic profile of the genome or specific genes through processes such as the modification of DNA and histones. The fact that epigenetic marks can directly link environmental factors to gene function makes them attractive targets for a mechanistic role in the gene–environment interaction effects that are increasingly being uncovered in aetiological studies of complex diseases. Many environmentally induced epigenetic changes appear to be related to dietary intake (for a detailed review see Waterland and Jirtle 68 ). It appears that DNA methylation can be affected by the dietary levels of methyl-donor components, for example folic acid, and that maternal dietary methyl supplements can increase DNA methylation and alter methylation-dependent phenotypes in mammalian offspring. One classic example is that of the epigenetic state of the agouti viable yellow locus in mice, which contains a gene determining coat colour and can be manipulated by altering the diet of the pregnant female. 69 Certain drugs may also modify epigenetic regulation – the use of metamphetamine, for example, linked to psychiatric illness in humans, alters the DNA methylation profile of genes expressed in the brain. 70 Intriguingly, and perhaps more pertinent to the aetiology of depression, it appears that the psychosocial environment may also mediate gene expression epigenetically. Research by Meaney and colleagues has shown that postnatal maternal care in rats, as measured by increased pup licking, grooming, and arch-backed nursing, leads to epigenetic modification of a NGF1-A transcription factor binding site in the promoter region of the glucocorticoid receptor gene ( NR3C1 ). 71 This finding is of particular relevance to the study of depression given the likely role of both the early rearing environment and the HPA axis in the aetiology of affective disorders.

Proband sex effects

As discussed earlier, the prevalence of MDD is approximately doubled in females compared to males, and several studies suggest that the heritability of the disorder is significantly higher in women. 12, 72 Furthermore, it appears that the genetic aetiology of MDD may differ between the sexes with the overlap of putative genetic factors involved in the disorder being incomplete. 72 Following the investigation of X-linked Mendelian diseases that exhibit sexual dimorphism, one potential explanation is that the overrepresentation of depression in women results from a MDD risk gene on the X chromosome. Several segregation analyses have suggested involvement of X-chromosome genes in MDD (see eg Vaillant et al. 73 ) and certain X-linked genes, for example, GPR50, have been associated with the disorder, 74 although such conclusions are not ubiquitous (see eg Faraone et al. 75 ) and no firm conclusions can yet been drawn about the involvement of X-linked sequence variants in depression.

Skewed X-chromosome inactivation is one X-linked epigenetic process that could potentially cause the excess rates of MDD in women, and also explain female MZ twin discordance. 76 X-inactivation silences gene expression and is initially instigated by expression of the XIST gene and then maintained via DNA methylation and histone modifications. The role of X inactivation is to compensate for the greater dosage of X-linked genes in women (who have two X chromosomes) compared to men (who have one X chromosome). It is generally assumed that in most women X inactivation is stochastic for each cell lineage – either the maternally or paternally inherited X can be silenced – but is maintained throughout subsequent cell divisions. There is, however, increasing evidence that in some cases the selection process is not random. It has been demonstrated, for example, that approximately half the female carriers of X-linked mental retardation exhibit skewed X-inactivation where the activation ratio between the two X chromosomes is 80:20% or higher. 77 Non-random X-chromosome inactivation has been observed in a number of disorders, including several X-linked immunodeficiencies, Lesch–Nyhan disease, incontinentia pigmenti, focal dermal hypoplasia and adrenoleukodystrophy. 78 In the normal population of women without a family history of X-linked disorders, 5–20% of women have constitutional skewing of X inactivation. 79 According to other authors, 30–40% of females exhibit ratios of 60:40% or more, and 10% of normal females demonstrate even more extreme ratios. 78 In studies of MDD, therefore, we propose that the 'skewedness' of the X chromosome should be thoroughly investigated, and if present taken into account when performing genetic studies because the results of linkage and association studies may be mediated by the proportion of females with skewed X-inactivation. Skewed X-inactivation also provides a mechanism for phenotypic discordance between female MZ twins. Male MZ twins will only express X-linked genes inherited from their mothers, but females can express either maternally or paternally inherited genes. Loat and colleagues. 80 have argued that given the random nature of X inactivation, female MZ twin pairs do not necessarily inactivate the same X chromosome and will thus show higher levels of discordance than male MZ twin pairs. To our knowledge, no study has yet tested this theory on individuals with MDD, but analyses on MZ twins assessed at ages 2, 3 and 4 suggests that this pattern is observed for a number of behavioural traits closely related to depression. 80 Another epigenetic phenomenon that may confound X-linked gene studies in MDD is the existence of genes escaping X inactivation. Not all genes on the X chromosome are inactivated, with as many as 15% showing evidence of expression from both X chromosomes. 76, 81 Genes escaping X inactivation are obvious candidates for explaining sexual dimorphism in disease prevalence, especially if no Y-chromosome homologue for those genes exists.

Sex effects have also been recently detected in genetic linkage and association studies of autosomal genes. For example, genome-wide linkage scans of MDD families provide evidence for male-only linkage on chromosome 12q22–q23.2 16 and evidence for female-only linkage on chromosome 2q33–35. 82 There are numerous other examples across the spectrum of psychiatric diseases where autosomal loci exhibit apparently clear-cut sex differences. Sex hormones are the usual 'culprit' used to explain such gender effects in complex disease, based in part on the myriad of data associating hormonal differences with disease states, and their critical involvement in numerous regulatory processes. Little is known, however, about the underlying mechanisms of how sex hormones predispose to or protect from a disease. The gender-specific effects observed in genetic linkage and association studies suggest that chromosomal regions and individual genes may be the target of sex hormone action, but the molecular mechanisms behind these interactions are yet to be elucidated. Although sex hormones cannot change DNA sequence, it is known they can be potent modifiers of epigenetic status and gene expression. There are several reports of the female sex hormone oestrogen altering the chromatin configuration of certain genes. 83, 84 Furthermore, it has been proposed that sex hormones may act to alter the DNA methylation profile of specific loci in the genome, 85, 86 controlling gene expression in a sex-specific manner. It is thus plausible that susceptibly to depression is mediated by the hormone-specific epigenetic modification of genes contained within nominated linkage regions. This may explain some of the sex effects observed widely in genetic linkage and association studies: a specific allele or haplotype may be a risk factor only after epigenetic modification by some aspect of the endocrinological millieu.

Parental origin effects

Another non-Mendelian feature that is commonly observed in studies of psychopathology is a parent-of-origin effect, where disease susceptibility is mediated by parental factors in a sex-specific manner. Parent-of-origin effects are apparent at both a phenotypic level, where the risk to offspring depends on the sex of the affected parent, and also at a molecular level when risk alleles only confer increased susceptibility if they are transmitted from the mother or the father. These effects have been observed in a number of psychiatric phenotypes, including several closely related to major depression. For example, it has been shown that the risk of developing bipolar disorder is higher in offspring with affected mothers than in those with affected fathers. 87 Genome-wide linkage-scans and candidate–gene association studies have also provided some preliminary evidence for parent-of-origin effects in depression. Zill et al. 88 for example, find evidence for a parent-of-origin effect with the GOLF gene, and Schiffer and Heinemann 89 report preferential maternal transmission of a GluR7 gene risk allele to MDD patients. Many other examples, however, have probably gone unnoticed because parent-of-origin effects are not routinely tested in traditional genetic studies. In fact, it is likely that parental origin effects are a much wider phenomenon in psychiatric diseases than it is generally thought given that linkage analyses, as a rule, are performed in a sex-averaged way.

The most likely mechanism behind such parent-of-origin effects is genomic imprinting – the differential expression of the genetic material at either a chromosomal or allelic level depending on whether the genetic material has been transmitted from the paternal or the maternal side. Genomic imprinting involves the epigenetic marking of chromatin, via the modifications of DNA and histones, which results in expression of only one allele at that locus. Genomic imprinting is fundamental to normal mammalian development and growth, and plays an important role in brain function and behaviour. 90 Genomic imprinting is traditionally viewed as an all-or-nothing phenomenon that occurs in only small, clustered regions of the genome. In these imprinted regions only maternally or paternally inherited genes are turned on, but not both, resulting in monoallelic expression, for example, at both H19 and IGF2 . It is estimated that there are between 100 and 200 imprinted loci in the human genome (see //igc.otago.ac.nz/home.html). Recent evidence, however, suggests that imprinting may be more widespread and less clear-cut than originally believed, and this could have important ramifications for our understanding of the aetiology of complex disorders such as depression. Preis et al. 91 used nine transgenic mouse lines to uncover a much more subtle form of imprinting in the murine genome. They found that a high proportion of transgenic lines displayed lower expression of a reporter transgene when it was passed through the maternal line although paternal alleles were expressed as well. It is proposed that these observations may be representative of imprinting patterns across all mammalian genomes, with perhaps the majority of genes demonstrating some degree of skewed allelic expression in a parent-of-origin dependent manner. Conversely, it has also been shown that genes previously believed to exhibit total monoallelic expression as a result of imprinting may actually show considerable heterogeneity. A study examining the allelic expression of three imprinted genes ( SNRPN, IMPT1, IGF2 ) in the normal population found evidence for significant biallelic expression indicating that functional variation at imprinted loci may be a common feature of the mammalian genome. 92

Association of DNA sequence variation with epigenetic variation – epi-alleles, epi-genotypes and epi-haplotypes

As discussed above, few convincing associations between specific polymorphisms and susceptibility to MDD have been revealed by candidate gene studies. One major problem is the heterogeneity apparent in the data generated from these analyses. The pattern of association observed is rarely consistent between studies, and it is not uncommon for different alleles and haplotypes to be associated with the disorder in different study populations. One possible explanation for this heterogeneity comes from the observation that genetic–epigenetic interactions may be commonplace across the genome. 'Epi-alleles' and 'epi-haplotypes' that combine both DNA sequence and epigenetic information may thus be better predictors of the risk for disorders like depression than any of the two components analysed separately. There is increasing evidence that some DNA alleles and haplotypes tend to be associated with a specific epigenetic profile. Of particular interest in this regard is increasing evidence that DNA methylation profiles may be associated with specific DNA alleles in genes putatively linked to mood disorders. For example, the T allele of the C677T polymorphism in the methylenetetrahydrofolate reductase gene ( MTHFR ), recently implicated in depression, 93 is associated with an increased risk of imprinting defects in the Prader–Willi syndrome/Angelman syndrome region of 15q. 94 Furthermore, the C102T polymorphism in the serotonin 5-HT2A receptor gene ( 5HT2AR) , which has been associated with several psychiatric disorders including depression, was found to be methylated specifically on the C allele. 95 Dempster et al. 96 found evidence that methylation in the promoter region of the COMT gene, another locus implicated in numerous psychiatric phenotypes, was associated in a dose-dependent manner with genotype at the val158met polymorphism, with val158 homozygotes exhibiting lower levels of methylation than met158 homozygotes. Finally, a recent epigenetic study of a C/G single nucleotide polymorphism (SNP) in the CDH13 gene in male germline cells revealed that C alleles are predominantly unmethylated, while G alleles are predominantly methylated. 97 The notion that epigenetic changes may be associated with specific DNA sequence changes sheds new light on the inconsistent genetic association studies observed in complex diseases, and suggests that a comprehensive epigenetic analysis of candidate SNPs and haplotypes is warranted.

Epigenetic studies in MDD: technological and methodological complexities

While epigenetics provides a new perspective on the aetiology of major depression, it would be naïve to expect that applying epigenetic theory to molecular-based studies of MDD psychopathology is a straightforward task that can be achieved without encountering a number of technological and methodological complexities. The study of epigenetics, especially in complex diseases, is a relatively new field of research, and optimal laboratory techniques and analysis methods are still being developed. It is vital that laboratory approaches are refined and verified before sweeping conclusions are drawn from experimental data. This is particularly important because epigenetic experiments need to overcome a number of inherent complexities that are not encountered when investigating simple DNA sequence variation. Potential problems surrounding the epigenetic studies can be subdivided into several groups, which will be discussed briefly in the sections below: (1) the technological limitations in identifying epigenetic variation; (2) sample- and target tissue-related issues; (3) the confounding effects of DNA sequence variation; and (4) the interpretation of a cause-effect relationship between epigenetic changes and disease aetiology.

Technological limitations

Whilst it is easy to theorize about the role of epigenetic processes in mediating susceptibility to psychiatric disorders, actually investigating these modifications at a molecular level is not so straightforward. To date, only a few empirical studies have been performed, and it is clear that a number of methodological difficulties need to be overcome before large-scale epigenetic studies can be viably executed.

A number of approaches to investigate DNA methylation have been developed (see Figure 3). Currently, the 'gold standard technique' for fine mapping of methylated cytosines is based on the treatment of genomic DNA with sodium bisulfite, which converts unmethylated cytosines into uracils (and subsequently, via polymerase chain reaction (PCR), to thymidines), whereas methylated cytosines are resistant to bisulfite and remain unchanged. 98 After sodium bisulfite treatment, one crude method to examine DNA methylation is via methylation-specific PCR (MSP). In this approach two PCR reactions are performed on bisulfite-treated DNA with primer sets specific to (i) methylated DNA and (ii) unmethylated DNA. Such an approach can only investigate methylation at a very small number of CpG sites and gives no quantitative information about the degree of methylation. Furthermore, data from experiments utilizing MSP should be treated with caution given the numerous confounding factors that can affect PCR efficiency on bisulfite-treated DNA. A more rigorous method to investigate DNA methylation is bisulfite genomic sequencing. DNA regions of interest are amplified and sequenced to identify C>T transitions or stable C positions, respectively corresponding to unmethylated and methylated cytosines in the native DNA. Typically, PCR amplicons are either sequenced directly to provide a strand-specific average sequence for the population of DNA molecules, or cloned and sequenced to provide methylation maps of single DNA molecules. 98, 99 An alternative to the laborious and expensive sequencing of cloned bisulfite-PCR products is the use of pyrosequencing to accurately quantify the degree of CpG methylation. Pyrosequencing is a sequencing-by-synthesis method that relies on the luminometric detection of pyrophosphate release upon nucleotide incorporation via an enzymatic cascade. Because there is a direct correlation between sequence data and the amount of nucleotides incorporated during the reaction, it provides an accurate method for detecting the precise methylation level at any CpG site giving truly quantitative data that are not achievable using standard bisulfite-sequencing protocols. 100 A major problem with the sodium bisulfite approach is that it results in considerable DNA degradation, and large quantities of genomic DNA material are needed if numerous genomic regions are to be profiled – obviously an issue if valuable, relatively inaccessible tissues such as the brain are to be profiled. One potential method to overcome problems associated with tissue availability is the use of whole-genome amplification of bisulfite-treated DNA. 101 In addition, no consensus has yet been reached on how to best statistically analyse bisulfite-sequence data. Such analyses are unlikely to be straightforward, especially if the differences observed across individuals are subtle as would be expected for disorders such as MDD. One possibility is to use an approach based on epigenetic distance, which reduces bisulfite-sequencing data from cloned PCR products to a binary code for each DNA molecule, and allows patterns of 'epigenetic drift' to be easily ascertained. 102

Image

Experimental approaches to investigate DNA methylation. ( a ) Microarray-based methylation profiling using microarrays can investigate DNA methylation changes at a genome-wide level. In this example the unmethylated fraction of genomic DNA is enriched using methylation-sensitive restriction enzymes and adaptor-ligation PCR and subsequently hybridized on microarrays (see Schumacher et al. 103 ); ( b ) locus-specific methylation analysis using sodium bisulfite treatment and PCR-based sequence analysis.

Слика пуне величине

These traditional, locus-specific techniques limit the number of the CpG sites that can be feasibly assessed, and thus exclude the possibility of performing a genome-wide 'epigenome-scan' to identify novel regions of importance. In recent years, a number of novel, high-throughput microarray-based methods have been developed, which should enable future epigenetic studies to overcome many of these issues. 103, 104 At present these methods have not been widely used and are relatively untested. Two general methods exist for treating and enriching DNA samples before array hybridization: the digestion of genomic DNA with restriction-sensitive enzymes, and the use of antibodies to specifically pull-down methylated cytosines. The enzyme approach cannot be used to interrogate every potential methylated cytosine in the genome, whereas the antibody approach can only examine the methylated fraction of the genome, which is far less informative than the unmethylated fraction. 103 As we have learnt from the use of gene expression microarrays in psychiatry, differences in sample preparation, microarray type, sample labeling and data analysis procedures pose a tremendous challenge to the field, 105 and some degree of standardization is needed across epigenetic studies. A major hurdle to the widespread use of methylation microarrays is cost – for example it is currently prohibitively expensive to scan the entire genome using DNA from a large sample of MDD patients and controls, especially if tissue-specific effects are important and numerous brain regions need to be assessed. Finally, until recently, the resolution of the available low-density arrays has been relatively crude, and the available methodology has not been particularly sensitive to subtle methylation differences. Current genome-wide methylation studies have been biased by the fact that current microarray designs focus primarily on cDNA, promoters, and 5′ regulatory sequences of known genes only. As array technology advances, however, with the development of commercially produced whole-genome 'tiling' arrays containing millions of features allowing an unbiased assessment of the entire genome, microarray studies have the potential to rapidly advance our understanding of the epigenetic mileau of the genome, and provide novel insights into the aetiology of MDD.

This article has been primarily dedicated to the role of DNA methylation in MDD aetiology. This focus partly reflects the fact that methods to examine other epigenetic processes such as histone modifications in psychiatric disorders are a step behind those currently available for DNA methylation analysis. The method used to examine the epigenetic state of histones is chromatin immunoprecipitation (ChIP). One limitation to this approach is the large number of cells needed for each experiment, although recent methodological advances may permit ChIP analysis on as few as 100 cells. 106 Another major problem with ChIP analysis is that, compared to DNA methylation marks, histone modifications are far less stable in post-mortem tissues. In this regard, specific immunoprecipitation protocols applicable to post-mortem brain tissue need to be developed, and the impact of potential confounds such as autolysis time or tissue pH need to be thoroughly examined. Some promising data come from recent investigations that suggest the immunoprecipitation of micrococcal nuclease-digested tissue extracts is a feasible approach to profile histone methylation at defined genomic loci in post-mortem brain. 107 Once histone-stability problems have been addressed, the development of powerful microarray-based 'ChIP-on-chip' methods, in which DNA isolated from ChIPs is hybridized to a microarry chip, should allow genome-wide analysis of histone modifications and provide additional epigenetic information to complement data from genome-wide DNA methylation studies.

Sample and target tissue

To identify epigenetic changes associated with depression, the ideal experiment would investigate prospectively the dynamics of genome-wide epigenetic changes in the brains of individuals who eventually become affected with MDD compared to unaffected control individuals. At the present time, however, limitations with our current range of epigenetic methodologies render such an approach impossible. As it is not yet possible to perform in vivo epigenetic studies, particularly for tissues like the brain, only retrospective study designs using post-mortem brain samples are viable.

Given the role of epigenetics in mediating when and where genes are expressed, an obvious confounding factor in epigenetic studies is tissue heterogeneity. Because different cell types exhibit quite different epigenetic profiles across different genomic regions, specific tissues – that is, the primary sites of disease manifestation – are deemed preferable for aetiological studies. It is likely that for studies of psychiatric disorders such as MDD, the primary focus of aetiological studies will be the numerous brain regions implicated in the disorder. Even within specific-tissue types, however, there is considerable cellular heterogeneity. Tissues like the cortex, for example, consist of numerous different types of neuronal and glial cells, and the detection of cell-type specific epimutations is likely to be difficult unless the epigenetic profile of specific cells can be investigated. This point is highlighted by a recent study identifying epigenetic changes occurring specifically in cortical interneuron cells, suggesting that different cell populations within a single tissue-type can have quite distinct epigenetic profiles. 108 An increasingly popular solution in the epigenetics research field is to apply 'Laser Capture Microdissection' technology, which enables the isolation of specific cell types or single cells from whole tissue avoiding the confounding effects of cell type variation. 109

Despite the problems of tissue specificity, because the availability of fresh brain tissue from well-phenotyped individuals with disorders like MDD is non-existent, one compromise is to use other, more accessible tissue sources like leukocytes for epigenetic profiling in the hope that the patterns observed will reflect those of the real tissue of interest. There is increasing evidence that many epimutations are not limited to the affected tissue or cell type, but can also be detected in other tissues. Good examples are the epimutations at IGF2 110 in lymphocytes and MLH1 in sperm cells, 111 observed in colon cancer patients and epimutations at KCNQ1OT1 in the lymphocytes and skin fibroblasts in Beckwith–Wiedemann syndrome. 112 In fact, peripheral blood-based studies may be useful in revealing epigenetic changes resulting from early embryogenesis, or even highlighting inherited epigenetic variation. The study of peripheral cells may even have some advantages over the use of brain tissue in that they are likely to accumulate fewer epigenetic changes induced by disease-related external factors, such as medications, recreational drugs and stress, which could all be confounding factors to epigenetic studies. The use of peripheral cells would also allow the longitudinal study of epigenetic changes throughout the lifecourse of individuals diagnosed with MDD, providing information about the epigenetic factors associated with the development, remission and relapse of the disorder. Finally, because there have been no thorough epigenetic studies in MDD to date, it is not known how large a sample needs to be investigated. At this stage the degree of any potential epigenetic differences between cases and controls is unknown, although the effects observed are likely to be small.

Defining a 'normal' epigenetic profile and proving a cause–effect relationship between epigenetic differences and MDD

Despite the current interest in the possible role of epigenetic processes in disorders like MDD, very little empirical research has been performed to characterize what actually comprises a 'normal' epigenome. Before we can systematically investigate the epigenetic changes associated with disease, we must first catalogue the genome-wide DNA methylation patterns in all major tissues. This is one of the targets of the Human Epigenome Project (www.epigenome.org), which aims to map all methylation variable positions in the genome. 113 Producing a reference map of the entire human epigenome is going to be a gargantuan task, especially given the huge epigenetic differences that are likely to occur both between tissue/cell types, and within a specific tissue/cell type over the course of development. To date, this private/public consortium has released DNA methylation profiles of the major histocompatibility complex 114 and chromosomes 6, 20 and 22. 115

As is the case for all non-DNA sequence based (neurochemical, pathophysiological and environmental) studies, proving a direct causal link between epigenetic factors and disease is not straightforward. For example, the observation of a different epigenetic profile between depressed and non-depressed individuals does not necessarily indicate a causal relationship between these epigenetic changes and depression. It is possible that any epigenetic changes in depressed individuals are not a cause of, but actually the result of MDD-induced changes in the brain. Given that several exogenous chemicals have been linked with processes like DNA methylation, it is also possible, for example, that the medications used to treat depression may cause epigenetic changes. In this regard, tissues that are not the disease site or directly affected by antidepressant medications, for example peripheral blood cells, could be very useful in elucidating inherited epigenetic changes associated with MDD. The ideal study design to identify causal relationships between epigenetic factors and MDD would be a prospective longitudinal study in which individuals at risk for depression are investigated before they develop the disease.

Confounding effects of DNA variation

A major issue in epigenetic studies is that putative epigenetic differences can be masked by the thousands of DNA sequence variants that exist between individuals. Owing to the nature of the technology currently employed to examine epigenetic changes, DNA sequence polymorphisms are not always easy to differentiate from epigenetic differences. This problem applies to all DNA methylation technologies currently utilized in aetiological studies. Cut sites for methylation-sensitive restriction enzymes, for example, can be created or removed by sequence changes. Sodium-bisulfite conversion reduces methylation status to standard sequence information, and can thus be confounded by SNPs. Two possible study designs can be used to address these problems. First, methylation differences in MZ twins discordant for MDD can be examined. MZ twins have identical genomes, so phenotypic differences cannot be accounted for by DNA sequence changes. However, a potential limitation of using MZ twins is that unaffected co-twins may also be carriers of epigenetic changes that may not be too far from a hypothetical 'threshold' of epigenetic misregulation, above which the twin would present with a clinical diagnosis of MDD. Typical microarray experiments are based on relative differences between two individuals, rather than the absolute size of a putative epigenetic change. It is possible that this difference, between an affected twin (a little bit above the 'threshold') and an unaffected co-twin (a little bit below the 'threshold') may be relatively small and difficult to differentiate from experimental errors. A second approach is to instigate a longitudinal study of epigenetic changes during the course of disease in MDD patients, using DNA taken from easily accessible tissue (eg peripheral blood cells). In such an experiment, the epigenetic profile of DNA samples taken at various time-points could be compared (eg at first diagnosis, remission and relapse). A similar approach has been suggested as a substitute to twin studies in pharmacogenetic investigations. 116 Such a design is powerful as it can inform us about the extent that epigenetic status fluctuates in peripheral blood cells, and may provide an insight into relapse-associated epigenetic changes.

Epigenetics and MDD: vogue, hassle or necessity?

So what is the role of epigenetics in aetiological studies of MDD: vogue, hassle or necessity? The answer is probably a bit of all three. Largely neglected until very recently, the study of epigenetics has become increasingly 'mainstream'. There is a certain buzz amongst the molecular psychiatry research community about the potential role of DNA methylation and histone modifications in a range of psychiatric phenotypes. It is now generally accepted that these epigenetic factors may sit alongside DNA sequence polymorphisms and environmental factors in mediating susceptibility to disorders like MDD. In this article we have discussed the benefits of including epigenetic theory into models of disease aetiology, highlighting how epigenetic mechanisms can account for the many features of MDD that are unexplainable using traditional genetic and environmental approaches (see Table 1).

Theoretical notions about a role for epigenetic processes in the development of MDD do not prove such a link, however. There is a need to move from theory into empirical laboratory-based research, and this is where the current 'vogue' for epigenetics becomes more of a 'hassle'. The study of epigenetics, especially in complex diseases, is a relatively new field of research, and optimal laboratory techniques and analysis methods are still being developed. We should be under no illusion that such experiments are going to be easy. If we are to really fulfill the novel heuristic opportunities that epigenetics provides, the development of novel high-resolution genome-wide methods to scan the epigenome for DNA methylation and histone modifications are vital.

Despite these difficulties, it is also clear that studies investigating epigenetic factors in MDD (as well as various other complex diseases) are a 'necessity'. Years of research effort have been spent attempting to identify the specific genes and environmental factors that were traditionally believed to determine individual susceptibility to MDD. While some progress has been achieved, our focus on only genes, environments and the interactions between them, has left many questions unanswered. Although it would be premature to conclude that epigenetics will lead to revolutionary discoveries in non-Mendelian biology, the study of DNA methylation and histone modifications has the potential to transform our understanding about the molecular aetiology of complex diseases.