Муц1 индукује стечену хеморезистенцију регулирањем абцб1 на егфр-зависан начин | ћелијска смрт и болест

Муц1 индукује стечену хеморезистенцију регулирањем абцб1 на егфр-зависан начин | ћелијска смрт и болест

Anonim

Субјекти

  • Терапијска резистенција против рака
  • Ћелијска сигнализација
  • Хемотерапија
  • Гликопротеини

Апстрактан

Хеморесистенција доприноси релапсу карцинома и повећању смртности код различитих врста карцинома, повећавајући хитну потребу за бољим разумевањем основног механизма. МУЦ1 је ненормално прекомерно изражен у бројним карциномима и повезан је са лошом прогнозом. Међутим, функционални значај МУЦ1 у хеморесистенцији није потпуно расветљен. Овде смо показали да је експресија МУЦ1 значајно индукована у ћелијама које су стекле хеморезистенцију и на транскрипцијском и на посттралационом нивоу. Користећи приступе употреби и губитку функција, показали смо критичну улогу МУЦ1 у индукцији резистенције на лекове. Стимулацијом ЕГФР активације и нуклеарне транслокације, МУЦ1 је повећао експресију АТП-везујућег касета транспортера Б1 (АБЦБ1). Изузетно је да циљано сузбијање ЕГФР-а или АБЦБ1 од стране схРНА-а и инхибитора ефективно преокреће хеморезистенцију. Штавише, истодобна примена инхибитора МУЦ1-ЕГФР-АБЦБ1 са паклитакселом значајно је блокирала не само раст тумора, већ и релапс у моделу миша ксенографта. Наши подаци колективно подржавају модел у којем МУЦ1 индукује стечену отпорност на хемотерапију урегулирањем АБЦБ1 на ЕГФР-зависан начин, пружајући нову молекуларну основу употребе ЕГФР инхибитора у МУЦ1-позитивним карциномима за спречавање резистенције на хемотерапију.

Главни

Хеморесистенција је један од важних механизама одговорних за рецидив тумора и лошу прогнозу разних типова рака. 1, 2, 2 Паклитаксел (ПТКС) је лек који уништава тубулин у лечењу широког спектра тумора. 4, 5, 6 Иако су студије откриле механизме отпорности на ПТКС у неколико малигних обољења, бројна критична питања остају, што захтева даљу истрагу. Показано је да транспортери касета за везивање АТП-а селективно испумпавају цитотоксичне лекове из ћелија што резултира мултипарктном резистенцијом. 7 Хумани АБЦ транспортер Б1 (АБЦБ1), такође познат као п-гликопротеин (Пгп), један је од добро окарактерисаних АБЦ транспортера са најширем специфичношћу супстрата. Многи лекови за хемотерапију против рака су супстрати за АБЦБ1, укључујући ПТКС, винкристин, доксорубицин и етопосид. 8, 9 АБЦБ1 је претјерано изражен код пацијената са карциномом који имају лош одговор на хемотерапију. 10, 11, 12 Да би се превазишла хеморесистенција изазвана АБЦБ1, развијено је неколико фармаколошких инхибитора, али са ограниченим успехом у клиници због токсичности, што се превасходно приписује критичним функцијама АБЦ транспортера у различитим нормалним ткивима у физиолошком очистку катаболита и ксенобиотици. 13, 14

Муцин 1 (МУЦ1) је трансмембрански гликопротеин. У нормалним ткивима, МУЦ1 се дистрибуира на апикалној површини ћелија луминалног епитела и формира муцинозни гел са осталим члановима муцина како би заштитио темељни епител. 15, 16 Међутим, МУЦ1 је аберантно гликозилиран и прекомерно изражен у многим карциномима и повезан је са лошим исходима, 17, 18 укључујући рак грлића материце 19 и рак плућа. 20 Доста доказа указује на онкогене функције за МУЦ1, које (1) потичу активацију рецептора тирозин киназа и сигнализацију низводно 21, 22 (2) смањује апоптотски одговор на генотоксични и оксидативни стрес 23 и регулише Внт / β- катенин, 24, 25 п53, 26, 27 матрикс металопептидаза (ММП13) 28 и НФ-Б Б 29 . Штавише, нађено је да прекомерна експресија МУЦ1 индукује трансформацију у ћелијама и трансгеничним моделима миша. 15, 18 Недавно, све већи број доказа показао је кључну улогу МУЦ1 у терапијској отпорности код одређених врста тумора. 30 гена регулисаних МУЦ1 високо предиктивно показују клинички исход код пацијената са карциномом дојке и плућа. 20, 31 Прекомерна експресија МУЦ1-Ц индукована хемотерапијске резистенције у ћелијама рака панкреаса повећањем протеина-1 из вишеструких лекова (МРП1, АБЦЦ1). 32 Наше претходне студије су такође показале да је МУЦ1-Ц повезан са мутацијом атаксије телангиектазије (АТМ) и Х2АКС, заштићен од ћелијске смрти изазване ИР-ом. 33

У овој студији имали смо за циљ да истражимо однос између МУЦ1 и ПТКС отпорности и да разрешимо молекулски механизам који стоји у основи хеморезистенције. Открили смо да ПТКС индукује МУЦ1, који је потом допринео хеморезистенцији урегулацијом АБЦБ1 кроз сарадњу са нуклеарним ЕГФР-ом. Наш рад је открио нови механизам за МУЦ1-посредовану регулацију АБЦБ1, носећи важне терапијске импликације у превазилажењу хеморезистенције МУЦ1-позитивних тумора.

Резултати

МУЦ1 експресија се индукује током стечене хеморесистенције

Анализа базе података ОНЦОМИНЕ открила је прекомерну експресију МУЦ1 код рака грлића материце (допунска слика С1А) и рака плућа (допунска слика С1Б). С обзиром на повезаност МУЦ1 са хеморезистенцијом, покушали смо истражити потенцијалну умешаност МУЦ1 у хеморезистенцију на карцином грлића материце и плућни мукоепидермоидни карцином плућа (ПМЦ). Прво смо успоставили ћелијску линију отпорну на ПТКС ХеЛа229 / ТР. Дуготрајно лечење ПТКС-ом резултирало је знатном индукцијом експресије МУЦ1 на нивоу мРНА и протеина у ћелијама ХеЛа229 / ТР (слика 1а), што је праћено са приближно 15-пута већим повећањем вредности ИЦ50 у односу на родитељске ћелије ХеЛа229 (допунска Слика С1Ц). Слична стратегија је такође коришћена за ПМЦ ћелијску линију НЦИ-Х292. Резултати су показали да је повећана МУЦ1 експресија ПТКС третманом повезана са индукцијом хеморезистенције (слика 1б и додатна слика С1Д).

Image

МУЦ1 експресија се индукује током стечене хеморесистенције. ( а ) Нивои мРНА и протеина МУЦ1 у матичним ћелијама ХеЛа229 (П) и ХеЛа229 / ТР (ТР) су мерени РТ-кПЦР (лево) и Вестерн блот (десно). ( б ) Нивои мРНК и протеина МУЦ1 у матичним (П) и резистентним на ПТКС ћелијама НЦИ-Х292 / ТР (ТР) мерени су РТ-кПЦР (лево) и Вестерн блот (десно). ( ц ) Ћелије ХеЛа229 су третиране различитим дозама ПТКС-а током 48 х. Изведен је РТ-кПЦР за идентификацију мРНА МУЦ1. ( д ) ХеЛа229 ћелије су трансфициране пГЛ3-МУЦ1 промотором (500 нг) и затим су третиране назначеном дозом ПТКС-а током 48 х. Релативни набори активности луциферазе израчунати су у односу на 0 нМ ПТКС третман (линија 1). ( е ) ћелије ХеЛа229 су третиране различитим дозама ПТКС-а током 48 х. Вестерн блот је изведен да се идентификује протеин МУЦ1. ( ф ) ћелије ХеЛа229 су трансфициране пИРЕСпуро2-МУЦ1-ХА (МУЦ1-ХА) или векторским плазмидима. Двадесет и четири сата након трансфекције, ћелије које експримирају МУЦ1-ХА третиране су са ДМСО (0 нМ) или 10 нМ ПТКС још 24 сата, а затим је извршен вестерн блот да се идентификује накупљање егзогене ХА означене МУЦ1-Ц. ( г ) ХЕК293Т ћелије су трансфициране са пИРЕСпуро2-МУЦ1-ХА и одабран је клон стабилне експресије. Ћелије су третиране назначеним дозама ПТКС-а током 48 х. Вестерн блот је изведен да се идентификује експресија МУЦ1. ( х ) ХеЛа229 ћелије су третиране са ДМСО (0 нМ) или 10 нМ ПТКС током 48 сати, а затим изложене циклохексимиду (ЦХКС) (50 µг / мл) на одређено време. Извршено је Вестерн блот, преостали ниво МУЦ1-Ц квантификовао је Имаге Студио Лите, верзија 3.1 (Ли-Цор, Линцолн, НЕ, САД) и затим је упоређен са почетним нивоом (0 х). Кривуља полуживота била је просек три независна експеримента. Подаци су приказани у три независна експеримента, средња вредност ± СД ( н = 3)

Слика пуне величине

Следеће смо истражили улогу МУЦ1 у модулацији одговора ћелија рака на терапију пратећи експресију МУЦ1 у родитељским ћелијама ХеЛа229 третиране ПТКС-ом. РТ-кПЦР је открио да је експресија МУЦ1 мРНА значајно индукована ПТКС (слика 1ц), посебно у дози од 5 нМ. Индукција МУЦ1 од 10 и 15 нМ ПТКС је такође била очигледна, али релативно скромна. Надаље смо поткријепили ПТКС-индуцирану транскрипцију МУЦ1 провођењем испитивања МАК1 заснованог на промотору. Активност транскрипције показала је сличан образац као индукција мРНА (слика 1д). Резултати заједно показују да је ПТКС транскрипционо регулисана МУЦ1 експресија. Следеће смо испитивали ефекат ПТКС-а на МУЦ1 на нивоу протеина. И нивои МУЦ1-Н и МУЦ1-Ц протеина су значајно повишени на начин зависан од дозе у ћелијама третираним ПТКС-ом (Слика 1е). Експеримент временским током показао је да је лечење ХеЛа229 ћелија са 5 нМ ПТКС резултирало повећањем протеина МУЦ1 већ у 48 х (допунска слика С1Е). Занимљиво је да смо открили да се МУЦ1 протеин почео повећавати на 5 нМ, али се није повећавао на 15 нМ. Подаци сугерирају механизам поред регулације транскрипције на нивоу МУЦ1 изазване ПТКС-ом. Да би се испитала та могућност, ћелије ХеЛа229 су пролазно трансфициране МУЦ1-ХА и изложене су 10 нМ ПТКС. Вестерн блот са анти-ХА антителом указивао је да егзогено експримирани МУЦ1 такође индукује ПТКС (слика 1ф). Слични резултати су такође примећени у ћелијама ХЕК293Т са стабилно експримираним МУЦ1-ХА (слика 1 г). Резултати су показали механизам пост-транскрипцијске регулације МУЦ1 помоћу ПТКС-а. У складу са овим појмом, испитивање полуживота показало је дужи полуживот МУЦ1 у ћелијама за третман ПТКС (~ 12 х) у односу на контролне ћелије (~ 5 х) (слика 1х и допунска слика С1Ф). Резултати заједно сугеришу да је ПТКС третман регулирао МУЦ1 транскрипционо као и пост-транслационо.

МУЦ1 модулира хемосензитивност у оба рака

Да бисмо истражили да ли је ПТКС-индукована МУЦ1 одговорна за опажену резистенцију у ћелијама рака, утишали смо експресију МУЦ1 у ћелијама ХеЛа229 / ТР. Мерење реакције ћелије на ПТКС показало је да је отпорност на ПТКС значајно смањена након утишања експресије МУЦ1 у ХеЛа229 / ТР (слике 2а и б и додатна слика С2А), потврђујући критичну улогу МУЦ1 у стеченој ПТКС отпорности. Срушавање експресије МУЦ1 у НЦИ-Х292 такође је указало на важну улогу МУЦ1 у ПТКС отпорности (слике 2ц и д и додатна слика С2Б), сличну оној у ХеЛа229. Да бисмо додатно потврдили допринос МУЦ1 хемосензитивности, користили смо другачији приступ утишавању МУЦ1 у ХеЛа229. Вестерн блот је потврдио да је експресија МУЦ1 ефикасно ослабљена у два одвојена клона која експримирају плазмиде схМУЦ1-А и схМУЦ1-Б, респективно (Слика 2е). Резултати су показали да ћутање МУЦ1 експресије значајно смањује преживљавање у ПТКС-третираним ћелијама (слика 2ф) и ИЦ50 вредности за ПТКС (допунска слика С2Ц). Треба напоменути да ћутање МУЦ1 има мало утицаја на ћелијску одрживост и омјер пролиферације ХеЛа229 / ТР (допунска слика С2Д) и ХеЛа229 ћелија (допунска слика С2Е). Даље смо потврдили улогу МУЦ1 експериментом спасавања. Увођењем МУЦ1-ХА отпорног на ММ-1-схМУЦ1-Б (слика 2 г) назад у ћелије ХеЛа229 / схМУЦ1-Б вратио је отпорност на ПТКС (слика 2х). Ови подаци заједно подржавају да МУЦ1 има важну улогу у модулацији осетљивости ћелија рака на ПТКС.

Image

МУЦ1 модулира хемосензитивност у ћелијама рака. ( а ) Вестерн блот назначених протеина у ћелијама ХеЛа229 / ТР / схЦТЛ и ХеЛа229 / ТР / схМУЦ1 са β- актином као контролом оптерећења. ( б ) ћелије ХеЛа229 / ТР / схЦТЛ и ХеЛа229 / ТР / схМУЦ1 посејане су у плочицу са 96 јажица (6000 ћелија по лежишту), култивисане преко ноћи и затим третиране различитим концентрацијама ПТКС током 48 х. Станична виталност мерена је ЦЦК8 тестом. ( ц ) Вестерн блот назначених протеина у ћелијама НЦИ-Х292 / ТР / схЦТЛ и НЦИ-Х292 / ТР / схМУЦ1 са β- актином као контролом оптерећења. ( д ) НЦИ-Х292 / ТР / схЦТЛ и НЦИ-Х292 / ТР / схМУЦ1 ћелије су посејане у плочу са 96 јажица (10000 ћелија по бунару), култивисане преко ноћи и затим третиране различитим концентрацијама ПТКС током 48 х. Станична виталност мерена је ЦЦК8 тестом. ( е ) ХеЛа229 ћелије су стабилно трансфициране пРНАУ6.1-схЦТЛ, пРНАУ6.1-схМУЦ1-А или пРНАУ6.1-схМУЦ1-Б плазмиди и подвргнуте западном блоту са назначеним антителом. ( ф ) ћелије ХеЛа229 / схЦТЛ и ХеЛа229 / схМУЦ1 су третиране са различитим концентрацијама ПТКС током 48 х. ЦЦК8 тестови су примењени да би се открила виталност ћелије. ( г ) Дијаграм дивљих и синонимних мутираних МУЦ1 секвенци. ( х ) ХеЛа229 / схМУЦ1-Б ћелије су трансфициране с пИРЕСпуро2-МУЦ1-ХА (МУЦ1-ХА) резистентним на пМУЦ1-ХА (вектор плазмиде). Вестерн блот је изведен да се идентификује експресија МУЦ1 (лево). Ћелије су третиране са ДМСО (0 нМ) или 5 нМ ПТКС током 48 х. ЦЦК8 тестови су примењени да би се открила виталност ћелија (десно). Подаци су приказани у три независна експеримента, средња вредност ± СД ( н = 3)

Слика пуне величине

МУЦ1 повисује АБЦБ1 након хемотерапије

Опште је примећено да појачана експресија транспортера АБЦ доприноси вишеструкој резистенцији у ћелијама рака. 34 Стога смо питали да ли АБЦ транспортери могу бити умешани у хеморезистенцију која зависи од МУЦ1. У том циљу, упоредили смо ћелије са недостатком МУЦ1 са искусним ћелијама за експресију АБЦ транспортера. Међу девет познатих транспортера повезаних са отпорношћу на ПТКС, мРНА (допунска слика С3А) и ниво протеина (допунска слика С3Б) АБЦБ1 значајно су регулисани у ХеЛа229 / схМУЦ1с у поређењу са ХеЛа229 / схЦТЛ ћелијама. У складу са регулацијом експресије АБЦБ1 зависном од МУЦ1, ПТКС је у индукцију гена АБЦБ1 (допунска слика С3Ц) и протеина (слика 3а) у ћелијама ХеЛа229 / схЦТЛ, а тај ефекат ПТКС је уклоњен у ћелијама ХеЛа229 / схМУЦ1. Да бисмо искључили могућност ефекта ван циља, извели смо спасилачки експеримент поновним изражавањем МУЦ1-ХА назад у ХеЛа229 / схМУЦ1-Б ћелије. Подаци су показали да поновна експресија МУЦ1 обнавља израз АБЦБ1 (Слика 3б). У складу са овим појмом, ниво мРНА (слика 3ц лево) и ниво протеина (слика 3ц десно) АБЦБ1 су регулисани у ћелијама ХеЛа229 / ТР у поређењу са родитељским ћелијама ХеЛа229. Ова регулација АБЦБ1 зависна од МУЦ1 додатно је подржана тиме што је утишавање МУЦ1 у ћелијама ХеЛа229 / ТР резултирало смањењем и АБЦБ1 мРНА (слика 3е лево) и нивоа протеина (слика 3е десно). Слични резултати виђени су у родитељским и НЦИ-Х292 / ТР ћелијама (слике 3д и ф). Збирно, ови резултати су показали да је МУЦ1 одговоран за индукцију АБЦБ1 од стране ПТКС-а.

Image

МУЦ1 појачава експресију АБЦБ1 након хемотерапије. ( а ) ХеЛа229 / схЦТЛ и ХеЛа229 / схМУЦ1-Б су третирани са 10 нМ ПТКС током назначеног времена. Вестерн блот је извршен да се испита ниво протеина АБЦБ1 и МУЦ1-Ц-терминала (МУЦ1-Ц) са П- актином као контролом оптерећења. ( б ) ХеЛа229 / схМУЦ1-Б ћелије су трансфициране са пИРЕСпуро2-МУЦ1-ХА (МУЦ1-ХА) резистентним на пМЕСл-Б или векторским плазмидима. Двадесет и четири сата након трансфекције, ћелије су третиране ПТКС (5 нМ) 48 х. Вестерн блот је изведен да се идентификује експресија протеина АБЦБ1. ( ц и д ) Нивои мРНА и протеина АБЦБ1 у ћелијама ХеЛа229П / ТР ( ц ) или НЦИ-Х292П / ТР ( д ) детектиране су РТ-кПЦР (лево) и Вестерн блот (десно) са β- актином као унутрашњим контрола. ПТКС ћелијске линије отпорности су култивиране у медијуму без ПТКС. ( е и ф ) Нивои мРНА и протеина АБЦБ1 у ХеЛа229 / ТР / схЦТЛ и ХеЛа229 / ТР / схМУЦ1с ( е ) или НЦИ-Х292 / ТР / схЦТЛ и НЦИ-Х292 / ТР / схМУЦ1с ( ф ) ћелије су детектиране од РТ-кПЦР (лево) и Вестерн блот (десно) са β- актином као унутрашњом контролом. Подаци су приказани у три независна експеримента, средња вредност ± СД ( н = 3)

Слика пуне величине

Инхибиција АБЦБ1 смањује хеморесистенцију

Да бисмо утврдили да ли је АБЦБ1 одговоран за отпорност на ПТКС зависну од МУЦ1, обновили смо експресију АБЦБ1 у ћелијама дефицитарним МУЦ1. Експресија АБЦБ1 је заиста била повезана са значајним повећањем отпорности на ПТКС (слике 4а и б). Супротно утишавање АБЦБ1 у ћелијама ХеЛа229 / ТР резултирало је значајним повећањем осетљивости на ПТКС (слике 4ц и д). Да потврдимо резултате добијене генетским приступом, користили смо фармаколошку методу применом два специфична АБЦБ1 инхибитора, верапамила и зосуквидара. Третман ХеЛа229 са АБЦБ1 инхибиторима такође је умањио отпорност на ПТКС (допунске слике С4А и С4Б). У складу са овим опажањима, инхибитори АБЦБ1 су поделили осетљивост и на ХеЛа229 / ТР (слике 4е и ф) и на НЦИ-Х292 / ТР (слике 4г и х) на ПТКС. Занимљиво је да је утишавање МУЦ1 експресије такође сензитизовало ћелије на друге супстрате АБЦБ1, укључујући доксорубицин, винкристин, етопозид и епирубицин (допунске слике С4Ц-С4Ф). Ови резултати колективно су показали да је АБЦБ1 одговоран за хеморезистенцију изазвану МУЦ1 у ћелијама родитељског и лека.

Image

МУЦ1 посредује хеморезистенцију преко АБЦБ1. ( а и б ) ХеЛа229 / схМУЦ1-Б ћелије су пролазно трансфициране са АБЦБ1 плазмидима (АБЦБ1) или векторским плазмидима (вец), а затим су третиране са ПТКС током 48 х. ( а ) Вестерн блот је коришћен за идентификацију израза АБЦБ1. ( б ) Испитивање ЦЦК8 је извршено да би се испитала ћелијска виталност ћелија. ( ц ) Вестерн блот је коришћен за идентификацију експресије АБЦБ1 у ХеЛа229 / ТР / схЦТЛ и ХеЛа229 / ТР / схАБЦБ1 ћелијским линијама са β- актином као контролом оптерећења. ( д ) ЦЦК8 је извршен да би се идентификовала ћелија одрживост ХеЛа229 / ТР / схАБЦБ1 и њене контролне ћелијске линије третиране са ПТКС током 48 х. ( е и ф ) Тестови ЦЦК8 примењени су за анализу пролиферације ћелија ХеЛа229 / ТР третиране са ПТКС (40 нМ) у комбинацији са верапамил (25 μг / мл) ( е ) или зосуквидар (0, 2 μМ) ( ф ) за назначене дана. ( г и х ) Тестови ЦЦК8 примењени су за анализу пролиферације ћелија НЦИ-Х292 / ТР у третману ПТКС (20 нМ) у комбинацији са верапамил (20 µг / мл) ( г ) или зосуквидар (2 µМ) ( х ) на наведене дане. Подаци су приказани у три независна експеримента, средња вредност ± СД ( н = 3)

Слика пуне величине

МУЦ1 појачава нуклеарну транслокацију ЕГФР-а и повећава АБЦБ1

Следеће смо истражили како је МУЦ1 регулирао АБЦБ1. С обзиром на повезаност МУЦ1 са ЕГФР стазом 35, 36 и последњом у регулацији експресије АБЦБ1, 37, 38, поставили смо питање да ли је индуцирана МУЦ1 експресија АБЦБ1 посредована ЕГФР стазом. Ову хипотезу смо тестирали лечењем ћелија са ПТКС-ом у комбинацији са ерлотинибом, инхибитором ЕГФР-а. Ерлотиниб је ефикасно блокирао ЕГФР фосфорилацију и ПТКС-индуцирану АБЦБ1 експресију у ХеЛа229 / схЦТЛ ћелијама (слика 5а). У складу с овим резултатима, блокирање ЕГФР фосфорилације ерлотинибом у ћелијама ХеЛа229 / ТР и НЦИ-Х292 / ТР повезано је са изразитим смањењем обиља МУЦ1, као и АБЦБ1 (слике 5б и ц). Квантификација нивоа транскрипта показала је да ерлотиниб спречава ПТКС-индуковано повећање АБЦБ1 мРНА у ћелијама ХеЛа229 (допунска слика С5А) и ХеЛа229 / ТР ћелија (слика 5д), као и НЦИ-Х292 / ТР ћелијама (слика 5е). Поред тога, утишавање ЕГФР-а у ћелијама ХеЛа229 / ТР такође је умањило АБЦБ1 (допунска слика С5Б) и хеморезистенцију (допунска слика С5Ц). Ови резултати сугерирају да, иако сам ЕГФР има мало ефекта, он је модулирао експресију АБЦБ1 изазване МУЦ1. У прилог важности ЕГФР / МУЦ1 у транскрипцијској регулацији АБЦБ1, ерлотиниб је значајно сензибилисао ХеЛа229 (слика 5ф) и ХеЛа229 / ТР (слика 5г) на инхибицију раста изазвану ПТКС-ом, као и НЦИ-Х292 / ТР ћелије (слика 5х ). Све у свему, резултати су показали да је МУЦ1 / ЕГФР укључен у обогаћивање АБЦБ1 изазваним ПТКС-ом.

Image

Инхибиција ЕГФР блокира индукцију АБЦБ1 и резистенцију на лек . ( а ) ХеЛа229 / схЦТЛ и ХеЛа229 / схМУЦ1 ћелије су третиране са ПТКС (10 нМ) у одсуству или присуству инхибитора ерлотиниба ЕГФР (5 μМ) у току 72 х. Вестерн блот је извршен да би се открила експресија назначених протеина са β- актином као контролом оптерећења. ( б ) ХеЛа229 / ТР ћелије су култивисане у медијуму са 25 нМ ПТКС током 24 сата, а затим су третиране ерлотинибом (20 μМ ) (ТР / Е) током 48 сати. Вестерн блот је извршен да би се открила експресија назначених протеина. ( ц ) НЦИ-Х292 / ТР ћелије су култивисане у медијуму са 10 нМ ПТКС током 24 сата, а затим су третиране ерлотинибом (10 µМ ) (ТР / Е) 48 х. Вестерн блот је изведен да се открију назначени протеини. ( д и е ) РТ-кПЦР је изведен да се идентификује ниво мРНА АБЦБ1 у ћелијама ХеЛа229 ( д ) и НЦИ-Х292 ( е ). ( ф ) Ефекат комбинације ерлотиниба (5 μМ) и ПТКС (10 нМ) у ХеЛа229 / схЦТЛ и ХеЛа229 / схМУЦ1 ћелијама је анализиран током 48 х ЦЦК8 тестом. ( г ) ћелије ХеЛа229 (П) и ХеЛа229 / ТР (ТР) су третиране са ПТКС (10 нМ) у комбинацији са ерлотинибом (Ерл, 20 μМ ); ( х ) НЦИ-Х292 (П) и НЦИ-Х292 / ТР (ТР) ћелије су третиране са ПТКС (20 нМ) у комбинацији са ерлотинибом (Ерл, 10 μМ ). ЦЦК8 тест коришћен је за анализу виталности ћелије за 48 х. Подаци су приказани у три независна експеримента, средња вредност ± СД ( н = 3)

Слика пуне величине

Да бисмо разумели како ЕГФР може утицати на регулацију АБЦБ1 посредовану МУЦ1, испитали смо да ли ЕГФР може да реагује на МУЦ1 прво изводећи експеримент фракције фракције ћелије. Резултат је открио да је лечење ПТКС-ом повезано са повећањем и МУЦ1 и ЕГФР-а у језгру, али са мањом променом цитоплазме (допунска слика С5Д). Извршили смо имунофлуоресцентно бојење да бисмо потврдили резултат експеримената фракције фракције. Заиста, ПТКС третман није само изазвао повећану нуклеарну дистрибуцију, већ и колокализацију МУЦ1 и ЕГФР (слика 6а). Треба напоменути да је нуклеарна колокализација МУЦ1 и ЕГФР изазвана ПТКС-ом ефикасно блокирана инхибицијом ЕГФР-а (слика 6а). Инхибицијски ефекат ерлотиниба на нуклеарну дистрибуцију МУЦ1 и ЕГФР изазвану ПТКС-ом даље је потврђен тестом фракције фракције ћелије (Слика 6б). Имунопреципитација открила је да се везивање МУЦ1 и фосфорилираног ЕГФР-а значајно повећало ПТКС третманом и ефикасно блокирало ерлотинибом (допунска слика С5Е). С обзиром на то да су вишеструке студије укључивале МУЦ1 26, 28, 39 и ЕГФР 40 у регулацију транскрипције као коактиваторе, затим смо истражили да ли ПТКС-индукована интеракција између МУЦ1 и ЕГФР у језгру може допринети транскрипцији АБЦБ1. У ту сврху, ЦхИП испитивање је извршено у ћелијама ХеЛа229 и ХеЛа229 / ТР. Резултат је показао да се МУЦ1 углавном везује за три региона промотора АБЦБ1: −400 до +200, −1150 до −1400 и −1650 до −1900, које су унутар истих секвенци као и места за везивање ЕГФР (допунске слике С5Ф и С5Г). Х3К27Ац-бингинг локација означава регију која се активира транскрипцијом. У складу са претходним резултатима, третман ерлотинибом значајно је смањио везивање МУЦ1 и ЕГФР на промотор АБЦБ1, посебно у области од +1 до +200 (слика 6ц). Да бисмо потврдили транскрипциону регулацију АБЦБ1 помоћу МУЦ1 / ЕГФР, извели смо тест луциферазом трансфектирањем ћелија ХеЛа229 / схМУЦ1-Б с МУЦ1-ХА плазмидом, заједно са извештачима луциферазе вођене промотором АБЦБ1. МУЦ1 експресија је стимулисала активност луциферазе, која је додатно појачана ПТКС третманом. У складу са налазом у ЦхИП експерименту, овај ефекат је посебно посредован у области од -200 до + 200бп (слика 6д). Поред тога, тишина МУЦ1 или ЕГФР ослабила је транскрипцију АБЦБ1, додатно откривајући важну улогу МУЦ1 / ЕГФР у регулацији АБЦБ1 (слика 6е). Ови подаци колективно сугеришу да МУЦ1 активира ЕГФР и индукује транскрипцију АБЦБ1 у ћелије ХеЛа229 и НЦИ-Х292.

Image

МУЦ1 појачава нуклеарну транслокацију ЕГФР-а и повећава АБЦБ1 након ПТКС третмана. ( а ) ХеЛа229 ћелије су третиране ПТКС (10 нМ) у одсуству или присуству ерлотиниба (Ерл, 5 μМ ) 12 х. МУЦ1-Ц (зелена) и ЕГФР (црвена) детектирани су имунофлуоресценцијом. Нуклеи су обојени ДАПИ (плави). ( б ) ХеЛа229 / схЦТЛ и ХеЛа229 / схМУЦ1 ћелије су третиране са 10 нМ ПТКС у одсуству или присуству ерлотиниба (5 μМ) 12 х, а затим су пречишћени нуклеарни и цитоплазматски протеини. Вестерн блот је изведен да би се открила експресија назначених протеина, а Ламин Б и И κ Б- α коришћени су као контрола оптерећења одвојено за нуклеарни и цитоплазматски протеин. ( ц ) ХеЛа229 (П) и ХеЛа229 / ТР ћелије су третиране (ТР / Е) или без (ТР) ерлотиниба (20 μМ) током 48 х, а затим је извршен ЦхИП тест са анти-МУЦ1-Ц, ЕГФР и хистоном Х3 (ацетил К27, Х3К27Ац) антитела, респективно. Извршен је РТ-кПЦР за откривање потенцијалне секвенце везивања у промотору гена АБЦБ1. Као позитивна контрола коришћена је Х3К27Ац-ЦхИП. Студентов т- тест је изведен између П и ТР или ТР и ТР / Е група, * П <0, 05, ** П <0, 01 и *** П <0, 001. ( д ) ХеЛа229 / схМУЦ1-Б ћелије су трансфициране пГЛ3-АБЦБ1 промотором или пГЛ3-базичним плазмидима (500 нг) са пИРЕСпуро2-МУЦ1-ХА (МУЦ1-ХА) резистентним плазмидима или векторским плазмидима (400 нг), затим 24 сата након трансфекције, ћелије су третиране са ПТКС (10 нМ) 12 х. Откривена је активност луциферазе. ( е ) ХеЛа229 / ТР / схЦТЛ или ХеЛа229 / ТР / схМУЦ1 или ХеЛа229 / ТР / схЕГФР ћелије су трансфициране пГЛ3-АБЦБ1 промотором или пГЛ3-базичним плазмидима (500 нг), активност луциферазе је измерена 36 х након трансфекције. Релативни набори активности луциферазе израчунати су у поређењу са пГЛ3-базичним плазмидима. Подаци су приказани у три независна експеримента, средња вредност ± СД ( н = 3)

Слика пуне величине

Истодобна примена оси МУЦ1 – ЕГФР – АБЦБ1 и ПТКС спречава рецидив тумора

Да бисмо истражили допринос МУЦ1 хеморезистенцији ин виво , генерисали смо ксенографт моделе миша. Тумори добијени ХеЛа229 / схЦТЛ су у почетку били осетљиви на ПТКС лечење, што се одразило на заустављени раст. Међутим, тумори су наставили раст на дан 21 након завршетка ПТКС третмана (слика 7а), што је у складу са стеченом ПТКС резистенцијом. Критична улога МУЦ1 у овој хеморесистенцији доказана је открићем да је исцрпљивање МУЦ1 повезано не само са смањењем раста тумора, већ и са потпуном спречавањем рецидива тумора након завршетка ПТКС третмана (слике 7а и б). У складу са нашим ин витро подацима, ПТКС третман изазвао је повишене нивое експресије МУЦ1, АБЦБ1 и значајно повећање нуклеарне локализације ЕГФР-а у туморским ткивима (слика 7ц). Треба напоменути да су ови ефекти били евидентни само у ХеЛа229 / схЦТЛ тумору, али не и у ХеЛа229 / схМУЦ1 тумору (Слика 7ц), подржавајући зависност од МУЦ1. Бојање ТУНЕЛ-ом открило је да ПТКС третман индукује више апоптозе у ХеЛа229 / схМУЦ1 туморима него оне у ХеЛа229 / схЦТЛ туморима (Слика 7д). Да бисмо испитали допринос МУЦ1 / ЕГФР-АБЦБ1 оси на хеморезистентност тумора, лечили смо мишеве који носе тумор ХеЛа229 / схЦТЛ са ПТКС у комбинацији са верапамил или ерлотинибом. Слично сензибилизирајућем ефекту схМУЦ1, верапамил или ерлотиниб су у значајној мери повећали ПТКС-индуцирану инхибицију раста тумора (Слика 7е, Допунске слике С6А и С6Б). Треба приметити да је мала разлика у телесној тежини мишева унутар група лека и комбинованог лечења (допунска слика С6Ц), што указује да третмани не изазивају значајну токсичност. Ови подаци колективно подржавају критичну улогу оси МУЦ1 / ЕГФР-АБЦБ1 у стеченој хеморезистенцији ћелија ХеЛа229, и штавише, циљајући ову осовину може ефикасно превазићи хеморезистенцију.

Image

Истодобна примена инхибитора МУЦ1 – ЕГФР – АБЦБ1 оси и ПТКС спречава рецидив тумора. ( а и б ) Женке БАЛБ / ц голих шест недеља супкутано су ињициране са 2, 5 × 106 6ЛеЛа229 / схЦТЛ ћелија или ХеЛа229 / схМУЦ1 ћелијама у вентралним боковима. Када је тумор достигао приближно 4 мм × 4 мм, мишевима су убризгали интраперитонеално ПТКС у 40 мг / кг свака три дана током 15 дана. Величине тумора мерене су свака 3 дана после ПТКС третмана. Запремина тумора је израчуната према формули: В = дужина × ширина 2/2. Наведени подаци значе са СЕМ од шест мишева у свакој групи. ( б ) 45. дана, сви мишеви су убијени, а тумори су изрезани и фотографирани. ( ц и д ) Извршено је ИХЦ бојење ( ц ) или ТУНЕЛ тест ( д ) одсека туморског ткива. ( е ) 2, 5 × 10 6 ХеЛа229 / схЦТЛ ћелије или ХеЛа229 / схМУЦ1 ћелије супкутано су убризгане у вентралне бокове женских БАЛБ / ц голих мишева старих 6 недеља. Када је тумор достигао 4 мм × 4 мм, мишеве су слепо распоредили у шест група и убризгали ПТКС (40 мг / кг) у комбинацији са верапамил (20 мг / кг) или ерлотинибом (50 мг / кг) интраперитонеално свака 3 дана током 15 дана. У 36. дану, сви мишеви су убијени, а тумори су изрезани и фотографирани

Слика пуне величине

Дискусија

Рак грлића материце је други најчешћи злоћудни облик који погађа жене широм света са високом смртношћу. 41 ПМЦ је ретка хистолошка врста малигнитета плућа. 42 ПТКС је важан лек за прво лечење обају карцинома. Функционална карактеризација МУЦ1 код ова два карцинома показује да МУЦ1 посредује у развоју стечене хеморезистенције ћелија рака. Лечење ћелија рака хемотерапијским лековима индукује експресију МУЦ1, која подстиче активацију и нуклеарну дистрибуцију ЕГФР-а. Заједно, ЕГФР и МУЦ1 транскрипцијски регулишу АБЦБ1 доприносећи стицању хеморезистенције. Подржавајући критичну улогу за оси МУЦ1 / ЕГФР-АБЦБ1 у хеморесистенцији, циљано инхибиција ЕГФР-а схРНА и ерлотиниб сензитивише ћелије карцинома на хемотерапију ин витро и ин виво . Наш рад не само да открива нови увид у стечену хеморезистенцију код рака грлића материце и ПМЦ-а, већ има и значајне терапијске импликације.

Превелика експресија МУЦ1 код карцинома и његова повезаност са лошом прогнозом код пацијената са карциномом навели су нас да истражимо потенцијалну улогу овог онкопротеина у прогресији рака. 19, 20 Користећи комбинацију приступа губитку и добитку функције, пружили смо и ин витро и ин виво доказе који директно повезују МУЦ1 са стеченом хеморесистенцијом. МУЦ1 је индукован у ћелијама рака након лечења хемотерапијским лековима. Посебно је занимљиво откриће да је експресија МУЦ1 била знатно регулирана у ћелијама рака које су стекле хеморезистенцију након дуготрајног ПТКС третмана. У складу с нашим опажањима, МУЦ1 је раније објављен да повезује са терапијском резистенцијом у неколико других врста карцинома, као што су рак дојке 31 и рак панкреаса. 32 Треба напоменути да је експресија МУЦ1 била релативно ниска код нелечених или наивних тумора, али значајно индукована ПТКС-ом, нарочито дуготрајним лечењем. Наши резултати показују да ПТКС третман регулише МУЦ1 транскрипционо као и пост-транслационо. МУЦ1 промотор се може регулисати епигенетским механизмом, 43 или елементима који делују на цис, као што су Спл, АП-1-4, НФ-1 и НФ- κ Б. 44 Такође су пријављени да проипалирајућа цитокина повећава МУЦ1. 45 ПТКС може повећати транскрипцију МУЦ1 активним НФ-Б Б 46 или проупалним цитокинима. 47 За разлику од транскрипцијске регулације МУЦ1, много се мање зна о пост-транслацијској регулацији МУЦ1. Даљње студије ће бити потребне како би се истражило на који начин хемотерапеутски лекови посттрансулационо повећавају експресију МУЦ1.

МУЦ1 је умешан у модулацију ћелијске осетљивости на терапију. Раније је објављено да је МУЦ1 доделио хеморезистенцију ћелија рака панкреаса уредивањем МРП1. 32 Идентификовали смо АБЦБ1 као важан фактор који посредује у хеморезистенцији зависној од МУЦ1 код рака грлића материце и ПМЦ-а. Протеини породице АБЦ често су укључени у мултирезистентност на рак. 34 Међу девет АБЦ-а повезаних са ПТКС-ом, открили смо да је АБЦБ1 протеин једини који је селективно индукован МУЦ1, мада је ниво мРНА АБЦЦ1 и АБЦЦ5 такође повишен од МУЦ1. Заиста, инхибиција АБЦБ1 са комплементарним фармаколошким и генетским приступима значајно је умањила хеморезистенцију ћелија рака. Резултати не само да откривају нови механизам хеморесистентности изазване МУЦ1, већ имплицирају и АБЦБ1 као потенцијални терапеутски циљ у ћелијама рака.

Да бисмо расветлили механизам како МУЦ1 регулише АБЦБ1, усмерили смо нашу пажњу на пут ЕГФР-а јер овај последњи случај није укључен само у прописе АБЦБ1 37, 38, већ је повезан и са МУЦ1. 35, 36 Недавна испитивања показала су да је ЕГФР био укључен у хеморесистенцију код многих карцинома регулисањем АБЦБ1 и АБЦГ2. 37, 38, 48, 49 Извештава се о динамичкој интеракцији између МУЦ1-Ц и ЕГФР-а у различитим контекстима са општим трендом међусобне функционалне повећавања. МУЦ1 промовише ЕГФР-зависну активацију ПИ3К-АКТ путање, 22, 50 и регулише локализацију ЕГФР-а према језгру 36, као и стимулише експресију ЕГФР-а везивањем на ЕГФР промотор. У складу са објављеним радом, открили смо да је повећана експресија МУЦ1 у ћелијама рака грлића материце повезана са повећаном фосфорилацијом и укупним нивоом ЕГФР-а (слике 5а и 6б). ПТКС третманом је стимулисана активност и нуклеарна локализација и МУЦ1 и ЕГФР. Важно је да је супресија ЕГФР-а помоћу инхибитора значајно потиснула ПТЦ-индуцирану АБЦБ1 експресију и преокренуо МУЦ1-посредовани отпор ПТКС-у (слика 5ф). Поред тога, утишавање МУЦ1 или ЕГФР у ћелијама ХеЛа229 / ТР повукло је АБЦБ1 и хеморезистенцију (слика 3е, допунске слике С2Б, С5Б и С5Ц). Формирање МУЦ1 / ЕГФР комплекса даље је потврђено цо-ИП тестом (допунска слика С5Е). Ови подаци подржавају модел МУЦ1 / ЕГФР-АБЦБ1 оси у хеморесистенцији изазваној МУЦ1. Треба приметити да је ерлотиниб такође значајно умањио ПТКС-индуцирану нуклеарну дистрибуцију МУЦ1 и ЕГФР, што би спречило њихову транскрипцијску активност. У ствари, ЦхИП тест је открио да је лечење ерлотинибом значајно смањило везање МУЦ1 и ЕГФР на промотор АБЦБ1, пружајући важан молекулски увид у хеморезистентност посредовану МУЦ1. Највише обогаћивање активности луциферазе нађено је у области од -200 до +200, која је обухватала места везивања за многе важне факторе транскрипције, као што су СТАТ3 (+64 до +72), ФОКСО3а (−181 до +68), п53 (- 49 до -40; -72 до -62), ИнвМЕД (-106 до -100), НФР1 / 2 (−123 до −115), Ц / ЕБП (−147 до −135), НФ- κ Б (−167 до −158), АП-1 (−122 до −116) и β- катенин (−228 до +31). Идентификација места везивања за МУЦ1 / ЕГФР у промотору АБЦБ1 је од значаја за расветљавање механизма којим МУЦ1 / ЕГФР регулише активацију транскрипције АБЦБ1. 51

Показали смо да комбинована примена ЕГФР инхибитора са АБЦБ1 супстратом може представљати обећавајућу стратегију за преокрет хеморезистенције посредоване АБЦБ1. ФДА је одобрила неколико малих молекуларних инхибитора тирозин киназе (ТКИ), као што су гефитиниб, 52, 53 ерлотиниб 54, 55 и лапатиниб, 56 за лечење НСЦЛЦ где се ЕГФР често активира амплификацијом или мутацијом. Занимљиво је да је стечена резистенција на ПТКС у ћелијама карцинома јајника такође повезана са појачаном осетљивошћу на инхибиторе ХЕР1 / ЕГФР, што је у корелацији са повећаном експресијом ХЕР1 / ЕГФР. 58 У складу с овим налазом, открили смо да је ЕГФР у почетку био неприметан код тумора грлића материце, али изазван ПТКС третманом (слика 7ц), што је праћено повећаном МУЦ1 / АБЦБ1 експресијом и терапијском резистенцијом. Наши подаци сугерирају блиску повезаност између хеморесистенције и активирања ЕГФР-а код тумора грлића материце и ПМЦ-а. У складу са овим појмом су наши подаци који показују да је ЕГФР активиран МУЦ1 у ПТКС резистентним ћелијама рака и што је још важније, инхибиција МУЦ1 резултирала је смањеном активношћу ЕГФР-а и смањеном експресијом АБЦБ1 што доводи до преокрета ПТКС резистенције. У нашем моделу миша са ксенографтом карцинома грлића материце, истодобна примена ПТКС са ЕГФР инхибитором ерлотинибом значајно је спречила раст и релапс тумора, што је повезано са смањеном експресијом МУЦ1 и АБЦБ1, и смањењем активности ЕГФР-а. Наши подаци имплицирају да се ЕГФР инхибитори поред комбинације са ПТКС-ом могу користити за превазилажење стечене резистенције на хемотерапију код МУЦ1-позитивног карцинома.

За многе путеве је речено да регулишу АБЦБ1 експресију. На пример, инхибиција п38 / МАПК смањује активност активатор протеина-1 (АП-1) и АБЦБ1. 59 Активација ЈНК / ц-Јун / АП-1 смањује АБЦБ1 мРНА експресију. 60, 61 Наши подаци показали су да инхибитори ЕГФР-а нису у потпуности инхибирали интеракцију МУЦ1 и АБЦБ1 промотора, што сугерише могући ефекат МУЦ1 на други пут поред ЕГФР-а.

Наши налази такође имају импликације у лечењу других карцинома, јер је показано да се МУЦ1 регулише у многим ПТКС-резистентним туморима, укључујући рак јајника и желудац (Допунска слика С7) на основу ОНЦОМИНЕ базе података. Потребне су додатне студије да бисмо истражили да ли наши налази у овој студији могу бити преведени на друге врсте рака код којих су МУЦ1 и АБЦБ1 позитивни.

материјали и методе

Ћелијска култура

ХеЛа229, ХЕК293Т и НЦИ-Х292 обезбедили су Целл Банк, Збирка култура типа, Кинеска академија наука (Шангај, Кина) и Фу Хенг Биологи Цомпани (Шангај, Кина), респективно. Ћелије ХеЛа229 и НЦИ-Х292 култивисане су у РПМИ1640 (Цорнинг, НИ, УСА) са 10% феталним говеђим серумом (Гибцо, Гранд Исланд, НИ, УСА), а ХЕК293Т је узгојен у ДМЕМ са додатком 10% феталног говеђег серума (Гибцо). са 100 У / мл пеницилина и 100 µг / мл стрептомицина, и одржава се у влажној атмосфери од 5% Ц02 на 37 ° Ц. Све ћелијске линије су рутински тестиране и без микоплазме.

Генерација ПТКС отпорних ћелијских линија

Да би се створиле ПТЛ отпорне ћелије ХеЛа229 / ТР, ХеЛа229 ћелије су биле постепено изложене 5, 10, 15, 20 и 25 нМ ПТКС, а сваки третман је трајао 9 дана. ПТКС-резистентне ћелије НЦИ-Х292 / ТР су генерисане излагањем постепено 2, 5, 5, 10 нМ ПТКС.

Плазмиди и трансфекција

ХеЛа229 / схЦТЛ или ХеЛа229 / схМУЦ1-А / Б ћелије су изведене трансфекцијом ћелија ХеЛа229 пРНАУ6.1-схЦТЛ или пРНАУ6.1-схМУЦ1-А / Б коришћењем Кс-треме ГЕНЕ ХП ДНА трансфекцијског реагенса (Роцхе Апплиед Сциенце, Басел, Швајцарска) и изабран од 500 µг / мл Г418. Две циљне секвенце за МУЦ1 приказане су како слиједи: схМУЦ1-А: 5′-ААГГТАЦЦАТЦААТГТЦЦАЦГ-3 ′, и схМУЦ1-Б: 5′-ААГТТЦАГТГЦЦЦАГЦТЦТАЦ-3 ′. Контролна секвенца шРНА (схЦТЛ) је 5'-ЦГЦТТАЦЦГАТТЦАГААТГГ-3 '. ПГИПЗ-пуромицински лентивирусни плазмиди били су из библиотеке Тхермо Сциентифиц Биосистемс ГИПЗ Лентивирал схРНАмир (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, САД). Циљне секвенце су биле сљедеће: схМУЦ1-1: 5'-ЦЦАГЦАЦЦГАЦТАЦТАЦЦА-3 '; схМУЦ1-2: 5′-ГАААТГТТТТТГЦАГАТТТ-3 ′; схАБЦБ1-1: 5′-ЦАГАТААТАТТААГГГААА-3 ′; схАБЦБ1-2: 5′-АГАТГАТГТЦТЦЦААГАТТ-3 ′; схЕГФР-1: 5 '- АГГААЦТГГАТАТТЦТГАА-3'; СхЕГФР-2: 5′-АГАТЦАГААГАЦТАЦАААААА-3 ′. Контролна секвенца глупости је 5'-ЦТЦГЦТТГГГЦГАГАГТАА-3 '. СхРНА плазмиди и амбалажни плазмиди (ПМ2Г и ПСПАКС2) су кофефицирани у ћелије ХЕК293Т. Вирусни супернатанти су сакупљени 48 х након трансфекције. Ћелије ХеЛа229 / ТР и НЦИ-Х292 / ТР инфициране су с схМУЦ1 (схМУЦ1-1 / схМУЦ1-2), схАБЦБ1 (схАБЦБ1-1 / схАБЦБ1-2), схЕГФР (схЕГФР-1 / схЕГФР-2) и схЦТЛ лентивирусом са медијум који садржи 1 μг / мл полибрена (Санта Цруз Биотецхнологи, Санта Цруз, Калифорнија, САД). Након 48 х, ћелије су одабране са 3 μг / мл пуромицина (ХеЛа229 / ТР) или 1.5 μг / мл пуромицина (НЦИ-Х292 / ТР). Да би се конструисао МУЦ1 експресионирајући плазмид, пуна дужина МУЦ1 са ХА ознаком на Ц-терминалу је клонирана у вектор пИРЕСпуро2. Да би се конструисао плазмид који експримира МУЦ1-ХА-експресионирајући МУЦ1-ХА пИРЕСпуро2-МУЦ1-ХА (МУЦ1-ХА), циљни низ схМУЦ1-Б био је синоним за мутирање из 5'-аагттцагтгцццагцтцтац-3 ′ у 5′-аагЦтцЦгцгцгцацгццццц . Експресијски плазмид пХа-МДРвт (АБЦБ1 плазмид) био је поклон др Мицхаела Готтесмана (Аддгене, Цамбридге, МА, САД; плазмид).

Пролазне трансфекције изведене су са реагенсом Липофецтамине 2000 (Инвитроген, Царлсбад, ЦА, САД) или Кс-треме ГЕНЕ ХП Трансфекцијским реагенсом (Роцхе Апплиед Сциенце, Басел, Швајцарска) према упутствима произвођача.

Тест ћелије пролиферације / виталности и вредности ИЦ50

Животна способност ћелије одређена је коришћењем комплета за бројање ћелија 8 (ЦЦК8) према протоколу произвођача (Дојиндо Молецулар Тецхнологиес, ​​Кумамото, Јапан). Укратко, 6000–10000 ћелија по лежишту (за испитивање виталности лека) је посејано у плочице са 96 јажица, култивисано преко ноћи и затим третирано различитим лековима. После релевантног третмана, додат је ЦЦК8 и инкубиран током додатних 2 сата, а затим је апсорбанција на таласној дужини од 450 нм измерена Синерги Х4 Хибред Реадер (БиоТек Инструментс, Винооски, ВТ, УСА). Вриједности релативне инхибиције раста и вриједности половине максималне инхибицијске концентрације (ИЦ50) израчунате су нелинеарном регресијском анализом помоћу ГрапхПад Присм 6.0 софтвера (ГрапхПад Софтваре, Инц. Ла Јолла, ЦА, УСА). Сваки експеримент је поновљен три пута са троструким узорцима.

Лекови и антитела

Следећи лекови и антитела коришћени су у нашим експериментима: ПТКС, винкристин, доксорубицин и верапамил, циклохексимид, етопозид (Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО, САД), зосуквидар, ерлотиниб и АГ-1478 (Селлецк Цхемицалс, Хоустон, ТКС), УСА), анти-МУЦ1-Ц антитело (Тхермо Сциентифиц, Худсон, НХ, УСА), анти-МУЦ1-Н антитело, 17 анти-ХА-таг, анти-АБЦБ1, анти-фосфо-ЕГФР 1068 антитела (Целл Сигналинг Тецхнологи, Данверс, МА, САД), анти-АБЦБГ2 антитело (ГенеТек, Ирвине, ЦА, УСА), анти-АБЦЦ1 антитело (Биоворлд Тецхнологи, Инц., Лоуис Парк, МН, УСА), анти-АБЦЦ2 и анти-ЕГФР антитела ( Протеинтецх Гроуп, Цхицаго, ИЛ, УСА), анти-АБЦЦ3 и анти-АБЦЦ5 (Цусабио Биотецх, Вухан, Кина), антитела против Ламина Б и анти-И κ Б-α (Санта Цруз Биотецхнологи), анти-хистон Х3 ( антитела за ацетил К27) (Абцам, Цамбридге, МА, САД), антитело везано за хрен пероксидазу (ХРП) и антитело на анти- п- актин (Мерцк Миллипоре Биллерица, МА, САД).

Вестерн блот

Ћелије су сакупљене триппсинизацијом и лизиране у НЕТН 150 лизирајућем пуферу (0, 5% НП-40, 20 мМ Трис (пХ 8, 0), 150 мМ НаЦл, 6 мМ ЕДТА). Брадфорд је протеинске количине квантификовао. Двадесет микрограма протеина је раздвојено помоћу СДС-ПАГЕ и пренето је на нитроцелулозну мембрану (Акиген, Тевксбури, МА, УСА). После блокирања у 5% немасног млека током 1 сата на собној температури, мембрана је инкубирана примарним антителом преко ноћи на 4 ° Ц, а затим је уследио ХРП везано секундарно антитело. За откривање је коришћен комплет супстрата за супстанцу ИммобилонТМ Вестерн Цхемилуминесцент ХРП (Миллипоре Цорпоратион, Биллерица, МА, САД).

Квантитативни ПЦР у реалном времену (РТ-кПЦР)

Укупна РНА је екстрахована користећи ТриПуре Исолатион Реагент према протоколу произвођача (Роцхе). Комплементарна ДНК синтетизована је коришћењем комплета за синтезу М-МЛВ реверзне транскриптазе (Промега, Мадисон, ВИ, УСА). РТ-кПЦР је изведен са Повер СИБР Греен ПЦР Мастер мик китом према упутствима произвођача (Апплиед Биосистемс, Варрингтон, УК). Појачања су изведена у АБИ ПРИСМ 7500 секвенцијалном систему детекције (примењени биосистеми). Релативне количине транскрипта израчунате су коришћењем методе ΔΔЦт са β- актином као ендогеним референтним геном. Сваки резултат је поновљен три пута. Прајмери ​​су из ПримерБанк-а.

Практичне секвенце за РТ-кПЦР:

Image

Нуклеарна и цитоплазматска екстракција

Нуклеарни и цитоплазматски протеини су пречишћени употребом НЕ-ПЕР нуклеарних и цитоплазматских екстракцијских реагенса (Пиерце Биотецхнологи, Инц., Роцкфорд, ИЛ, САД) према упутствима произвођача. Нуклеарни и цитоплазматски протеини су тада Брадфорду квантифицирали и даље анализирали западном блотом.

Имунофлуоресцентно бојење

Култивиране ћелије испране су ПБС собне температуре једном, фиксиране хладним 4% формалдехидом током 30 минута и испране са ПБС три пута. Ћелије су пермеабилизиране хладним метанолом током 20 минута и инкубиране су с примарним антителима преко ноћи на 4 ° Ц након 5% блокаде БСА. Ћелије су инкубиране са флуоресцентним секундарним антителима (Јацксон ИммуноРесеарцх, Вест Грове, ПА, УСА) у 5% БСА током 1 сата на 37 ° Ц. Нуклеи су обојени помоћу ДАПИ (Вецтор Лабораториес, Бурлингаме, ЦА, САД). Конфокални микроскоп (Никон, Токио, Јапан) коришћен је за посматрање свих обојених кришки.

Хроматин имунопреципитација

Ћелије ХеЛа229 и ХеЛа229 / ТР сејане су у посуде са културама од 150 мм. Ћелије су испране са ПБС собне температуре и фиксиране са 1% формалдехида у ПБС у трајању од 10 минута на 37 ° Ц. Затим су ћелије испране леденим ПБС-ом и скупљене центрифугирањем. Ћелијске пелете су поново суспендоване у пуферу за лизу (1% СДС, 5 мМ ЕДТА, 50 мМ Трис.ХЦл (пХ 8, 0) са инхибитором протеазе) и ултразвучне. Извршите имуноклеарисање инкубирањем хроматина са одсеченом ДНК сперме лососа, пре имунолошким серумом и зрнцима сефарозе протеина А током 2 сата на 4 ° Ц. Супернатант је подвргнут имунопреципитацији са МУЦл, ЕГФР или антителом на хистон Х3 (ацетил К27) током 6 х на 4 ° Ц, после чега је додавано зрно протеина А сефарозе, ДНК сперме лососа током 1 сата. Куглице сефарозе су скупљене и испране узастопно у ТСЕИ (0, 1% СДС, 1% Тритон Кс-100, 2 мМ ЕДТА, 20 мМ Трис.ХЦл (пХ 8, 0), 150 мМ НаЦл), ТСЕИИ (0, 1% СДС 1% Тритон Кс- 100, 2 мМ ЕДТА, 20 мМ Трис.ХЦл (пХ 8, 0), 500 мМ НаЦл), пуфер ИИИ (0, 25 М ЛиЦл, 1% НП-40, 1% деоксихолат, 1 мМ ЕДТА, 10 мМ Трис.ХЦл (пХ 8, 0 )) и ТЕ пуфер. ДНК је елуирана из куглица елуционим пуфером (1% СДС, 0, 1 М НаХЦО3). Елуција је загревана на 65 ° Ц преко ноћи да би се преокренула формалдехидна унакрсна веза, и пречишћена КИАкуицк ПЦР комплетом за пречишћавање (КИАГЕН ГмбХ, Хилден, Немачка).

Негативни прајмери ​​смештени на 167 кб узводно од АБЦБ1. Прајмери ​​за ЦхИП:

Image

Ко-имунопреципитацијски тест

Ћелије ХеЛа229 и ХеЛа229 / ТР лизиране су у пуферу НЕТН 150 лизе са 1 мМ ПМСФ и 20 мМ коктел таблетама са инхибиторима фосфатазе (Роцхе Диагностицс ГмбХ, Маннхеим, Немачка). Ћелијски лизат је претходно очишћен са 30 µл протеина А / Г плус агарозом (Санта Цруз Биотецхнологи) на 4 ° Ц током 2 х. Супернатант је инкубиран са МУЦ1-Ц-терминалним антителом и ИгГ антителом хрчка (Санта Цруз Биотецхнологи) преко ноћи на 4 ° Ц, ротирањем. Свеукупно, 20 μл протеина А / Г плус агароза је додато ћелијском лизату и инкубирано током 2 сата на 4 ° Ц са ротацијом. Имунопреципитати су сакупљени центрифугирањем и испрани три пута са НЕТН 150 пуфером.

Анализа луциферазе

ХеЛа229 ћелије су трансфициране са луцерном репортер плазмидима пГЛ3-МУЦ1-промотор (500 нг) или пГЛ3-АБЦБ1-промотор (500 нг) заједно са пГЛ3-СВ40-Ренилла (10 нг). Тридесет шест сати касније, ћелије су сакупљене и анализиране системом испитивања дуалног луциферазе (Промега), према упутствима произвођача.

Долар Куфе на Дана-Фарбер Институту за рак Харвард Медицал Сцхоол у ​​Бостону, МА, САД, великодушно је пружио плиг3-МУЦ1-промотор репортер плазмид луциферазе.

Хумани АБЦБ1 промотор (-2500 до +700) је амплификован са прајмерима (горе: 5′-ГГГГТАЦЦГЦААГГГГАЦЦАГГТАГГТТТЦАТЦ-3 ′, доле: 5′-ЦТАГЦТАГЦЦТАГТТЦЦТТТТТТТТТТТТ-3 ′), а хумани АБЦБ200 амплификован (АМФ200) са прајмерима (горе: 5′-ЦТАГЦТАГЦАГГАААТЦТГАААГЦЦТГАЦ-3 ′, доле: 5′-ГГГГТАЦЦЦЦЦТТТЦТАГАГАГГГТГЦА-3 ′), а затим је клониран у пГЛ3-базични вектор (Промега) како би се конструисао пГЛ3-АБЦБ1-промотер (-7) извештач и извештач луциферазе пГЛ3-АБЦБ1-промотор (-200 до +200).

ТУНЕЛ тест

Да би се откриле апоптотске ћелије у туморском ткиву, узорци су одмах фиксирани у 4% параформалдехиду, а пресеци туморског ткива обојени су ТУНЕЛ китом (Промега), према упутствима произвођача. Флуоресцентни сигнали снимљени су на конфокалном микроскопу (Никон).

Хистолошко и имунохистохемијско бојење (ИХЦ)

Туморско ткиво је фиксирано у 4% параформалдехиду, а затим је дехидрирано пре уградње у парафин. Све, 6 μм ткива је исечено и обојено у складу са стандардним поступком са еозином и хематоксилином. Туморима који су уграђени парафином два пута је де-парафиниран ксилоном у трајању од 5 минута, а затим сваки пут третиран градијентним етанолом, током 3 мин. Одсеци ткива су затим загревани на 92–98 ° Ц у 10 мМ цитратном пуферу (пХ 6, 0) током 35 минута за тражење антигена. Да би се повећала пропусност ткива, секције ткива су третиране у ПБСТ (0, 2% Тритон Кс-100) у току 10 мин. Одсеци ткива су третирани са 3% хидроген пероксидазом у метил алкохолу у трајању од 10 минута, а затим су инкубирани 1 х са блокирним серумом на собној температури. Секције ткива су инкубирани са примарним антителом на 4 ° Ц преко ноћи. Бојење ИХЦ-а је изведено са АБЦБ1 и МУЦ1-Ц, ЕГФР антитела. Поступак бојења следио је упутства произвођача за АБЦ систем бојења (Санта Цруз Биотецхнологи).

Покуси на животињама

Све животиње су збринуте у складу са Водичем за негу и употребу лабораторијских животиња и принципима за употребу и негу краљешњака. Сви експерименти на животињама конзултовали су смернице АРРИВЕ за животиње. 62 Истраживање је одобрио Одбор за институционалну његу и употребу животиња на Медицинском факултету Универзитета у Шангају Јиаотонг. Истражитељи су били заслепљени због распореда група.

Туморске ћелије убризгане су супкутано у вентралне бокове женских БАЛБ / ц голих мишева старих 6 недеља. Када су тумори достигли приближно 4 мм × 4 мм, мишевима који носе тумор били су насумично додељени ( н = 6 по групи) и лечени различитим лековима.

Мишеви убризгани са 2, 5 × 106 ХеЛа229 / схЦТЛ или ХеЛа229 / схМУЦ1 ћелије слепо су додељени у две групе за експерименте отпорности на лекове са шест мишева за сваку групу: мишеви у групи 1 су третирани са ПБС као контролом, а мишеви у групи 2 су третирани са ПТКС (40 мг / кг). ПТКС (Такол; Бристол-Миерс Скуибб, Принцетон, Њ, САД) је одговарајуће разређен у ПБС-у пре третмана. Лекови су убризгавани интраперитонеално свака 3 дана. Укупан период лечења био је 15 дана, 30 дана након коначне примене, мишеви су убијени.

Мишеви убризгани са 2, 5 × 106 ХеЛа229 / схЦТЛ слепо су додељени у шест група за експерименте комбиноване отпорности на лекове са шест мишева за сваку групу: групе 1 и група 2 су третиране као горе, група 3 третирана је верапамилом (20 мг / кг), група 4 су третиране верапамилом и ПТКС, група 5 третиране су ерлотинибом (50 мг / кг), а група 6 су третиране ерлотинибом и ПТКС. Мишеви убризгани са 2, 5 × 106 ХеЛа229 / схМУЦ1 распоређени су у две групе као горе, са по шест мишева за сваку групу. Ерлотиниб и верапамил (Селлецк Цхемицалс) припремљени су према упутствима произвођача, а затим разређени у ПБС-у. Лекови су убризгавани интраперитонеално свака 3 дана. Раст тумора праћен је правилом калибра свака 3 дана, а укупни период лечења је био 15 дана за комбиновано лечење леком. Три недеље након коначне примене, мишеви су убијени. Запремина је израчуната према формули: В = дужина × ширина 2/2.

Статистичка анализа

Све статистичке анализе извршене су помоћу ГрапхПад Присм 6 (ГрапхПад Софтваре, Ла Јолла, ЦА, САД). Сваки резултат представљен је као средња вредност ± СД три независна експеримента ( н = 3), а двострани т- тест ученика је извршен за процену разлике између повезаних група, а П- вредности <0, 05 су сматране статистички значајним. * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001 и **** П <0, 0001.

Додатне информације

Ворд документи

  1. 1.

    Допунске цифре

    Напомена издавача

    Спрингер Натуре остаје неутралан у погледу захтјева за јурисдикцијом у објављеним мапама и институционалним припадностима.

    Додатне информације прате овај рад на веб локацији Целл Деатх анд Дисеасе (//ввв.натуре.цом/цддис)