Наног промовише карактеристике матичних ћелија рака и отпорност рака простате на лишавање андрогена | онкогена

Наног промовише карактеристике матичних ћелија рака и отпорност рака простате на лишавање андрогена | онкогена

Anonim

Субјекти

  • Матичне ћелије рака
  • Терапијска резистенција против рака
  • Онкогенеза
  • Карцином простате

Апстрактан

Молекуларна мимикрија матичних ћелија рака (СЦ) имобира неопластичне ћелије са побољшаним пролиферативним и обнављајућим способностима. У прилог су показани бројни посредници само-обнове СЦ-а који показују онкогени потенцијал. Недавно смо известили да срушавање гена за самообнављање матичних ћелија ембрионалне матичне ћелије (ЕСЦ) са ННАОГ на кратким длачицама значајно смањује клоногене и туморигенске способности различитих ћелија рака. У овој студији желели смо да тестирамо потенцијалне про-туморигенске функције НАНОГ-а, посебно код рака простате (ПЦа). Користећи кРТ-ПЦР, прво смо потврдили да ПЦа ћелије изражавају НАНОГ мРНА првенствено из локуса НАНОГП8 на хромозому 15к14. Затим смо конструисали лентивирусни репортер промотора у коме је геномски фрагмент НАНОГП8 од 3, 8 кб коришћен за покретање експресије протеина зелене флуоресценције (ГФП). Приметили смо да НАНОГП8 -ГФП + ПЦа ћелије показују карактеристике матичних ћелија рака (ЦСЦ), као што су појачани клонски раст и регенеративни капацитет тумора. Да бисмо даље истражили функције и механизме НАНОГ-а у туморигенези, установили смо НАНОГ-ом индуцираног тетрациклином прекомерним експресијом ћелијских линија рака, укључујући ПЦа (Ду145 и ЛНЦаП) и ћелије рака дојке (МЦФ-7). НАНОГ индукција је промовисала резистенцију на лекове у МЦФ-7 ћелијама, регенерацију тумора у Ду145 ћелијама и, што је најважније, развој тумора резистентних на кастрацију у ћелијама ЛНЦаП. Ови про-туморигенски ефекти НАНОГ-а били су повезани са кључним молекуларним променама, укључујући регулацију молекула као што су ЦКСЦР4, ИГФБП5, ЦД133 и АЛДХ1. Садашње студије о функцији, заједно са нашим недавним радом на губитку функције, успостављају интегралну улогу НАНОГ у неопластичним процесима и осветљавају његове механизме деловања.

Увод

Бесмртност је међу основним биолошким својствима малигних ћелија која се може приписати присуству различитог подскупа матичних ћелија унутар тумора. Неопластичне ћелије које се само обнављају постављене су као хипотеза да подупиру дугорочни пролиферативни потенцијал ћелија рака, често делећи профиле експресије гена ембрионалним матичним ћелијама (ЕСЦс) или примитивним соматским СЦ (Бен-Поратх ет ал., 2008; Вонг ет ал., 2008; Лиу и др., 2009; Пеце и др., 2010). Бројне студије у последњих неколико година пружиле су чврсте доказе за постојање таквих матичних ћелија која одржавају рак, опћенито названих „матичне ћелије рака“ (ЦСЦ) или „ћелије које иницирају тумор“ (Ал-Хајј ет ал., 2003 ; Сингх и др., 2003; Патравала ет ал., 2006; О'Бриен ет ал., 2007; Боико ет ал., 2010). Међутим, молекулски оквир унутар којег се ћелије рака уклапају у СЦ парадигму и како се то односи на развој клиничких манифестација болести у касном стадију, укључујући отпорност на конвенционалне терапије, рецидив тумора и метастазе, остаје нејасан.

Бесконачно самообнављајуће ћелије (то јест, ЦСЦ) могу замислити бесмртну природу ћелија тумора на нивоу популације, а нагомилавање доказа подупире тврдњу да ЕСЦ гени само обнављају и плурипотенцију, укључујући фактор транскрипције тријаду ОЦТ-3 / 4 (то јест, ОЦТ-4), СОКС-2 и, посебно занимљиви, НАНОГ, служе као неопластични мотори који покрећу онкогенезу (Хоцхедлингер ет ал., 2005; Пиестун ет ал., 2006; Гангеми ет ал., 2009; Јетер ет ал., 2009; Лиу и сур., 2009; По и др., 2010; Збинден и сур., 2010). Раније смо оцењивали узрочно-посљедичну везу између експресије НАНОГ-а у ћелијама епитела људског рака и развоја тумора (Јетер ет ал., 2009). Открили смо да НАНОГ мРНА у соматским ћелијама рака потиче претежно од НАНОГП8 , ретрогене деривата различитог од локуса НАНОГ1 израженог у ЕСЦс, и да је мРНА НАНОГП8 обогаћена у матичним / матичним ћелијама / прегениторима ЦД44 + рака простате (ПЦа) и на МЦФ7 страни ћелије популације. Надаље, показали смо да је протеин НАНОГ хетерогено експримиран као 'градијент' у ксенографту као и у примарним ћелијама тумора простате. Од посебног значаја, приметили смо да обустава НАНОГ смањује клоногени раст и туморигенитет дојке (МЦФ-7), дебелог црева (Цоло320) и неколико простате (ПЦ3, Ду145 и ЛАПЦ-9) ћелијских линија карцинома и ксенографта (Јетер ет ал., 2009). Ови резултати постављају важно питање да ли НАНОГ експресија активно промовише неоплазију и / или прогресију тумора. Овде се бавимо овим питањем даље истражујући порекло НАНОГ-а у ћелијама рака, посебно у ПЦа, и истражујући његов онкогени потенцијал и повезане механизме.

Резултати

Експресија мРНА НАНОГП8 у ПЦа, укључујући примарне туморе пацијента (ХПЦа)

Наш први циљ у овој студији био је да утврдимо да ли су ћелије рака које експримирају ендогени НАНОГ интринзично јединствене у поређењу са својим коефицијентима који не изражавају (или који имају експресију). У ту сврху осмислили смо промоторску стратегију за праћење и изоловање ћелија различито изражавајући НАНОГ . Међутим, једна компликација је да су пријављене најмање две врло сличне врсте НРНОГ мРНА које потичу из два различита локуса (слика 1а), укључујући НАНОГ1 , смештен на хромосому 12п13, у ЕСЦ-у, и његов ретроген НАНОГП8 , смештен на хромозому 15к14 (говорница и Холланд, 2004). С обзиром на њихову изузетну сличност (високо очувана током читаве дужине обрађених транскрипата, са само шест нуклеотидних супституција у кодирајућим регионима и 99% идентичних на нивоу аминокиселина) (Јетер ет ал., 2009), теоретски, НАНОГ1 и / или НАНОГП8 може да објашњава присуство НАНОГ мРНА у ћелијама рака. Претходно смо пружили прелиминарне доказе да је НАНОГП8 био преовлађујући извор НАНОГ мРНА у ћелијама епитела рака, укључујући ПЦа (Јетер ет ал., 2009); међутим, због методолошких ограничења нисмо могли да елиминишемо НАНОГ1 као важног сарадника. Стога смо се одлучили за даљње истраживање поријекла НАНОГ мРНА користећи квантитативну анализу обрнуте транскрипције – ПЦР (кРТ – ПЦР).

Image

НАНОГ геномских локуса и НАНОГ мРНА експресија у ПЦа ћелијама. ( а ) Схема структуре гена НАНОГ1 и НАНОГП8 . Цхр, хромозом; Е, екон; УТР, непреведена регија. Регион од 22 бп јединствен за НАНОГ1 (вертикална трака) коришћен је за дизајнирање прајмер / сонди за ПЦР специфичан за НАНОГ1 - и НАНОГП8 . ( б ) Квантитативно откривање ПЦР (кПЦР) НАНОГП8 мРНА у различитим ћелијама рака, које је нормализовано на ГАПДХ. Нормализовани нивои НРНП8 мРНА у ЛНЦаП ћелијама постављени су на 1, а нивои НАНОГП8 мРНА у дојкама (МЦФ7), дебелом цреву (Цоло320) и ПЦа ћелијским линијама (ЛНЦаП, Ду145 и ПЦ3) и ксенографтима (ЛАПЦ-4 и ЛАПЦ-9) у односу на ЛНЦаП. ( ц ) Нивои мРНА НАНОГП8 у групи примарних тумора пацијента (ХПЦа) како је одређено кПЦР. ХПЦа56П1 и ХПЦа101П0 су два ксенографта са раним пролазом (П) установљена у нашој лабораторији. ПЦа, рак простате; ГАПДХ, глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа; ХПЦа, хумани ПЦа.

Слика пуне величине

Дизајнирали смо НАНОГ1 - и НАНОГП8 специфичне кРТ – ПЦР прајмере и сонде (допунска табела С1) циљајући јединствену регију од 22 бп у НАНОГ1 3'- непрерачунатој области (слика 1а). НАНОГП8 мРНА се лако открива у низу ћелијских линија рака, укључујући оне изведене из дојке (МЦФ7), дебелог црева (Цоло320) и ПЦа (ЛНЦаП, Ду145 и ПЦ3), као и на ксенографтима ЛАПЦ4 и ЛАПЦ9 ПЦа (Слика 1б). Као што се могло очекивати, ЛНЦаП, најниже бенигна ПЦа линија, изразила је најмање НАНОГП8 мРНА (слика 1б). Супротно томе, НАНОГ1 кРТ – ПЦР на истој плочи ћелија рака (користећи идентичан образац који се користи у НАНОГП8 појачањима) је углавном испод границе детекције (то јест, праг циклуса ( Ц т )> 38), мада су ти исти прајмери ​​снажно појачани производ из Н-ТЕРА тератокарциномских ћелија ( Ц т од 21) (подаци нису приказани). Оно што је посебно важно, кохорта од седам примарних узорака болесника ПЦа (хумани ПЦа (ХПЦа)) и два рана ксенографта (односно ХПЦа58П1 и ХПЦа101П0) такође је изразила лако откривену НАНОГП8 мРНА (слика 1ц), док је НАНОГ1 био неприметљив (то јест, Ц т > 38) у свим узорцима (није приказано). У складу са ранијим налазима (Јетер ет ал., 2009), примарни узорци ПЦа изразили су више релативне нивое НАНОГП8 мРНА у односу на култивисане ПЦа ћелије (упоредите слике 1ц и 1б). Занимљиво је да су два ХПЦа узорка (то јест, ХПЦа58 и ХПЦа101) који су успешно створили ксенографте након трансплантације у НОД / СЦИД мишеве изражени виши нивои НАНОГП8 мРНА од осталих пет ХПЦа узорака (Слика 1ц). После ин виво пасаже, ХПЦа58П1 је показао смањене док ХПЦа101П0 показује повећане нивое мРНА НАНОГП8 (слика 1ц), што сугерише да пасажа ХПЦа тумора код мишева може да промени ниво експресије НАНОГП8 мРНА.

Извештач промотера НАНОГП8-ГФП прати подврсте ПЦа ћелија обогаћених клоногенским и туморигенским својствима

Горе наведене кРТ-ПЦР анализе су у складу са нашим претходним полуквантитативним РТ-ПЦР подацима (Јетер ет ал., 2009) и потврђују да је НАНОГП8 мРНА преовлађујући НАНОГ мРНА врста у ПЦа (и неким другим карциномима) ћелијама. Сходно томе, конститутивни и свеприсутни промотор фосфоглицерат киназе (ПГК) замењивали смо лентивирусни вектор РРЛ-ПГК-ГФП (Зуффереи ет ал., 1998) с регионом од 3, 8 кб (нуклеотиди -3764 до + 58) узводно од НАНОГП8 Почетак странице транскрипције (ТСС) за конструкцију вектора РРЛ-НП8-ГФП (слика 2а). Анализа сортирања ћелија активираним флуоресценцијом (ФАЦС) ПГК-ГФП-трансдуцираних ћелија ПЦа показала је да је у ЛНЦаП и Ду145 ћелијама 80–90% ћелија било ГФП + на 2 μл вируса, а само нешто више ћелија је постало ГФП + на 20 μл вирус (слика 2б и допунска слика С1а). ПЦ3 ћелије инфициране вектором ПГК-ГФП-а, са друге стране, показале су повећање ГФП + ћелија зависних од вируса од титра (Слика 2б). За поређење, само врло мали проценат ПЦа ћелија је био ГФП + након трансдукције са 2 μл лентивируса НП8-ГФП, припремљеног паралелно (слика 2б и допунска слика С1а). Чак и код 20 μл вируса, само ∼ 19% ЛНЦаП ћелија и ∼ 34% Ду145 ћелија су били НП8-ГФП + (Слика 2б). За ПЦ3 ћелије, чак и на 100 μл вируса, <10% ћелија заражених НП8-ГФП су биле ГФП + (слика 2б). Ови резултати сугеришу да су, као што смо раније известили (Јетер и сур., 2009), ПЦа ћелије које експримирају НАНОГ углавном ретке, а ниво мРНА НАНОГП8 у култивираним ћелијама ПЦа је низак, што је у складу са претходном кРТ-ПЦР анализом (слика 1б). Треба напоменути да су Ду145 ћелије изразиле НП8-ГФП као јасан градијент са повећаном количином вируса, достигавши ∼ 80% ГФП + ћелија на 100 μл вируса (Слика 2б). Ова опажања паралелна су с нашим претходним извештајима о експресији протеина НАНОГ као градијенту и НАНОГ протеина који се лакше откривају у Ду145 ћелијама у односу на ћелије ПЦ3 или ЛНЦаП (Јетер ет ал., 2009). Имунофлуоресцентно (ИФ) бојење ЛНЦаП ћелија трансдуцирано НП8-ГФП показало је сувислу експресију НАНОГ и зеленог флуоресцентног протеина (ГФП) у тим ћелијама (слика 2ц). Користећи протокол имунолошког оштећења денатурације (Јетер ет ал., 2009), приметили смо ∼ 10-пута обогаћивање НАНОГ-позитивних ћелија у прочишћеним ћелијама НП8-ГФП + ЛНЦаП у поређењу са оним у скупним ћелијама ЛНЦаП (није приказано). Штавише, кРТ-ПЦР анализа показала је да ниво НРНР мРНА у НП8-ГФП + насупрот НП8-ГФП - ПЦ3 ће бити 2, 02% у односу на 0, 11% у односу на нивое у Н-ТЕРА ћелијама карцинома хумане ембрионалне станице, што указује на 18-пута обогаћивање НАНОГ-а мРНА у НП8-ГФП + ПЦ3 ћелијама. Узето заједно, ови резултати сугерирају да су ПЦа ћелије које експримирају промоторске конструкте обогаћене НАНОГ мРНА и експресијом протеина.

Image

НАНОГП8 експресионирајуће ПЦа ћелије поседују ЦСЦ својства. ( а ) Шематски приказ РРЛ-ГФП лентивирусних репортерских конструкција. ГФП, зелени флуоресцентни протеин; НП8, промотор НАНОГП8 ; ПГК, фосфоглицерат киназа. ( б ) ФАЦС анализа процента ГФП + ћелија после трансдукције са промоторима лентивирусима репортера. 50К ћелија / удубљење у посудама са 12 лежишта посађених 1 дан раније преведене су назначеним количинама лентивируса. Култивиране ћелије су одржаване у свежем медијуму и пасиране до ФАЦС анализе даис 5 дана након трансдукције. ( ц ) Имуноизовање НП8-ГФП-трансдуцираних ЛНЦаП ћелија за НАНОГ (црвено) показује колокализацију ГФП и НАНОГ експресије. Оригинална увећања: × 200. ( д - ф ) ФАЦС-прочишћене одрживе (7ААД - ) станице НП8-ГФП + ПЦа преведене (7-10 дана пре) са лентивирусом НП8-ГФП показују појачани ЦЕ. ( д ) ћелије НП8-Ду145 (200 ћелија / базенчић на плочи са културом од шест јажица) постигнуте 14 дана након оплата; холо, холоклони; меро, мероклони; пара, параклоне. * П <0, 001. ( е ) ћелије НП8-ПЦ3 (200 ћелија / базенчић на плочи са културом у шест јажица) постигнуте су 14 дана након оплата. ( ф ) ЛНЦаП ћелије које су паралелно испитиване на клоналну густину у условима лишеним андрогенима (ЦДСС + 20 µМ бикалутамид) насупрот стандардном медију за раст (2К ћелије / отвор и 200 ћелија / базенчић, респективно) постигнуте 14 дана након наношења. НП8-ГФП + ЛНЦаП ћелије показале су пораст ЦЕ само у условима лишавања андрогена. ( г, х ) ћелије НП8-ГФП + ПЦа су више туморне од ћелија НП8-ГФП. ФАЦС-пречишћене ГФП +/– ћелије убризгане су у Матригел у НОД / СЦИД-и примаоце. ( г ) убризгано је 5К сваке НП8-ГФП +/− Ду145 ћелије и тумори су сакупљени на ∼ 2 месеца. ( х ) 1К свакој пречишћеној ћелији НП8 +/− ПЦ3 убризгано је сц у експериментима трансплантације тумора од 1 ° и 2 ° (сакупљено на дан 56, односно 49 дана). Приказани су обједињени подаци. 7ААД, 7-аминоактиномицин-Д; ЦДСС, серум одстрањен угљеном декстраном; ЦЕ, ефикасност клонирања; ЦСЦ, матичне ћелије рака; ФАЦС, сортирање ћелија активирано флуоресценцијом; ПЦа, рак простате; сц, поткожно.

Слика пуне величине

Затим смо кренули да тестирамо биолошке карактеристике РРЛ-преведених и сортираних Ду145, ПЦ3 и ЛНЦаП ћелија. Ду145 ћелије НП8-ГФП +, у поређењу са НП8-ГФП - ћелијама, генерисале су више хололона, мероклона и параклона (слика 2д), за морфолошки одвојене класе за које се генерално сматра да одражавају стање диференцијације почетне ћелије, при чему хололони садрже дугорочно самообнављајући ЦСЦ-ови (Ли ет ал., 2008). Супротно томе, пречишћене ћелије ПГК-ГФП + и ПГК-ГФП - Ду145 показале су сличну ефикасност клонирања (ЦЕ) (допунска слика С1б). ПЦ3 НП8-ГФП + ћелије су такође показале појачани ЦЕ (слика 2е) и даље, створиле су веће клонове у поређењу са НП8-ГФП - ПЦ3 ћелијама (3949 ± 1462, насупрот 2278 ± 912, респективно; П = 0.04). Занимљиво је да су ћелије НП8-ГФП + и НП8-ГФП - ЛНЦаП показале сличан ЦЕ у стандардном медијуму који садржи серум. Међутим, у условима лишеним андрогена, то јест, у медијумима који садрже серум са стриженим угљеном декстраном (ЦДСС) и / или анти-андроген бикалутамидом, прочишћене ћелије НП8-ГФП + ЛНЦаП показале су значајно већи ЦЕ него НП8-ГФП - ћелије (слика 2ф и додатна слика С2а). Ова последња запажања у ћелијама ЛНЦаП пружила су први доказ да је НАНОГ могао бити повезан са резистенцијом на лишавање андрогена.

Коначно, анализирали смо квинтесенцијално биолошко својство ЦСЦ-а, односно развој тумора. НП1-ГФП-трансдуциране Ду145 ћелије, у почетку 30% ГФП +, сортиране су у 7-аминоактиномицин-Д (7ААД) -негативне (то јест, одрживе) НП8-ГФП - и НП8-ГФП + подскупове, и убризгавају се поткожно (сц) у НОД / СЦИД мишеве. Примарни (1 о ) Ду145-НП8-ГФП + тумори нису само већи од оних који су изведени из Ду145-НП8-ГФП - ћелија (Слика 2г), већ су садржавали и мешавину ГФП + (41%) и ГФП - ћелија ( није приказано), на тај начин рекапитулирајући хетерогеност почетне популације, и сугеришући да би станице НП8-ГФП + могле да се поделе асиметрично, да би настале НП8-ГФП - ћелије. НП8-ГФП + Ду145 ћелије прочишћене од првих тумора такође су регенерирали туморе ∼ 60% већи од тумора који потичу из ћелије НП8-ГФП (нису приказани). Хистолошка анализа показала је лакше откривајуће НАНОГ-експримирајуће и Ки-67 + ћелије у туморима који потичу из ћелија НП8-ГФП + Ду145 (допунска слика С2б). Слично НП8-ГФП + Ду145 ћелијама, НП8-ГФП + ПЦ3 ћелије су такође генерисале веће туморе од својих НП8-ГФП - колега у оба о и 2 о туморском испитивању (Слика 2х). Колективно, истраживачке студије за праћење показују да ПЦа ћелије које експримирају НАНОГП8 поседују веће клонске и туморске регенерационе капацитете, карактеристике повезане са ЦСЦс и очекиване од њих.

Успостављање индуцибилног НАНОГ прекомерног експресије лентивирусног система

Други главни циљ ове студије био је утврдити ћелијске и молекуларне механизме који подупиру биолошке функције НАНОГ-а у ћелијама рака. Како се НАНОГ нормално експримира у култивираним ћелијама епитела карцинома у односу на ЕСЦ (Јетер ет ал., 2009), направили смо тетрациклин (доксициклин, докс) -индуцибилни лентивирусни систем да претерано експримира НАНОГ (Слика 3а). Ћелије карцинома (МЦФ7, Ду145 и ЛНЦаП) иницијално заражене пЛВКС-ТетОН лентивирусом (слика 3а) и које експримирају високе нивое докс-индуцибилног активатора (ТетР / ВП16) клонално су добијене анализом експресије елемента који реагује на тетрациклин ( ТРЕ) репортер луциферазе (подаци нису приказани). Стабилни клонови су затим подвргнути трансдукцији од 2 ° било с пЛВКС празним вектором, или с лентивирусним векторима пЛВКС-ТРЕ-Наног1 / НаногП8 у којима је клонирана НАНОГ1 или НАНОГП8 кДНА низводно од ТРЕ (слика 3а). Анализа Вестерн блот-а показала је док-индуцирано регулирање НАНОГ протеина на начин овисан о дози (Слике 3б и ц; имајте на уму да је већина комерцијалних анти-НАНОГ антитела (Абс) генерисана против НАНОГ1 и препознају и НАНОГ1 и НАНОГП8 на вестерн и ИФ; Јетер ет ал., 2009). Индуковани протеин НАНОГ (ради једноставности, и НАНОГ1 и НАНОГП8 протеини ће се од сада и даље назвати НАНОГ због готово идентичних секвенци аминокиселина) већином откривен у језгру (слике 3д и е и додатна слика С3), субцелију очекује се локализација за фактор транскрипције. У недостатку док-а, Ду145-експресионирајуће НАНОГ (слика 3д) и МЦФ7 (допунска слика С3) ћелије су ретке, а ННОГ-експресионе ЛНЦаП ћелије су још ретке (Слика 3е), у складу са нашим ранијим резултатима (слике 1б и 2б; Јетер ет ал., 2009) и наша запажања да је ендогени НАНОГ протеин детектован само западним блоттингом при дужем излагању (Слике 3б и ц, а подаци нису приказани).

Image

Успостављање и карактеризација док-индуцибилног НАНОГ система прекомерне експресије. ( а ) шематски приказ бЛВКС-ТетОН (Цлонтецх) бинарног система за експресију индуцибилног НАНОГ1 или НАНОГП8: ЦМВ, цитомегаловирус промотор; док, доксициклин; ТРЕ, елемент који реагује на тетрациклин. ( б, ц ) Анализа Вестерн блот протеинских екстраката (80 µг целог ћелијског лизата) показује прекспресију НАНОГ индуцирану доксом. НС, неспецифични опсег. ( б ) Западна анализа НАНОГ у екстрактима добијеним из контролних пЛВКС МЦФ-7, Ду145 и ЛНЦаП ћелија или одговарајућих пЛВКС-НАНОГ1 / П8 клонова, било необрађених, било индукованих док-ом (500 нг / мл; 48 х). ( ц ) Докс титрација у МЦФ-7 пЛВКС ћелијама како је назначено. Имајте у виду да су у обе западне анализе ендогени НАНОГ протеини једва детектирани због тога што су ћелије које експримирају НАНОГ веома ретке (видети доле). ( д, е ) бојење НАНОГ ИФ коришћењем Рб поликлоналног анти-НАНОГ Аб (Х-155; Санта Цруз) показало је нуклеарну експресију НАНОГ у већини клонално изведених ћелија после индукције док-а у пЛВКС-НАНОГ1 / П8 Ду145 ( д ) или ЛНЦаП ( е ) ћелије. Аб, антитело; док, доксициклин.

Слика пуне величине

Да бисмо проценили да ли је прекомерно експресован НАНОГ протеин функционалан, извели смо НАНОГ хроматинске имунопреципитације (ЦхИП) тестове праћене ПЦР коришћењем прајмера против неколико пријављених генских циљева НАНОГ1 у хуманим ЕСЦ-има, укључујући ц-Миц, Оцт-4, Е-кадхерин, ФГФ4, Гли1 и ХокЦ13 (Медеирос ет ал., 2009 и допунска слика С4). Прво смо урадили ЦхИП тестове у Н-ТЕРА ћелијама, а резултати су показали различито везање протеина НАНОГ на појединачне промоторе гена (Слика 4а). Анализа ЦхИП у НАНОГ1- и НАНОГП8-прекомерном притиску (то јест пЛВКС-Наног1 / НаногП8) ЛНЦаП ћелије показала је да се НАНОГ-индуковани доксом такође везују за промоторне регионе ових гена (Слика 4б), иако су нивои везивања, након што се нормализују на РбИгГ ЦхИП, очекивано је био мањи него у Н-ТЕРА ћелијама (упоредите слике 4б и ц са 4а). Слични ЦхИП тестови нису показали значајно везивање ни НАНОГ1 нити НАНОГП8 на ГАПДХ промотору (Слика 4ц). Све у свему, анализа ИФ и ЦхИП показује да прекомерно експримирани НАНОГ1 / НАНОГП8 протеини у нашим индуцибилним системима локалишу се за језгро и функционални су у везивању очекиваних циљева.

Image

Прекомерно експримирани протеини НАНОГ1 и НАНОГП8 у ћелијама рака везују се за очекиване молекуларне мете. ( а ) Анализа ЦхИП у ћелијама карцинома хуманог ембрионалног карцинома. Хроматин припремљен из Н-ТЕРА ћелија коришћен је у имунопреципитацији са Рб поликлонским анти-НАНОГ Аб или, као контролом, РбИгГ. ДНК кооципизована у ЦхИП је затим коришћена за ПЦР анализу промоторског региона наведених молекула. Резултати су изражени као везивање НАНОГ-а за циљеве у односу на РбИгГ (приказано као 1). ( б ) пЛВКС-НАНОГ1 / НАНОГП8 ЛНЦаП ћелије (клон Д2) су или необрађене, или индуковане док-ом (500 нг / мл) током 72 х. Хроматин је припремљен и ЦхИП тестови су изведени слично као у Н-ТЕРА ћелијама. ( ц ) Примери ЦхИП тестова са ГАПДХ ЦхИП као негативне контроле. Аб, антитело; ЦхИП, имунопреципитација са хроматином; ГАПДХ, глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа.

Слика пуне величине

Краткотрајна индукција НАНОГ не промовише пролиферацију ћелија рака

Успешно успоставивши индуцибилни систем за прекомерно изражавање функционалног НАНОГ-а, следећи смо покушали да утврдимо биолошке одговоре на повишени протеин НАНОГ у ћелијама рака. Како је раније било извесно да прекомерна експресија НАНОГ повећава пролиферацију у неколико типова ћелија, укључујући НИХ3Т3 ћелије (Зханг ет ал., 2005), ЕСЦ (Ма ет ал., 2009) и ћелије колоректалног карцинома (Менг ет ал., 2010), прво извршили краткорочне тестове у којима су наше индуцибилне НАНОГ ћелијске линије стимулисане док-ом током 3-4 дана пре бројања укупног броја ћелија. На наше изненађење, у стандардним условима културе није примећена значајна разлика у пЛВКС контроли у односу на пЛВКС-Наног1 / П8 ЛНЦаП, Ду145 или МЦФ-7 ћелије (допунска слика С5а; подаци нису приказани). Тестови за уграђивање бромо-деоксиуридина (БрдУ) такође нису показали разлике (допунска слика С5б), што сугерише да повећана краткорочна експресија НАНОГ-а не промовише ћелијску пролиферацију у тим ћелијама рака. У складу са овим уоченим недостатком фенотипа, анализа западне блотине краткорочних (∼ 3–4 дана) ћелија Ду145, ЛНЦаП и МЦФ-7 третирана доксом показала је да упркос јасној индукцији НАНОГ протеина, није било забележити промене у нивоа неколико позитивних регулатора ћелијског циклуса, укључујући ЦДЦ25А и ЦДК6, за које се извештава да су транскрипционо регулисани као одговор на прекомерну експресију НАНОГ у хуманим ЕСЦ-има (Зханг ет ал., 2009), као и циклин-Д1 и он-циген-ц-Миц (Додатна слика С5ц и д). Слично овим регулаторима ћелијског циклуса, неколико СЦ молекула, укључујући Сок2, Оцт4, Гли1, Нкк3.1 и ЦД44, као и два молекула повезана са епителијско-мезенхималном транзицијом, односно пуж и Е-кадхерин, такође нису показали значајне промене након краткотрајне индукције НАНОГ1 / НАНОГП8 (допунска слика С5ц и д).

НАНОГ прекомерна експресија подстиче фенотипове отпорне на кастрацију и регенерацију тумора у ћелијама ЛНЦаП

Иако краткотрајна индукција НАНОГ-а није промовисала пролиферацију ћелија рака, она је подстакла опстанак и формирање сфере у ЛНЦаП ћелијама који нису зависни од усидрености у условима недостатком андрогена, углавном тестиран на дужи рок (2–4 недеље). Два независна експеримента показала су да пЛВКС-НаногП8, али не пЛВКС-Наног1 ЛНЦаП ћелије стварају ∼ 2 × више сфера у метилцелулози него пЛВКС контролне ћелије (Слика 5а). С друге стране, и пЛВКС-Наног1 и пЛВКС-НаногП8 ЛНЦаП ћелије култивисане у ЦДСС, у поређењу са пЛВКС контролним ћелијама, формирале су више андрогена (АИ) жаришта и плутајуће сфероиде (Слике 5б и ц), што је резултирало већим бројем ћелија. (Слика 5д).

Image

НАНОГ прекомерна експресија промовише АИ фенотипове у ЛНЦаП ћелијама. ( а - д ) Појачани АИ раст НАНОГ-прекомерног експресије ЛНЦаП ћелија у односу на празан вектор (пЛВКС) контролу. ( а ) Експресија пЛВКС-НАНОГП8 промовише формирање сфере ЛНЦаП. 2.5К ћелије (експеримент бр. 1) или 1К (експеримент бр. 2) ћелије су смештене у посуду са 24 јажице у Метхоцулт допуњеној са Б27 и Н2, и 500 нг / мл док-а. Кугле (> 100 µМ) су постигнуте две недеље касније. Доље су приказане двије репрезентативне микрофотографије сфера формираних у метилцелулози. ( б - д ) НАНОГ1 и НАНОГП8 прекомерна експресија поспешује раст АИ ЛНЦаП ћелија. Три врсте ЛНЦаП ћелија (2К ћелије / базенчић, посађене у ТЦ удубник са шест јажица) узгајане су у медијуму који садржи ЦДСС до 30 дана, храњењем (+500 нг / мл док) сваких 3–5 дана. Микроскопија са светлим пољем коришћена је за снимање АИ жаришта и плутајућих сфера ( б ). ( ц ) Квантификација АИ жаришта у две различите временске тачке. ( д ) Укупан број живих ћелија по лежишту на дан 30. ( е ) НАНОГ прекомерно експримирајуће ЛНЦаП ћелије (1 × 10 6 по ињекцији) имплантиране сц у мужјака НОД / СЦИД-γ генерирају веће туморе од ћелија које контролирају пЛВКС ( све покупљено на дан 35). ( ф, г ) прекомерна експресија НАНОГ1 / П8 поспешује регенерацију тумора отпорног на кастрацију. Три врсте пЛВКС ЛНЦаП ћелија су имплантиране (10К по ињекцији) сц било у нетакнутој или у потпуности кастрираној (тј. Хируршкој кастрацији и третману бикалутамидом). НОД / СЦИД-γ мишеви и тумори су прикупљени 41 (нетакнути) и 61 (кастрирани) дана након имплантације. Приказане су просечна тежина тумора ( ф ) и слике тумора ( г ). ( х ) ЛНЦаП ћелије које експримирају НАНОГП8 изведене из АИ тумора показују појачана миграцијска својства која су процењена тестом „огреботине“ потпомогнутом видео-микроскопијом. Приказане су репрезентативне временске слике за пЛВКС и пЛВКС-НАНОГП8 ЛНЦаП ћелије (леви панели) и квантификација миграције ћелија у све три групе (десно). АИ, андрогени независно; ЦДСС, серум одстрањен угљеном декстраном; док, доксициклин; сц, поткожно.

Слика пуне величине

Затим смо одредили утицај прекомерне експресије НАНОГ на развој тумора ЛНЦаП, било у нетакнутој (хендикепирани андрогенима) или кастрираној (хируршка кастрација и третман бикалутамидом; видети одељак Материјали и методе) мишеви НОД / СЦИД-γ. Приметили смо да НАНОГ прекомерна експресија подстиче регенерацију тумора ЛНЦаП код нетакнутих домаћина, али на помало недоследан начин. На пример, ћелије пЛВКС-Наног1 развиле су веће туморе од пЛВКС ћелија у једном (Слика 5е), али не и другом (Слика 5ф) експерименту. С друге стране, пЛВКС-НаногП8 ћелије су регенерирале веће туморе од пЛВКС ћелија, али у оба експеримента разлика је била испод статистичке вредности (слике 5е и ф). Супротно томе, и пЛВКС-НаногП8 и пЛВКС-Наног1 ћелије развиле су значајно веће туморе од контролних ћелија код кастрираних НОД / СЦИД-и мишева (слике 5ф и г). Треба напоменути да су кРТ-ПЦР и имунохистохемијска (ИХЦ) анализа показале свеукупно сличне нивое НАНОГ мРНА и експресије протеина у пЛВКС-НАНОГ1 и пЛВКС-НАНОГП8 ЛНЦаП туморима развијеним нетакнутим (допунска слика С6а, лево; додатна слика С6б) или кастрираним ( није приказано) домаћини. Занимљиво је да смо изводили туморске ћелије из ЛНЦаП АИ тумора и анализирали њихове миграцијске капацитете видео-микроскопијом која пролази временом, приметили смо да АИ ћелије које експримирају НАНОГП8 поседују већи степен миграције тако да затварају индуковане 'ране' брже од пЛВКС контролне или пЛВКС-Наног1 ћелије (Слика 5х).

Молекуларне промене које прате НАНОГ прекомерну експресију у ћелијама ЛНЦаП

С обзиром на то да НАНОГ-ове прекомерно експримирајуће ЛНЦаП ћелије и ин витро и ин виво показују појачан ватростални раст хормона, питали смо се који молекуларни механизми могу да објасне ову отпорност на одузимање андрогена. ИХЦ анализа АИ тумора развијена у кастрираним домаћинима (слика 5 г) показала је значајно више Ки-67 + ћелија и у пЛВКС-Наног8 и пЛВКС-Наног1 туморима (слика 6а), сугеришући да НАНОГ прекомерна експресија подстиче пролиферацију ћелија ин виво . У складу са овим закључком, пЛВКС-Наног1 АИ тумори, а нарочито пЛВКС-НаногП8 АИ тумори, показали су виши ниво ц-Миц у поређењу са контролним туморима (Слика 6б). Супротно томе, нисмо приметили очигледне разлике у Ки-67 + ћелијама у ЛНЦаП туморима развијеним код нетакнутих мушких мишева (допунска слика С6ц). Раније смо пружили прелиминарне доказе да се чинило да се НАНОГ и андрогени рецептори (АР) реципрочно експримирају у ћелијама ХПЦа у туморима пацијента (Јетер ет ал., 2009). ИХЦ (слика 6а) и Вестерн блоттинг анализа (слика 6ц) открили су смањене нивое АР у пЛВКС-Наног1 / НаногП8 ЛНЦаП АИ туморима. У ствари, чак и у краткорочним ин витро испитивањима, и клон Б2 (слика 6д), и клон Д2 (допунска слика С5ц) ћелије ЛНЦаП, након индукције НАНОГ1 / НАНОГП8, показале су суптилно али поновљиво смањење АР. У складу са смањеним нивоима АР, пЛВКС-Наног1 / НаногП8 ЛНЦаП АИ тумори су такође показали смањене нивое антигена специфичног за простату (ПСА) (Слика 6а). Пилот експерименти са ПСА промотором вођеним ПСА такође су показали да пЛВКС-Наног1 / НаногП8 ЛНЦаП ћелијске културе имају ∼ 20% и 18%, респективно, мање ГФП + ћелија од пЛВКС контролних ЛНЦаП ћелија (подаци нису приказани). У принципу, повећана пролиферација ћелија (то јест, повећана Ки-67 + ћелија повезана са у-регулацијом ц-Миц) и инхибиција диференцијације (то јест, смањени АР и ПСА) могу помоћи да се објасни како НАНОГ1 / НАНОГП8 промовише регенерацију тумора ЛНЦаП АИ.

Image

Молекуларне промене повезане са НАНОГ-промовисаним АИ фенотиповима у ЛНЦаП ћелијама ( а ) Х&Е бојење и ИХЦ анализа молекула назначена у три ЛНЦаП АИ тумора (бројеви ознака тумора наведени у заградама). ( б, ц ) Анализа Вестерн блот-а ц-Миц ( б ) и АР ( ц ) код АИ ЛНЦаП тумора. Н1, пЛВКС-НАНОГ1 ЛНЦаП АИ тумор; НП8, пЛВКС-НАНОГП8 ЛНЦаП АИ тумор. НС, неспецифични опсег (служио као контрола оптерећења). ( д ) Анализа Вестерн блота Наног (врх; НС, неспецифични опсег) и АР у клонираним Б2 ЛНЦаП ћелијама третираним назначеним концентрацијама док-а. ( е, ф ) Приказ топлотне мапе промене експресије гена 11 молекула у ЛНЦаП ћелијама, узгајаних било у условима лишеним андрогена ( е ), било у регуларним серумским културама ( ф ). Нивои мРНА за ове и друге молекуле (видети детаље у Додатној табели С1 и С3) су одређени кРТ-ПЦР и топлотне мапе које су генерисане коришћењем Матрик2.пнг софтвера. Боје обојене шипкама (скала доле) означавају ниво мРНА у НАНОГ прекомерно експресијућим ћелијама култивисаним под назначеним условима у односу на пЛВКС контролне ћелије култивисане под истим условима. АИ, андрогени независно; АР, андрогени рецептор; док, доксициклин; ИХЦ, имунохистохемијски; кРТ – ПЦР, квантитативни РТ – ПЦР.

Слика пуне величине

Да бисмо додатно истражили потенцијалне молекулске механизме НАНОГ-промовисаних кастрација отпорних својстава у ЛНЦаП ћелијама, помоћу кРТ-ПЦР, анализирали смо ниво мРНА у групи молекула (допунска табела С1 и С3), која обухвата пријављене НАНОГ циљеве у ЕСЦ-има ( ОЦТ-4 и СОКС-2 ), ЦСЦ маркери ( ЦД133 , ЦД44 , ц-КИТ / Ц Д117 , АЛДХ1 (алдехид дехидрогеназа-1) и АБЦГ-2 / БЦРП ) и молекули претходно уплетени у отпорност кастрације ПЦа ( ИГФБП5 , ЦКСЦР4 и Бцл-2 ). Као што је приказано на слици 6е, инзулински растни фактор раста-протеин-5 ( ИГФБП-5 ) и мРНА рецептора хемокинског рецептора ЦКСЦР4 су значајно регулирани као одговор на прекомерну експресију НАНОГ у условима лишеним андрогенима. Релативни нивои мРНА ЦКСЦР4 повишени су ∼ 12 × и × 10 ×, а ИГФБП5 је повишен за × 5 × и × 7 ×, у пЛВКС-Наног1 и пЛВКС-НаногП8 ЛНЦаП третираним бикалутамидом у односу на ниво у контролним ћелијама пЛВКС ( Слика 6е и додатна табела С3). Три површинска маркера ЦСЦ, ЦД133 , АБЦГ2 и ц-КИТ , углавном су порасла као одговор на НАНОГ прекомерну експресију, посебно у сферама (Слика 6е). Неколико других испитиваних молекула показало је и неке измјене у увјетима недостатка андрогена (Слика 6е), иако су те разлике углавном мање од двоструке.

Помало изненађујуће, када смо прегледали исти панел гена у ЛНЦаП ћелијама култивисан у регуларним медијумима који садрже серум и третирани док-ом 3–14 дана, многи од истих гена су такође били динамички регулисани као одговор на индукцију НАНОГ1 / НАНОГП8, која је укључивала и ИГФБП5 и ЦКСЦР4 , као и ЦД133 , АБЦГ2 и ц-КИТ (слика 6ф). Ови резултати сугеришу да су промене ових гена вероватно укључене у посредовање општих про-туморигенских ефеката поред АИ-специфичних ефеката НАНОГ-а.

Даљњи доказ да Наног прекомерна експресија промовише ЦСЦ фенотипе и својства ЦСЦ-а

Да бисмо даље проценили ћелијске и молекуларне последице НЕОГ прекомерне експресије у другим контекстима, наставили смо ин витро и ин виво студије користећи наше индуцибилне ћелије Ду145 и МЦФ7. Индукција НАНОГП8 у ћелијама Ду145, које су АИ ПЦа ћелије и немају експресију АР, подстакла је регенерацију тумора на ектопичним (сц; слика 7а) и ортотопским (дорзална простата или ДП; слика 7б). Занимљиво је да пЛВКС-Наног1 Ду145 ћелије нису регенерирале значајно веће туморе од пЛВКС контролних ћелија (слике 7а и б) упркос укупним нивоима експресије НАНОГ мРНА (допунска слика С6а, десно) и протеина (није приказано) у пЛВКС-Наног1 и пЛВКС -НаногП8 Ду145 тумори. пЛВКС-НаногП8 Ду145 ћелијски изведени ортотопски тумори имали су виши ниво ц-Миц протеина у поређењу са пЛВКС-Наног1 или пЛВКС-контролним ћелијама (слика 7ц), можда делимично објашњавајући про-туморигенску активност НАНОГП8.

Image

НАНОГ прекомерна експресија промовише ЦСЦ карактеристике. ( а, б ) ДуАН45 ћелије које прекомерно експримирају НАНОГП8 стварају веће туморе од ћелија које контролирају пЛВКС. ( а ) Субкутана (сц) ињекција три врсте пЛВКС Ду145 ћелија (500К) у Матригелу у НОД / СЦИД домаћине, прикупљена дана 79. ( б ) Ортопска трансплантација пЛВКС Ду145 ћелија (милион) у Матригелу у дорзал простата (ДП) НОД / СЦИД-γ мишева, сакупљен на дан 40. ( ц ) Анализа западног блота нивоа протеина ц-Миц у ортотопичним Ду145 туморима (горе). Нивои ЕРК и Е-кадхерина су непромењени и приказани су као контроле учитавања. ( д ) ћелије НАНОГ-прекомерне експресије пЛВКС-МЦФ7 биле су резистентне на хемотерапеутске лекове доксорубицин (200 нМ) и паклитаксел (25 нМ). 35К ћелије посађене по лежишту ( н = 3) у посуди са шест јажица индуковане су са 500 нг / мл док током 48 сати, праћено лечењем са лековима (96 х). Ћелије су трипсинизоване и бројане, а број ћелија је представљен као проценат у односу на контролу. * П <0, 01; # П <0, 001 (Студент'с т -тест). ( е ) Приказивање топлотне мапе промене експресије гена 14 молекула у ћелијама пЛВКС-Наног1 (Н1) или пЛВКС-НаногП8 (НП8) МЦФ7 индукованих док-ом (500 нг / мл) током 3, 5 и 14 дана. Нивои мРНА за ове и друге молекуле (видети детаље у допунској табели С1 и С3) су одређени кРТ-ПЦР и топлотне мапе су генерисане помоћу софтвера Матрик2.пнг. ( ф ) ИФ обојење ЦД133 протеина у пЛВКС МЦФ7 ћелијама како је назначено. Слике су снимљене конфокалним микроскопом. ( г ) НАНОГ1 / П8 индукција повећава АЛДЕФЛУОР-позитивне ћелије. Три врсте пЛВКС-МЦФ7 ћелија су третиране док-ом (500 нг / мл, 10 дана), а затим су коришћене у АЛДЕФЛУОР тестовима. Указани су средњи проценти ћелија позитивних на АЛДЕФЛУОР. ЦСЦ, матичне ћелије рака; док, доксициклин; сц, поткожно; кРТ – ПЦР, квантитативни РТ – ПЦР.

Слика пуне величине

МЦФ-7 ћелије које су прекомерно експримирале НАНОГ, нарочито НАНОГП8, показале су повећану отпорност на хемотерапеутске лекове доксорубицин и паклитаксел, у складу са претходним налазима других (Боургуигнон ет ал., 2008). Да бисмо истражили потенцијалне механизме који стоје на основу НАНОГ-подношене толеранције на лекове у МЦФ7 ћелијама, такође смо користили кРТ-ПЦР квантификацију више од десетак гена (Слика 7е). Резултати су показали динамичку регулацију НАНОГ1 / НАНОГП8 неколико гена за преживљавање / детоксикацију, укључујући Бцл-2 , АБЦГ2 , ЦД133 и АЛДХ1А1 (Слика 7е и Додатна табела С3). Ако је бојење потврдило пораст протеина ЦД133 у НАНОГ-прекомерно експримирајућим МЦФ7 ћелијама (слика 7ф). АЛДХ1А1 (АЛДХ1 изоформа А1) је примарна АЛДХ изоформа која посредује фенотип АЛДЕФЛУОР (Гинестиер ет ал., 2007). У складу са регулирањем мРНА АЛДХ1А1, прекомерна експресија НАНОГ1 / НАНОГП8 увелике је повећала проценат АЛДЕФЛУОР-позитивних МЦФ7 ћелија (слика 7г). Значајно је да су и НАНОГ1 и НАНОГП8 такође повећали обиље АЛДЕФЛУОР + Ду145 ћелија (допунска слика С6д).

Поред горе поменуте четири молекуле, НАНОГ1 / НАНОГП8 прекомерна експресија у ћелијама МЦФ7 је такође регулисана на ниже нивое, многи од других испитиваних молекула, укључујући ц-Миц , ОЦТ-4 , СОКС2 , ЦД44 , ц-КИТ , ММП9 , ТВИСТ и СНАИЛ (слика 7е).

Дискусија

НАНОГП8 експресионирајуће ПЦа ћелије поседују ЦСЦ својства

У овом истраживању прво користимо диференцијалну кРТ-ПЦР анализу како бисмо показали да култивисане ПЦа (и неке друге врсте рака) ћелије и ксенографт као и тумори пацијената углавном испољавају НАНОГП8 мРНА, а НАНОГ1 мРНА углавном испод прага детекције. Ови резултати потврђују наш претходни прелиминарни извештај (Јетер ет ал., 2009) и у складу су са НАНОГ1 који је ограничен на плурипотентне ћелије и регулисан током диференцијације (Цхамберс ет ал., 2003; Цхамберс и Томлинсон, 2009). Чини се да је ген НАНОГ1 у ПЦа ћелијама попут ПЦ3 епигенетички утишан као третман ТСА, инхибитором хистон деацетилазе, али не и 5'-аза-деоксицитидином, инхибитором ДН-метитрансферазе, делимично "враћа" експресију НАНОГ1 (Јетер ет ал., 2009). Интригантно је да соматске ћелије рака, уместо да реактивирају ендогени локус НАНОГ1, изражавају НАНОГ из локуса НАНОГП8 . Тренутно истражујемо како се НАНОГП8 ретрогене транскрипционо активира у ћелијама рака.

Оборење ендогеног НАНОГ-а у ћелијама рака значајно смањује њихов туморигенски капацитет (Јетер ет ал., 2009). Пошто је иницијација тумора једна од главних карактеристика ЦСЦ-а, наши резултати губитка функције (Јетер ет ал., 2009) сугеришу да ћелије рака које експресирају НАНОГП8 могу да поседују ЦСЦ својства. Ова премиса је рођена у садашњим истраживањима праћења промотора: ПЦа ћелије које експримирају НАНОГП8 су суштински јединствене у поређењу са изогеним ћелијама које се не експресују, показујући појачану клоногеност ин витро и туморигеницност ин виво . Изразито, ћелије НАНОГП8 -ГФП ПЦа могу да регенеришу туморе који садрже ГФП - ћелије као већину, што сугерише да се НАНОГП8 + ПЦа ћелије могу само-обновити ин виво .

НАНОГ прекомерна експресија промовише ЦСЦ фенотипе и својства ин витро и ин виво

Наше тренутне студије стјецања функција НАНОГ даље надопуњују ранија открића (Јетер ет ал., 2009) и указују на то да је прекомерна експресија НАНОГ довољна да ћелијама рака доделити одређена својства и фенотипе ЦСЦ-а. Дакле, НАНОГ индукција поспешује клоногенски опстанак у ЛНЦаП ћелијама, резистенцију на лекове у МЦФ7 ћелијама и, што је најважније, развој тумора у ћелијама ЛНЦаП и Ду145. Пратећи манифестацију таквих биолошких својстава ЦСЦ-а, прекомерна експресија НАНОГ-а појачава експресију многих молекула повезаних са ЦСЦ-ом, укључујући, између осталог, ЦД133 , АБЦГ2 , АЛДХ1А1 и ЦД44 .

НАНОГ прекомерна експресија потиче АИ фенотипе и регенерацију ПЦа отпорне на кастрацију

Једно од најзначајнијих открића наше студије је да је НАНОГ експресија повезана са АИ и отпорношћу кастрације у ћелијама ПЦа. Први наговештај за такво удруживање долази из промоторских студија праћења, у којима смо открили да ЛНЦаП ћелије које експримирају НАНОГП8 поседују продужену и знатно повећану преживетљивост у условима лишеним андрогена. Наредне студије добитка функција пружају уверљиве доказе да прекомерна експресија НАНОГ-а потиче клоногену и регенерацију тумора ЛНЦаП ћелија у условима / домаћинима лишеним андрогена. Ови резултати сугерирају да НАНОГ може допринети напредовању ПЦа у стање ватросталног хормона. In support, whole-genome cDNA microarray analysis shows that NANOG is preferentially expressed in PCa cells that express low levels of PSA, the population naturally resistant to androgen blockade (Qin et al. , unpublished observations). In further support, NANOG overexpression also enhances tumor regeneration in AR and AI Du145 cells.

What mechanisms might be responsible for NANOG-conferred AI phenotypes and castration resistance? One mechanism is likely related to the NANOG-promoted CSC phenotypes and properties discussed above. Prostate CSCs seem to express low levels of AR and thus are intrinsically less dependent on AR signaling (Collins et al., 2005; Patrawala et al., 2006; Li et al., 2009). In support of this connection, we have previously reported reciprocal nuclear expression between AR and NANOG (Jeter et al., 2009), and we have shown here that NANOG-overexpressing LNCaP cells express lower levels of AR, especially in tumors developed in castrated hosts.

NANOG promotes the expression of other molecules such as Bcl-2, IGFBP-5 and CXCR4, which might also be involved in NANOG-mediated castration resistance in LNCaP cells. Bcl-2 is an antiapoptotic protein and its overexpression has been strongly implicated in the development of castration-resistant PCa (McDonnell et al., 1992). IGFBP-5 mRNA and protein are upregulated in response to castration and exogenous IGFBP-5 stimulates the proliferation of immortalized prostate epithelial cells (Xu et al., 2007). Also, overexpression of IGFBP-5 accelerates the proliferation of LNCaP cells in androgen-deprived conditions in a phosphatidylinositol-3-kinase-dependent manner (Miyake et al., 2000). IGFBP-5 is known to regulate IGF-1 receptor signaling, which has been implicated in LNCaP (and LAPC-9) PCa progression to androgen independence (Nickerson et al., 2001), and is required for the emergence of the CD133 + drug-resistant PC9 cells (Sharma et al., 2010). Finally, CXCR4 and its cognate chemokine CXCL12 have been implicated in PCa cell migration and invasion (Singh et al., 2004; Frigo et al., 2009). A functional consequence of NANOG-promoted CXCR4 expression may be the enhanced migratory capacity of NANOGP8-expressing LNCaP AI tumor cells.

The mechanisms underlying the NANOG-mediated castration resistance are likely multi-faceted, and our ongoing research seeks to further address whether some of these CSC- and AI-associated molecules represent direct NANOG targets and exactly how NANOG promotes PCa AI progression.

NANOGP8 versus NANOG1: similarities and distinctions

Throughout the preceding discussions, we mostly used the term NANOG to 'generically' refer to the proteins encoded by both NANOG1 and NANOGP8 , mainly because the predicted NANOG1 and NANOGP8 proteins are ∼ 99% identical (Jeter et al., 2009). Multiple lines of evidence support the overt similarities between NANOG1 and NANOGP8 proteins. First, most currently used commercial anti-NANOG Abs are raised against NANOG1 but generally recognize the recombinant NANOGP8 proteins equally well (Jeter et al., 2009). Second, both NANOG1 and NANOGP8 are induced, remarkably, to very similar levels in cancer cells (Figures 3b and c). It is worth mentioning that the induced NANOG1 and NANOGP8 are both at much lower levels than endogenous NANOG1 levels in N-TERA cells (Figures 7b and c), suggesting that somatic cancer cells might not be able to tolerate very high levels of NANOG as a result of unique biochemical mechanisms regulating NANOG turnover. Third, importantly, NANOG1 and NANOGP8 show similar biological effects in many experimental settings. For example, both NANOG1 and NANOGP8 promote castration-resistant LNCaP tumor development (Figures 5f and g), increase c-Myc and decrease AR in AI tumors (Figures 6a and c), and enhance the expression of many same genes such as CD133, IGFBP-5 and ABCG2 (Figures 6e and f, and 7e).

On the other hand, NANOGP8 is the predominant 'isoform' expressed in cancer cells and may, therefore, have evolved new functions distinct from those of NANOG1 in ESCs. In support, we have observed, in most assays, much more consistent biological effects with NANOGP8 overexpression compared with NANOG1 overexpression. For example, only NANOGP8 promotes, in LNCaP cells, AI sphere and AI foci formation, castration-resistant tumor development and cell migration (Figure 5). Likewise, NANOGP8, but not NANOG1, promotes Du145 tumor development and c-Myc upregulation. At the molecular levels, NANOGP8 and NANOG1 seem to bind to chromatin-associated targets with different affinities (Figure 4). Moreover, NANOGP8 and NANOG1 frequently induce different gene alterations even in the same cell types maintained under the identical conditions (Figures 6e and f, and 7e). Finally, whole-genome ChIP-Seq analysis has shown that, although NANOG1 and NANOGP8 share ∼ 75% genomic binding sites, the two proteins show ∼ 25% distinct binding sites in the genome (Jeter et al. , unpublished observations). Further analysis of the ChIP-Seq data, together with our efforts to elucidate the unique biochemical properties and signaling partners of NANOG in cancer cells, and the interrelationship between AR/androgen signaling and NANOG, should greatly advance our understanding of the molecular mechanisms underlying the immortality of cancer cells and the development of castration-resistant PCa.

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Додатне информације

Речник

АД

androgen dependent

AI

androgen independent

ЦЕ

cloning efficiency

ЦхИП

хроматин имунопреципитација

ЦСЦ

матичне ћелије рака

dox

доксициклин

ДП

dorsal prostate

ЕМТ

epithelial mesenchymal transition

ЕСЦ

ембрионалне матичне ћелије

HPCa

human prostate cancer patient samples

NOD/SCID

non-obese severe combined immunodeficient mice

PCa

карцином простате

qRT–PCR

quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction

сц

subcutaneous

СП

side population

TSS

transcription start site

УТР

непревођена регија

Додатне информације прате рад на веб локацији Онцогене (//ввв.натуре.цом/онц)