Мотив напине неуропротективни протеин зависан од активности (аднп) регулише дендритичне бодље кроз протеине који се везују на микротубулима | молекуларна психијатрија

Мотив напине неуропротективни протеин зависан од активности (аднп) регулише дендритичне бодље кроз протеине који се везују на микротубулима | молекуларна психијатрија

Anonim

Субјекти

  • Биохемија

Апстрактан

НАП мотив неуропротективног протеина зависног од активности (АДНП) повећао је меморијски резултат код пацијената који пате од благог когнитивног оштећења и заштићених активности свакодневног живота код пацијената са шизофренијом, истовремено учвршћујући аксонски транспорт микротубула (МТ), код мишева и мува. Питање је како НАП утврђује МТ? Наша анализа секвенци идентификовала је мотив интеракције с МТ-везивањем протеина (ЕБ1) СкИП (СИП, Сер-Иле-Про) у АДНП / НАП и показала специфична места везивања за СкИП код свих чланова породице протеина ЕБ (ЕБ1-3). Други су открили да ЕБ1 повећање израслина неурита ублажава ЕБ2, док ЕБ3 ступа у интеракцију са протеином 95 постинаптичке густине (ПСД-95) ради модулације дендритичке пластичности. Овде је НАП повећао експресију ПСД-95 у дендритичким бодљима, које је инхибирало утишавање ЕБ3. ЕБ1 или ЕБ3, али не и утишавање ЕБ2 инхибира НАП посредовану заштиту ћелија, што одражава НАП специфичност везивања. НАПВС К ИПК (СкИП = СКИП), али не и НАПВААААК опонашао је НАП активност. АДНП, неопходан за диференцијацију неурона и стварање мозга код миша, члан комплекса за ремоделирање хроматина СВИ / СНФ и главни протеин мутиран у аутизму и дерегулиран код шизофреније код мушкараца, показао је сличне интеракције ЕБ, које су побољшане лечењем НАП-а. Новооткривени заједнички циљ МТ-а НАП / АДНП-а директно се укључује у синаптичку пластичност, објашњавајући ширину и ефикасност неуропротективних / неуротрофних капацитета.

Увод

Активно зависни протеин (АДНП), 1, 2 мутиран у ≥0, 17% случајева поремећаја из аутизма (један од најчешћих гена повезаних са поремећајем аутизма до сада), 3 дерегулиран у шизофренији, 4, 5 предвиђајући напад фронтотемпоралне деменције 6 и идентификован потпуном протеомиком као једини протеин који значајно опада у серуму болесника са Алзхеимер-овом болешћу (АД) (у поређењу са подударним контролама), 7 учествује у ремоделирању хроматина као компоненте есенцијалне неферментирајуће СВИтцх / сахарозе (СВИ / СНФ) комплекс. 8, 9 Док регулише> 400 гена током ембрионалног развоја, 10, 11, 12 АДНП није ограничен на ћелијско језгро, 13, 14, 15 и у интеракцији је с кључним регулаторима процеса аутофагије, повезаним са цитоплазматским микротубулима (МТ). 5

МТ, кључни цитоскелетни филаменти који се налазе у свим еукариотским ћелијама, пружају структурну подршку, сегрегацију хромозома и интрацелуларни промет. Неуронски МТ су неопходни за аксонски транспорт и синаптички пренос. 16, 17 МТ + крајњи протеин (+ ТИПс), укључујући крајње везујуће протеине (ЕБ), имају улогу у аксоналном расту и у интеракцији су са протеинима повезаним са МТ. 18

Од три члана сисавца породице ЕБ (ЕБ1, ЕБ2 и ЕБ3), 19 ЕБ3 се преферирано изражава у мозгу и користи се за праћење МТ динамике. 20, 21 Иако је присутан у конусима раста и конусима раста, ЕБ3 је претежно локализован унутар дендритичног одељка и окарактерисан је као главни регулатор дендритичке пластичности кичме утицајем на динамику актина у кичми. 22, 23, 24 ЕБ1, који дели 54% идентитета са ЕБ3, умешан је у аксонски транспорт. 23 ЕБ1 / ЕБ3, али не и ЕБ2 промовишу трајни раст МТ-а сузбијањем катастрофа, 25 повећавају број неурита у ћелијама феокромоцитома (ПЦ12), док ЕБ2 блокира неуритно издужење, 26 смањујући активност ЕБ1. 27 ЕБ2 не формира димере ни са ЕБ1 ни са ЕБ3, док је димеризација ЕБ1 / 3 (али не нужно и хетеродимеризација) предуслов за везивање + ТИП партнера. 28, 29

Кратки мотив пептида, Сер-к-Иле-Про (СкИП) користе бројни + ТИП-ови за локализацију МТ савета на ЕБ1 зависан начин, за 30 и ЕБ3 се такође предлаже да комуницирају са овим мотивом, на пример у плексину . 31 ЕБ3 директно се веже на п140Цап (инхибитор сигнализације Срц киназе1, СРЦН1, који садржи СИП мотив). Локализиран на постинаптичкој густини, 24 п140Цап у интеракцији је са синаптосомално повезаним протеином од 25 кДа (СНАП-25) да регулише стварање кичме. 32

Мапирање структурне активности АДНП фрагмената идентификовано је НАП (НАПВСИПК), који садржи СИП мотив, као неуропротективни пептид. 1 У моделима АД, НАП је заштићен од тау патологије и когнитивног пада. 33, 34, 35 НАП третман регулисао је ћелијски базен МТ, утицао на динамику / стабилност МТ у неуронским и глијалним ћелијама, што је било повезано са динамичком инвазијом МТ у конус раста и укључивањем тау у осовину МТ под стресним условима 36, као и штитећи од прекривања МТ-а услед трошења тау-а. 37 Слично томе, НАП је опоравио аксонски транспорт ин виво , након распада МТ-а колхицином, заштићен од поремећаја аксонског транспорта у амиотрофичном моделу бочне склерозе са испољеном тау патологијом 38 и у моделу Дросопхила који изражава ненормалну људску тау. 39 Код пацијената са благим когнитивним оштећењем (пре АД и који имају тау патологију), НАП (давунетиде) значајно је заштитио вербално опозив и визуелно радно памћење. 40 Поред тога, НАП третман побољшао је активности свакодневног живота 41 и пружио префронталну заштиту кортекса (мерено магнетном резонанцом спектроскопијом која процењује ниво Н- ацетиласпартата и холина) 42 у клиничким испитивањима схизофреније.

Овде смо издвојили да идентификујемо да ли СИП мотив управља НАП-овим неуротрофичким / неуропротективним активностима кроз интеракцију са ЕБ3 и ЕБ1, са циљем бољег разумевања његових молекуларних и ћелијских активности, као активног мотива и прототипа кандидата за лекове који је изведен из есенцијалне протеин.

Резултати

АДНП / НАП веже ЕБ3

Упоредна анализа секвенци показала је да су главни (СкИП) остаци који делују на мотивима изузетно сачувани међу ЕБ, док су остали остаци који су укључени у шупљину (вероватно да имају интеракције са осталим остацима везивног пептида) мање сачувани, посебно у ЕБ2 (допунски Слика С1). Као што се очекивало, ЕБ3 је био изразито изражен у неуронским ћелијским културама (допунска слика С2).

Да би се проценило да ли је матични протеин НАП (НАПВ СИП К), АДНП, у интеракцији са ЕБс, коришћено је имунопреципитација (ИП) са екстрактима протеина из оригиналног извора АДНП, П19 ћелија. П19 ћелије такође изражавају ЕБ (допунска слика С2). 27 АДНП ИП идентификовао је имунореактивни опсег сличан ЕБ1 на западном блоту (слика 1а), али не и ЕБ2 или ЕБ3 (слике 1б и ц). Међутим, када су за ИП коришћена антитела ЕБ2 или ЕБ3, примећена је и интеракција са ИБН сличним ИБН (слика 1д). Снажни распон од 50 кДа ИБ, виђен у АДНП-ЕБ ИП (слике 1а и ц), сумњало се да је МТ подјединица, тубулин и специфични ИП тубулина, резултирао је АДНП-ИБ (слика 1е). Ово је верификовано ИП-ом помоћу АДНП антитела (слика 1ф). Када је АДНП ИП извршен у присуству НАП, појавио се додатни тубулин-ИБ са молекулском масом идентичном ЕБ3 (слика 1ф). Слични резултати су добијени са п140Цап ИБ, молекулом који утиче ЕБ3. 24 Даље ИБ је показало да су тубулин (ТУБ2.1) и п140Цап антитела такође идентификовали рекомбинантну ЕБ3 (слика 1х). Како НАП није део епитопа препознатог по АДНП антителу коришћеном за ИП (слика 1ф), закључујемо да је НАП побољшао интеракцију АДНП-ЕБ3-п140Цап.

Image

Неуропротективни протеин зависан од активности (АДНП) делује у интеракцији са ЕБ1-3 и тубулином. ( а ) ; ( б ) ЕБ2; ( ц ) ЕБ3 антитела; ( д ) антитела ЕБ2 или ЕБ3 су коњугована са афинитетним зрнцима и елуирани антиген је идентификован на 8% ПАГЕ и ИБ са антителом АДНП. ( е, ф ) недиференцирани екстракти П19 ћелија су исталожени са ( е ) антитијела тубулина [ТУБ 2.1 1 ] и елуирани антиген је идентификован са 8% ПАГЕ и ИБ са зечјим АДНП антителом. ( ф ) Ћелијски екстракти (500 µг) су исталожени са 10 µг АДНП антитела или ( г ) у одсуству или у присуству 3 мг НАП. Тубулин је откривен помоћу ТУБ2.1 и п140Цап, антителом п140Цап. Ц = контролни екстракт, Е = елуција. ( х ) Рекомбинантни ЕБ3 подвргнут је колони афинитета НАП-а и мрље (слика 2) су подвргнуте ТУБ2.1 ИБ или п140Цап антителу (разблажење 1: 500). ЕБ, крајњи везујући протеин.

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Директна интеракција НАП-а са ЕБ3 тестирана је применом афинитетне хроматографије. Рекомбинантни хумани ЕБ3 је инкубиран са продуженим НАП (ЦКККГГНАПВСИПК) ковалентно повезаним са агарозним зрнцима. Фракције пуњења, протока, испирања и елуције су раздвојене са ПАГЕ, а затим ИБ са антителима ЕБ3. Резултати су идентификовали везивање НАП-ЕБ3 (слика 2а). Специфичност колоне је приказана конкуренцијом са НАПВСИПК / ЕБ3-миметичким пептидима (који нису садржавали ЦКККГГ размак који се користи да би се избегла стерицка препрека; види додатну слику С3). Дакле, зрнца повезана са НАП-ом инкубирана су са рекомбинантним ЕБ3 и било: (1) растворљивим НАП-ом (позитивна контрола, која би требало да избрише све везивање); (2) НАПВСКИПК (представља потенцијално везивање ЕБ3, НАП миметик); (3) НАПВСАИПК, потенцијално уско повезана негативна контрола; и (4) НАПВААААК, негативна контрола која не садржи потпис који обавезује ЕБ3. Конкуренција са НАП или НАПВСКИПК инхибира везивање ЕБ3 за колону афинитета НАП. Супротно томе, није било очигледне конкуренције са НАПВСАИПК или НАПВААААК; ЕБ3 је био везан за НАП и посебно је елуиран у киселој концентрацији (Слика 2б). Да би се потврдило да је ЕБ3 заиста специфично везан и елуиран из НАП колоне у присуству НАПВААААК, зрнца су узета из смоле колоне, помешана са пуфером за узорке и урађена је Вестерн блот анализа која показује да се ЕБ3 не везује за саму смолу (слика 2б, 'АААА'-перла трака). Стога је ЕБ3 директан везни циљ за НАП и његова интеракција је посредована мотивом везивања СкИП, СИП или СКИП.

Image

ЕБ3 се везује за НАП (НАПВСИПК) и СКИП (НАПВСКИПК). НАП се веже на смолу за спајање сулфолинк и рекомбинантни ЕБ3 се набаци на резултирајући афинитетни ступ. Протеини су одвојени натријум-додецил-сулфатом (СДС) –10% полиакриламид гел електрофорезом (ПАГЕ), а затим имуноблотом (ИБ). Молекуларна тежина је одређена маркерима. На слици су приказани ИБ резултати за ЕБ3 антитела (32 кДа; а и б ). Експерименталне тачке су поновљене ≥2. ( а ) Везање на НАП: Материјал за пуњење колоне - рекомбинантни ЕБ3 (оптерећење), проток кроз (ФТ1 и ФТ2), испирање (В1 и В2) и елуирани материјал (Е1–4). Свака трака била је напуњена са 40 μл узорка: Оптерећење = ~ 11, 5 μг ФТ1 = ~ 3, 1 μг ФТ2 = ~ 1 μг В1 = ~ 0 μг В2 = ~ 0 μг Е1 = ~ 0 μг Е2 = ~ 9 μг. ( б ) ЕБ3 веже секвенце које садрже СИП и СКИП: Ознаке трака су као у ( а ). Везање ЕБ3 за НАП колону померило је НАП = НАПВСИПК и СКИП = НАПВСКИПК, али не САИП = НАПВСАИПК и АААА = НАПВААААК. Допунска табела С2 наводи волумен узорка и процењену количину протеина напуњену на свакој траци гела за раздвајање протеина. ( ц ) НАП се везује за ЕБ1 / ЕБ3, али не и за ЕБ2: Хроматографија на колони је изведена као горе, међутим, 3 мг смоле је прво инкубирана са говеђим серумским албумином од 3 мг (БСА). После 20 х инкубације на 4 ° Ц, 1 сат инкубације на собној температури и испирања са 3 колоне физиолошком отопином пуферираном фосфатом (ПБС), 3 мг рекомбинантног протеина (ЕБ1, горња плоча; ЕБ2, средња плоча; ЕБ3, доња плоча) се напуни и колона је обрађена као горе. Све у свему, приказано је 12% СТРАНИЦЕ и бојења ЦББ-ом. Оптерећење по траци било је 20 μл од ФТ (4 мл), В (2 мл) или Е (2 мл). Траке: 1-лоад, ФТ, В1, В2, В3, В6, В9, В10, Е1, Е2, Е3, Е5 и Е10). ( д ) СКИП (НАПВСКИП) се везује за ЕБ1 и ЕБ3. Експерименти су изведени као у ( ц ), само уместо НАП, модификовани СКИП (НАПВСКИП) је био везан за смолу и изложен ЕБ1 (горњи панел) или ЕБ3 (доњи панел). ЕБ, крајњи везујући протеин.

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Да бисмо верификовали ове резултате и процијенили могуће везивање за све ЕБ, инкубирали смо сваки од три рекомбинантна ЕБ (ЕБ1-3) са НАП перлама. Такође смо додали још једну меру специфичности, а то је пре-инкубација колона са БСА. Док су ЕБ1 и ЕБ3 у интеракцији са имобилизованим НАП-ом, у основи, није примећено НАП-ЕБ2 везивање (Слика 2ц). Да бисмо додатно утврдили специфичности, додали смо још један ступац афинитета са ЦКККГГНАПВС К ИП и наши резултати показали су специфично везивање НАПВС К ИП за ЕБ1 и ЕБ3 (слика 2д).

Да бисмо проценили интеракцију на ћелијском нивоу, ектопички смо експримирали протеин ЕБ3 који је означен РФП-ЕБ3 у ћелијама ЦОС-7 (Слика 3, процењено је ~ 1000 ћелија, што показује ~ 2% ефикасности трансфекције). Имунофлуоресценција са далеко црвено обележеним антителима тубулина проценила је локализацију МТ. Означен ЕБ3 коканизиран са тубулином / МТ-има (слика 3а). Даље, виђен је 6-фам-НАП унутар непреносиве ћелије, као и пре 43 (слика 3а). Даље, 6-фам-НАП је додат у ћелије које су инфициране ЕБ3. Као што се види на слици 3б, тубулин, ЕБ3 и НАП су локализовани и показали су класичну влакнасту станичну организацију. Анализа само две појединачне ознаке одједном (у присуству 10-12 М НАП) указала је на кокалокацију тубулина са ЕБ3, НАП са тубулином и НАП са ЕБ3 (слика 3ц). Нуклеарна ознака НАП и ЕБ3 утврђена је нуклеарним обележавањем (слика 3д, плава), специфичност ЕБ3 привидне реорганизације у присуству НАП утврђена је у недостатку нуклеарног означавања (слика 3д, ЕБ3 + НАП у поређењу са сликом 3а, само ЕБ3) .

Image

НАП колокализује са ЕБ3 и повећава интеракцију ЕБ3-тубулина (микротубула, МТ). Коришћене су ЦОС ћелије. ( а ) Локализација α тубулина (далеко црвено-плава мрља), трансфекција с ЕБ3 цДНА коњугираном на црвени флуоресцентни протеин (црвена) и колокализација - два су панела приказана за сваку експерименталну тачку, укључујући квантитативну анализу колокализације тубулина-ЕБ3. Фам-НАП (10 −12 М) је виђен унутар непресађене ћелије, која је изложена фазној контрастној слици исте ћелије (бар 50 µм). Приказана је контрола без тубулинске етикете (само ЕБ3) да би се утврдила специфичност етикете. ( б ) Све у свему, 10-12 М фам-НАП је инкубирано са ћелијама, а три појединачне ознаке (тубулин, ЕБ3 и НАП) су приказане независно и спојене (бар 25 µм). ( ц ) Анализа две појединачне етикете одједном (у присуству 10-12 М фам-НАП). ( д ) Анализа означеног НАП-а (10-12 М, ЕБ3 и обележених језгара (ДРАК5). Контрола без нуклеарне етикете је приказана да би се утврдила специфичност етикете (ЕБ3 + НАП). Експерименти су поновљени> 3. ЕБ, крај- везујући протеин.

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

НАП ефекти на ПСД-95 кластере у примарним културама неурона посредују од ЕБ3

Експресија ЕБ3 је маркер за зреле неуроне сисара (који показују бодље са главом гљиве, позитивне на постсинаптички маркер ПСД-95), док је ЕБ1 изразито изражен у раним фазама развоја, смањујући након тога 24 (додатна слика С2). Раније је обарање ЕБ3 значајно смањило број бодљи (∼ 60% контроле) без промене морфологије кичме када се инкубира током 1 недеље. 46 Краћа времена излагања (4 дана) показала су морфолошке промене, али нису утицала на број избочења после пригушивања ЕБ3. 24

С обзиром на запажену интеракцију НАП-ЕБ3 и НАП ефекте на МТ организацију у примарним кортикалним неуронима, 36 упитали смо да ли НАП утиче на дендритичке бодље у тим неуронима и да ли овај ефекат захтева ЕБ3. Користили смо имунореактивност ПСД-95, као меру кичме. 47

Инкубација примарних кортикалних неурона са НАП (2 х) повећала је број ПСД-95 пункта по дужини дендритичке осовине (слике 4а и б, зелене тачке). Запажена је кривуља дозирања у облику звона са врло значајним врхом од 10 до 12 М НАП (слика 4ц). ЕБ1 / ЕБ3 везујући НАПВСКИПК опонашао је НАП активност. НАПВСАИПК и НАПВААААК (који се не такмиче за везивање за ЕБ3-НАП) нису побољшали густоћу пункта ПСД-95 (слика 4д). Утишавање ЕБ3 мРНА (48 х, допунска слика С2), без смањења густоће пункта ПСД-95 (слика 4е), значајно је смањило појединачно обојено подручје пункта (слика 4ф) и инхибирало НАП активност, како на густини пункта, тако и на појединачној пункти обојена површина која је значајно повећана за 25% у присуству НАП-а (слика 4ф). За разлику од НАП-а, који је повећао појединачно обојено подручје пунктама, НАП-миметик који не веже ЕБ3, НАПВААААК, није повећао појединачно обојено подручје пунктом (допунска слика С4), што указује на специфичност.

Image

Лечење НАП-ом повећава накупљање ПСД-95 у дендритичким бодљима. Кортикални неурони су третирани носачем или НАП ( 10-18 -10 -6 М) током 13 дана ин витро (ДИВ) током 2 сата, а затим су фиксирани и обојени за Тир-тубулин, Глу-тубулин и ПСД-95. ( а ) Репрезентативне слике кортикалних неурона обојених за Тир-тубулин (црвена), ПСД-95 (зелена) и Глу-тубулин (плава). Траке: 10 µм. ( б ) Повећани одсеци слике од 10-12 М НАП и неурони третирани носачем. Тир-тубулин (црвена), ПСД-95 (зелена) и Глу-тубулин (плава). Траке: 1 µм. ( ц ) Упоређивање ефекта на ПСД-95 густине: Резултати показују да је густина ПСД-95 пункта значајно порасла код неурона који су лечени НАП током 2 сата у поређењу са контролама носача (анализа варијансе, АНОВА, П <0, 0001, н = 25 дендрита по лечењу). ( д ) Упоређивање ефеката пептидних деривата на густину ПСД-95: Резултати показују да је густина ПСД-95 пункта значајно повећана код неурона који су лечени НАПВСИПК или НАПВСКИПК током 2 х у поређењу са контролама везива, и на њих није утицао НАПВСАИПК или НАПВААААК (АНОВА, П <0, 0001, н = 14–48 дендрита по третману). ( е ) кортикални неурони 13ДИВ су или третирани носачем, третирани трансфекцијским реагенсом (липофектамин РНАиМАКС), третирани сиРНА против ЕБ3, третирани само са 10-12 М М НАП, или са не-циљаном сиРНА (не) и НАП, или третирани сиРНА против ЕБ3 и НАП. 2 х третманом 10-12 М НАП значајно је повећао експресију ПСД-95 и то је потпуно инхибирано ушуткивањем ЕБ3 током 48х. (АНОВА, П <0, 0001, н = 18 дендрита по лечењу). ( ф ) 2-сатна обрада са 10 −12 М НАП значајно је повећала просечну површину ПСД-95 пункта и то је потпуно инхибирано ушуткивањем ЕБ3 током 48 сати. Пригушење ЕБ3 значајно је смањило просечну површину ПСД-95 пунцта (АНОВА, П <0, 0001, н = 12 дендрита по третману). ЕБ, крајњи везујући протеин; ПСД, протеин постинаптичке густине.

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

НАП ћелијска заштита захтева ЕБ1 или ЕБ3, али не захтева ЕБ2

Да би се повећала зависност од НАП од ЕБ, сваки од ПЦ12 ћелија подвргнут је пригушивању РНА, а НАП активност је процењена од стране МТС. Да би се утврдило пропадање, ћелијски екстракти су подвргнути РНА или западној анализи (допунске слике С2 и С5). Нечујно ЕБ резултирало је најмање 50% смањењем експресије одговарајућег транскрипта / протеина. Да бисмо даље проценили НАП заштиту, користили смо токсичност Зн из следећих разлога. (1) Висока концентрација Зн уништава МТ, што НАП преокреће у неуронима, 44 глиа 43 и ПЦ12 ћелијама. 36 (2) Токсични Зн индукује урегулацију породице Срц киназа-урегулацију Н- метил-Д-аспартата (НМДА) рецептора, ексцитотоксичност 48 и неуродегенерацију (ЕЦ50 за убијање Зн ћелија је на 308 + 38 µ М 36 ) .

Сходно томе, додали смо Зн (400 µМ) у ћелије ПЦ12 што је резултирало смрћу 30–50% (слика 5а). Све у свему, делимична, али значајна заштита од опијања Зн 10–12 М НАП у потпуности је укинута са ЕБ1 или ЕБ3, али не и са утишавањем ЕБ2. Према томе, НАП захтева нетакнут израз ЕБ1 / ЕБ3 за ћелијску заштиту.

Image

НАП заштита ћелија ПЦ12 од интоксикације Зн захтева ЕБ1 и ЕБ3, предложени механизам деловања. ( а ) Третман Зн (400 µМ) резултирао је ПЦ12 ћелијском смрћу, која је заштићена од НАП третмана ( 10-12 М) у контролној групи (непреносива). Угађањем ЕБ1 и ЕБ3 (али не и ЕБ2) укинута је НАП заштита од опијања Зн. Коришћено је пет услова: контрола, не-третиране ПЦ12 ћелије (непреносиве), само трансфекцијски реагенс (само транс-реагенс), пригушивање РНК ЕБ1 (сиРНА-ЕБ1), ЕБ2 (сиРНАЕБ2) и ЕБ3 (сиРНА-ЕБ3). Резултати митохондријалне активности (МТС ћелијске виталности) су приказани 100 (је 100% преживљавање) - контрола без трансфекције, Зн или НАП третмана. Подаци су анализирани једносмерном анализом варијанције (АНОВА) ( н = 5 / експериментална група). Пост хоц поређење је направљено у односу на групу за лечење Зн за сваку од променљивих. ( б ) НАП, СКИП и Ац-СКИП ( 10–9 М) сваки засебно значајно повећава преживљавање. Заштита од три пептида је била слична (АНОВА, П <0, 0001, н = 12–30, пост хоц поређење је направљено с обзиром на вехикулитет + Зн третман). ( ц ) Остали тестирани пептиди, СРИП и ТРИП (слика 2), нису били неактивни. Резултати су били слични резултатима контроле. Ац-СКИП је коришћен као активна контрола. (АНОВА, П <0, 0001, н = 12, пост-хок поређење је направљено у односу на носач + третман Зн). ( д ) Давање ефекта Фин-МТ интеракције коришћено је пригушивање ЕБ РНА. Доследне разлике примећене су при утишавању ЕБ1 значајно смањујући Фин-МТ интеракцију. Горњи панели показују ИБ резултате (П-МТ пелете и С-растворљиви тубулин). Доњи панел приказује однос Фин / Тубулин у МТ пелетима, што указује на> двоструко смањење након утишања ЕБ1 ( н = 3, П <0, 01). ( е ) НАП ступа у интеракцију са ЕБ1, ЕБ3 или ЕБ3 / ЕБ1 димером. Ова интеракција промовише и повећава остале СкИП протеине попут п140Цап и АДНП везивања за ЕБ. Остали примери протеина који вежу ЕБ (садрже мотив СкИП) су АПЦ, МЦФ, МЦАК и ЦЛАСП. Тада комплекс делује кооперативно. Ови СкИП протеини регулишу, на пример, Срц / Фин који заузврат регулишу фосфорилацију тау-а и НМДАР. ПСД-95 и дребрин такође везују ЕБ3, учествујући у сложеној регулацији и даљим интеракцијама протеина протеина. ЕБ, крајњи везујући протеин; ПСД, протеин постинаптичке густине.

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Даљња процена 10 -9 М НАП и пептидних деривата заједно са 400 µМ Зн показала је да НАПВСКИПК и ацетил-НАПВСКИПК-НХ2 пружају заштиту од токсичности Зн, опонашајући активност НАП-а (Слика 5б). Супротно томе, НАПВСРИПК и НАПВТРИПК нису били активни (слика 5ц).

Као што је за Фин раније показано да је неопходно за НАП активност на растом аксона, 49 такође смо тестирали да ли је Фин-МТ интеракција измењена након ЕБ утишања. Резултати су показали ~ двоструко смањену интеракцију Фин-МТ након пригушивања ЕБ1, што сугерише укључивање Фина у каскаду сигнализације НАП, низводно од ЕБ1 (слика 5д).

Дискусија

Наше оригиналне афинитетне хроматографије са укупним екстрактима мозга сугерисале су тубулин као партнера који повезује НАП. 43 Сада предлажемо да ова интеракција у великој мери буде директним везивањем НАП-ЕБ1 / ЕБ3. Постављамо механизам деловања за НАП који позива на протеинску сарадњу, укључујући АДНП, на растућем врху МТ-а, што у коначници доводи до неуротрофизма (слика 5е) и заштите од дисфункције / когнитивних недостатака (на пример, у мишевима АДНП +/−, поштеђених НАП-а замена 35 ).

АДНП такође може да везује ЕБ2, који може бити повезан са другим епитопима великог молекула. АДНП, 1 неопходан за формирање мозга, 10 који утичу на развој мозга, 8, 11, 14 заштите од повреда мозга 50 и старење, 35, сада је повезан са ЕБ1 / ЕБ3 путем НАП активног места посредованог МТ неуропластичности, укључујући пут аутофагије. 5, 51

Димеризација ЕБ је предуслов за увезивање + ТИП партнера. 28 Афинитет појединачних + ТИП-ЕБ1 интеракција је слаб (низак µМ) и више СкИП мотива сарађује у циљу повећања ефикасности циљања 30 зависних од ЕБ (на пример, ЕБ1 и ЦЛИП-170 синергистички регулишу МТ динамику 52 ). Предлажемо да потенција НАП буде повезана са овим кооперативним ефектом (Слика 5е).

Почетна запажања су такође укључивала НАЦ-интерактивни протеин од 100 кДа, 43 који је када је подвргнут масеној спектрометрији идентификован као дребрин, протеин везан за ЕБ3, неопходан за неуритогенезу 22, а наши тренутни резултати открили су интеракцију п140Цап-АДНП, вероватно индикатив за кооперативност повезаност с ЕБ-има (слика 4е).

Неуронал / астроцит обогаћен п140Цап (који садржи НАП сличан СИП мотив) веже (1) ЕБ3, (2) СНАП-25 и (3) скелетни протеин п130Цас, негативно регулирајући Срц киназу активирањем Цск киназе. 53 Повећање СНАП-25 и синаптофизина током НАП-а током развоја и заштите од исцрпљивања синаптофизина под стресом 54, 55 сада је везано за све већи раст неурита и ЕБ3-сродну пластичност кичме кичме.

Откривање НАП-а укључивало је скрининг за неуропротекцију против електричне блокаде тетродотксином (ТТКС). 1 Ала скенирање супституције НАП-а показало је да је његов СИП мотив кључан за заштиту кортикалних неурона против ТТКС-а. 56 Када су хронично изложени ТТКС-у, кортикални неурони губе дендритичне бодље и дегенерирају. 57 Дакле, НАП може заштитити од губитка дендритичне кичме повезане са ТТКС. Заиста, у кортикалним неуронима ко-култивираним астронама изложеним пренаталном етанолу, показујући смањење броја дендрита него неурони посејани на контролном глију (који изражава већи ниво АДНП), НАП је значајно повећао раст дендрити. Слични ефекти примећени су на раст / разгранање аксона. 54

СХ3 домен ПСД-95 директно се везује за подручје богате полипролином ЕБ3 да би изменио динамику МТ-а, на нивоу дендритичке пластичности. 58 ЕБ3 контролише динамику актина и регулише морфологију / синаптичку пластичност краљежнице, интеракцијом са ПСД-95 и активацијом НМДАР. 59 У том погледу, НАП (такође у интеракцији са актином, 43 вероватно путем ЕБ3) заштићен је од ексцитотоксичности НМДА и убрзаног израслина неурита 60 / неуроразвоја. 1

Раст аксона изазваних НАП-ом захтева од Фин киназе. 49 Фин, члан СФК (Срц не-рецепторских породица тирозинских киназа), 61 организује постсинаптичку машинерију НМДАР фосфорилацијом, 62 чиме се повећава њен афинитет према ПСД-95. 63, 64 Изложеност неурона Зн повећава НМДАР цитотоксичност активирањем СФК. Фин веже тау 65, а тау фосфорилира СФК. 61 Када се тау одвоји од МТ-а након фосфорилације, може приступити дендритичком одељку, повећавајући на тај начин Фин концентрацију и последично НМДАР фосфорилацију. У Тау - / - ћелијама, Фин је искључен из дендрита, а експресија скраћеног тау мутанта која је искључена из дендрита доводи до секвестрације Фина у сома. 66 Фин - / - мишеви су показали смањену густину кичме и абнормалну морфологију кичме на начин који зависи од старости. 67 Интегрисање хемијских и електричних информација које укључују НМДАР је пресудно за синаптичку пластичност зависну од активности, на којој се заснивају развој неурона и формирање меморије. 68 Супротно томе, дисфункција НМДАРс је умешана у бројне болести мозга, укључујући АД и шизофренију. 69 У хипокампусу и префронталном кортексу, физиолошка регулација НМДАР-а помоћу Срц је блокирана сигнализацијом неурегулин1-ЕрбБ4, пут који је генетски уплетен у шизофренију. 70 НМДАР активација индукује трајне измене у МТ мрежи и ЕБ3 локализацију у дендритима и додатно сузбија улазак МТ у дендритичке бодље.

Предлажемо да се НАП веже за ЕБ3 / ЕБ1 и промовише друге протеине који садрже СкИП попут АДНП (слика 1), да ступе у интеракцију са ЕБ (слика 5е), повећавајући на тај начин утицај МТ на неуропластичност и неуропротекцију. Заједно, овај механизам може објаснити високу снагу НАП-а, појачавајући МТ + ТИПС, као и звонасту криву дозе (на пример, слика 4ц), повезану са гомилањем на растућем крају МТ-а. Интеракција са ЕБ могла би такође да објасни претходно описану НАП повезаност с тубулином / МТ, 43, 44 укључивањем тау-МТ-а, 36 заштитом од таупатије 39 и испадањем тау-а, 37 као и ћелијском специфичношћу без утицаја на ћелије рака, које можда изражава ЕБ2. 71 Поред тога, спектралплакини промовишу раст аксона посредованог МТ-ом функционишући као структурални протеини повезани са МТ и ЕБ1-зависни + ТИП-ови преко СкИП мотива, што сугерише да НАП ефекат на раст неурита, конус раста и транспорт на аксонама може да се објасни интеракцијом са ЕБ1 / ЕБ3. 72 Асоцијација са дребрин-интеракцијом који третира ЕБ3 од значаја је за одржавање правилног развоја и синаптичке пластичности 22 и може представљати још један клинички циљ с обзиром на то да дребрин смањује кортекс Довновог синдрома и код АД пацијената. 73 У том погледу, лечење НАП-ом штити неуроне Довновог синдрома 74 и благо оштећење когнитивних функција. 40 Занимљиво је да се ПСД-95 значајно смањио у префронталном кортексу пацијената са схизофренијом 75 и НАП (давунетид) заштићеним активностима свакодневног живота 41 и пружио префронталну заштиту кортекса 42 у клиничким испитивањима схизофреније.

Суштинска улога АДНП-а у формирању и функцији мозга и ефикасност НАП-а у клиничким испитивањима на људима сада су повезани са разумевањем ћелијског механизма деловања. НАП, мотив АДНП-а који је интерактиван са ЕБ-ом, предложен је као првокласни кандидат за лекове, трасирајући пут ка откривању нових начина (укључујући новооткривени НАПВСКИПК) у борби против разорних поремећаја мозга повезаних са губитком виталних ћелијских функција који кулминирају. у губитку кључних свакодневних активности.

Додатне информације

Ворд документи

  1. 1.

    Додатни материјал

    Додатни материјал прати рад на веб локацији Молекуларна психијатрија (//ввв.натуре.цом/мп)