Неуритин може нормализовати неуронски дефицит алзхеимерове болести | ћелијска смрт и болест

Неуритин може нормализовати неуронски дефицит алзхеимерове болести | ћелијска смрт и болест

Anonim

Субјекти

  • Алцхајмерова болест
  • Ћелијска сигнализација

Апстрактан

Сматра се да смањена сложеност неурита хипокампала и синаптичка пластичност доприносе прогресивном слабљењу епизодне меморије и благом когнитивном опадању који се јављају нарочито у раним фазама Алзхеимерове болести (АД). Упркос функционалном и терапијском значају за пацијенте са АД, интервенција за спасавање или нормализацију дендритичке елаборације и синаптичке пластичности једва је обезбеђена. Овде показујемо да је прекомерна експресија неуритина , протеина зависног од активности, подстакла раст неурита и сазревање синапсе паралелно са појачаним базалним синаптичким преносом у култивисаним неуронима хипокампа. Важно је да је егзогена примена рекомбинантног неуритина у потпуности повратила дендритичку сложеност, као и густину кичме у хипокампалним неуронима припремљеним од Тг2576 мишева, док није утицала на неуритно гранање неурона од њихових дивљих врста легла. Такође смо показали да је растворљиви рекомбинантни неуритин, када је хронично унет у мозак мишева Тг2576, нормализовао синаптичку пластичност у акутним крижцима хипокампа, што доводи до нетакнуте дугорочне потенцијале. Откривањем заштитних акција растворљивог неуритина против неуролошких оштећења повезаних са АД, пружамо потенцијални терапијски приступ пацијентима са АД.

Главни

Ефикасна неуронска комуникација кроз синапсе је пресудна за нормалне мождане функције, док се измене у броју синапси, морфологија дендритичке кичме и дендритичка сложеност одражавају различитим облицима синаптичке пластичности и узрочно су повезане са различитим неуролошким поремећајима. 1, 2, 3, 4, 5 На пример, губитак синапсије и атрофија неурита главни су неуробиолошки супстрати у основи оштећења памћења код неуродегенеративних болести попут Алзхеимерове болести (АД). 6, 7 Појачана дендритичка мислокализација хиперфосфорилираног протеина тау, протеина повезаног микротубулом обогаћеног аксонама зрелих неурона, 8 и обиље растворљивих олигомерних облика β- амилоида (А β ) узрокују синаптичке недостатке и поремећај синаптичке пластичности који укључују прогресију АД патологије. 6, 9, 10 Очигледно смањење неуротрофичних фактора примећених у мозгу пацијената са АД 11 довело је до неколико испитивања за примену неуротрофичних фактора, као што је неуротрофни фактор који потиче из мозга (БДНФ), да би ублажили и евентуално преокренули синаптичке недостатке. 11, 12, 13 Међутим, скраћивање или смањена експресија његових когнитивних рецептора у мозгу АД ограничила је њихову потенцијалну употребу као АД терапеут. 12, 14, 15

Неуритин, такође познат као кандидатни пластични ген 15, првобитно је идентификован у скрининг студији за гене који су регулисани активностима, а потом је откривено да је један од сигналних молекула низводно до БДНФ и његовог рецептора за киназу сродну рецепторима тропомиозином типа Б. 16, 17 Испитивања су показала да би неуритин могао бити индукован експерименталним нападима или нормалним животним искуствима, попут сензорне стимулације и вежбања. 17, 18, 19, 20, 21, 22 Смештен у интервалу 6п24-п25 на хромозому 6, 23, неуритински ген кодира мали, високо очуван протеин који садржи секреторну сигналну секвенцу на Н-терминусу и консензусну секвенцу за гликозилфосфатидилинозитол ( ГПИ) на Ц-терминусу. 16 Ова ГПИ веза омогућава да се неуритин усидри на ћелијским површинама, а након цепања ГПИ фосфолипазом резултирајући растворљиви неуритин се ослобађа у ванћелијски простор. 16, 20, 24, 25, 26

За време ембрионалног неуронског развоја, неуритин се углавном експримира у регионима мозга који пролазе брзо пролиферацију неуронских базена, што сугерише заштитну улогу неуритина за диференциране неуроне. 26, 27 Занимљиво је да ниво експресије неуритина остаје повишен после рођења или се чак повећава, нарочито у пределима мозга који вероватно показују високу неуралну активност и синаптичку пластичност, као што су хипокампус, видни кортекс и спољни гранулирани слој можданог црева. 16, 19, 20, 26 Поред тога, неуритин поспешује раст неуритских лукова и формирање синаптика. 16, 20, 24, 25, 28, 29, 30, 31 Иако су разне студије сугерисале ове моћне неуритогенетске активности неуритина, допринос експресије неуритина или његове ефикасности против неуродегенеративних болести које показују атрофију неурита и губитак синапсе у великој мери је неистражен .

Овде смо утврдили да експресија неуритина повећава сложеност неурита и подстиче сазревање појединих бодљи у култивисаним неуронима хипокампа. У складу са овим налазима, базални синаптички пренос је појачан пролазном експресијом неуритина. Важно је да је, када се егзогено примењује, растворљиви неуритин пептид спасио дендриту сложеност неурона припремљених од Тг2576 мишева, трансгеничног мишјег модела АД, тако да је сложеност била упоредива са оном код дивљих (ВТ) мишева и такође нормализовала синаптичку пластичност у хипокампус Тг2576 мишева. Узети заједно, ови резултати сугерирају да неуритин, нарочито растворљив облик неуритина, преокреће синаптичке дефекте који се манифестују код Тг2576 мишева и да манипулације за повећање нивоа неуритина могу бити корисни терапијски приступи у АД.

Резултати

Неуритин повећава раст неурита

Неуритогенеза је кључни ћелијски процес којим се скидају неуронски кругови контролом аксонских лукова и дендритичких гранања током неуралног развоја, а такође доприноси преправљању неуронске повезаности која је основа синаптичке пластичности у одраслој доби. 32 Овај процес контролишу не само ћелијски својствени фактори, већ и вањски фактори који су укључени у синаптичку активност. Показало се да је неуритин моћан регулатор за неуритогенезу ин витро и ин виво . 16, 24, 26 Да бисмо потврдили неуритогенетски ефекат неуритина на култивиране неуроне, трансфицирали смо неуроне са неуритином пуне дужине (пИРЕС-еГФП-неуритин-Флаг) 26 или његовим контролним вектором. Како раст неурита почиње рано у постнаталном развоју, 29, 33 хипокампална неурона у култури су трансфицирана током 3 дана ин витро (ДИВ) и анализирана 3 дана касније. Ти трансфицирани неурони су идентификовани с изразом еГФП или неуритин-Флаг-а који је обележен Алека Флуор 488, јер је интензитет самог еГФП сигнала из пИРЕС-еГФП-неуритин-Флаг обично био слаб. Аксонски и дендритични процеси су дискриминисани са Тау-1 и микротубулом повезаним протеином 2 (МАП2), респективно (слике 1а и б). 8 Прикупљен је и поново састављен низ конфокалних слика како би се расветлиле читаве неуронске структуре. У поређењу са неуронима који су заражени контролним вектором, експресија неуритина током 3 дана значајно је повећала и укупну аксоналну (*** П <0, 001, Манн-Вхитнеи У- тест; Слике 1а и ц) и укупну дужину дритрити (*** П = 0, 0005, Манн-Вхитнеи У- тест; Слике 1б и д).

Image

Експресија неуритина повећава раст неурита. ( а и б) Конфокалне слике било контролних вектора или неурона који експримирају неуритин који су били истовремено имунолошки обојени са еГФП или еГФП / заставом (зелена), Тау-1 ( а, црвена) или МАП2 ( б, црвена). Вага, 100 нм. Инсетови су × 6, 9 увећаних приказа одређених региона. Укупна аксонска дужина ( ц : контрола, 1017, 13 ± 112, 96 µм , н = 19 неурона насупрот Неуритину, 2555, 57 ± 341, 08 µм , н = 26 неурона) и дендритичка дужина ( д : контрола, 709, 35 ± 78, 79 µм , н = 23 неурона насупрот Неуритину, приказано је 1446, 69 ± 171, 17 μм , н = 30 неурона) контролних и неуритин експресионирајућих неурона. ( е ) Детаљне анализе неурита који се визуелно приказују бојењем заставом. Неуритин је успорио брзину смањења прелазних бројева (на 30 µм : контрола, 5, 64 ± 0, 76 насупрот Неуритину, 7, 88 ± 0, 71, * П = 0, 0402; на 40 µм : 4, 86 ​​± 0, 93 насупрот 7, 13 ± 0, 58, * П = 0, 0415; на 60 µм : 3, 57 ± 1, 06 у односу на 7, 19 ± 0, 77, ** П = 0, 0011; на 70 µм : 3, 57 ± 0, 97 према 6, 94 ± 0, 91, ** П = 0, 0053; на 80 µм : 2, 64 ± 0, 88 према 4, 25 ± 1, 06, *** П = 0, 0004; на 90 µм : 2, 64 ± 0, 82 наспрам 5, 94 ± 0, 62, ** П = 0, 0018; на 100 µм : 2, 27 ± 0, 63 насупрот 5, 71 ± 0, 68, ** П = 0, 0018; на 110 µм : 1, 79 ± 0, 55 насупрот 5, 44 ± 0, 61, *** П = 0, 0009; на 120 µм : 1, 91 ± 0, 51 у односу на 4, 69 ± 0, 58, ** П = 0, 0012). Статистички значај изражен је као * П <0, 05; ** П <0, 01; *** П <0, 001

Слика пуне величине

Сложеност неурита је такође важна за активност неурона кроз неуронске кругове, јер сложеност утиче на ширење акционог потенцијала као и на својствено паљење. 34, 35 Тако смо рачунали број неуритских пресека концентричних кругова радијуса који се повећавају за 10 μм (Схолл анализа) 36 да би квантитативно анализирали сложеност неуритичких стабала. У контролним векторима трансфектираним неуронима, бројеви пресека достигли су максимум на 30 µм од сома, а затим се континуирано смањивали (Слика 1е). Као што је примећено у оптичким текталним неуронима или моторним неуронима Ксенопус лаевис , 24, 25, 28, неуритин је повећао број пресека за ~ 40% на врхунцу, а затим је смањио брзину смањења (Слика 1е). Ови резултати јасно показују да пролазна експресија неуритина потиче раст аксонских и дендритичних процеса и драматично повећава сложеност неуритских стабала. Иако смо проценили неуритогенетску активност неуритина у раној фази развоја (6 ДИВ), регулисана експресија неуритина може модулисати неуритску разраду и, заузврат, може утицати на квалитет и количину синаптичке трансмисије чак и у каснијим фазама.

Неуритин поспешује синаптичко сазревање

Показало се да неуритин појачава дендритичку разраду и синаптогенезу, 27, 30, 31, али да ли експресија неуритина утиче на сазревање синапси сисара остаје непознато. Стога смо анализирали морфологију појединачних кичми као и густину кичме након трансфекције код 9 ДИВ и додатну инкубацију од 14 дана. Ко-трансфекција мономерног ДсРед-а омогућила нам је да визуелизујемо и квантитативно анализирамо дендритичке структуре кичме, независно од експресије неуритина. Неуритин-експресионирајући неурони су показали пораст густине кичме у поређењу с контролним неуронима (* П = 0, 0134, парни т- тест; Слике 2а и б-1).

Image

Експресија неуритина поспјешује сазревање бодљи. ( а ) Репрезентативне слике или контролног вектора (лево) - или неуритина (десно) - експримирајуће неуроне имуностаниране са еГФП / заставом и (зелени, горњи) и истовремено означени мономерним ДсРед (мДсРед, црвена, средња). Флуоресцентне слике су спојене (одоздо). Вага, 10 µм . ( б ) Мерјени су бројеви кичме на 10 µм ( б – 1 : контрола, 9, 73 ± 0, 83 насупрот Неуритину, 12, 86 ± 0, 90) и разврстани у њихове подтипове ( б – 2 : Класа И: Контрола, 1, 85 ± 0, 18 у односу на Неуритин, 2, 53 ± 0, 22; Класа ИИ: 3, 88 ± 0, 43 у односу на 6, 23 ± 0, 51; Класа ИИИ: 3, 20 ± 0, 36 према 3, 26 ± 0, 38; Класа ИВ: 0, 80 ± 0, 09 у односу на 0, 84 ± 0, 12) из ​​контролног вектора- ( н = 31) и неуритинског експресије ( н = 34) неурона. ( ц ) Питене карте које показују учесталост посматрања сваке врсте бодљи. ( д ) Кумулативни дијаграми вероватноће за пречнике главе кичме ( д – 1 ) и дужине кичме ( д – 2 ). Приказани су умеци: просечни пречници главе кичме (контрола, 0, 86 ± 0, 1 µм насупрот Неуритину, 0, 97 ± 0, 01 µм ) или дужине кичме (1, 78 ± 0, 03 µм наспрам 1, 79 ± 0, 02 µм ). За ( ц и д ) користи се 1345 бодља из 31 неурона који експримирају вектор и 2245 бодова из 34 неурона који експримирају неуритин. Статистички значај је изражен као * П <0, 05 и *** П <0, 001

Слика пуне величине

Облик дендритичне кичме се значајно мења синаптичком активношћу која јој се намеће, па структурални потпис може представљати синаптичку ефикасност. 2, 3, 4, 37 Кичме су сврстане у четири класе на основу пречника (ширине) и дужине главе кичме, који обухватају главу и врат: И – ИВ: бодљикава, гљива, танка и филоподија. 3, 37, 38 Свака класа кичме има изразиту функцију у синаптичком преносу и различито доприноси синаптичкој пластичности; бодљике гљиве су функционалније компетентније од осталих. 5 Када смо класификовали појединачне кичме (погледајте детаље о критеријумима за материјале и методе), 38 неурона који експримирају неуритин показао је значајно повећан број бодљи који припадају класи И (* П = 0, 0269, Манн-Вхитнеи У- тест) и класи ИИ ( *** П <0, 001) у поређењу са контролом. Супротно томе, експресија неуритина није утицала на број бодљи у класи ИИИ ( П = 0, 8696) или класи ИВ ( П = 0, 7775) (слике 2б – 2). Сходно томе, од укупног броја избочења удио бодљикаве класе ИИ повећан је за ~ 10%, уз незнатно смањење пропорција бодљикава класе ИИИ и ИВ (слика 2ц). Подржавајући повећан удио кичми класе ИИ, експресија неуритина резултирала је повећањем средњег пречника укупних глава кичме (*** П <0, 001, Колмогоров – Смирнов тест; Слике 2д-1), али није утицала на дужину кичме ( П = 0.1344, тест Колмогоров – Смирнов; Слике 2д – 2). У складу са нашим подацима, бодљикава гљива (класа ИИ) на неуронима у визуелном кортексу била је мање обилна код мишева којима је недостајао неуритин него оних у ВТ легломатерима. 29 Према томе, неуритин вероватно има улогу у стабилизацији функционално зрелих синапси, или могуће у олакшавању сазревања дендритичних бодљи.

Неуритин појачава базални синаптички пренос

Промоција неуритичког раста и сазревање дендритичне кичме сугерисала је да неуритин може контролисати функционалност синаптичких веза. Као и у морфолошкој анализи краљежнице, хипокампални неурони су трансфицирани или контролним или неуритинским векторима на 9 ДИВ и инкубирани током додатних 14 дана. За мерење кванталних синаптичких одговора, забележили смо минијатурне ексцитаторне постсинаптичке струје (миниЕПСЦ), углавном миниЕПСЦ посредоване рецепторима α -амино-3-хидрокси-5-метил-4-изоксазолепропионске киселине (АМПА), са потенцијалом задржавања од -70 мВ ( Слика 3а). Амплитуда миниЕПСЦ-а представља кванталну величину која се обично изводи из садржаја везикула везикула или обиља постинаптичког АМПА рецептора, док промене у учесталости миниЕПСЦ-а означавају промене у вероватноћи ослобађања пресинаптичких везикула или у броју синапси које садрже АМПА рецепторе. 39 Важно је да је неуритин значајно повећао учесталост миниЕПСЦ-а у поређењу са оним у контролама (** П = 0, 007, Манн-Вхитнеи У- тест; Слике 3б и ц), али није утицао на амплитуду миниЕПСЦ-а ( П = 0, 3, Манн-Вхитнеи У- тест; Слике 3б и ц). Пораст учесталости миниЕПСЦ-а је такође примећен у оптичким текталним неуронима Кс. лаевис-а који су вирално експримирали неуритин. 25 Стога, ови подаци указују на то да неуритин повећава број функционалних синапси, вероватно подстичући сазревање синапси.

Image

Експресија неуритина повећава миниЕПСЦ фреквенцију у култивираним хипокампалним неуронима. ( а ) Репрезентативни трагови миниЕПСЦ-а снимљени из контролног вектора (одозго) - или неуритина (доњи)-експресионирајући хипокампне неуроне. Калибрација: 20 пА и 200 мс. ( б ) Кумулативни дијаграми вероватноће амплитуда миниЕПСЦ (горе) и интервала догађаја (доњи). ( ц ) Средња амплитуда миниЕПСЦ (горња: контрола, 11, 7 ± 0, 4 пА насупрот Неуритину, 12, 7 ± 0, 7 пА) и миниЕПСЦ фреквенција (дно: 1, 2 ± 0, 2 Хз у односу на 2, 08 ± 0, 2 Хз) упоређују се између контролног вектора- ( н = 10) и неуритин- ( н = 13) експресију неурона. Статистички значај је изражен као ** П <0, 01

Слика пуне величине

Растворљиви неуритин спречава дендритичку атрофију хипокампалних неурона код Тг2576 мишева

Нећелијска аутономна функција коју врши неуритин сугерише да делује као лиганд на непознате рецепторе. 24, 25 Заправо, показало се да неуритин постоји претежно као растворљиви излучени облик ин виво , 26 и неколико студија показало је да овај растворљиви облик има неуротрофичне ефекте на неуроне сисара. 16, 26, 27 Неуритска атрофија се обично примећује и у мозгу пацијената са АД и код модела АД, 40 и лако се рекапитулише у култивираним неуронима припремљеним од Тг2576 мишева. 41 Да бисмо развили потенцијалну укљученост неуритина у неуритску атрофију, измерили смо ниво мРНА неуритина у хипокампу 6-месечних Тг2576 мишева, што је показало смањење мРНА неуритина у поређењу са оном контроле ВТ легла (** П = 0, 0079, непарни т- тест; Слика 4а). Стога смо одлучили испитати да ли пораст неуритина нуди заштитно дјеловање дендритичке елаборације у узгојеним хипокампалним неуронима из Тг2576 мишева или од њихових ВТ легла. Да бисмо правилно контролисали концентрацију неуритина током следећих експеримената, егзогенски смо примењивали рекомбинантни неуритин пептид, растворљиви неуритин на 150 нг / мл, 16, 27, 42, уместо да претерано експрексирамо неуритин пуне дужине. За визуализацију читавих дендритичних грана користили смо вирус бјесноће који кодира еГФП (САДΔГ еГФП) 43 и анализирали смо и дендритичку арборнизацију користећи Схолл анализу и густоћу краљежнице након третмана неуритином (Слика 4б). Неочекивано, сам растворљиви неуритин пептид није утицао на дендритичку арборнизацију у ВТ контролним неуронима ни на једној удаљености од сома (слике 4ц-е и допунска табела 1), што се разликовало од наших резултата пролазном експресијом неуритина пуне дужине (слика 1). 24, 25, 28, 30 Број кичме такође није промењен третманом неуритин пептида ( П > 0, 05, једносмерна АНОВА са пост хоц Бонферрони; Слике 4ф и г).

Image

Растворљиви неуритински пептид спречава неуритску атрофију у неуронима из Тг2576 мишева. ( а ) Нивои мРНА неуритина приказани су из хипокампа 6-месечних Тг2576 и ВТ мишева након нормализације у односу на ВТ стељере (ВТ, 1 ± 0.0201 у односу на Тг2576, 0.8340 ± 0.0177, н = 5 мишева, респективно ). ( б ) Експериментална шема за лечење и обрађивање неуритин пептидима. ( ц ) Репрезентативне слике хипокампних неурона који експримирају еГФП, припремљене од Тг2576 или њихових мишева с ВТ леглом након третмана рекомбинантним неуритин пептидом (150 нг / мл 16, 27, 42 ) или носачем (ПБС као контрола). Вага, 50 µм . ( д ) Проводе се анализе тестова за мерење дендритичних прелаза гране са означеним дистанцираним круговима од сома. Статистички значај између ВТ-контроле наспрам Тг2576-Цонтрол изражава се са * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001, док је поређење између Тг2576-Цонтрол у односу на Тг2576-Неуритин изражено као П <0, 05, ‡ ‡ П <0, 01. ( е ) Укупни број прелаза до граничне гране, ~ 120 μм је приказан за сваку групу. ВТ-контрола, 286, 8 ± 11, 3 насупрот ВТ-Неуритин, 320, 4 ± 11, 1 насупрот Тг2576-Цонтрол, 182, 3 ± 16, 6 у односу на Тг2576-Неуритин, 253, 3 ± 14, 1, н = 11 неурона, респективно. ( ф ) Предочене су репрезентативне слике еГФП обележених дендрита Тг2576 и ВТ неурона након третмана рекомбинантним неуритином или носачем (ПБС као контрола). Вага, 10 µм . ( г ) Укупни број бодљи на 10 µм из сваке групе. ВТ-контрола, 8, 69 ± 0, 37 у односу на ВТ-неуритин, 8, 78 ± 0, 33 у односу на Тг2576-контролу, 5, 48 ± 0, 37 у односу на Тг2576-неуритин, 8, 68 ± 0, 46, н = 11 неурона, респективно. Вишеструка поређења помоћу пост-хоц Бонферронијевог теста након АНОВА откривају значајно смањење укупног броја прелазака ( е ) и броја кичме ( г ) са Тг2576 неурона у поређењу са онима из других група. Статистички значај је изражен као ** П <0, 01 и *** П <0, 001

Слика пуне величине

У складу с претходним извештајем, 41 неурона изолована од Тг2576 мишева показала је превелику поједностављеност у својим дендритичним стаблима, што показује значајно смањени број укупних дендритичких прелаза (*** П <0, 001, једносмерни АНОВА са пост хоц Бонферрони; слика 4е ) и бодље (*** П <0, 001; Слике 4ф и г) у поређењу са онима из ВТ контролних мишева. Важно је да је третирање неурона са Тг2576 мишевима растворљивим неуритин пептидом значајно ослабило смањење дендритичке елаборације (Тг2576-Неуритин наспрам Тг2576-Цонтрол, ** П = 0, 0036; Слика 4е) и синаптичку формацију (*** П <0, 001; Слика 4г), и чак је преокренуо скоро до нивоа опаженог у ВТ неуронима ( П > 0, 05 и за дендритичке прелазе и за број кичме; Слике 4е и г, респективно), што је у складу са нашим недавним запажањима. 44 Да бисмо даље испитали ефикасност неуритина, лечили смо Тг2576 неуроне са повећаном концентрацијом растворљивог неуритина. Сложеност неуритских процеса Тг2576 неурона је повећана на начин зависан од дозе коришћеног неуритин пептида и била је упоредива са контролним нивоом нарочито од 150 нг / мл (допунска слика 1). Због тога, растворљиви неуритин вероватно има заштитну улогу против дендритичке дегенерације која се манифестује у моделима АД и вероватно код пацијената са АД.

Растворљиви неуритин спашава синаптичку пластичност хипокампала у Тг2576 мишевима

Бројни животињски модели АД показују дефицит у синаптичкој пластичности хипокампалних кола, пре свега због синаптотоксичних активности олигомерног А β . 45, 46, 47, 48 На пример, дуготрајно потенцирање (ЛТП), електрофизиолошки представник синаптичког јачања у неуронским везама у основи учења и памћења, 49 у хипокампусу Тг2576 мишева је тешко оштећено у доби од 6 месеци, истовремено са нагли пораст токсичног А β пептида и дефицита меморије. 50, 51, 52, 53 Имајући у виду запажену неуропротективну улогу растворљивог неуритина, као и недавни извештај да је неуритин побољшао когнитивне способности код Тг2576 мишева, 44, ми смо закључили да растворљиви неуритин може имати утицаја на ЛТП код Тг2576 мишева.

У почетку смо упоређивали ЛТП у Сцхаффер-овом колатералном путу акутних крижика хипокампа код 6-месечних мишева Тг2576 са оним у ВТ легла. У складу са претходним извештајима, 47, 50 ЛТП је значајно ослабљено код Тг2576 мишева у поређењу са ВТ мишевима (*** П = 0.00004, парни т- тест; Слике 5а и ц). Да бисмо решили могућност да растворљиви неуритин утиче на овај дефицит ЛТП-а, инфузирали смо рекомбинантни неуритински пептид у церебровентрике 6-месечних Тг2576 мишева коришћењем осмотских пумпи две недеље и затим прегледали ЛТП. Открили смо да је ова хронична инфузија растворљивог неуритина у мозак мишева Тг2576 спасила ЛТП, док су мишеви Тг2576 који су примили вештачку цереброспиналну течност (аЦСФ) још увек имали оштећења у ЛТП (* П = 0.03346; Слике 5б и ц). Заиста, величина ЛТП-а добијеног од Тг2576 мишева инфузираних растворљивим неуритином била је упоредива са оном код ВТ мишева (Тг2576-Неуритин наспрам ВТ, П = 0.438; Слика 5ц). Узето заједно, ови резултати показују да растворљиви неуритин функционално враћа синаптичку пластичност, вероватно због своје неуропротективне активности на нивоу кола.

Image

Растворљиви неуритин спашава ЛТП у хипокампу Тг2576 мишева. ( а ) ЛТП у Сцхаффер колатералном путу 6-месечних ВТ легла и Тг2576 мишева. Теренски ЕПСП снимљени су из ЦА1 области акутних одсечака хипокампа, а ЛТП је индукован ТБС, означеним црном стрелицом. ЛТП је изражен као средња вредност ± СЕМ% нагиба почетног нивоа фЕПСП-а снимљених током најмање 20-минутног основног периода. Уметци показују репрезентативне трагове на временским тачкама које се подударају са бојом (калибрација: 1 мВ и 10 мс). ( б ) ЛТП Тг2576 мишева који су подвргнути осмотској инфузији било аЦСФ или рекомбинантног неуритин пептида. Стрелица, умеци и калибрација као у а . ( ц ) Резиме хистограма за синаптичко потенцирање у 1 х након индукције ЛТП у а и б . Јачина ЛТП код Тг2576 мишева значајно се смањила (ВТ, 166, 8 ± 10, 9%, н = 8 кришки од 3 мишева у односу на Тг2576, 101, 4 ± 4, 8%, н = 9 кришки од 3 мишева), али настављена је осмотском инфузијом растворљивог неуритин пептида (Тг2576-Цонтрол, 100, 5 ± 4, 9%, н = 12 кришки од 4 мишева у односу на Тг2576-Неуритин, 146, 3 ± 22, 2, н = 9 одсека од 4 мишева). Статистички значај је изражен као * П <0, 05 и *** П <0, 001

Слика пуне величине

Дискусија

Функционална улога неуритина у нервном систему у развоју интензивно је проучавана, док физиолошка дејства неуритина на синаптичке карактеристике, нарочито оне повезане са неуродегенеративним болестима, остају у великој мери непозната. Овде смо проценили промовисање ефекта неуритина на неуритску разраду, сазревање дендритичке кичме и синаптички пренос. Први пут смо показали да растворљиви неуритин преокреће неуритску атрофију и оштећење синаптичке пластичности манифестоване у Тг2576 трансгеничном моделу миша АД, подржавајући улогу за нећелијске аутономне функције неуритина.

Неуротрофичне улоге неуритина

Израз "неуротрофни" се опћенито користи да опише колекцију ефеката који покрећу неуритогенезу, арборнизацију грана, синаптогенезу или преживљавање диференцирајућих неурона. 11 Претходне студије које су користиле пролазну експресију неуритинског гена или примену неуритин пептида пружиле су доказ да неуритин има неуротрофичну улогу барем током развојних фаза. Ове неуротрофне функције укључују промоцију неуритогенезе, 16, 24, 27 регулацију формирања и стабилизације синапсе, 25, 28, 29, 31 и спречавање програмиране ћелијске смрти. 26, 27 У складу са овим неуротрофичним деловањима, образац експресије неуритина је просторнотемпорално повезан са експанзијом неуронских ћелија 26, 54 и синаптичким модификацијама изазваним активностима. 18, 19, 20, 22 На пример, транскрипција неуритина у визуелном кортексу појачана је током отварања ока, 19, 55, када се изразито повећава и дендритичко гранање сложености и броја кичме, као и у миниЕПСЦ. 33, 56, 57

Претходна открића смо проширили на деловање неуритина на формирање и сазревање дендритичних бодљи, показујући да је експресија неуритина довела до повећања броја и пропорција бодљикавог и печурког бодљикавог типа. За разлику од свестраних малих бодља (филоподија и танких бодљи) који обично формирају тихе или слабо осетљиве на глутамат синапсе, велике бодље (бодљикаве и бодљикаве бодље) са великим постсинаптичким густинама су високо обогаћене АМПА рецепторима и тако су потенцијално осетљиве на пресинаптички глутамат издање. 2, 58 Експресија неуритина резултирала је повећањем фреквенције, али не и амплитудом миниЕПСЦ-а. У комбинацији са повећаним бројем функционално зрелих бодљи, селективни утицај на фреквенцију миниЕПСЦ-а може се приписати претварању тихих синапса посредованих неуритином у функционалне синапсе, укључујући укључивање АМПА рецептора у чисти-Н-метил-Д -аспартат ( Синапси рецептора НМДА). 25 Алтернативно, постинаптичка експресија неуритина може ретроградно изменити пресинаптичке карактеристике, попут повећања вероватноће ослобађања пресинаптичких везикула, што резултира повећаном учесталошћу миниЕПСЦ-а. 39 Детаљна анализа молекуларних механизама који стоје на основу синаптичких ефеката неуритина допринеће даљем разумевању функционалног сазревања синапси.

Неуритин пуне дужине насупрот топивом неуритину излученог

Слично ендогеном неуритину, егзогено експримирани неуритин постоји и у обличју ћелијске површине и у излученим облицима. 26 У оптичким тектталним неуронима Кс. лаевиса , експресија неуритина у целој дужини поспешила је аксонски раст или дендритичко гранање, као и конверзију тихих синапси у функционалне синапсе, док скраћени облик неуритина који нема ГПИ секвенцу није имао. 24, 25 Интригантно, излучени облик неуритина, укључујући неуритин пептид, резултирао је неуротрофичним последицама на неуронима сисара, укључујући промоцију неуритске разраде и спречавање апоптозе. 16, 26, 27 Постоји могућност да неуритин који недостаје ГПИ може бити неправилно прерађен и да се не може излучити у ванћелијски простор. 59 Међутим, треба утврдити да ли и на који начин растворљиви неуритин даје различите излазе у поређењу са неуритином који је везан за површину ћелије.

Изненађујуће, ефекат на дендритичку сложеност растворљивог неуритина који је примењен на неуроне из ВТ мишева био је неодвојив од ефекта неурона третираних ПБС-ом (Слика 4). Овај недостатак растворљивог неуритина био је у великој супротности с оним који је претходно примећен у кортикалним и хипокампалним неуронима. 16, 26, 27 Ова несклад може се приписати разлици у развојном стадију неурона, то јест ДИВ. Испитивали смо дендритичку сложеност у касној фази (ДИВ, 19) након примене растворљивог рекомбинантног неуритина, док су анализе у тим ранијим студијама рађене у ранијим фазама (ДИВ, 3–7). 16, 26, 27 Ову могућност додатно подржава и наше запажање да је неуритска обрада повећана експресијом неуритина процењеном на 6 ДИВ (слика 1). Различита морфолошка ефикасност неуритина у ограниченом временском року може бити последица ефекта плафона за сигналне механизме активиране ендогеним неуритином, јер се ниво ендогеног неуритина хипокампа повећао од постнаталног 4. дана до одрасле доби. 16 Рекапитулирајући пораст ендогеног неуритина у узгојеним хипокампалним неуронима може појачати каскадне сигналне каскаде, које су у 12 ДИВ потпуно засићене; према томе, егзогена примена растворљивог неуритина после тога не би произвела додатне ефекте. Занемарив ефекат неуритин пептида на сазреле ВТ неуроне (Слика 4) наводи нас на претпоставку да неуритин има улогу у дендритичкој арборнизацији, формирању синапси и синаптичком преносу током ране фазе развоја, али не и када се његова експресија засити у каснијој фази (ДИВ, 19). С обзиром на смањени ниво неуритина у мозгу пацијената са АД 44 и у хипокампу Тг2576 мишева (слика 4а), могуће је нагађати да егзогени неуритин може спречити смањење ендогеног неуритина примећеног у неуронима са Тг2576 мишева на преокрет неуритичког атрофија.

Растворљиви неуритин спречава синаптички дефицит АД

Важно је да смо показали да растворљиви неуритин спречава дендритичку атрофију и оштећење ЛТП-а на неуронима хипокампала и хипокампа, од Тг2576 мишева. Оба дефицита укључују активацију каспазе-3. 46, 60, 61 Заправо, показало се да синаптотоксични А β активира каспазу-3, што резултира цепањем Акт1 (такође познатом као протеин киназа Б- α ), чија је активност критично потребна за дендритичку арбораризацију и синаптичку пластичност. 46, 60, 62, 63 Дакле, могуће је да активирање претпостављеног рецептора за неуритин омета активацију каспазе-3 (Путз и др. 26 ) и накнадно цепање Акт1, иако та могућност није процењена.

Недавно је објављено да растворљиви неуритин покреће пут рецептора инсулина, сугерирајући рецептор инсулина као претпостављени рецептор за неуритин. 42 Поред тога, растворљива неуритин стимулисала је изванћелијску сигнално регулисану киназу (ЕРК) и сисавце циља рапамицина (мТОР) преко инсулинског рецептора. 42 Активности ЕРК-а и мТОР-а уско су биле укључене у синтезу де ново протеина, предуслов за нормалну синаптичку пластичност и формирање меморије. 49, 64, 65 Нови докази указују да дисрегулација мТОР сигнализације узрочно доприноси патогенези АД, иако то и даље остаје дискутабилно. 64, 66, 67, 68 Код мишева Тг2576 активност мТОР-а је значајно потиснута, а фармаколошка регулација мТОР-а је спасила ЛТП. 66 Функционални значај мТОР у синаптичким дефектима АД био је поткријепљен подацима о понашању другог животињског модела АД. 68 Стога, нормализација ЛТП код Тг2576 мишева инфузијом растворљивог неуритина може бити последица повећања мТОР активности посредованог неуритином. С обзиром на неуропротективне активности растворљивог неуритина, посебно за неуроне из Тг2576 мишева, а не за оне са ВТ контрола, биће корисно утврдити да ли инфузија растворљивог неуритина у мозак Тг2576 мишева нормализује и њихов меморијски дефицит.

Укратко, само лечење неуритином резултирало је неуротрофичним активностима у расту неурита и сазревању дендритичне кичме у нормалним неуронима, посебно у раним фазама развоја. Оно што је важно, показали смо да растворљиви неуритин спроводи неуропротективне акције за неуроне и хипокампалне склопове код мишева Тг2576, што спречава дендритичку атрофију и оштећење синаптичке пластичности. Предочили смо значајне доказе да растворљиви неуритин ревертира синаптичке недостатке у животињском моделу АД, сугеришући да манипулација нивоом ендогеног неуритина или снабдевање егзогеним растворљивим неуритином може понудити терапијске користи против неуродегенеративних болести.

Материјали и методе

ДНК и вирусни конструкти

Користили смо пИРЕС-ЕГФП-неуритин1-ФЛАГ за прекомерну експресију неуритина и пИРЕС-ЕГФП за његов контролни плазмид на примарним неуронима хипокампала, које је др Недиви љубазно обезбедио на МИТ. 26 Да бисмо визуелизовали или категоризовали дендритичне бодље, користили смо пДсРед-Мономер-Н1 за додатну трансфекцију или вирус беснила који кодира побољшани ГФП (САДΔГ еГФП) за вирусну инфекцију. 43

Култура хипокампалних неурона, трансфекција и имуноцитохемија

Примарни неурони хипокампала сецирани од ембрионалног мишева дана Ц57БЛ / 6 постављени су на покриваче од поли-Л-лизина (Сигма, Ст. Лоуис, МО, САД). Неурони су одржавани у неуробазалном медијуму (Инвитроген, Царлсбад, ЦА, САД) са додатком Б27 (Инвитроген), 5 мМ Л-глутамина (Сигма), 2, 5 µМ цитозина β - Д-арабинофуранозида (Сигма), 5% феталног говеђег серума ( Хицлоне, Логан, УТ, УСА) и 1% пеницилин / стрептомицин (Инвитроген) у влажном окружењу од 5% ЦО 2 /95% О 2 инкубатора на 37 ° Ц.

Неурони су трансфицирани Кит за трансфекцију калцијум-фосфата (Инвитроген) следећи претходно описане методе. 69 Укратко, инкубирали смо неуроне у претходно загрејаном минималном есенцијалном медијуму (Инвитроген) допуњеном 5 мМ МгЦл2 током 30 минута и растварали претходно помешани талог ДНК / Калцијум-фосфат у медијум. После 45 мин инкубације, неурони су испрани три пута претходно еквилибрираним ХБСС у 10% ЦО2 / 90% О2 инкубатору на 37 ° Ц.

За имуноцитохемију, неурони су фиксирани са ПБС који садржи 4% параформалдехид, 4% сахарозе у трајању од 10 мин на 37 ° Ц, и пермеабилизовани са ПБС који садржи 0, 2% Тритон Кс-100, 20 мМ глицина током 5 минута на собној температури. Неурони су испрани три пута са ПБС у трајању од 5 минута, блокирани са 2% говеђег серумског албумина током 30 минута на собној температури и инкубирани са примарним антителом против заставе (Целл Сигналинг Тецхнологи, Данверс, МА, САД), МАП2 (Сигма) и Тау-1 (Миллипоре, Бедфорд, МА, САД) на 4 ° Ц током ноћи. После испирања, секундарна антитела коњугована са Алека Флуор 488 (Инвитроген) или Алека Флуор 568 (Инвитроген) се даље инкубирају на 37 ° Ц током 45 мин.

Аквизиција слике и квантитативна морфометрија

Флуоресцентне слике стечене су коришћењем Олимпус Флуовиев 1000 конфокалног микроскопа. Слике прикупљене из три или четири независна експеримента под истим параметрима анализиране су коришћењем софтвера за обраду слика МетаМорпх (Универсал Имагинг, Бедфорд Хиллс, НИ, УСА). Да се ​​избегну умирући неурони који утичу на резултат, из анализе су искључени неурони са вакуолама у сома и са дендритичком фрагментацијом.

За анализу дендритичне кичме, одабрани су ријетко трансфицирани неурони да би се минимизирало дендритичко преклапање и сноп слика је добијен у з- димензији при оптичкој дебљини од 0, 4 µм да би се покрили читави неурони. Критеријуми за категоризацију краљежнице кориштени су према раније описаној методи. 38 Укратко, избочења дуж дендрита класификована су у четири класе краљежнице у зависности од њихове ширине главе и дужине врата. Класа И, „тврдоглава“, кратке дужине <0, 5 µм , без великих глава без врата; Класа ИИ, „печурка“ за зреле бодље са дужином између 0, 5 и 1, 25 μм , са великом главом кичме и кратким вратом; Класа ИИИ, „танка“ за бодље са дужином између 1, 25 и 3, 0 µм , са малом кичменом главом и издуженим вратом; Класа ИВ, „филлоподија“ за имматуер бодље са дугим влакнастим испупчењима којима недостаје било која дисттибилна глава кичме.

Да бисмо квантитативно измерили сложеност дендрита, користили смо Схолл анализу као што је претходно описано. 36, 41 Након уклањања неуритских процеса који су очигледно изведени из других ћелија са првобитних слика, концентрични кругови са полумјером од 10 µм извучени су 15 м м од сома, а број крижања са дендритичким гранама у сваком кругу је избројан помоћу Слика Ј (НИХ). Анализа обарања извршена је бројењем укупних прелаза на удаљености од ~ 120 µм од сома.

Quantitative real-time RT-PCR

Total RNA was extracted by miRNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) and 0.5 μ g of RNA was processed for cDNA synthesis using SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit (Invitrogen) according to the manufacturer's instruction. Quantitative real-time RT-PCR was carried out using SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Quantitative real-time RT-PCR was performed on a 7500 Fast Real-Time PCR systems (Applied Biosystems). The primers used were as follows: Neuritin forward, 5′-GGGACTTAAGTTGAACGGCA-3′; Neuritin reverse, 5′-ACCCAGCTTGAGCAAACAGT-3′; Gapdh forward, 5′-TCCATGACAACTT TGGCATTG-3′; Gapdh reverse, 5′-CAGTCTTCTGGGT GGCAGTGA-3′. All of the mRNA level were normalized to that of Gapdh mRNA.

Intracerebroventricular infusion of recombinant neuritin peptide using osmotic pumps

To examine the effect of soluble neuritin on synaptic plasticity in the hippocampus of AD model mice, we used Tg2576 mice that expressed human APP695 gene harboring the Swedish double mutation (KM670/671NL). 70 Tg2576 mice (Taconic, Germantown, NY, USA) were crossed with C57BL6/SJL F1 hybrid mice to get the offspring. For LTP experiments, we used 6-month-old heterozygous transgenic mice and their WT littermates. All mice were housed under a 12 h light/dark cycle and given ad libitum access to food and water. All procedures for animal experiments were approved by the ethical review committee of POSTECH (Pohang University of Science and Technology), Korea, and performed in accordance with the relevant guidelines.

Installation of the osmotic pumps was performed following the manufacturer's guideline. Forty eight hours before the surgery, the osmotic mini pump (1007D, Alzet, Cupertino, CA, USA) was filled with aCSF (containing the followings: 10 mM glucose, 119 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH 2 PO 4, 1.3 mM MgSO 4, 2.5 mM CaCl 2, and 26 mM NaHCO 3 at pH 7.4) with or without recombinant neuritin peptide (1260 ng, Abcam, Cambridge, UK) and equilibrated in 0.9% NaCl at 37 o C. Delivery cannula (Alzet, brain infusion kit 3) was implanted in order to target the end of cannula to intracerebroventricle (coordination of anteroposterior, −0.4; mediolateral, ±1; dorsoventral, −2.3 in mM from the bregma) of anesthetized (Ketamine/Xylazine) mice in a stereotaxic apparatus (Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA). The osmotic pump was attached to the delivery cannula tubing and subcutaneously implanted at the back to allow spontaneous infusion (injection speed: 90 ng/day). After 2 weeks of infusion, animals were killed for the LTP experiment.

Електрофизиологија

To measure miniEPSCs, neurons were placed in a recording chamber while perfused with aCSF containing 1 μ M voltage-gated sodium channel blocker tetrodotoxin (Tocris, Minneapolis, MN, USA), 20 μ M NMDA receptor antagonist D -2-amino-5-phosphonovaleric acid (Tocris), 100 μ M γ -aminobutyric acid class A receptor antagonist picrotoxin (PTX, Tocris). Whole-cell voltage-clamp recording was performed with a MultiClamp 700B amplifier (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) using the recording electrodes (3–5 MΩ) filled with a pipette solution containing 100 mM Cs methanesulfonate, 20 mM CsCl, 10 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM MgCl 2, 0.4 mM NaGTP, 4 mM MgATP, and 10 mM phosphocreatine (finally adjusted to pH 7.2). Throughout the recording experiments, the series resistance (10–30 MΩ) was monitored while holding neurons at −70 mV. Currents were filtered at 2.4 kHz, digitized at 10 kHz, and then miniEPSCs were analyzed in Mini Analysis Program (Synaptosoft Inc., Fort Lee, NJ, USA) using custom software with detection criteria that included an amplitude>8 pA, a minimum rise rate of 5 pA/ms, and a decay constant between 1–12 ms.

For LTP in acute hippocampal slices, field excitatory postsynaptic potentials (fEPSPs) were recorded from transverse-sectioned acute hippocampal slices (400 μ m thick) obtained from 6-month-old male Tg2576 or their WT littermate mice. After decapitation, hippocampi were quickly isolated from the brain and chilled in ice-cold 50% sucrose-based (175 mM sucrose, 11 mM glucose, 20 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 1.4 mM NaH 2 PO 4, 1.3 mM MgCl 2, and 26 mM NaHCO 3, adjusted to pH 7.4) aCSF that was oxygenated with 95% O 2 and 5% CO 2 gas. Acute hippocampal slices were obtained using an 800-McIlwain Tissue Chopper (Brinkman Instruments, Westbury, NY, USA) and placed in oxygenated aCSF at 37 °C for more than 1 h. Slices were maintained in a submerged recording chamber continuously perfused with oxygenated aCSF bath solution, containing 100 μ M PTX, at a flow rate of 2.5–3 ml/min. The fEPSPs were recorded in the striatum radiatum of the CA1 subfield by the 3 M NaCl-filled microelectrodes (3–5 MΩ) while stimulating the Schaffer collateral pathway afferent fibers with a bipolar concentric electrode (WPI). The pulses were generated with an A360 stimulus isolator (WPI) and fEPSPs were recorded with an Axopatch 200A amplifier linked to a Digidata 1200 (Molecular Devices) interface. Test fEPSPs were evoked by the stimulation intensity that yielded one-third of the maximal fEPSP responses at a frequency of 0.033 Hz, and LTP was induced by five episodes of theta burst stimulation (TBS) that were delivered at 0.1 Hz. In each episode, 10 trains of stimulation that consisted of four pulses at 100 Hz were delivered at 5 Hz.

Статистичка анализа

All the numerical data resulted from analysis were denoted as mean±SEM%. Mann–Whitney U- test or unpaired t -test was used to determine statistical significance between two data set as appropriately. Kolmogorov–Smirnov test was used to compare the spine head diameter and length between groups. In the case of multiple comparisons, one-way ANOVA with post hoc Bonferroni test was used. Statistical significance between groups is expressed as follows: NS, not significant; * П <0, 05; ** П <0, 01; *** П <0, 001.

Додатне информације

Ворд документи

  1. 1.

    Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Додатне информације

Речник

АД

Алцхајмерова болест

A β

β -amyloid

BDNF

неуротрофни фактор који потиче из мозга

GPI

glycosylphosphatidylinositol

WT

wild type

DIV

days in vitro

MAP2

microtubule-associated protein 2

miniEPSCs

miniature excitatory postsynaptic currents

AMPA

α -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepro-pionic acid

ЛТП

long-term potentiation

aCSF

artificial cerebrospinal fluid

NMDA

N-methyl- D -aspartate

ERK

extracellular signal-regulated kinase

mTOR

mammalian target of rapamycin

fEPSPs

field excitatory postsynaptic potentials

TBS

theta burst stimulation

Додатне информације прате овај рад на веб локацији Целл Деатх анд Дисеасе (//ввв.натуре.цом/цддис)