Ного-ц регулише апоптозу кардиомиоцита током инфаркта миокарда миша | ћелијска смрт и болест

Ного-ц регулише апоптозу кардиомиоцита током инфаркта миокарда миша | ћелијска смрт и болест

Anonim

Субјекти

  • Апоптоза
  • Ћелијска сигнализација
  • Исцхаемиа
  • Инфаркт миокарда

Апстрактан

Инфаркт миокарда је узрокован недовољном коронарном опскрбом крвљу, што доводи до оштећења миокарда и на крају затајења срца. Молекуларни механизми повезани са губитком кардиомиоцита током инфаркта миокарда (МИ) и срчаних болести повезаних са исхемијом још увек нису у потпуности разјашњени. Ного-Ц је протеин ендоплазматског ретикулума који се свеприсутније експримира у ткивима укључујући срце, али срчана функција Ного-Ц још увек није позната. У овом истраживању открили смо да је Ного-Ц био регулисан у мишјим срцима након МИ, а хипоксични третмани такође повећавају ниво протеина Ного-Ц у кардиомиоцитима. Прекомерна експресија Ного-Ц посредована аденовирусом довела је до кардиомиоцитне апоптозе, док је оборење ного-ц схРНА заштитним кардиомиоцитима заштићено од ћелијске апоптозе изазване хипоксијом. Важно је да су ного-Ц нокаутомирани мишеви показали побољшану срчану функцију, мање инфарктне области и мање апоптотичких ћелија после МИ. Штавише, открили смо да миР-182 негативно регулише експресију Ного-Ц и да се током МИ смањује, изражавајући миР-182 у кардиомиоцитима заштићеним хипоксијом и ного-Ц-посредованом апоптозом ћелија. Наши резултати показују да је повећана срчана експресија Ного-Ц довољна и неопходна за исхемију изазвану кардиомиоцитну апоптозу и срчану дисфункцију, што сугерише да дерегулација Ного-Ц миРНА може бити потенцијални терапеутски циљ за срчане болести повезане са исхемијом.

Главни

Инфаркт миокарда (МИ) узрокује оштећење миокарда и на крају доводи до затајења срца, водећег узрока смрти у свету. 1, 2 МИ карактерише недовољно коронарно снабдевање крвљу, а продуљена исхемија током МИ изазива губитак кардиомиоцита услед апоптозе и некрозе. 3 Иако су пријављени различити сигнални путеви који су укључени у апоптозу кардиомиоцита, укључујући реактивне врсте кисеоника (РОС), протеин киназу Ц, МАПК и нуклеарни фактор кБ, 4, 5, 6, 7, молекуларни механизми повезани са МИ и срчаном повезаном са исхемијом болести још нису у потпуности схваћене.

Протеини инхибитора раста неурита (Ного) припадају фамилији протеина ретикулона, за коју је карактеристичан мотив циљања ендоплазматског ретикулума на карбокси терминалу. 8 Ного ген кодира три спојне изоформе, Ного-А, Ного-Б и Ного-Ц. Ного-А је мембрански протеин који се експримира углавном у централном нервном систему као што су олигодендроцити и неурони, а служи као фактор инхибиције раста и ограничава поновно ширење аксона. 9, 10 Недавно је Ного-А такође откривен као важан негативни регулатор развојне ангиогенезе у централном нервном систему. 11 Ного-Б је краћа изоформа од Ного-А, изражена свеприсутно у телу. 12 У периферном нервном систему, Ного-Б се изражава у Сцхванновим ћелијама, а интеракција Ного-Б са његовим рецепторима на неуронима посредује аксонско гранање, што указује на улогу у прекомерном аксоналном клијању након повреде периферног нерва. 13 У периферним крвним судовима, Ного-Б регулише миграцију ендотелних ћелија тако што посредује васкуларну преградњу после лезија. 14 А код пацијената са плућном артеријском хипертензијом, Ного-Б се повећава и изазива превелику пролиферацију ћелија глатких мишића плућа услед сузбијања ћелијске апоптозе. 15 Упркос овим важним функцијама из ин витро студија, ного-А или Ного-Б кноцкоут миш показује релативно нормалне фенотипе. 16 Ного-Ц је најкраћи протеин у породици Ного, а изражава се у многим ткивима, укључујући јетру, неурон, ћелије глатких мишића васкула, скелетне мишиће и срце. 17 Код трансгених мишева који изражавају Ного-Ц у Сцхванновим ћелијама, озљеда ишијас узрокује одложену аксоналну регенерацију и смањење опоравка моторичких функција. 18 Код карцинома јетре ниво протеина Ного-Ц негативно је повезан са величином и прогнозом тумора. 19, 20 Међутим, улога протеина Ного-Ц у срчаној патогенези није истраживана.

Пошто је објављено да Ного протеини посредују више ћелијску апоптозу, 21, 22, 23, а апоптоза је уобичајена карактеристика срчаног инфаркта, онда претпостављамо да Ного-Ц може имати улогу у посредовању апоптозе кардиомиоцита током срчаног инфаркта. У овом истраживању, користећи комбинацију ин витро и ин виво приступа, истраживали смо улогу Ного-Ц у МИ и исхемијских кардиомиоцита. Пронашли смо нерегулисан ниво протеина Ного-Ц у МИ срчаним ткивима и хипоксичним кардиомиоцитима. Брисање ного-Ц сачувало је срчане функције након МИ. Наше истраживање пружа ин виво доказ, по први пут, да Ного-Ц има кључну улогу у регулисању срчане функције и може послужити као потенцијални терапеутски циљ за клиничко лечење МИ.

Резултати

Експресија ного-Ц је регулисана у МИ срцу и хипоксичним кардиомиоцитима

Ного-Ц се свеприсутно изражава у мишјим ткивима, укључујући срце, што је назначено његовом схемом израза (подаци нису приказани). Да бисмо разумели патолошку улогу Ного-Ц у срцу, проверили смо ниво експресије у МИ. Имунохистохемијско бојење Ного-Ц антителом показало је да је Ного-Ц регулиран у граничној зони инфаркта 24 сата након ЛАД (слика 1а). Резултат Вестерн блот-а потврдио је пораст нивоа Ного-Ц протеина у граничној зони МИ, на шта указује и 2, 3-одстотно повећање мишјег срца МИ, него код лажне контроле (Слика 1б). Затим смо тестирали да ли хипоксија подстиче ниво протеина Ного-Ц у култивираним неонаталним кардиомиоцитима помоћу два приступа. Прво смо лечили кардиомиоците ЦоЦл2, једињењем које се обично користи као индуктор хипоксије због његове улоге у индукцији и стабилизацији фактора 1 α (ХИФ-1а) који индукује хипоксију. ЦоЦл 2 (600 µМ током 24 х) изазвао је пораст нивоа Ного-Ц протеина на 3, 2 пута више од нивоа протеина у контролним ћелијама у возилу (Слика 1ц). Затим смо култивирали кардиомиоците у хипоксичном инкубатору са гасом који садржи 94% Н2, 1% О2 и 5% ЦО 2 током 12 х, и открили смо да лечење хипоксије такође повећава Ного-Ц до 3, 3 пута у поређењу са кардиомиоцитима узгојеним у нормоксији (Слика 1д). Заједно, ови резултати показали су да се протеин Ного-Ц мењао током хипоксије или МИ, што сугерише да Ного-Ц може имати улогу у патогенези срчаних болести повезаних са хипоксијом.

Image

Ного-Ц се регулише у МИ срцу и хипоксичним кардиомиоцитима. ( а ) Бојење хематоксилином / еозином и имунохистохемијским бојењем Ного-Ц лакомираних и МИ мишјих срца, бојење ИгГ као контрола. ( б ) Вестерн блот и просечни подаци који показују нивое Ного-Ц протеина у лажним и МИ мишјим срцима 24 сата након операције. н = 6–7 мишева. ( ц ) и ( д ) нивоа протеина ного-Ц у неонаталним кардиомиоцитима штакора, третираним 24 х ( ц ) ЦоЦл 2 (600 µМ) или са инкубацијом хипоксије (1% О2), током 12 х ( д ). н = 6 независних експеримената. * П <0, 05 насупрот лажној групи или контролним ћелијама

Слика пуне величине

Кардиомиоцитоза изазвана ного-Ц апоптозом

Следеће смо истражили да ли је промена функције ного-Ц протеина посредованих кардиомиоцитима. Трансфекција неонаталних кардиомиоцита пацова аденовирусом који садржи Ного-Ц цДНА (Ад-Ного-Ц) узроковала је повећани ниво ћелијског Ного-Ц протеина (Слика 2а). Прекомерна експресија ного-Ц повећане апоптозе кардиомиоцита, како показује тест проточне цитометрије, са ЛР (ЛР квадрант означава проценат раних апоптотских ћелија до обојених ћелија Алека 488) од 17, 53 ± 3, 085% у ћелијама које експресују Ад-Ного-Ц и 6, 4 ± 1, 112% у векторским контролним ћелијама, и УР (УР квадрант означава проценат касних апоптотских ћелија на Алека 488 и ћелије обојене пропидијум јодидом) од 9, 982 ± 1, 045% у ћелијама Ад-Ного-Ц и 7, 373 ± 1, 134% у контроли (Слика 2б). Апоптотички ефекат Ного-Ц на кардиомиоците такође је потврђен ТУНЕЛ-ом бојења, са 2, 2 пута повећаном апоптотичком стопом у адено-Ного-Ц ћелијама у односу на контролне ћелије (Слика 2ц). Стога, наши резултати сугеришу да је Ного-Ц довољан да индукује апоптозу кардиомиоцита.

Image

Ного-Ц регулише апоптозу кардиомиоцита. ( а ) Вестерн блот који показује ниво протеина Ного-Ц у неонаталним кардиомиоцитима штакора, трансфицираним са Ад-Ного-Ц на 50 МОИ или Ад-лаз током 48 х. н = 3 независна експеримента. ( б ) Анализа проточне цитометрије и ( ц ) бојење ТУНЕЛ-ом који показује апоптотичке стопе неонаталних кардиомиоцита штакора трансфицираних Ад-Ного-Ц или Ад-лазом. н = 3 независна експеримента за анализу проточне цитометрије; и н = 6 независних експеримената за ТУНЕЛ бојење. Линија скале = 25 μм . ( д ) Вестерн блот који показује ниво Ного-Ц протеина у новорођеним кардиомиоцитима штакора, трансфицираним са Ад-сх-Ного-Ц на 50 МОИ или Ад-сцрамбле током 48 х. н = 3 независна експеримента. ( е ) Анализа проточне цитометрије и ( ф ) ТУНЕЛ бојење које показује апоптотске стопе неонаталних кардиомиоцита пацова заражених Ад-сх-Ного-Ц или Ад-сцрамбле као одговор на ЦоЦл 2 стимулацију (600 µМ ). н = 6 независних експеримената. Линија скале = 25 μм . * П <0, 05 у односу на контролне ћелије кодирања. # П <0, 05 насупрот кодрирању + ЦоЦл 2 ћелије

Слика пуне величине

Затим смо истражили да ли смањени ниво Ного-Ц протеина може заштитити кардиомиоците од апоптотских подражаја инфицирањем кардиомиоцита аденовирусом који садржи Ного-Ц кратку длаку у праменовима (схРНА) (Ад-сх-Ного-Ц) до рушења Ного-Ц протеина (слика 2д) . Анализа проточне цитометрије показала је да је ного-Ц падом заштићена апоптоза кардиомиоцита индукована ЦоЦл2, од 12, 61 ± 3, 444% до 6, 103 ± 1, 166% (ЛР) и 13, 21 ± 2, 47% до 7, 315 ± 1, 637% (УР) (Слика 2е). Слично томе, бојање на ТУНЕЛ показало је да оборење Ного-Ц смањује кардиомиоцитну апоптозу изазвану ЦоЦл 2 са 25, 8% на 13, 3% (Слика 2ф). Све у свему, наши резултати показали су да је Ного-Ц довољан и потребан за апоптозу кардиомиоцита.

Напад ного-Ц заштићених мишева од срчане дисфункције изазване МИ

Да бисмо разумели ин виво функцију Ного-Ц, генерисали смо мишеве Ного-Ц - / - помоћу ТАЛЕН технике за брисање Ного-Ц специфичног егзона 1ц (слике 3а и б). У основи, омјери срчане масе према тјелесној тежини и тежини срца према дужини тибије код мишева Ного-Ц - / - слични су односу код контролних мишева у доби од 8 тједана (Слика 3ц). Такође, унутрашњи пречник леве коморе (ЛВИД) / дебљина задњег зида леве коморе (ЛВПВ) није показао разлику између Ного-Ц - / - и контролних мишева (Слика 3д). Подручје кардиомиоцита обојењем хематоксилином / еозином и ултра-структура помоћу танкосмислонског електронског микроскопа сличне су у срцима Ного-Ц - / - и контролних мишева (слике 3е и ф). Штавише, ного-Ц нокаут није променио функцију срца као што је откривено ехокардиографијом (Табела 1) и електрокардиографским тестом (слика 3г). Ови подаци сугерирају да брисање Ного-Ц не утиче на морфологију срца и функцију у базалним условима.

Image

Генерација и карактеризација Ного-Ц Кноцкоут миша. ( а ) Шематски дијаграм конструкције миша Ного-Ц - / - мишем ТАЛЕН техником. ( б ) Вестерн блот показује ниво протеина Ного-Ц у срцима дивљих врста и мишева Ного-Ц - / - . ( ц ) Однос тежине срца према телесној тежини (лево) и омјера тежине срца према тибији (ХВ / ТЛ) (десно) 8-недељних мужјака ВТ и Ного-Ц - / - мишева. н = 11 мишева. ( д ) Бојење хематоксилином и еозином, које приказују коморе срца 8-недељних мушких ВТ и Ного-Ц - / - мишева (лево), и дијастоле ЛВИД према ЛВПВ (десно). Линија за скалирање = 0, 5 цм. н = 6. ( е ) Слика попречног пресека 8-недељних мушких ВТ и Ного-Ц - / - срчаних миша хематоксилином и бојом еозином (лево) и просечним подацима (десно). ВТ, н = 70 ћелија (од 4 мишева); Ного-Ц - / -, н = 63 ћелије (од 5 мишева). Повећава снага: 400Кс. ( ф ) Репрезентативне ТЕМ слике 8-недељних мушких ВТ и Ного-Ц - / - мишјих срца. Линија скале = 0, 5 µм . ( г ) Електрокардиографске слике 8-недељних мушких ВТ и Ного-Ц - / - мишева (лево) и статистички подаци за П-амптитуде, ПР-интервал и КТ интервал (десно). н = 4–5 мишева

Слика пуне величине

Табела пуне величине

Затим смо истражили могући ефекат недостатка Ного-Ц на функцију срца током МИ. Иако је анализа ехокардиографије показала углавном смањену фракцију избацивања (ЕФ) и промену фракције фракције (ФАЦ) код контролних мишева после МИ (ЕФ: 67.26 ± 3.148% насупрот 23.51 ± 3.694%, ФАЦ: 50.9 ± 2.992% насупрот 15.44 ± 2.338%, пре и после МИ), ного-Ц нокаутом значајно је побољшао функцију срца након МИ на 44, 61 ± 4, 164% (ЕФ) и 30, 49 ± 2, 77% (ФАЦ) (слика 4а). Величина инфаркта (ИР) срца миша Ного-Ц - / - такође се смањила у поређењу са дивљим псима после МИ (слика 4б). Нивои лактатне дехидрогеназе (ЛДХ) у мишјем серуму Ного-Ц - / - након МИ су резервисани за поређење са повећаним нивоима контролних легла после МИ (1004 ± 76, 79 у Ного-Ц - / - мишу у односу на 1740 ± 289, 9 у контролног миша после МИ) (слика 4ц), што указује да нокаут ного-Ц има заштитни ефекат на МИ-индуковану повреду срца. Даље смо испитали кардиомиоцитну апоптозу бојењем ТУНЕЛ-ом после МИ и открили да ного-Ц нокаутом штити апоптозу кардиомиоцита, од 10, 64 ± 2, 25% у контролним срцима након МИ до 2, 907 ± 1, 163% у Ного-Ц - / - срцима (Слика 4д). Колективно, ови подаци подржавају заштитну улогу ного-Ц нокаутом од оштећења срца изазваног МИ.

Image

Ного-Ц нокаутом штити срце миша од повреде МИ. ( а ) Типичан пример М-начина ехокардиограма дивљег типа и Ного-Ц - / - миша срца са (МИ) или без (лажне) ЛАД лигације у трајању од 24 х (лево), и просечни подаци ЕФ (средњи) и ФАЦ ( јел тако). н = 6 мишева за сваку групу. * П <0, 05 насупрот лажним дивљим мишевима; # П <0, 05 насупрот МИ мишевима дивљих врста. ( б ) Репрезентативни трифенилтетразолијум хлорид (ТТЦ) који обарва слике секвенцијалних секција срца (лево) и просечне податке величине ТТЦ инфаркта (десно) ВТ и Ного-Ц - / - мишева после ЛАД лигације током 24 х. н = 4 мишева, * П <0, 05 у односу на дивље врсте мишева. ( ц ) Серумске ЛДХ активности дивљег типа и мишеви Ного-Ц - / - са или без ЛАД лигације током 24 х. н = 5–11 мишева. * П <0, 05 у односу на ВТ лаж; # П <0, 05 насупрот ВТ МИ. ( д ) обојење ТУНЕЛ-ом које показује апоптотске ћелије у граничној зони МИ од ВТ и Ного-Ц - / - срца миша 24 сата након ЛАД лигације (лево) и просечне податке (десно). н = 4 мишева. Линија скале = 25 μм . * П <0, 05 насупрот мишевима дивљих врста

Слика пуне величине

МиР-182 негативно регулисао експресију Ного-Ц током МИ

МиРНА имају критичну улогу у срчаним патолошким процесима. У овом истраживању покушали смо да идентификујемо могућу миРНА која регулише експресију гена Ного-Ц током МИ. Анализом силикона предвиђено је да миР-182 циља 3 'непреведени регион (3'УТР) Ного-Ц (слика 5а). Важно је да је експресија миР-182 значајно смањена у срцу током МИ (слика 5б) или у кардиомиоцитима третираним ЦоЦл2 (слика 5ц). Прекомерна експресија миР-182 драматично је смањила експресију протеина Ного-Ц у кардиомиоцитима (слике 5д и е). Поред тога, миР-182 је смањио ного-Ц3'-УТР луциферазну репортерску активност (слика 5ф), што даље потврђује да је Ного-Ц циљни ген миРНА-182.

Image

миР-182 регулише експресију Ного-Ц. ( а ) Анализа Ного-Ц 3'УТР региона који предвиђа миР-182 као регулатор. ПЦР подаци који показују експресију миР-182 у МИ срцима ( б ) или кардиомиоцитима третираним ЦоЦл2 ( ц ). ( д ) Експресија миР-182 у контроли и миР-182 мимично трансфицирани неонатални кардиомиоцити штакора. ( е ) Вестерн блот (лево) и просечни подаци (десно) који показују нивое ного-Ц протеина у контроли и миР-182 прекомерно експресирајући неонатални кардиомиоцити штакора. ( ф ) Репортерска активност луциферазе пацова Ного-Ц3 'УТР у ћелијама трансфектованим миРНА 182 мимиком или кодирани миРНА мимиком током 48 х. ( г ) Анализа проточне цитометрије која показује апоптотичке стопе неонаталних кардиомиоцита штакора трансфицираних са или без миР-182 мимике као одговор на стимулацију ЦоЦл 2 (600 µМ ) или прекомерну експресију Ного-Ц. н = 6 независних експеримената. * П <0, 05 у односу на контролне ћелије. # П <0, 05 насупрот ЦоЦл2 или Ного-Ц ћелијама прекомерне експресије

Слика пуне величине

Да би се тестирало да ли миР-182 има улогу у апоптози изазваној ного-Ц кардиомиоцитима, кардиомиоцити су кофефицирани миР-182 и Ад-Ного-Ц, или трансфицирани миР-182 у присуству ЦоЦл2. Иако прекомерна експресија Ного-Ц или лечење кардиомиоцитне апоптозе изазване ЦоЦл2, прекомерна експресија миР-182 заштићених ћелија било од ного-Ц или ЦоЦл2-индуковане апоптозе, како је тестирано проточном цитометријом (Слика 5г). Наши резултати заједно показују да миР-182 има важну улогу у срчаним болестима везаним за хипоксију негативно регулирајући експресију Ного-Ц.

Дискусија

Ного породични протеини су дубоко укључени у више ћелијских процеса. Поред добро проучених функција нервног система, наша данашња студија открила је да је Ного-Ц детерминантан играч у апоптози повезаној са исхемијом, кардиомиоцита током МИ. Постоји неколико линија које подржавају наше представе. Прво, ного-Ц протеин се повећава у МИ срцу и у хипоксичним стимулусима изазваним апоптотским кардиомиоцитима. Друго, прекомерна експресија Ного-Ц сама по себи је довољна да индукује апоптозу кардиомиоцита, док оборење Ного-Ц спречава хипоксију изазвану апоптозу. Треће, ин виво нокаут ного-Ц (Ного-Ц - / - ) сачувао је срчану функцију и заштитио кардиомиоците од апоптозе након МИ. Најзад, идентификовали смо да је Ного-Ц циљни ген миР-182, који је негативно регулисао Ного-Ц и регулисан током МИ.

Апоптоза је важно својство које води до срчане дисфункције након МИ и исхемијских болести срца. 24, 25 Дакле, истраживање молекуларних механизама на којима стоји апоптоза је корисно за боље разумевање МИ, па чак и за обезбеђивање терапијских циљева за лечење МИ. У нашем тренутном истраживању открили смо да су и ниво мРНА и протеина Ного-Ц у МИ регулисани у срцу МИ, а протеин Ного-Ц углавном се повећавао у пограничном подручју инфарктске зоне где се већина апоптотичких ћелија обогатила, што сугерише могућу улогу ного- Ц у патогеном процесу апоптозе кардиомиоцита. Заиста, прекомерна експресија Ного-Ц у кардиомиоцитима узроковала је ћелијску апоптозу, а оборење ного-Ц инхибирало апоптозу изазвану хипоксијом. Наши налази да Ного-Ц регулише ћелијску апоптозу у срцу су у општем сагласју са налазима Ного-А, једне од спојних изоформа Ного-Ц, у кардиомиоцитима. 23 Иако је изразито изражен у централном нервном систему, за Ного-А се такође наводи да је регулисан у људским срцима дилатиране кардиомиопатије и неонаталних кардиомиоцита штакора подвргнутих хипоксији / реперфузији и обарању ного-А инхибиране хипоксије / реперфузије изазване апоптозе кардиомиоцита индукованом инхибицијом пута ћелијске смрти повезаних са митохондријом, накупљања РОС-а и дијастоличке абнормалности калцијума. 23 Структурно, Ного-Ц дели трансмембрански домен и Ц-терминални домен са Ного-А, док недостаје Н-терминални домен који садржи протеин Ного-А. 26, 27 Дакле, могуће је да заједнички домени који деле два Ного протеина доприносе апоптотичким ефектима, једнаким инхибиторним ефектима регенерације у нервном систему. 18 Међутим, тачни молекуларни механизми апоптозе изазване ного-Ц кардиомиоцитима требају додатно истраживање.

Наши горњи резултати о претходним студијама Ного-Ц и других о Ного-А указују да повећани Ного протеини током МИ или исхемијских болести срца могу допринети срчаном дисфункционисању регулисањем апоптозе кардиомиоцита. Да бисмо боље разумели патофизиолошки значај Ного-Ц у срцу, генерисали смо Ного-Ц нокаут модел миша, први ного-Ц нокаут модел по нашем сазнању. Наше функционално истраживање ин виво на нуго мишевима Ного-Ц пружа чврсте доказе који потврђују нашу хипотезу да је исцрпљивање ного-Ц заштићене апоптозе кардиомиоцита у срцу МИ, у великој мери смањено ИР, и што је најважније, очувана срчана функција после повреде МИ, што сугерише да Ного- Ц може служити као терапеутски циљ за лечење МИ или срчаних болести повезаних са исхемијом. Наша данашња студија о заштитном дејству Ного-Ц нокаута у срцу је у сагласности са Ного-А нокаут моделом миша. 23 Иако је ного-Ц нокаутом заштитио срце од оштећења МИ, није показао срчани фенотип на базалном нивоу, што сугерише да је Ного-Ц или неопходан за нормалне функције или да у суду постоје сувишни путеви. Наши прелиминарни подаци открили су да су нивои мРНА код друга два члана Ного породице, Ного-А и Ного-Б, повишени у мишјим срцима Ного-Ц, што сугерише да повишени Ного протеини могу бар делимично пружити компензациону функцију у Ного-Ц КО срцима . У том погледу, заштитни ефекат ного-Ц нокаута независног од компензаторно повећаног Ного-А сугерира да Ного-Ц и Ного-А могу различито регулисати апоптозу кардиомиоцита. Заправо, апогоза индукована ного-А кардиомиоцитима путем митохондрија зависног пута 23, док Ного-Ц није имао утицаја на митохондрије (подаци нису приказани).

МикроРНА (миРНА) имају пресудну улогу у патогенези различитих срчаних болести, укључујући МИ, пост-инфарктну фиброзу и затајење срца. 28, 29, 30, 31, 32, 33 У мишјим и људским срцима профил експресије миРНА у пограничној зони инфарктног подручја измењен је након МИ и током накнадне фиброзе срца. 32 Смањена регулација миРНА, посебно породица миР-29, де-потиснула је своје циљне гене, који кодирају протеине повезане са фиброзом, изазивајући пост-инфарктну фиброзу и срчану дисфункцију. 34 У тренутној студији, предвидјели смо, према 3'УТР региону Ного-Ц, да је Ного-Ц циљни ген миР-182. Ин витро експресија миР-182 смањује ниво протеина Ного-Ц и ного-Ц 3'-УТР луцифераразну репортерску активност, потврђујући наше предвиђање да миР-182 негативно регулише експресију Ного-Ц. Штавише, експресија миР-182 је смањена у граничној зони инфарктног срца и у хипоксичним кардиомиоцитима, што сугерише да миР-182 може бити укључен у патолошке процесе МИ и исхемијске болести срца. Извештава се да МиР-182 учествује у регулацији више физиолошких и патолошких процеса, укључујући развој и дегенерацију ретине, 35, 36 карцинома, 37, 38, 39, 40 упале, 41, 42 и хипертрофију срца. 43 Супротно томе, миР-182 је показао супресијску функцију тумора код неких врста карцинома, као што је глиобластома, 44 док је онгогену функцију имао код других врста рака, као што је аденокарцином плућа. 45 У нашем истраживању открили смо да миР-182 штити кардиомиоците од Ного-Ц и апоптозе изазване хипоксијом. Нејасно је зашто миР-182 различито функционише на раст ћелије или апоптозу код карцинома или у срцу, а ткивни специфични ефекти могу бити могући разлог ове разлике. Међутим, како је миР-182 регулисан током МИ и исхемијског срца још није јасно и заслужује даља испитивања.

Укратко, наша садашња студија је открила да је ного-Ц протеин био регулисан у МИ срцу и хипоксичним кардиомиоцитима, повећана апогоза индукована Ного-Ц и утишавање Ного-Ц заштићених кардиомиоцита од апоптозе изазване хипоксијом. Нокаут ного-Ц заштитио је срце од повреде МИ и очувао рад срца. Надаље, идентификовали смо да је миР-182 негативни регулатор Ного-Ц, а смањивање миР-182 може допринети повећању ного-Ц и срчане дисфункције током МИ. Наши налази откривају критичну улогу Ного-Ц у срцу и тако бацају ново светло на развој терапијских циљева за срчане болести повезане са исхемијом.

Материјали и методе

МИ миш модел

Све поступке са животињама одобрио је Институционални одбор за бригу и употребу животиња Пекиншког здравственог научног центра. МИ модел модела је успостављен са мушким мишевима Ц57БЛ / 6 у доби од 8-12 недеља, како је раније описано. 46 Мишевима је анестезирана интраперитонеална ињекција пентобарбитал натријума (60 мг / кг). Откривен је четврти интеркостални простор преко левог грудног коша и срце је нагло истиснуто из торакалног простора, а ЛАД испод врха леве преткоморе повезан је са 6 стерилним свиленим шавом. Лажни субјекти су подвргнути истој операцији, осим што ЛАД није био лигиран. Двадесет и четири сата након операције, ехокардиографија је обављена Вево 710 РМВ-707Б (ВисуалСоницс, Торонто, Онтарио, Канада), а срца су сакупљена и припремљена за експерименте.

Генерација Ного-Ц нокаут модела миша

Ного-Ц нокаут мишеви (Ного-Ц - / - ) су генерисани техником ТАЛЕН у позадини Ц57БЛ / 6. Укратко, 8 базних парова егсона 1ц гена Ного, специфични егзон за Ного-Ц, исечен је да индукује мутацију померања оквира, што резултира скраћеним протеином, који може бити подложан распаду који нема смисла. Избацивање Ного-Ц потврђено је Вестерн блотом и секвенцирањем гена.

Имунохистохемијска анализа обојења

Узорци срца су фиксирани са 4% параформалдехидом и утиснути парафинским воском. Одсеци су натопљени у 3% Х202 да би се очистила ендогена пероксидаза и микроталовали у пуферу натријум-цитрата (1 мМ, пХ 6). Клизачи су блокирани у 1% БСА током 30 минута на 37 ° Ц, а затим су испитивани са анти-Ного-Ц антителом (1: 100) преко ноћи на 4 ° Ц и секундарним антителом коњугиране пераксидазом из хрена на 37 ° Ц током 30 минута .

Изолација и култура неонаталних кардиомиоцита пацова

Неонатални кардиомиоцити штакора су изоловани и узгојени као што је претходно описано. 22 Укратко, вентрикули штакорки Спрагуе-Давлеи постнатално 1 до 2 дана су дигестирани у раствор ХБСС (КЦл 0, 4 г / л, КХ 2 ПО 4 0, 06 г / л, НаХЦО 3 0, 35 г / л, НаЦл: 8 г / л, На 2 ХПО 4 12Х 2О 0, 12 г / л, глукоза 1 г / л, пХ 7, 4) који садржи 0, 1% трипсина (Инвитроген, Царлсбад, ЦА, САД) и 0, 05% колагеназе типа ИИ (Вортхингтон, Лакевоод, ЦО, САД). Ћелије су припремљене током 2 сата и супернатант који садржи пречишћене кардиомиоците је сакупљен и поново посађен и узгојен током 48–72 х пре трансфекције аденовируса.

Изградња аденовируса

ЦДНА пуне дужине Ного-Ц је појачана ПЦР примерима: 5′-ЦАЦЦАТГГАЦГ ГАЦАГААГАААЦА-3 ′ (напред) и 5′-ТЦААТЦТГЦТТТГЦГЦТТЦААТЦЦ-3 ′ (обрнуто), појачани производ је затим убачен у пЕНТР / ТЕВ / Д-ТОПО вектор (Инвитроген). Новоизграђени производ је рекомбинован са пАд / ЦМВ / В5-ДЕСТ вектором (Инвитроген). Циљна секвенца за Ного-Ц-схРНА била је 5'-ГГЦАГАТЦГТГГЦААГАААА-3 '. Секвенца Ного-Ц-схРНА је убачена у вектор пЕНТР ТМ / У6 и затим је комбинована са пБЛОЦК-иТ ТМ 6-ДЕСТ вектором. Аденовирус је произведен Аденовирусним системом експресије (Инвитроген) и пречишћен коришћењем Вивапуре АденоПАЦК20РТ Кит (Сарториус, Готтинген, Немачка).

Иммуноблоттинг

Протеин је екстрахован из миокарда миша или изолованих кардиомиоцита помоћу Ротх лизијског пуфера (ХЕПЕС 50 мМ, НаЦл 150 мМ, ЕДТА 5 мМ, ЕГТА 5 мМ, НаФ 20 мМ, Тритон Кс-100 1%, пХ 7.4) са додатком 100Кс коктела инхибитора протеазе (Сигма, Санта Клара, Калифорнија, САД). Укупно 40–100 уг протеина је затим раздвојено помоћу СДС-ПАГЕ и пренето у ПВДФ мембране. Мембране су испитиване са назначеним примарним антителом (Ного-Ц или α -тубулин), а затим су инкубиране са секундарним антителом (ИгГ коњугираним пероксидазом хрен-ИгГ из ЗСГБ-БИО, Пекинг, Кина). Имуноблоти су процењени коришћењем Цхеми Доц КСРС + инструмента (Био-РАД, Херцулес, ЦА, САД).

МиРНА тест

Тест микроРНА откривен је помоћу прајмера матичне петље купљеног од компаније Рибобио (Гуангзхоу РибоБио, Гуангзхоу, Кина). У6 мале нуклеоларне РНА (Гуангзхоу РибоБио) коришћена је за нормализацију. Секвенца рно-мир-182 је 5'-АЦГЦГГГУЦУАГЦУГЦЦГГАГГЦЦУЦЦЦАЦЦГУУУУУГГЦААУГГУАГААЦУЦАЦАЦАЦЦГГУА-3 '. Мимици Рно-мир-182 (Гуангзхоу РибоБио) трансфицирани су на неонаталне кардиомиоците пацова Липофектамином 3000 (Инвитроген).

Двоструки тест луциферазе

Нго-Ц3'-УТР секвенце су умножене ПЦР примерима: 5′-ГЦГЦТЦГАГААААГЦ ЦЦЦАААЦАГААГТ-3 ′ (напред) и 5′-ААТГЦГГЦЦГЦАААЦАЦТАААЦАЦАААЦАТ-3 ′ (обрнуто). ПЦР производи су затим конструисани у пмиР-РБ-РЕПОРТ плазмид (Гуангзхоу РибоБио) који садржи два извештача, ренила луциферазу (хРлуц) за процену експресије и луциферазу лептира (хлуц) као интерну контролу за корелацију количине. Хела ћелије су трансфектиране са 100 нг Ного-Ц 3'УТР репортер плазмидом и 2 μг рно-миР-182 мимичним или празним вектором. Ћелије су сакупљене 48 сати након трансфекције и анализиране коришћењем система дуалног луциферазе за испитивање репортера (Промега, Мадисон, ВИ, УСА). Активност луциферазе испитана је луминометром Веритас (Турнер БиоСистемс, Суннивале, Калифорнија, УСА). Активност ренилла луциферазе сваког узорка нормализована је на активност луциферазе кријесница.

Анализа ћелијске смрти помоћу ТУНЕЛ бојења и проточне цитометрије

Ћелијска апоптоза одређена је тестом ТУНЕЛ (терминална деоксирибонуклеотидил-трансфераза (ТДТ) посредована дУТП-дигокигенин ницк енд) коришћењем ин ситу ћелије за детекцију смрти (Роцхе, Индианаполис, ИН, САД), или помоћу анексија В / пропидијум коњугованог са флуоресцеин-изотиоцијанатом. јодидна двострука бојна проточна цитометрија коришћењем прибора за детекцију апоптозе Аннекин-В-ФИТЦ (Дојиндо Лабораториес, Кумамото-кен, Јапан).

Анализа трансмисионе електронске микроскопије

Срца су фиксирана са 2% глутаралдехидин натријум-какодилатним пуфером (0, 1 М, пХ 7, 2) на 4 ° Ц преко ноћи и накнадно фиксирана 1 сат у 1% осмиумтетроксиду. Дигиталне слике су набављене системом електронског микроскопа високог контраста ЈЕМ-1230 и системом меког снимања (ЈЕОЛ, Токио, Јапан).

ТТЦ бојење

Мишеви су убијени анестетиком 24 сата након операције МИ. Срца су замрзнута на -20 ° Ц током 20 минута, а затим су одсечена у кришке дебљине 5 мм. Пет непрекидних кришки од врха до места оклузије инкубирано је у трифенилтетразолијум хлориду (ТТЦ) на 37 ° Ц током 5 минута. После фиксације са 4% параформалдехида преко ноћи, свака кришка је извагана ( в ) и сликана дигиталним фотоапаратом. Подручја инфаркта означена су као подручје које није обојено ТТЦ-ом. Пхотосхоп је оценио ИР и леве коморе (ЛВ). Проценат инфарктске површине израчунат је као ИР / ЛВ = (∑ИР (по кришки ) × в (по кришки ) ) / (∑ЛВ (по кришки ) × в (по кришки) ).

ЛДХ тест

Крв из једне милилитерне вене је сакупљена из десне коморе са шприцом и потом центрифугирана на 3000 о / мин током 15 мин, 4 ° Ц. Узорци серума послати су у клиничку лабораторију Треће болнице на Пекинг универзитету на анализе нивоа ЛДХ.

Статистичка анализа

Подаци су представљени као средња вредност ± СЕМ Статистичка значајност разлика између група анализирана је непарним т- тестом или једносмерном АНОВА праћеном СНК-ом (Студент-Невман-Кеулс) када су упоређене више од две групе. П <0, 05 се сматра статистички значајним.

Речник

МИ

инфаркт миокарда

РОС

реактивне врсте кисеоника

3′УТР

3 'непреведена региона

ТУНЕЛ

терминално деоксирибонуклеотидил-трансфераза (ТДТ) посредовано дУТП-дигокигенин ницк енд означавање

АВ

анексин В

ТТЦ

трифенилтетразолијум хлорид

ИР

инфарктна величина

ЛВ

лева клијетка

ЛАД

лактат дехидрогеназе

схРНА

РНА кратка шишка

миРНА

микроРНА

ЛВИД

унутрашњи пречник леве коморе

ЛВПВ

дебљина задњег зида леве коморе

ЕФ

лом при избацивању

ФАЦ

фракциона промена подручја

ХВ / БВ

однос тежине срца и телесне тежине

ХВ / ТЛ

однос дужине и тежине срца на голеници

ОН

хематоксилин / еозин