Нови естроген-индуцирани ген еиг121 регулише аутофагију и подстиче опстанак ћелија под стресом | ћелијска смрт и болест

Нови естроген-индуцирани ген еиг121 регулише аутофагију и подстиче опстанак ћелија под стресом | ћелијска смрт и болест

Anonim

Субјекти

  • Аутопхаги
  • Канцер ендометријума
  • Регулација гена
  • Лизосоми

Апстрактан

Раније смо идентификовали нови геном индуковани естрогеном, ЕИГ121 , као различито регулисан у ендометриоидном и недендометриоидном карциному ендометрија. Функција ЕИГ121 није била позната. Помоћу система индуцираног тетрациклином открили смо да прекомерна експресија ЕИГ121, али не и ЛацЗ, узрокује дубоку супресију раста ћелије. Субцелуларна фракционација и имунофлуросцентно обележавање показали су да је ЕИГ121 трансмембрански протеин локализован у одељцима ендосома и лизосома у касној плазма мембрани. Брисање доминираног трансмембранског домена укинуло је мембранско повезивање. У ћелијама које прекомерно изражавају ЕИГ121, цитоплазматске вакуоле акумулиране након индукције ЕИГ121, а аутофагосомски маркер ЛЦ3 премештен у тачне, тачкасте структуре. Електронска микроскопија открила је да се у ћелијама прекомерно експримирајућим ЕИГ121 значајно повећавају аутофагосоми. Прекомерна експресија ЕИГ121 такође је повећала ћелије које садрже киселе везикуле и изазвала лизосомалну деградацију дуговечних протеина. У МЦФ-7 ћелијама, и ЕИГ121 и ЛЦ3 су брзо разградили лизосомални механизам после гладовања. Припадање ЕИГ121 блокирано је деградацијом ЛЦ3 изазвано гладовањем. Сама по себи, обустава ЕИГ121 није утицала на опстанак ћелија. У комбинацији са гладовањем или цитотоксичним агенсима, обустава ЕИГ121 увелике је повећала апоптозу. Наши резултати сугерирају да је ЕИГ121 повезан са одјељцима ендосом-лизосом и да може имати важну улогу у аутофагији. Под неповољним условима, као што су гладовање и изложеност цитотоксичним агенсима, ЕИГ121 може заштитити ћелије од ћелијске смрти урегулирањем путање аутофагије.

Главни

Користећи технологију скрининга за микрореду цДНА, раније смо пријавили идентификацију новог гена изазваног естрогеном ЕИГ121. 1 ЕИГ121 је прекомерно изражен код хиперплазије ендометрија и карцинома ендометриоидног типа, две патолошке пролиферације ендометрија повезане са неприлагођеном изложеношћу естрогену. Супротно томе, ЕИГ121 је био дубоко потиснут у папиларни серозни карцином матернице (УПСЦ) и малигни мешовити муллеријански тумор (МММТ), недендометриоидни карцином ендометрија који су у великој мери неовисни о изложености естрогену и повезани са неповољним клиничким исходима. У складу са нашим запажањима, неке недавне студије профилирања гена карцинома ендометрија такође су откриле да ЕИГ121 (КИАА1324) показује највећу разлику у нивоима експресије гена између ендометриоидног карцинома и УПСЦ и МММТ. 2 Ови интригантни налази сугерирали су нам да ЕИГ121 може имати врло различите улоге у развоју карцинома ендометроида у раном стадијуму у поређењу с напредовањем напреднијих карцинома ендометриоида или нондометриоида.

Ћелијска функција ЕИГ121 је потпуно непозната, што ефикасно истраживање његове улоге у раку чини непрактичним. Помоћу БЛАСТ претраге, хумани ЕИГ121 ген мапиран је на хромозом 1п13.1. Интригантно је да се његов израз током еволуције веома очувао код врста. Људски протеини и протеини глодара су 90% идентични. Секвенца за сисар ЕИГ121 је врло слична редоследу гена непознате функције код Ц. елеганс, Ксенопус , риба и пилетина. Таква хомологија међу врстама сугерише да ЕИГ121 има важну ћелијску функцију. Стога смо користили стратегије прекомерне експресије и РНАи да проучимо улогу ЕИГ121 у ћелијској смрти и расту. На наше изненађење, ЕИГ121 прекомерна експресија сузбила је раст ћелија и индуцирала аутофагију, деградативни и рециклирајући механизам за уклањање и промет главних цитоплазматских компоненти. Користећи ЕИГ121 сиРНА, показали смо да аутофагија изазвана ЕИГ121 потиче опстанак ћелија након лишавања хранљивих састојака и изложености цитотоксичним хемотерапијским средствима.

Резултати

Прекомерна експресија ЕИГ121 доводи до инхибиције раста ћелије и апоптозе

Раније смо приметили да је ЕИГ121 високо повишен у карциному ендометриоидног типа. Међутим, наша настојања да прекомерно изразимо ЕИГ121 конститутивно у Исхикава (ћелијској линији ендометријског карцинома), ћелијама 293Т и НИХ3Т3 нису успели, док прекомерна експресија ЛацЗ-а у истој краљежници плазмида није узроковала потешкоће. Ово нам је указало да високи нивои ЕИГ121 могу бити токсични за ћелије. Стога смо прешли на систем који индуцира тетрациклином и изоловали клонове Т-Рек-293-ЕИГ121 ћелија који изражавају ЕИГ121 на различитим нивоима. Прекомерна експресија ЕИГ121 значајно је инхибирала раст ћелија, а степен инхибиције зависио је од нивоа експресије ЕИГ121 (Слика 1а). У клону А, који изражава највише нивое ЕИГ121, број ћелија је смањен за преко 75% у поређењу са ћелијама које не изражавају ЕИГ121.

Image

Прекомерна експресија ЕИГ121 доводи до инхибиције раста и апоптозе. ( а ) Одабране су ћелије Т-Рек-293 које изражавају ЕИГ121 на различитим нивоима као одговор на лечење тетрациклином. У горњем панелу, клонови А, У и Кс, који изражавају високе, средње и скромне нивое ЕИГ121, поплочани су у четвороструком у плоче са шест јажица и инкубирани током или 48 х или без тетрациклина. Затим су ћелије биле трипсинизиране и бројане. Имајте на уму да је филм прекомерно изложен да би се показао сигнал ЕИГ121 за клон Кс. ( б ) Т-Рек-293-ЕИГ121 клон У или Т-Рек-293-ЛацЗ ћелије су посејане у трипликатима и додат је тетрациклин 0 или 24 х. Профил репрезентативне проточне цитометрије представља бојење аннекин-В ФИТЦ-ом у к оси и ПИ у оси и. Комбиновани проценат ћелија у доњем десном квадранту (рана апоптоза) и горњем десном квадранту (касна апоптоза) представља апоптотске ћелије, а горњи леви квадрант представља мртве ћелије. На хистограмима је приказано средство ± СД трипликата; * означава значај при П <0, 05 у односу на ћелије без индукције тетрациклина, док ** означава значај на П <0, 01

Слика пуне величине

Да бисмо одредили механизам одговоран за посматрани губитак ћелија изазван експресијом ЕИГ121, испитивали смо ефекте прекомерне експресије ЕИГ121 или ЛацЗ на апоптозу проточном цитометријом анализа ћелија обојених са анексином В. Као што је приказано на слици 1б, чак и средњи ниво експресије ЕИГ121 значајно је повећао проценат апоптотских ћелија, док прекомерна експресија ЛацЗ није утицала на апоптозу.

Смрт некротичне ћелије измерена активношћу лактатне дехидрогеназе (ЛДХ) која се ослобађа у медијум није повећана у ћелијама прекомерно експримирајућим ЕИГ121 (подаци нису приказани).

ЕИГ121 је трансмембрански протеин повезан са плазма мембраном и транс -Голги / касни ендосом – лизосом

Да бисмо стекли увид у механизме који стоје на основу својстава инхибиције раста и својстава која потичу апоптозу ЕИГ121, прво смо проучавали његову ћелијску локализацију. Софтвер за биоинформатику предвиђао је да ЕИГ121 има претпостављени трансмембрански домен између аминокиселинских остатака 911 и 931. Користећи поликлонално антитело против краја ЕИГ121 Ц, утврдили смо да је у ћелијама МЦФ-7 ЕИГ121 углавном локализован у плазма мембрани и цитоплазми. перинуклеарно подручје, са цитоплазматском локализацијом, типично поларизованом на једну страну језгре (слика 2а). У неким ћелијама чини се да је ЕИГ121 такође повезан са цитоскелетним влакнима. Субцелуларна фракционација употребом лизата из ћелија МЦФ-7, која изражавају релативно висок ниво ендогеног ЕИГ121, показала је да се ЕИГ121 обогатио у екстракту мембране, али не и у нуклеарном екстракту или цитосолу (слика 2б). Мутантни протеин за делецију трансмембранског домена (ЕИГ121ΔТМ) налазио се углавном у цитосолу (слика 2б) и медијуму ћелијске културе (није приказан), док је дивљи тип ЕИГ121 и мутант са делецијом у домену доменовог рецептора манносе-6-фосфата (ЕИГ121ΔМ6ПР ) још увек су обогаћени у припреми мембране (није приказано).

Image

ЕИГ121 је трансмембрански протеин повезан са плазма мембраном и ендомембранама. ( а ) МЦФ-7 ћелије су узгајане на покривачима и обојене са ЕИГ121 антителом. Имајте на уму бојење плазма мембране и перинуклеарну интрацелуларну локализацију ЕИГ121. ( б ) Необрађене МЦФ-7 ћелије или Исхикава ћелије које су трансфициране плазмидима који експримирају дивљи тип ЕИГ121 или мутирани ЕИГ121 без недостатног дометног трансмембранског домена (ΔТМ) су узгајани у плоче од 10 цм и припремљене су субцелијске фракције. Те фракције су затим раздвојене на СДС-ПАГЕ гелу и мембрана је испитивана разним антителима

Слика пуне величине

Експерименти са двоструким обележавањем открили су да је ЕИГ121 делимично колокализован са манносе-6-фосфатним рецепторима (М6ПР) (слике нису приказане) и ТГН38, два транс- Голги маркера и Раб 7 (касни ендосомски маркер), али не са ендоплазматским ретикулумом (каретицулин ) (слике нису приказане) и маркери митохондрије. Поред тога, ЕИГ121 је добро колокализован маркерима лизосома, укључујући ЛАМП1, катепсин Б и катепсин Д (слика 3). Ови резултати показују да је ЕИГ121 трансмембрански протеин који је повезан са одељењима плазме мембране / транс- Голги / касни ендосом – лизосом. Локализација ЕИГ121 у ћелијама Т-Рек-293-ЕИГ121 које прекомерно експримирају ЕИГ121 је слична оној ендогеног протеина ЕИГ121 у ћелијама МЦФ-7 (подаци нису приказани).

Image

ЕИГ121 се локализује у одјељцима касног ТГН-ендосома-лизосома. Двоструко имунофлуоресенцијално обележавање ендогеног ЕИГ121 (зелено), заједно са Раб7, катепсином Д, лизотракером и митотракером (црвено) у МЦФ-7 ћелијама

Слика пуне величине

ЕИГ121 индукује цитоплазматску вакуолизацију

Ћелије Т-Рек-293-ЕИГ121 и ћелије МДА-231-т-ЕИГ121 (стабилни ћелијски клонови добијени из ћелија МДА-МБ-231 да би експримирали ЕИГ121 на начин индукован тетрациклином) прекомерно експримирање ЕИГ121 садрже велике вакуоле. Цитоплазматске вакуоле акумулиране су 8 сати након ЕИГ121 индукције (није приказано). За 24 сата цела цитоплазма је растворена вакуолама (слика 4а). Иако у базалним условима ћелије МДА-МБ-231 садрже неке вакуоле, само прекомерна експресија ЕИГ121, али не и ЛацЗ, значајно повећава вакуолизацију (Слика 4а). Могуће је да вакуолизација можда није последица ЕИГ121, већ уместо артефакта прекомерне експресије. Да искључимо ову могућност, трансфицирали смо ћелије експресивним векторима ЕИГ121, ЕИГ121ΔТМ, ЕИГ121ΔМ6ПР и ЛацЗ. Како сви ови конструкти садрже В5 епи-ознаку на њиховим Ц-термининима, примењивали смо В5 антитело на трансфициране ћелије да бисмо приказали нивое експресије егзогених протеина. Иако су све ћелије експримирале В5-фузијске протеине, само експресија ЕИГ121 и ЕИГ121ΔМ6ПР дивљег типа, али не и ЕИГ121ΔТМ и ЛацЗ, индуцирана је вакуолизацијом (Слика 4б).

Image

Прекомерна експресија дивљег типа ЕИГ121, али не и ЕИГ121ΔТМ и ЛацЗ, индукује цитоплазматску вакуолацију. ( а ) Т-Рек-293-ЕИГ121 клоне А ћелије, МДА-231-т-ЕИГ121 или МДА-231-т-ЛацЗ ћелије узгајане су на покривачима, а тетрациклин је додат 0 или 26 х. Ћелије су затим фиксиране и обојене Х&Е. ( б ) Плазмиди који експримирају дивљи тип ЕИГ121-В5, ЕИГ121ΔТМ-В5, ЕИГ121ΔМ6ПР-В5 или ЛацЗ-В5 фузиони протеини су трансфицирани у ћелије Исхикава Х, а 48 сати касније ћелије су фиксиране и обојене коришћењем антитела против В5

Слика пуне величине

ЕИГ121 индукује стварање аутофагосома

Аутофагија је високо очувани процес у којем се оштећени или вишак органела и протеинских агрегата секвестришу у везикуле са двоструком мембраном и испоручују лизосомима на разградњу и рециклирање. Аутофагија има важну улогу у промоцији преживљавања током ускраћивања хранљивих материја, регулисању ћелијског ремоделирања током развоја и диференцијације, спречавању неуродегенерације и одређивању животног века. 3, 4 Будући да је цитоплазматска вакуолација знак аутофагије, а ЕИГ121 је изражен у лизосомима у којима је садржај аутофагосома деградиран, поставили смо хипотезу да ЕИГ121 прекомерна експресија изазива аутофагију. Електронском микроскопијом ћелије које су прекомерно експримирале ЕИГ121 имале су обилне двоструке или више-мембранске везивне структуре које садрже препознатљиве ћелијске органеле и супстанце које су електронски густе карактеристичне за аутофагосоме и аутолизосоме (слика 5а). У ћелијама индукованим да експримирају ЛацЗ или нису индуковане тетрациклином, детектовано је мало аутофагосома (подаци нису приказани).

Image

Прекомерна експресија ЕИГ121 индукује стварање аутофагсосома и транслокацију аутофагосомског маркера ЛЦ3 у везикуле сличне тачкицама. ( а ) Т-Рек-293-ЕИГ121 или Т-Рек-293-ЛацЗ ћелије су се инкубирали 24 сата са или без тетрациклина, фиксирали, а затим прегледали електронском микроскопијом. Имајте на уму да су на горњим панелима лако откривени аутофагоми (стрелице), док је у ћелијама које не изражавају ЕИГ121 (доњи панели) формирано неколико аутофагосома. ( б ) Ћелије клона А Т-Рек-293-ЕИГ121 узгајане су на покривачима, а тетрациклин је додат у половину лежишта током 24 сата. Ћелије су затим фиксиране и обојене коришћењем антитела против ЛЦ3

Слика пуне величине

Индукција аутофагије повезана је са коњугацијом фосфатидилетаноламина (ПЕ) у лаки протеин-ланац ланца 3-ЛЦ (ЛЦ3). Коњугирани ЛЦ3 прелази у аутофагосоме и чврсто се веже на мембрану аутофагосома. 5 Према томе, ЛЦ3 транслокација је поуздан биомаркер аутофагије. 6, 7 У ћелијама које не изражавају ЕИГ121, ЛЦ3 је био равномерно распоређен у цитоплазми, док је у ћелијама индукованим да експримирају ЕИГ121, ЛЦ3 експресија се одвијала претежно у пунктуирајућим тачкастама структурама, у складу са индукцијом аутофагије (Слика 5б).

ЕИГ121 појачава лизосомску разградњу дуговечних протеина

Да бисмо квантификовали обим аутофагије изазване ЕИГ121, измерили смо развој киселих органела везикула коришћењем акридин наранчастог бојења, праћено проточном цитометријом. Као и код других ацидотропних боја, црвена флуоресценција настала акридин наранчастим бојењем представља само аутофагосоме и лизосоме каснијег ступња; 7 према томе, бојење акридином наранђом подцењује обим аутофагије. Ипак, у поређењу са контролом без тетрациклина или ћелијама које прекомерно изражавају ЛацЗ, прекомерна експресија ЕИГ121 увелике је повећала проценат ћелија које су флуоресцедирале. Прекомерна експресија ЕИГ121 током 24 сата повећала је ћелије које садрже киселе органеле за 40%, док је 48 сати након експресије ЕИГ121 број ћелија које садрже киселе органеле порастао 2, 5 пута (Слика 6а). Контроле које прекомерно изражавају ЛацЗ нису показале пораст акридинских наранчасто-позитивних киселих органела (Слика 6б).

Image

Прекомерна експресија ЕИГ121 повећава киселе везикуле и разградњу дуговечних протеина. Т-Рек-293-ЕИГ121 клоне А ћелије ( а ) или Т-Рек-293-ЛацЗ ћелије ( б ) узгајане су у плочама са шест јажица и инкубиране су без или са тетрациклином 24 или 48 х. Ћелије су затим инкубиране у медијуму који садржи акридин наранџасте боје и прикупљени је помоћу трипсинизације за анализу проточне цитометрије. Нацртане су кратке повећања ћелија које садрже киселе везикуле органеле. ( ц ) Ћелије клона А Т-Рек-293-ЕИГ121 узгајане су у плочама са 12 јажица и инкубиране су у присуству или одсуству трациклина током 8 или 24 х. Затим су ћелије обележене у медијуму који садржи 14 Ц-валина и гањани су прво током 3 сата да би се испразнили краткотрајни протеини, а затим још 16 х. Деградација дуговечних протеина представљена је радиоактивношћу која се ослобађа у медијуму током последњих 16 х (однос ТЦА растворљиве радиоактивности и укупне ћелијске радиоактивности). Свака група је садржавала пет реплика, а приказани подаци (средња вредност ± СЕМ) репрезентативни су за три независна експеримента

Слика пуне величине

Пошто се садржај аутофагосома на крају разграђује помоћу киселих ензима унутар лизосома, затим смо испитивали да ли прекомерна експресија ЕИГ121 утиче на разградњу лизосомалног протеина. Т-РекЕИГ121 ћелије су индуковане да експримирају ЕИГ121, а затим су ћелијски протеини обележени са 14 ° Ц током 24 сата, након чега је уследила 3 ​​сата и преко ноћи јурњава. Током почетне 3-сатне потраге, краткотрајни протеини су разграђени углавном протеосомским механизмом, а средина која садржи радиоактивност је одбачена. Дуговечни протеини углавном су разграђивани лизосомалним ензимима током ноћи преко ноћи. Након што су излучени протеини и ћелијске крхотине уклоњени таложењем трихлороцетне киселине (ТЦА) из медијума ћелијске културе, радиоактивност која остаје у медијуму требало би да одражава активност разградње протеина током периода потјере. ЕИГ121 експресија је значајно појачала активност разградње протеина ћелија (Слика 6ц). У ћелијама које су прекомерно експримирале ЕИГ121 током 8 или 24 сата, разградња дуговечних протеина значајно се повећала за 30, односно 37%.

Током аутофагије изазване гладовањем, ЕИГ121 и ЛЦ3 се транслоцирају у исте везикуле и разграђују се лизосомским механизмом

Многи протеини који су укључени у аутофагијски циклус између различитих ћелијских делова или органела и њихово обиље, такође се могу контролисати. 3 Стога смо испитали да ли је на ЕИГ121 обиље или ћелијска локализација утицала гладовање, снажни индуктор аутофагије. Током аутофагије, аутофагосомски маркер ЛЦ3 се коњугира са ПЕ и транслоцира у мембране аутофхагосома и у мањем обиму аутолисосома. Након што су аутофагосоми спојени са лизосомима, ЛЦ3 на интра-аутофхагосомалној мембрани се брзо разграђује лизосомалним протеазама, те се због тога количина ЛЦ3-И и ЛЦ3-ИИ у одређеним временским тачкама после гладовања може повећати или смањити, у зависности од различите ћелије контексти и дужина гладовања. 8, 9 Због динамичких промена ЛЦ3 током аутофагије, ЛЦ3 се користи као сурогат маркер за аутофагију. Стога смо такође испитали промене ендогеног ЛЦ3 после гладовања у овим ћелијама. Као што је приказано на слици 7а, у року од 30 минута од глади, ниво ЕИГ121 и ЛЦ3 смањен је за 70%. Након 2 сата гладовања, ЛЦ3-И (некоњугирани облик) и ЛЦ3-ИИ (ПЕ-коњугирани облик) готово су потпуно нестали, док је смањење ЕИГ121 успорило након почетних 30 минута гладовања и никада није било потпуно потпуни губитак ЛЦ3. Како је смањење протеина ЕИГ121 и ЛЦ3 настало брзо након гладовања, њихово смањење ће вероватно бити последица разградње протеина. Да бисмо разликовали два главна механизма разградње протеина, затим смо изгладнили МЦФ-7 ћелије и третирали их бафиломицином А1 (БафА1), средством које подиже лизосомални пХ и инхибира лизосомалну фузију и протеосомалним инхибитором МГ132. БафА1 је потпуно блокирао деградацију ЕИГ121 и ЛЦ3 изазване гладовањем, док је МГ132 имао мали ефекат, што сугерише да су ЕИГ121 и ЛЦ3 деградирали лизосомални механизам током гладовања (слика 7б).

Image

Након гладовања, ЕИГ121 и ЛЦ3 колокализују и обојица се разграђују лизосомалним механизмом. ( а ) МЦФ-7 ћелије су страдале у ХБСС током 0, 0, 5, 1, 2 и 4 х. Имајте на уму брзу деградацију ЕИГ121 и ЛЦ3-И и ЛЦ3-ИИ при гладовању. Овај експеримент је спроведен два пута и сваки пут са свим групама за лечење у дупликату. ( б ) Деградација ЕИГ121 и ЛЦ3 изазвана гладовањем блокира лизосомални инхибитор БафА1. МЦФ-7 ћелије су претходно третиране или са БафА1 (100 нМ) или МГ132 (10 μМ) током 30 мин, пре него што су изгладњеване у ХБСС током 2 сата у континуираном присуству БафА1 или МГ132. Или 50 или 150 µг ћелијских лизата је разрешено СДС-ПАГЕ гелом и испитивано с ЕИГ121 или ЛЦ3 антитела, респективно. ( ц ) Имунофлуоресцентно бојење ЕИГ121 и ЛЦ3 у различито време након гладовања. Коришћено је зечје поликлонално антитело против ЛЦ3. Обратите пажњу на распршено везикуларно обојење ЕИГ121 након гладовања. ( д ) ЕИГ121 и ЛЦ3 двоструко обележавање МЦФ-7 ћелија култивисано у 10% ФБС или гладовано у ХБСС током 20 мин. У овом експерименту, коришћено је мишје моноклонско антитело против ЛЦ3. Стрелице означавају колокализоване везикуле ЛЦ3- и ЕИГ121

Слика пуне величине

У МЦП-7 ћелијама без трупа, ЕИГ121 се углавном локализовао на плазма мембрани и цитоплазми у перинуклеарној регији, са поларизацијом на једну страну језгре (слика 7ц). Супротно томе, 30 минута након станичног гладовања, блиставе везикуларне структуре ЕИГ121 почеле су да се шире у ћелијској цитоплазми. Након 1 сата гладовања, постале су очигледне веће везикуле на ЕИГ121, док је интензитет перинуклеарног бојања ЕИГ121 знатно смањен. У нешкодованим ћелијама МЦФ-7, ЛЦ3 је био равномерно распоређен у цитоплазми, с повременим великим, пунктатним бојењем у перинуклеарној регији (слика 7ц). Након гладовања, цитоплазматски ЛЦ3 драматично се смањио, док велико обојање пунктатом није утицало.

Резултати са слика 7а и б сугерисали су да се ЕИГ121 и ЛЦ3 сусрећу са истом судбином након гладовања, наиме, разградњом протеина посредованом лизосомом. Следеће смо утврдили да ли се ова два протеина после гладовања крећу у исте везикуле. У ту сврху је добивено различито ЛЦ3 антитело генерисано у миша (МБЛ Интернатионал Цорпоратион, Вобурн, МА, УСА). Пошто су се и ЕИГ121 и ЛЦ3 разградили након гладовања у трајању од 30 минута, проучавали смо могућу колокализацију ова два пре 30 минута. Као што је приказано на слици 7д, у нестервираним ћелијама МЦФ-7, ЕИГ121 је густо локализован у перинуклеарној области, док је ЛЦ3 равномерно распоређен у цитоплазми. После гладовања 20 минута, распршене везикуле позитивне на ЕИГ121 снажно су колокализоване са великим ЛЦ3 украшеним везикулама.

Обустава ЕИГ121 компромитује аутофагију изазвану гладовањем и сензибилизира ћелије до ћелијске смрти изазване лишавањем хранљивих састојака и изложеношћу цитотоксичним агенсима

Да бисмо утврдили да ли је ЕИГ121 потребан за аутофагију, испитали смо ефекат рушења ЕИГ121 на деградацију ЛЦ3 изазване гладовањем. Отпад ЕИГ121 резултирао је смањењем експресије протеина ЕИГ121 за око 70%, а то је повезано са компромитованом деградацијом ЛЦ3 изазване изгладњивањем, што је одређено имунофлуоресценцијом (ИФ) (слика 8а) и западним упијањем (слика 8б).

Image

ЕИГ121 кноцкдовн компромитује аутофагију изазвану гладовањем. ( а ) ЕИГ121 сиРНА блокирана деградација ЛЦ3 изазвана гладовањем. МЦФ-7 ћелије су трансфековане контролном не-циљаном сиРНА или ЕИГ121 сиРНА током 72 х, а затим гладоване у ХБСС током 2 сата. Ћелије су затим фиксиране и обојене за ЛЦ3. ( б ) МЦФ-7 ћелије су трансфициране сиРНА у дупликату и гладоване као у А, али ћелијски лизати су сакупљени и испитивани са ЛЦ3 или ЕИГ121 антителом користећи Вестерн блоттинг. Приказан је представник једног од три независна експеримента. Густина трака у односу на прву траку нестарних ћелија приказана је испод мрља. Скраћенице: не-нетрафиковане ћелије (без сиРНА); ЕИГ, ЕИГ121 сиРНА; кон, контролирајте нетР циљање сиРНА

Слика пуне величине

Аутофхагија подстиче опстанак ћелија под ускраћивањем хранљивих материја и другим стресним условима. 4, 10 Хипотетирали смо да ЕИГ121 доприноси таквим аутфагичким заштитним механизмима. Сам поништавање ЕИГ121 није утицао на опстанак ћелија (слика 9а, први ред), што показују слични обрасци бојења између контролних и ЕИГ121 сиРНА трансфицираних ћелија помоћу ТУНЕЛ теста. Након гладовања у серуму (слика 9а, средњи ред) или третмана паклитаксела (слика 9а, доњи ред), оборење ЕИГ121 увелике је повећало проценат ћелија подвргнутих апоптози. Одцепљена каспаза 3 није се открила у ћелијама МЦФ-7, али се одцепљена каспаза 7 значајно повећала у ћелијама које су биле трансфековане с ЕИГ121 сиРНА. ЕИГ121 кноцкдовн повећао је базне нивое цепане каспазе 7 у поређењу са нетрансфектираном контролом и не-циљаном сиРНА контролом (слика 9б). Губитак серума (током 48 х, траке 4–6), гладовање хранљивим материјама (траке 7–9) и третмани доксорубицином (траке 10–15) повећали су цепану каспазу 7, али пад ЕИГ121 је претерао са овим повећањем. Ови резултати указују да исцрпљивање ЕИГ121 угрожава опстанак ћелија под различитим ћелијским стресима.

Image

Одустајање од ЕИГ121 смањује виталност ћелија у условима третмана серумом или цитотоксичним лековима. ( а ) МЦФ-7 ћелије су трансфековане 48 х контролном нециљавајућом сиРНА или ЕИГ121 сиРНА и инкубиране у медијуму са 10% ФБС или медијумом без серума током 48 сати или третиране са 20 нМ паклитаксела (таксол) 16 х. Ћелије су затим фиксиране за ТУНЕЛ бојење. За сваки експеримент, апоптотске ћелије (обојене зелено) квантификоване су између тотал 2000 укупних ћелија (обојене плавом бојом), а апоптотички индекс израчунато је дељењем броја апоптотских ћелија са бројем укупних ћелија. ** означава значај на нивоу П <0, 01, у односу на контролне не-циљне сиРНА групе. ( б ) МЦФ-7 ћелије су трансфициране 48 х контролном нециљаном сиРНА или ЕИГ121 сиРНА и затим третиране како је назначено. Ћелије су пукнуте и ЕИГ121, одцепљена каспаза 7 и п- актин су испитивани коришћењем специфичних антитела. Н, нетрафиковане ћелије (без сиРНА); Е, ЕИГ121 сиРНА; Ц, контролирајте сиРНА без таргетирања

Слика пуне величине

Дискусија

У овој студији смо показали да нови ген ЕИГ121 изазван естрогеном има улогу у аутофагији и да ова функција може подстаћи опстанак ћелија под ускраћивањем хранљивих материја и другим ћелијским стресима. Субцелуларна фракционација (слика 2) и конфокална микроскопија (слика 3) показали су да је ЕИГ121 трансмембрански протеин повезан са преградама плазма мембране, транс- Голгијевом мрежом (ТГН), касним ендосомима и лизозосомима. Стога смо високо сумњали да ЕИГ121 може имати улогу у процесима трговине интрацелуларном мембраном који укључују ове органеле. Један од таквих процеса трговине људима је аутофагија. Током аутофагије, прекомерне, старе и непотребне макромолекуле, укључујући дугоживе протеине и органеле, прво се омотају двослојном мембраном да би се формирали аутофагосоми. Након тога, аутофагосоми примају лизосомске ензиме спајањем са транспортним везикулама које потичу из ТГН-а или лизосома. Коначно, заокупљени материјали се разграђују лизосомалним ензимима, а аминокиселине и други мали молекули се рециклирају. 3, 11 Бројна истраживања показују да ТГН протеини имају важну улогу у аутофагији. Бецлин-1, ПтдИнс 3-киназа и АТГ9, три протеина потребна за аутофагију, локализују се на ТГН у условима довољним за храњиве материје, али се редистрибуирају на аутофагосоме и лизосоме током аутофагије изазване гладовањем. 12, 13, 14 Раб7, протеински ендосомски протеин, је неопходан за сазревање касних аутофагосомалних вакуола. 15 Како последња фаза аутофагије укључује фузију аутофагосома са лизосомима и разградњу захваћених материјала лизосомалним ензимима, нема сумње да су лизосомални протеини важни за аутофагију. То је доказано блокадом аутофагије коришћењем лизосомалних инхибитора 16, 17 и дефектним аутофагијским одговорима код болести лизосомалног складиштења или нокаутом животињских модела лизосомалних протеина. 18, 19

За време гладовања, ЛЦ3-И (цитоплазматски) се претвара у ЛЦ3-ИИ (везан на мембрану), а након фузије аутофагосома са лизосомима, интра-аутофагосомални ЛЦ3-ИИ се брзо разграђује лизосомалним протеазама. У складу са овом идејом, приметили смо да је на гладовању ЕИГ121 прерасподељен у везикуле позитивне на ЛЦ3, а затим су и ЛЦ3 и ЕИГ121 деградирани (Слика 7). Количина ћелијских ЛЦ3-И и ЛЦ3-ИИ у одређеној временској тачки у датој ћелији је веома динамична и зависи од ћелијског контекста. На пример, ЛЦ3-ИИ је повишен у ХЕК293 ћелијама после 2 сата инкубације у КРБ главном пуферу, док исти третман доводи до смањења и ЛЦ3-И и ЛЦ3-ИИ у ХеЛа ћелијама. 8 Аминокиселинска гладовања ћелијских линија колоректалног карцинома доводе до повећања ЛЦ3 у ћелијама СВ620 и ВиДр, али смањена ЛЦ3 у ћелијама СВ480 и ЛоВо. 9 У нашој студији открили смо да је у ћелијама МЦФ-7 ЛЦ3-ИИ доминантан облик ЛЦ3 и да су, изгладњивани, и ЛЦ3 и ЕИГ121 брзо разграђени (слике 7а и б). Међутим, у ћелијама МДА-МБ-231 ЛЦ3-И је доминантан облик и да се током раног временског периода гладовања (5 до 30 мин) ЛЦ3-ИИ повећава, док продужено гладовање (30 мин до 2 х) доводи до дубоке разградње ЛЦ3 (подаци нису приказани). Вјерујемо да је до деградације ЛЦ3 и ЕИГ121 дошло у лизосомима, као што је БафА1, средство које повисује лизосомални пХ и инхибира фузију са лизосомима, 16 потпуно укинуло деградацију ЕИГ121 и ЛЦ3 изазвано гладовањем (Слика 7б). Како је ЛЦ3 препознат као биомаркер аутофагије, овде приказани резултати показују да ЕИГ121 има улогу у аутофагији изазваној гладовањем и цитотоксичним лечењем. Међутим, прецизна функција ЕИГ121 у аутофагији и механизам на којем та функција још увек нису јасни и требали би бити фокус будућих студија.

Прво смо описали ЕИГ121 као ген изазван естрогеном који је био прекомерно експресиониран у естрогеном зависном ендометријском ендометриоидном аденокарциному, али није естрогенски независан недендометриоидни карцином ендометрија. 1 Улога аутофагије у карциному остаје контроверзна. С једне стране, код различитих врста карцинома откривен је недостатак аутофагичних гена као што је беклин-1, а мишеви са хаплоинсуфицијенцијом белин-1 склонији су туморигенези. 20 Супресори тумора попут п53 могу позитивно регулисати аутофагију, док су онкогени молекули попут мТОР негативни регулатори аутофагије. 21, 22, 23 Ова запажања сугеришу да аутофагија сузбија туморигенезу. С друге стране, добро је познато да аутофагија подстиче преживљавање нормалних и туморских ћелија под стресним условима као што су помањкање хранљивих материја и лечење цитотоксичним лековима и тако може олакшати развој тумора и отпорност на терапију. 24, 25 Ова контрадикторна запажања сугеришу да улога аутофагије у туморигенези може да зависи од нивоа протеина који регулишу аутофагију, ћелијски тип и микро окружење. Нека недавна истраживања показала су да нормалан раст ћелија захтева равнотежу у аутофагичном путу и ​​да и недовољни и прекомерни нивои аутофагије могу инхибирати опстанак и покренути ћелијску смрт. 4, 26 У овој студији приметили смо да прекомерна експресија ЕИГ121 доводи до инхибиције раста и апоптозе (Слика 1а). Само уништавање ЕИГ121 није утицало на преживљавање ћелија, али у комбинацији са дезервацијом хранљивих материја или лечењем цитотоксичним лековима довело је до масовне ћелијске смрти (слика 9). Ови резултати сугерирају да туморске ћелије можда не зависе од ЕИГ121 када има довољно хранљивих састојака, али аутофагија изазвана ЕИГ121 може да подстакне привремени опстанак ћелија под стресним условима. Аутофагичка активност је најистакнутија у центру раних тумора млечне жлезде, где је ограничена количина хранљивих материја и кисеоника, због недостатка ангиогенезе изазване тумором. 27 Стога је могуће да високи нивои ЕИГ121 које смо претходно приметили код хиперплазије ендометрија и карцинома ендометрија 1. степена доприносе опстанку ове ране ненормалне пролиферације, када је егзогена количина хранљивих материја изузетно ограничена, индукујући аутофагију. У напреднијим ендометриоидним карциномима и нондометриоидним карциномима, јер масивна ангиогенеза и сигнализација повишеног фактора раста могу подржати раст тумора, ЕИГ121 није потребан за преживљавање тумора. У ствари, континуирано присуство високог нивоа ЕИГ121 у овим туморима може довести до заустављања раста и смрти ћелија, јер продужена и прекомерна аутофагија доприноси извршењу ћелијске смрти. 28, 29 Нагађамо да се због метаболичке катастрофе изазване прекомерном аутофагијом ЕИГ121 елиминише из узнапредовалих карцинома. Из истог разлога, нисмо могли успоставити стабилне ћелије које конститутивно експримирају ЕИГ121 на високим нивоима.

Разлог зашто ћелије МЦФ-7 ин витро и карцином ендометроида ендометроида ниског степена могу да подносе релативно високе нивое ЕИГ121 тренутно није јасан. Могуће је да ћелије МЦФ-7 и тумори ендометрија ниског степена носе додатне генетске или епигенетске промене које могу антагонизирати ефекте инхибиције раста и смрти, проузроковане дуготрајном и прекомерном експресијом ЕИГ121. Поред тога, улога ЕИГ121 у раку вероватно ће да зависи од фазе развоја тумора и ћелијског контекста. На пример, ТГФ- β је супресор тумора у раним фазама туморигенезе, али подстиче напредовање у каснијим фазама. 30 Чак и класични супресор ПТЕН-а може имати својства која промовишу тумор у подешавању мутације п53 функције. 31 Стога није изненађујуће да ЕИГ121 може имати врло различите улоге у раним карциномима ендометрија од ендометрија у поређењу с узнапредовалим туморима и нонндометриоидним туморима.

Чињеница да је ЕИГ121 позитивно регулисан естрогеном поставља питање улоге естрогена у регулацији аутофагије и функције аутофагије у ткивима која реагирају на естроген. Показало се да стероидни хормони, као што су екдизон, витамин Д и глукокортикоиди, снажно индукују аутофагију. 32, 33, 34 У ствари, аутофагија изазвана екдизоном потребна је за разградњу пљувачних жлезда, телесне масти и средњег црева како би се омогућило преградња ткива и морфогенеза за трансформацију ларви налик црвима у одрасле мухе. 35 Такође је показано да селективни модулатори рецептора естрогена, укључујући тамоксифен и ресвератрол, индукују аутофагију, 36, 37 и коактиватор ПЕЛП1 естрогена рецептора транслоцира у аутофагосоме након третмана ресвератролом. 38 Могуће је да естрогени, путем ПЕЛП1 или ЕИГ121, посредовани путевима, модулирају само-пробавне активности ткива ендометрија матернице и ткива млечне жлезде како би се прилагодили ремоделирању ткива ендометрија током менструалног циклуса и лактације и инволуције млечних жлезда.

Речник

УПСЦ

папиларни серозни карцином материце

МММТ

малигни мешани муллеријски тумор

ТГН

транс -Голги мрежа