Нова улога инхибитора хдака у амл1 / ето амл ћелијама: активација апоптозе и фагоцитоза индукцијом аннекин а1 | ћелијска смрт и диференцијација

Нова улога инхибитора хдака у амл1 / ето амл ћелијама: активација апоптозе и фагоцитоза индукцијом аннекин а1 | ћелијска смрт и диференцијација

Anonim

Апстрактан

Химерни фузијски протеин АМЛ1-ЕТО, створен транслокацијом т (8; 21), регрутује хистон деацетилазу (ХДАЦ) до промотора зависних од АМЛ1, што резултира транскрипцијском репресијом циљних гена. Анализирали смо транскрипцијске промене т (8; 21) ћелија Касуми-1 АМЛ као одговор на ХДАЦ инхибиторе, депсипептид (ФК228) и субероиланилалид хидроксаминску киселину (САХА), које су индуковале изразиту инхибицију раста и апоптозу. Користећи цДНА низ, аннекин А1 (АНКСА1) је идентификован као један од гена изазваних ФК228. Индукција АНКСА1 мРНА била је повезана са ацетилацијом хистона у промотору АНКСА1 и преокретом ХДАЦ-зависне супресије Ц / ЕБП α од стране АМЛ1-ЕТО уз директно регрутовање Ц / ЕБП α у АНКСА1 промотора. То је довело до повећања изоформиране Н-терминалне изоформе протеина АНКСА1 и накупљања АНКСА1 на ћелијској мембрани. Неутрализација анти-АНКСА1 антителом или утишавање гена са АНКСА1 сиРНА инхибира апоптозу изазвану ФК228, сугеришући да урегулација ендогене АНКСА1 поспешује ћелијску смрт. ФК228-индукована експресија АНКСА1 била је повезана са масовним повећањем везаности ћелија и захватањем ћелија Касуми-1 људским макрофагама добијеним ТХП-1, који је у потпуности поништен АНКСА1 оборењем сиРНА трансфекцијом или неутрализацијом АНКСА1. Ови налази идентификују нови механизам деловања ХДАЦ инхибитора, који индукују експресију и екстернализацију АНКСА1 у леукемијским ћелијама, што заузврат посредује фагоцитни клиренс апоптотских ћелија путем макрофага.

Главни

Транслокација т (8; 21) ствара химерни фузијски протеин АМЛ1-ЕТО, 1 који регрутује ензиме хистон деацетилазе (ХДАЦ) до промотора зависних од АМЛ1, што резултира транскрипцијском репресијом циљних гена. Ацитилација хистона је неопходна за успостављање транскрипционо компетентног хроматина. 2 Стање ацетилације хистона и других протеина који регулишу транскрипцију контролише хистон ацетилтрансферазе и хистон деацетилазе (ХДАЦ). 3 ХДАЦ такође формирају комплекс са фузивним протеинима леукемије, као што су АМЛ1-ЕТО, ПМЛ-РАР α , МЛЛ-ЦБП и други, што резултира аберрантно потиснутом експресијом гена потребним за контролу ћелијског раста и тиме трансформацију примитивне ћелије хематопоезе. 4 Супротно томе, инхибитори хистон деацетилазе (ХДАЦИ) могу да индукују апоптозу, диференцијацију и раст туморских ћелија, укључујући ћелије леукемије. 5 Ова својства ХДАЦИ-а учинила су их посебно занимљивим као средство за превазилажење резистенције на лекове карактеристичне за акутну мијелоидну леукемију (АМЛ) која сада смањује изгледе за дугорочно преживљавање ових пацијената. Неколико структурно различитих ХДАЦИ је сада развијено као антиканцерогена средства; ових натријум фенилбутирата, депсипептида (ФК228), субероиланилалид хидроксаминске киселине (САХА) и МС-275 тренутно се проучавају у клиничким испитивањима на пацијентима са хематолошким малигнитетима и чврстим туморима. 5 Механизам ХДАЦИ, међутим, није познат. Познавање њиховог механизма могло би се користити у развоју других побољшаних ХДАЦИ и у дизајну комбинованог лечења.

Стога смо проучавали механизме анти-леукемичког ефекта ХДАЦИ-а у АМЛ ћелијској линији Касуми-1. Одабрали смо ФК228 за који је раније показано да поседује цитотоксичну активност против мијелоидне леукемије 6, 7, али не и за Т-ћелијске лимфоме, 8 и користили смо други ХДАЦИ САХА, који је тренутно у току кроз клиничка испитивања хематолошких малигнитета. 9 Да бисмо идентификовали гене регулиране ХДАЦ-ом у ћелијама Касуми-1 које садрже АМЛ1-ЕТО фузијски протеин, прво смо анализирали транскрипцијске промене као одговор на ФК228 помоћу технологије цДНА матрице. Открили смо да је ФК228-индуцирана апоптоза повезана са индукцијом експресије про-апоптотичког протеина анексина А1 (АНКСА1) путем хистонске ацетилације његовог промотора. АНКСА1 је члан 37 кДа суперфамилије анексина који по структури припада породици свеприсутних фосфолипида и протеина који везују калцијум. У зависности од ћелијског система, подразумева се индукција апоптозе, 10 активација каспазе-3, инхибиција раста ћелија 12, 12, фагоцитоза. 15 Надаље, пријављено је да смањивање експресије АНКСА1 корелира са прогресијом тумора у раку главе и врата. 10 У овој студији открили смо да ФК228 индукује хистоније ацетилацију, индукцију експресије гена АНКСА1 и везивање Ц / ЕБП α у АНКСА1 промотору, посебно у АМЛ1 / ЕТО експримирајућим АМЛ ћелијама, а ти ефекти су допринели апоптотској ћелијској смрти и оплодњи апоптотичких ћелије помоћу макрофага. Ови ефекти су блокирани и антителом које блокира АНКСА1 и утишавањем АНКСА1 гена са АНКСА1 сиРНА. Будући да фагоцитни клиренс ћелија апоптотске леукемије игра важну улогу у решавању упале после хемотерапије, наши налази такође наглашавају кључну улогу АНКСА1 као посредника апоптозе и фагоцитозе као одговора на ХДАЦ инхибицију.

Резултати

ФК228 инхибира раст и индукује апоптозу Касуми-1 ћелија

Прво смо испитивали инхибиторне ефекте ФК228 који зависе од дозе на раст ћелија Касуми-1 изложених инкременталним концентрацијама ФК228 (1, 5 и 10 нМ) 16 х. Број ћелија одређен је на 24, 48, 72 и 96 х након испирања лека (Слика 1а, и). Пошто је третман са 5 нМ ФК228 значајно инхибирао раст ћелија Касуми-1 у поређењу са растом контролних ћелија, ова концентрација је изабрана за даља механичка испитивања.

Image
Image

ФК228 делује на инхибицију раста, апоптозу и ћелијски циклус у ћелијама Касуми-1 и НБ4. ( а ), ( ц ) ћелије Касуми-1 ( а ) и НБ4 ћелије ( ц ) култивисане су у присуству различитих концентрација ФК228 (1, 5 и 10 нМ) током 16 х, после чега је испрано лек са средњом променом. Утицај на раст ћелије (и) одређен је бројем одрживих ћелија коришћењем методе искључења Трипан плавим. Графикони приказују просјек ± СД резултата три независна експеримента. (ии) Проценат контролних ћелија на анексину В и ћелија третираних са ФК228 (временска тачка од 72 сата). Графикони приказују просјек ± СД резултата из три независна експеримента. Статистички значајне разлике ( ** П <0, 01) одређене су упареним Студентовим т- тестом. ( б ) Пример резултата анализе проточног цитометријског ћелијског циклуса. Касуми-1 ћелије су третиране са ФК228 (5 нМ) током 16 х, праћено испирањем лека, након чега су фиксне ћелије обојене ПИ у временској тачки од 72 сата. Бројеви показују просек ± СД процента ћелија у Г1 и С фазама ћелијског циклуса из три независна експеримента, израчунатог програмом МодФит. ( д ), ( е ) ћелије Касуми-1 ( д ) и НБ4 ћелије ( е ) култивисане су у присуству различитих концентрација САХА (0, 5, 1, 0 и 2, 0 μМ ) током 16 х. Ефекти на раст ћелије (и) одређени су бројем одрживих ћелија коришћењем методе искључења Трипан плавим. Графикони приказују просјек ± СД резултата три независна експеримента. (ии) проценат контролних ћелија позитивних на анексин и ћелије третиране САХА (временска тачка од 72 сата). Графикони приказују просјек ± СД резултата из три независна експеримента. Статистички значајне разлике ( ** П <0, 01) одређене су упареним Студентовим т- тестом

Слика пуне величине

Како је објављено да ФК228 изазива апоптозу код многих типова ћелија тумора, следеће смо истражили да ли ФК228 индукује апоптозу у ћелијама Касуми-1. У 72 х културе, пролазно (16 х) излагање ћелија 5 нМ ФК228 је изазвало апоптозу ( П <0, 001, слика 1а, ии). У концентрацији од 10 нМ, ФК228 је изазвао смрт готово свих ћелија Касуми-1. ФК228 на 5 нМ такође је утицао на ћелијски циклус, тако што је однос ћелија фазе Г 0 / Г 1 умерено порастао и однос ћелија С фазе значајно се смањио у поређењу са налазима у необрађеним контролним ћелијама у року од 72 х ( П = 0, 03), с повећањем популације хиподиплоида (суб-Г1) (Слика 1б). Све у свему, ово је показало да инхибиција раста ћелије Касуми-1 изазване ФК228 узрокује комбинација апоптотских и инхибицијских одговора ћелијског циклуса.

Као што је приказано на слици 1ц, међутим, НБ4 АПЛ ћелије, које експримирају фузиони протеин ПМЛ-РАР α 4 за које се зна да формирају комплексе са ХДАЦ-ом, биле су мање осетљиве него Касуми-1 ћелије на ФК228. Иако су ефекти ФК228 који инхибирају раст од дозе такође примећени у НБ4 ћелијама, 5 нМ ФК228 није изазвало значајну апоптозу и само је минимално утицало на дистрибуцију ћелијског циклуса Г 0 / Г 10 / Г 1 : контрола 44, 8 ± 4, 2 вс ФК228 57.6 ± 4.0, П = 0.04; С: контрола 49.0 ± 4.2 у односу на ФК228 38.5 ± 2.5, П = 0.03, у року од 72 х). Већа доза (10 нМ) ФК228 је, међутим, значајно инхибирала раст и апоптозу ћелија НБ4, у складу са налазима из претходне студије. 7

Још један ХДАЦИ, САХА, изазвао је инхибирајуће ефекте ћелијског раста и индукцију апоптозе у обе ћелије Касуми-1 и НБ4 (слика 1д и е). Док је мања доза САХА (0, 5 и 1 µМ ) изазвала више апоптозе у Касуми-1 него ћелија НБ4, већа доза (1 µМ) САХА је индуковала готово потпуну ћелијску смрт Касуми-1 и НБ4 ћелија.

ФК228 увећава експресију АНКСА1 у АМЛ1-ЕТО-позитивним ћелијама Касуми-1 и СКНО-1

Да бисмо одредили механизме индукције апоптозе помоћу ФК228, испитали смо промене у експресији гена Касуми-1 ћелије третиране ФК228 помоћу цДНА матрице. Следећи критеријуми су коришћени за идентификацију гена који су различито експримирани у ћелијама третираним ФК228 и контролним ћелијама: доња граница промене набора (ФЦ)> 2 и разлика од вредности> 150 коришћена је за идентификацију нерегулисаних гена и горња граница ФЦ 2 и разлика средње вредности од 50150 коришћене су за идентификацију регулисаних гена. У ћелијама Касуми-1 третираним ФК228 123 гена су регулисана и 14 гена је регулисано. Међу њима, ген који кодира фактор некрозе тумора α (ТНФ α ) био је умерено регулисан (2, 1 пута), у складу са претходним извештајем о индукцији гена ТНФ α путем хистонске хиперацетилације. 16 Нађено је да је анти-инфламаторни цитокински ген ТГФ- п 17 подрегулиран 2, 3 пута у Касуми-1 ћелијама третираним ФК228. Гени угулирани> 2, 1 пута сажети су у Табели 1. Фокусирали смо наше студије на про-апоптотички ген АНКСА1, који је показао 3, 5-пута повећање експресије као одговор на ФК228.

Табела пуне величине

Да бисмо потврдили резултате микрорачуна, анализирали смо промене у мРНА експресији гена АНКСА1 користећи ПЦР у реалном времену. Ово је показало да је експресија мРНА АНКСА1 у ћелијама Касуми-1 више пута повишена са 5 нМ ФК228 или 1 µМ САХА (ФК228 6.4 ± 0.2, САХА 7.4 ± 0.5 пута повећање у односу на контролу; Слика 2а). Међутим, није примећено даље повећање нивоа мРНА АНКСА1 код веће (10 нМ) дозе ФК228 (подаци нису приказани). Исто тако, ови ХДАЦИ-ји су индуцирали АНКСА1 мРНА у другој ћелијској линији позитивној на АМЛ1-ЕТО, ћелије СКНО-1 (ФК228 6.0 ± 0.7-, САХА 9.6 ± 1.3 пута повећање у поређењу с контролом), али не у АМЛ1-ЕТО-негативном НБ4, Ћелије У937 или ОЦИ / АМЛ2 (слика 2а). Није примећена даљња индукција АНКСА1 мРНА у НБ4 ћелијама при већој дози ФК228 (10 нМ) или у каснијим временским тачкама (48 и 72 х; подаци нису приказани).

Image
Image

ФК228 и САХА индуцирају АНКСА1 мРНА с повећањем ацетилације хистона у промотору АНКСА1 у ћелијама Касуми-1 и СКНО-1. ( а ) Индукција експресије мРНА АНКСА1 у ћелијама Касуми-1, СКНО-1, НБ4, У937 и ОЦИ / АМЛ2 третиране са ФК228 (5 нМ), САХА (1 μМ), и / или З-ДЕВД-фмк (50 μМ ) током 24 х, како је откривено ТакМан РТ-ПЦР анализом. Одређено је обиље транскрипата АНКСА1 у односу на обиље транскрипата β2-микроглобулина како је описано у Материјалима и методама. Графикони приказују репрезентативне податке из три независна експеримента. ( б ) Хроматин из Касуми-1, СКНО-1 или НБ4 ћелије третиране ФК228 (5 нМ) или САХА (1 μМ) током 24 сата имунопреципитирано је антителом против ацетилираног Х3-Лис9 (и) и Х4 (ии ), а затим анализира помоћу ТакМан ПЦР коришћењем сонди и прајмера који одговарају АНКСА1 промотору. Графикон приказује обиље ацетилираних Х3-Лис9 и Х4 у односу на „улаз“ као што је описано у Материјалима и методама. Графикони приказују репрезентативне податке из три независна експеримента. ( ц ) ПЦР профили ТакМан у реалном времену појачања АНКСА1 промотора приказани примерима ЦхИП тестова. Репрезентативни профили ацетилираних Х3-Лис9 у ћелијама Касуми-1 (и) и НБ4 (ии) третираним са ФК228. (иии) Ин- кривуља показује укупну геномску ДНК пре имунопреципитације

Слика пуне величине

ФК228 активира АНКСА1 транскрипцију гена путем хистонске ацетилације у АМЛ1-ЕТО-позитивним ћелијама Касуми-1 и СКНО-1

Следеће смо утврдили да ли је индукција транскрипције АНКСА1 посредована ацетилацијом хистона. Ово је испитано коришћењем ЦхИП теста и квантификовано ТакМан ПЦР-ом да би се идентификовао критични остатак хистона на АНКСА1 промотору модификован од ХДАЦИ у АМЛ1-ЕТО-позитивним и -негативним ћелијама. Као што је приказано на сликама 2б и ц, и ФК228 и САХА су промовисали ацетилацију хистона у промотору АНКСА1 у АМЛ1-ЕТО-позитивним ћелијама Касуми-1 (хистон Х3Л9; ФК228 38.1 ± 7.6-, САХА 83.6 ± 13.5-, Х4; ФК228 3.9 ± 0, 8-, САХА 4, 1 ± 0, 8 пута повећање у односу на контролу). Слични резултати примећени су у ћелијама СКНО-1 (Х3Л9; ФК228 3, 4 ± 0, 6-, САХА 58, 1 ± 9, 5-, Х4; ФК228 1, 4 ± 0, 3-, САХА 2, 6 ± 0, 5 пута повећање у поређењу са контролом), али не у АМЛ1-ЕТО -негативне ћелије (тј. ћелије НБ4, У937 и ОЦИ / АМЛ2).

Да бисмо разјаснили механизме ацетилације хистона у промотору АНКСА1 у ћелијама позитивним на АМЛ1-ЕТО, испитали смо могућност да АНКСА1 буде директна мета гена АМЛ1-ЕТО. Међутим, нису пронађена директна места која вежу АМЛ1 у промотору АНКСА1. Следеће смо се фокусирали на АНКСА1 промоторску регију као могућу локацију везних места за кандидатске АМЛ1 циљне гене. Истраживање овог региона показало је да су ове локације потиснуте од стране АМЛ1-ЕТО путем регрутовања ХДАЦ-а 18 и идентификовала су четири везна места Ц / ЕБП α (транскрипциони фактор ЦЦААТ / појачивач који везује протеин α ): тгтгаТТЦЦАацт (ГенБанк У25414; нуклеотиди 410–422 ), аааТГТААтаттт (нуклеотиди 610–622), цттТГТААтгцца (нуклеотиди 822–834) и гтгТГАААтцттц (нуклеотиди 1001–1013). Пошто експресија Ц / ЕБП α гена и Ц / ЕБП α- зависна транскрипција инхибира АМЛ1-ЕТО потискивањем његове позитивне ауторегулацијске петље, 19, 20, истражили смо да ли ХДАЦИ могу индуковати експресију Ц / ЕБП α гена у АМЛ1- ЕТО-позитивне ћелије. Ово је показало да ФК228 или САХА специфично повећавају ниво мРНА Ц / ЕБП α у ћелијама Касуми-1 (ФК228 9.1 ± 0.9, САХА 4.6 ± 0.5 пута повећање у односу на контролу) и СКНО-1 ћелије (ФК228 5.2 ± 0.6-, САХА 3.3 ± 0, 4 пута повећање у односу на контролу), али не у ћелијама НБ4, У937 и ОЦИ / АМЛ2 (слика 3а). Помоћу ЦхИП теста, потврдили смо регрутовање Ц / ЕБП α у АНКСА1 промоторску регију у ћелијама Касуми-1 (повећање од 12, 2 ± 3, 3 пута) и СКНО-1 (индукција Ц / ЕБП α без детекције у контроли) након излагања ФК228 (слика 3б). Ови налази снажно указују на то да је транскрипција АНКСА1 регулисана преокретом ХДАЦ-зависне супресије Ц / ЕБП α од стране АМЛ1-ЕТО и директним регрутовањем Ц / ЕБП α на ген промотора АНКСА1.

Image

ФК228 и САХА индуцирају Ц / ЕБП α мРНА с повећањем регрутовања Ц / ЕБП α на АНКСА1 промотор у Касуми-1 и СКНО-1 ћелијама. ( а ) Индукција експресије мРНА Ц / ЕБП α у Касуми-1, СКНО-1, НБ4, У937 и ОЦИ / АМЛ2 ћелијама третираним ФК228 (5 нМ) или САХА (1 µМ) током 24 сата које је открио ТакМан РТ -ПЦР анализа. Одређено је обиље транскрипата Ц / ЕБП α у односу на β2-микроглобулин као што је описано у Материјалима и методама. Графикони приказују репрезентативне податке из два независна експеримента. ( б ) Хроматин из ћелија Касуми-1 и СКНО-1 третиран ФК228 (5 нМ) током 24 сата је имунопреципитиран антителом против Ц / ЕБП а и анализиран помоћу ТакМан ПЦР помоћу сонди и прајмера који одговарају АНКСА1 промотору. Графикон приказује обиље Ц / ЕБП α регрутовања у односу на „инпут“ како је описано у Материјалима и методама. Графикони приказују репрезентативне податке из два независна експеримента

Слика пуне величине

ФК228-индуцирани АНКСА1 потиче апоптозу

Затим смо се фокусирали на испитивање функционалне улоге АНКСА1 у ћелијским ефектима индукованим ХДАЦ инхибиторима у ћелијама Касуми-1. Прекомерне експресије обе, АНКСА1 пуне дужине и цепања НКС-терминала АНКСА1 показале су се да промовишу апоптозу. 11, 12 Анализа имунофлуоресценције помоћу моноклонског АНКСА1 антитела, која детектује АНКСА1 пуне дужине, или поликлоналног АНКСА1 антитела, детектујући одцепљени Н-терминални протеин АНКСА1 целом дужином, показао је пораст експресије АНКСА1 локализованог на плазма мембрани у ФК228 -обрађене ћелије Касуми-1, које су видљивије детектиране поликлоналним анти-АНКСА1 (слика 4а). Извештава се да је цепљени производ протеина АНКСА1 изазван каспазом повезан са ћелијском смрћу 11, а као што је приказано на слици 4б, заиста смо потврдили повећање количине цепљеног АНКСА1 протеина одрезаног Н-терминалним (33 кДа) од стране ФК228 коришћењем Вестерн блот анализе са поликлонским анти-АНКСА1. Моноклонско анти-АНКСА1 антитело је такође открило пораст протеина АНКСА1 пуне дужине (37 кДа) за ФК228. ФК228 је иницирао цепање каспазе-3 повезано са појавом повећане цепане верзије АНКСА1 у ћелијама Касуми-1 (Слика 4б, ии). Инхибитор каспазе-3 З-ДЕВД фмк ефикасно је блокирао цепање каспазе-3 (слика 4б, ии), умањену апо22-индуковану ФК228 (% АннекинВ + ћелије: контрола 16, 1 ± 3, 2, ФК228 54, 4 ± 4, 6, ФК228 / З-ДЕВД 34, 4 ± 4, 5, П = 0, 01, у року од 72 х), потиснуто убрзано цепање АНКСА1 (детектирано поликлоналним антителом) и делимично спречено повећање целог протеина (детектирано моноклонским антителом; Слика 4б), без промене мРНА АНКСА1 (Слика 2а) . Ови резултати показују да активација каспазе-3 делом доприноси активирању АНКСА1 и ћелијској смрти, али ови ефекти нису независни од транскрипције.

Image

( а ) АНКСА1 индукција и транслокација индукована ФК228 у ћелијама Касуми-1. Индукција и транслокација АНКСА1 у ћелијама Касуми-1 откривена имунофлуоресцентном микроскопијом након 24 х третманом ФК228 (5 нМ). Ћелије су обојене за АНКСА1 (моноклонским или поликлоналним антителом, зелено), а језгра су контрапонирана са ДАПИ (плава). Резултати су репрезентативни за два независна експеримента. ( б ) цепање АНКСА1 изазвано ФК228 и цепање каспаза-3 у ћелијама Касуми-1. Целоћелијски лизати су припремљени из ћелија Касуми-1 узгајаних са и без ФК228 (5 нМ) или ФК228 / З-ДЕВД-фмк (50 μМ) током 24 сата и подвргнути имуноблотској анализи за експресију АНКСА1 и каспазе-3. Коришћена су анти-поликлонска и моноклонска АНКСА1, анти-прокапаза-3 и анти-одцепљена антитела каспаза-3. П- актин је показао једнако оптерећење узорака. Приказани подаци представљају три независна експеримента. ( ц ) Неутрализација АНКСА1 инхибира ФК228-индуковану апоптозу у ћелијама Касуми-1. Проценат ћелија Касуми-1 које показују ФК228-индуцирану аннекин В-позитивност претходно третирану са или без АНКСА1 неутрализујућег антитела. ФК228 је додат ћелијама 24 сата након претходне обраде са АНКСА1 неутралишућим антителом, након чега су ћелије испране и медијум промењен. Ћелије су затим инкубиране током 48 сати, а позитивност анексина В је анализирана проточном цитометријом. Графикони приказују просјек ± СД резултата из три независна експеримента. Статистички значајне разлике ( * П <0, 05) одређене су упареним Студентовим т- тестом

Слика пуне величине

Да бисмо утврдили допринос урегулације АНКСА1 у апоптози изазваној ФК228, прво смо испитали утицај антитела за неутрализацију АНКСА1 на цитотоксичне ефекте ФК228 на ћелије Касуми-1. Неутрализација АНКСА1 потпуно је блокирала апоптозу изазвану ФК228 у ћелијама Касуми-1 (слика 4ц). У алтернативном приступу, анализирали смо ФК228-индуцирану апоптозу у АНКСА1 обореној Касуми-1 ћелији. Ово је показало да је експресија мРНА АНКСА1 у ћелијама које су биле трансфековане с АНКСА1 смањена за 80% у току 48 х у поређењу са његовом експресијом у неспецифичним (НС) сиРНА-трансфектираним ћелијама (Слика 5а, и). Ово се претворило у потпуни нестанак одцепљене изоформе АНКСА1 и делимично смањење експресије протеина пуне дужине (Слика 5а, ии). Примећено је да су ћелије које су биле трансфековане с АНКСА1 сиРНА биле значајно мање подложне апоптози изазваној ФК228 него ћелије које су биле трансфековане НС-сиРНА (Слика 5б, и). Међутим, пригушивање АНКСА1 само је делимично блокирало ефекте инхибиције раста ФК228 (слика 5б, ии), сугеришући да иако АНКСА1 игра улогу у индукцији апоптозе, механизми независни од АНКСА1 одговорни су за антипролиферативне ефекте ФК228.

Image

( а ) АНКСА1 оборење у ћелијама Касуми-1, које су трансфековане сирому АНКСА1. Касуми-1 ћелије су трансфициране са НС-сиРНА или АНКСА1 сиРНА, као што је описано у Материјалима и поступцима. (и) Приказана је бројност транскрипата мРНА АНКСА1 у односу на ону β2- микроглобулина у контроли (непреносив) и НСуми сиРНА- или АНКСА1 сиРНА-трансфектиране ћелије Касуми-1. Графикони приказују просјек ± СД репрезентативних података из три независна експеримента. Статистички значајна разлика ( ** П <0, 01) одређена је упареним Студентовим т- тестом. (ии) Експресија протеина АНКСА1 у НС-сиРНА- или АНКСА1 сиРНА-трансфекованим ћелијама Касуми-1 анализирана је у Вестерн блот-у коришћењем анти-зечјег поликлоналног АНКСА1 антитела. Подаци су репрезентативни за два експеримента који су дали упоредне резултате. ( б ) Ефекти утишања АНКСА1 сиРНА на апоптозу и виталност ћелија Касуми-1. Проценат ћелија позитивних на анексин (и броја живих ћелија (ии) за ћелије Касуми-1 које су трансфековане с НС-сиРНА- или АНКСА1 сиРНА третиране ФК228. ФК228 је додат 24 сата, након чега су ћелије испране, медијум промењен, а ћелије се инкубирају током 48 х. Позитивност Анексина В мерена је проточном цитометријом, а број одрживих ћелија одређен је методом искључења Трипан плавим. Графикони приказују средњу вредност ± СД резултата из три независна експеримента. Статистички значајне разлике ( * П <0, 05 ) били су одређени упареним т- тестом ученика

Слика пуне величине

АНКСА1 посредује захватање апоптотских ћелија макрофазима

Пошто је АНКСА1 ендогени лиганд који природно посредује у захватању апоптотских ћелија, 21 истраживали смо функционалне ефекте АНКСА1 на фагоцитозу ћелија леукемије. Користили смо систем ко-културе који се састоји од макрофага који потичу од хуманог ТХП-1 и ћелија Касуми-1 и обавили смо тест адхеренције ћелије да бисмо проценили улазак Касуми-1 ћелија макрофазима у ко-културу. Као што је приказано на слици 6а (и), изложеност ФК228 током 24 сата драматично је повећала везаност ћелија Касуми-1 на макрофаге (необрађене према ћелијама третираним ФК228: 57 ± 9 ћелија насупрот 196 ± 33 ћелија / микроскопска поља (0, 08 мм 2 / поље), н = 5; П = 0, 01). Утврђивање ћелија Касуми-1 макрофаговима потврђено је експериментима обележавања флуоресценцијом, у којима су макрофаги обележени са ЦД14 коњугованим са ПЕ (слика 6а, ии).

Image
Image

Укључивање АНКСА1 у захватање ћелија Касуми-1 макрофазима. Кластерирање ФК228 (5 нМ) обрађених ћелија Касуми-1 на ТХП-1 диференцираном макрофагом. Контролне и ФК228-третиране ћелије Касуми-1 додате су у ТХП-1 диференциране макрофагом током 3 х. Групирање ћелија Касуми-1 је визуелно приказано после испирања ћелија које нису прогутане. (и) Репрезентативна фотомикрографија класије ћелија Касуми-1 на моно-слоју диференцираног макрофагом ТХП-1 (× 40). (ии) Поплава макрофагова је визуелизована детекцијом имунофлуоресцентности макрофагова са ПЕ-коњугованим анти-ЦД14 мишјим моноклонским антителом (× 400). ( б ) Касуми-1 ћелије које су трансфициране са АНКСА1 сиРНА или НС сиРНА и третиране са ФК228 ко-култивиране са макрофагом диференцираним ТХП-1 током 3 сата. Репрезентативна фотомикрографија ћелија Касуми-1 која се групише на моно-слоју диференцираног макрофагом ТХП-1: (и) × 40 и (ии) × 400. ( ц ) ћелије Касуми-1 претходно обрађене са АНКСА1 неутралишућим антителом, а затим ФК228 кокултивиране су са макрофаг диференциран ТХП-1 у току 3 х. Репрезентативна фотомикрографија ћелија Касуми-1 групирана у макрофагу диференцираног монопласта ТХП-1: (и) × 40 и (ии) × 400

Слика пуне величине

Супротно томе, припајање ћелија изазвано ФК228 је приметно поништено у АНКСА1 сиРНА-трансфектираним ћелијама Касуми-1 (инхибиција 60, 5 ± 10, 5%; н = 5; П <0, 001; Слика 6б). Исто тако, претходна обрада са ФК228 и АНКСА1 неутралишућим антителом 24 сата пре експеримената са културом резултирала је значајном репресијом пропадања ФК228 стимулисаног леукемије ћелија макрофазима (54, 1 ± 3, 0% инхибиције; н = 5; П = 0, 02; Слика 6ц ). Међутим, овај ефекат није појачан када је у време ко-културе додато медијуму за неутрализацију АНКСА1, што сугерише да је мембрански везан и не растворљив облик АНКСА1 који доприноси уградњи ћелија леукемије макрофазима (не показано).

Дискусија

У овој студији истражили смо нови механизам деловања ХДАЦИ-а у ћелијама леукемије у којима се налази АМЛ1-ЕТО-фузијски протеин. Конкретно, приметили смо дубоку инхибицију раста и апоптозу АМЛ1-ЕТО-позитивних ћелија Касуми-1 и СКНО-1 као одговор на ФК228 и САХА. Надаље смо показали да је овај одговор повезан са повећањем регулације про-апоптотичког гена АНКСА1 10, 11, 12, 22 преко ацетилације хистона у његовој промоторској регији. Супротно томе, ХДАЦ инхибиција није успела да индукује експресију АНКСА1 у АПЛ ћелијској линији НБ4 или у другим АМЛ линијама У937 и ОЦИ-АМЛ2. Ове АМЛ1-ЕТО негативне ћелије су такође показале смањену осетљивост на ефекте ХДАЦИ који инхибирају раст, што сугерише да АНКСА1 доприноси про-апоптотичким ефектима ових средстава.

Специфична модулација АНКСА1 транскрипције у АМЛ1-ЕТО позитивним ћелијама сугерише молекулску везу између овог химерног фузионисаног протеина и регулације активности промотора АНКСА1. Као што се тренутно разуме, АМЛ1-ЕТО регрутује ХДАЦ комплекс за промотере зависне од АМЛ1, 1, 4, 23, што резултира транскрипционом модулацијом гена регулисаних АМЛ1, укључујући урегулацију ТИС11б, 24 ц-миц, циклин Д1 25 гени и смањивање гена који кодирају транскрипциони фактор Ц / ЕБП α , 19, 20 супресор тумора п14 АРФ, 26 неурофиброматоза-1 протеин, 27 и интерлеукин 3. 28 Недавно је протеасомална деградација АМЛ1-ЕТО ФК228 објављено је да је резултат прекинуте повезаности АМЛ1-ЕТО са протеином топлотног удара 90 (ХСП90). 29 Додајући ово разумевање, наше студије су идентификовале везна места Ц / ЕБП α у АНКСА1 промоторском региону која не садрже директно место везано за АМЛ1. Наша открића да је ФК228 регулирао Ц / ЕБП α ген и промовисао везивање Ц / ЕБП α на АНКСА1 промотору указују на могућност да је Ц / ЕБП α -зависна транскрипциона активација АНКСА1 један од молекуларних механизама који диктирају специфичност ацетилације хистона и транскрипцијске активације циљних гена у АМЛ1-ЕТО експримирајућим АМЛ ћелијама. Међутим, наша открића индукције апоптозе високим дозама ФК228 или САХА независно од експресије АМЛ1-ЕТО, и запажање да ћутање АНКСА1 у ћелијама Касуми-1 само делимично блокира ефекте инхибиције раста ФК228, сугеришу да док АНКСА1 игра улогу у индукцији апоптозе у Касуми-1 ћелијама које експримирају АМЛ1-ЕТО, механизми независни од АНКСА1 могу допринети про-апоптотичким својствима ХДАЦИ без обзира на експресију АМЛ1-ЕТО. Недавни извештаји приписују анти-леукемијску активност ХДАЦИс САХА, валпроичне киселине и бензамидног деривата МС275 директној активацији промотора тумора-селективног лиганда смрти ТРАИЛ преко протеина који веже елемент цАМП одговора и ЦБК. од СП1 и СП3 у АМЛ ћелијама. 7 Ови ефекти виђени су у АМЛ ћелијама без обзира на њихов статус експресије АМЛ-ЕТО. Пошто, слично као код МС275, ФК228 такође снажно инхибира ХДАЦ1 и ХДАЦ2, 30 индукција ТРАИЛ-а такође може допринети ФК228-индукованој апоптози у ћелијама Касуми-1. Регрутовање ЦБП-а од стране ХДАЦИ, заузврат, индукује промоцију хистонске ацетилације и транскрипцију циљног гена. 4 Иако АНКСА1 промотор не садржи СП1 место, улога регрутовања ЦБП-а у индукцији АНКСА1 и идентификација места ацетилације укључују следећу карактеризацију.

Следеће смо се фокусирали на про-апоптотичку функцију АНКСА1 у АМЛ1-ЕТО експримирајућим АМЛ ћелијама. У вези с тим, откривено је да ФК228 повећава ниво протеина и цепних производа цепања НКС-терминала АНКСА1 пуне дужине и 33 кДа, што је довело до локализације АНКСА1 на плазма мембрани. Супротно томе, инхибиција функције АНКСА1 (антитијелом за неутрализацију АНКСА1, које је блокирало локализацију АНКСА1 на плазма мембрани) или експресијом (сиРНА) значајно је смањила апоптозу изазвану ФК228, што указује да је АНКСА1 укључен у индукцију апоптозе као одговор на ФК228. Поред тога, наши резултати сугерирају специфичну улогу цепљеног протеина АНКСА1 у убрзавању процеса ћелијске смрти. Ранији извештаји су указивали да ћелије које су биле заражене цепљеним протеинима АНКСА1 показују већу конститутивну и индуцибилну активност каспазе-3, 12 што сугерише да активација АНКСА1 доприноси покретању каскаде каспазе и апоптози. Показали смо да инхибиција каспазе-3 делимично блокира апоптозу изазвану ФК228 и цепање АНКСА1 без поништавања гена АНКСА1. Овај налаз је у сагласности са налазом Дебрет ет ал. , 11 који су показали да је цепање АНКСА1 инхибитором каспазе инхибирано у ћелијама У937. Ови налази сугерирају да иако АНКСА1 доприноси активацији каспазе-3, одцепљена каспаза-3 заузврат потиче цепање и апоптозу АНКСА1 у ћелијама леукемије.

Наши подаци о цДНА низу показали су да ФК228 регулише 123 гена, плус да сарађује с другим протеинима у регулисању гена који кодирају про-апоптотичке протеине ТНФ α (2, 1 пута) и профилин (четвороструко) за које се извештава да се придружују. са АНКСА1. 12, 31 Даље је показано да ФК228 активира транскрипцију гена ТНФ α хиперацетилацијом хистона Х3 и Х4 у свом промоторском региону, што је повезано са активирањем каспаза-8 и -10, а самим тим и цепањем каспаза-3 и -7. 16 Поред тога, показало се да третирање У937 ћелија ТНФа повећава АНКСА1 мРНА и експресију протеина; 12 обрнуто, пријављено је да ћелије У937 које прекомерно експримирају АНКСА1 су подложније ТНФ-индукованој апоптози. 32 Ова запажања сугеришу да АНКСА1 и ТНФ α , чији су промотори гена мете ацетонисање изазване ФК228, кооперативно промовишу индукцију апоптозе. Транскрипциона активација неколико других проапоптотских гена, укључујући Фас, Бак и ТРАИЛ, такође је умешана у апоптозу изазвану ХДАЦ-ом. 7, 33 Неки од ових апоптотских догађаја изазваних ФК228 могу се појавити заједно са активирањем каспазе-3 што доприноси повећаној експресији и цепању АНКСА1.

Поред улоге АНКСА1 у апоптози изазваној ФК228, наше студије су идентификовале јединствену улогу АНКСА1 у интеракцијама између леукемијских ћелија и макрофага, један од критичних атрибута микро окружења коштане сржи. Конкретно, АНКСА1 неутрализујуће антитело и сиРНА / АНКСА1 ефикасно су блокирали улазак ФК228 третираних Касуми-1 ћелија макрофазима, што сугерише да АНКСА1 који је локализован у мембрани игра критичну улогу у фагоцитози. То се потенцијално објашњава чињеницом да апоптотичке ћелије изазване антитуморском терапијом морају бити ефикасно препознате и интернализоване макрофазима. У складу с тим, Арур ет ал. 21 показало је да се АНКСА1 регрутује из цитосола до мембране у Јуркат Т ћелијама под апоптозом и да је ово регрутовање специфично за АНКСА1 међу израженим анексинима. Ови аутори су из овога закључили да је извоз АНКСА1 био критични сигнал за захватање апоптотских ћелија.

Иако ова запажања документују улогу АНКСА1 као ендогеног лиганда који зависи од каспазе и који посредује у захватању апоптотских ћелија и тако служи као премосни молекул између апоптотских ћелија и макрофага, наше је прво запажање да ХДАЦИ учествују у овом механизму. У складу са овим налазима, недавно је показано да пептид Ац 2-26 добијен од АНКСА1, који одговара првим аминокиселинама АНКСА1 Н терминала, стимулише фагоцитозу апоптотских полиморфонуклеарних леукоцита помоћу макрофага који потичу из моноцита. 34 Наши подаци о цДНА показују да је анти-инфламаторни цитокин ТГФ- β , који функционише заједно са АНКСА1 у фагоцитози, 17 такође транскрипционо индукован ФК228, што сугерише блиску међусобну интеракцију између АНКСА1 и ТГФ- β у фагоцитози апоптотичког Касуми- 1 ћелија.

Укратко, наша открића сугеришу да ФК228 и САХА, веома моћно антитуморско средство које је тренутно у фази И / ИИ клиничких испитивања на пацијентима са хематолошким малигнитетима, 9, 35, индуцирају транскрипцијску активацију АНКСА1 путем хистонске ацетилације његовог промотора. Наши подаци надаље сугеришу да је индукција АНКСА1 специфична за ћелије леукемије које експримирају АМЛ1-ЕТО химерни фузијски протеин. То резултира урегулацијом и екстернализацијом унутарћелијског протеина АНКСА1 који индукује апоптозу и, што је још важније, обезбеђује сигнал "поједи ме" који води до фагоцитног чишћења ћелија леукемије макрофазима. Пошто је брзо препознавање и захватање апоптотских ћелија од стране суседних макрофага и фагоцитоза важна компонента антиканцерогене терапије, закључујемо да ФК228 обећава као ефикасно антитуморско средство код лекова, позитивних на АМЛ1-ЕТО леукемије, које делују двоструким механизмима - индукцијом апоптозе и контролу упалних реакција.

Материјали и методе

Реагенси и ћелијске културе

Користили смо следеће АМЛ1-ЕТО позитивне АМЛ ћелијске линије: Касуми-1, које је обезбедио др Х. Асоу, 36 и СКНО-1, које је обезбедио др Т. Накагава. 37 Следеће четири АМЛ1-ЕТО негативне ћелијске линије су такође добијене. НБ4 ћелијску линију је обезбедио др М. Ланотте, 38, а ОЦИ-АМЛ2 ћелијску линију је обезбедио др М. Минден (Онтарио Институте оф Цанцер Институте, Торонто, Канада). У937 ћелије су купљене из америчке колекције типова културе (Роцквилле, МД, САД), а ћелије ТХП-1 су купљене у биолошком центру Рикен (Тсукуба, Јапан). Ћелије Касуми-1, НБ4, ОЦИ-АМЛ2, У937 и ТХП-1 одржаване су у медијуму РПМИ-1640 који садржи 10% серум феталног телета, 1% Л-глутамин и пеницилин-стрептомицин; 2 нг / мл ГМ-ЦСФ је додато у ћелије културе СКНО-1. ФК228 (Фујисава Пхармацеутицал Цо. Лтд., Осака, Јапан), који је растворен у диметилсулфоксиду до концентрације 10 мМ и чуван на -20 ° Ц, је разблажен у медијуму за културе пре ин витро излагања ћелија.

Ћелије су третиране са ФК228, инхибитором каспазе-3 З-ДЕВД-фмк (Цалбиоцхем, Ла Јолла, ЦА, УСА), и / или САХА (обезбедили су га др. П. Маркс и В. Рицхон, Мерцк & Цо. Инц., Вхитехоусе Статион, Њ, УСА) у назначеним концентрацијама. Медијум је промењен након 16 сати излагања ФК228.

Тест ћелије за одрживост

24–96 х након излагања леку идентификоване су одрживе ћелије помоћу методе искључења плавим бојама и израчунато у хематоцитометру.

Проток цитометријске анализе

Расподела ћелијског циклуса је одређена проточном цитометријом језгара обојених пропидијум-јодидом (ПИ). Укратко, ћелије су испране два пута физиолошком отопином пуферираном фосфатом (ПБС), фиксиране у ледено хладном етанолу (70% в / в у води) и обојене са ПИ раствором (25 μг / мл ПИ, 180 У / мл РНасе 0, 15% Тритон Кс-100 и 30 мг / мл полиетилен гликола у 4 мМ цитратном пуферу, пХ 7, 8; ​​све из Сигма Цхемицал Цо., Ст. Лоуис, МО, УСА). Садржај ДНК је мерен помоћу проточног цитометра ФАЦСцан (Бецтон Дицкинсон Иммуноцитометри Системс, Сан Јосе, Калифорнија, САД) и анализиран програмом МодФит (Верити Софтваре Хоусе, Топсхам, МЕ, УСА). Ћелије са садржајем ДНК хиподиплоида (<2 н ) сматране су апоптотичним.

За студије везивања ПИ / анексина В урађене за анализу апоптозе, свеже ћелије су испране два пута пуфером за везивање (10 мМ ХЕПЕС, 140 мМ НаЦл и 5 мМ ЦаЦл2, пХ 7, 4; све од Сигма Цхемицал Цо.) и обојене са ФИТЦ-коњугирани анексин В (Роцхе Диагностиц Цо., Индианаполис, ИН, САД) током 15 минута на собној температури. Флуоресценција анексина В одређена је коришћењем проточног цитометра Бецтон Дицкинсон ФАЦСцан, а интегритет ћелијских мембрана истовремено је процењен методом искључења ПИ.

Профилирање израза засновано на олигонуклеотидном низу

Хибридизација је изведена коришћењем низова сонди људског генома У95Ав2 (Аффиметрик, Санта Цлара, Калифорнија, САД) који садрже сетове сонда са претходно карактеристичним генима. The target was labeled and hybridized to the probe arrays, and the arrays washed, stained, and scanned, as described previously. Briefly, total RNAs were prepared after 24 h of treatment with FK228 (5 nM) using the RNeasy Total RNA isolation kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), and double-stained cDNA was synthesized from total RNA. An in vitro transcription reaction was carried out to produce biotin-labeled cRNA from the cDNA, and the cRNA was fragmented and hybridized to the oligonucleotide probes on the probe array during 16 h of incubation at 45°C. Immediately after hybridization, the hybridized probe array underwent an automated washing and staining on the fluids station, and the Genechip Microarray Suite 4.0 Software (Affymetrix) was used to measure the intensity of the expression of each target gene by calculating the average differences (perfect match intensity minus mismatch intensity) of the 14–20 probe pairs used for the particular gene.

DNA-Chip Analyzer Software was used to analyze the quantified images and the expression change for each target gene was estimated with the reduced Li Wong PM-MM difference model. 39 The statistical results were imported into the Result Viewer 2.0 software.

Вестерн блот и антитела

An equal amount of cell lysate was separated by 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, followed by immunoblotting on Hybond-P membranes (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK). Proteins were visualized using the enhanced chemiluminescence detection system (Amersham Pharmacia Biotech) after incubation overnight at 4°C with the following antibodies: anti-rabbit polyclonal ANXA1 antibody, 15 anti-mouse monoclonal ANXA1 antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), and anti-procaspase-3 and anti-cleaved caspase-3 antibodies (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Anti- β -actin (Abcam, Cambridge, MA, USA) blots were run in parallel as loading controls.

Квантитативни ПЦР у реалном времену

RNA was isolated using TRIZOL (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA). One microgram of total RNA template was used per 10 μ l of reverse transcriptase reaction by AMV reverse transcriptase (Roche Diagnostic Co.) using hexanucleotide random primers at 42°C for 1 h following the manufacturer's instructions. For quantitative real-time RT-PCR, duplicate 1 μ l samples of each cDNA were amplified as follows: 50°C for 2 min, 95°C for 10 min, 40 or 50 cycles at 95°C for 15 s, and 60°C for 60 s. The relative amount of gene expression was calculated using the expression of β 2 -microglobin as an internal standard. Primers (FP, forward; RP, reverse) and probe sequences of ANXA1, C/EBP α , and β 2 -microglobin ( β 2 -m) were as follows: ANXA1 (GenBank δ accession number BC035993; nucleotides 375–450), FP: 5′-CAGGTCACCTTGAGGAGGTTGT-3′; RP: 5′-CAGCACGAAGTTCATCAGCATC-3′; probe: 5′-TTGGCTCTGCTAAAAACTCCAGCGCA-3′; C/EBP α (GenBank™ accession number NM_004364; nucleotides 161–230) FP:5′- GCATCTGCGAGCACGAGAC-3′; RP:5′- AACTCGTCGTTGAAGGCGG-3′; probe:5′- TCCATCGACATCAGCGCCTACATCG-3′; β 2- m FP: 5′-AGCTGTGCTCGCGCTACTCT-3′; RP: 5′-TTGACTTTCCATTCTCTGCTGG-3′; probe: 5′-TCTTTCTGGCCTGGAGGGCATCC-3′. The abundance of each transcript of interest relative to the abundance of β 2 -microglobulin was calculated as follows: relative expression (RE)=100 × 2exp(−Δ C T ), where Δ C T is the mean C T of the transcript of interest minus the mean C T of the transcript for β 2 -microglobulin. To obtain the mean C T values, we performed all reactions in duplicate.

Тест имунопреципитације хроматин

The chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay was performed following the manufacturer's instructions (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA). The cells were fixed with formaldehyde (final concentration, 1%), lysed, sonicated, and then immunoprecipitated by overnight incubation at 4°C with anti-acetylated H3-lys9, anti-dimethylated H3-Lys9 (both antibodies from Upstate Biotechnology), and anti-C/EBP α (Santa Cruz Biotechnology). PBS or rabbit IgG was added as a negative control. A small portion of chromatin was set aside for use as the 'input' fraction by processing for immunoprecipitated chromatin. After immunoprecipitation, salmon sperm DNA beads (Upstate Biotechnology) were added and incubated for 1 h at 4°C. The chromatin-antibody/beads complexes were washed sequentially with low salt, high salt, and LiCl immune complex wash buffers and then with TE buffer. The immunoprecipitated and input chromatin was treated with RNase and proteinase K and maintained at 65°C for 6 h to reverse the formaldehyde crosslinks, after which the DNA fragments were purified (QIAquick PCR purification kit; Qiagen, Tokyo, Japan). Total DNA (10 × diluted input fraction) and immunoprecipitated DNA samples were applied to real-time PCR. For quantitative real-time PCR, primers and probes were designed by Primer Express software packaged with the Applied Biosystems Model 7700 sequence detector (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Probes and primers were selected to include the proximal promoter where a large number of the described transcriptional response elements reside. The probes were labeled at the 5′ end with FAM and at the 3′ end with TAMRA, which served as a quencher. The amplification conditions were as follows: 50°C for 2 min, 95°C for 10 min, 50 cycles at 95°C for 15 s, and 60°C for 60 s. Annexin A1 promoter elements (GenBank™ accession number U25414; nucleotides 873–953), FP: 5′-TCACTTTGTTTTTGGACATAGCTGA-3′; RP: 5′-CCACACCTAGCAACCAGAAGTTAG-3′; probe: 5′-CCATGTACTTCAAACAGAAGGCAGCCAATT-3′. The abundance of each transcript of interest relative to that of 'input' C T values was calculated as follows: RE = 2ΔCT, where Δ C T is the difference in C T between the transcript of interest and total DNA (10 × diluted 'input' fraction), which represents a relative change of the targeted modification in the ANXA1 gene promoter region compared with the input. 40 The C T data from duplicate PCRs, in which the same DNA was used were averaged before the RE was calculated.

The Gene regulation program (www.gene-regulation.com) was used to predict transcription factor binding sites.

Мала интерферирајућа РНА трансфекција

ANXA1 gene expression in leukemia cells was silenced by the siRNA technique. The sense strand of the siRNA silencing (ANXA1-siRNA) was ACUCCAGCGCAAUUUGAUGTT (BC035993; nucleotides 412–432). Mock transfection was done with buffer alone. A nonspecific control pool containing four pooled nonspecific siRNA duplexes was also used as a negative control (referred to as NS-siRNA; Takara Bio Inc., Shiga, Japan). Transfection of Kasumi-1 cells was facilitated by the Trans IT-TKO Tranfection Reagent (Mirus Corporation, Madison, WI, USA), following the manufacturer's instructions, with modification. Briefly, 24 μ l of the TKO reagent was first incubated with 100 μ l of OPTIMEM-I medium (Invitrogen Co.) at room temperature for 15 min before siRNA was added. After another 15 min at room temperature, 500 μ l of RPMI-1640 (with 20% calf serum) containing 0.8 × 10 6 cells was added. The final siRNA concentration was 125 nM, and the incubation was allowed to continue for 4 h at 37°C in 5% CO 2, after which 3.5 ml of RPMI-1640 (with 20% calf serum) was added, and the incubation continued at 37°C for 24 s. FK228 was added to a final concentration, as indicated, and the cells were harvested 72 h later for apoptosis and cell cycle analysis. The gene silencing was verified by TaqMan RT-PCR and Western blot performed at 48 h after transfection.

Preparation of cells for phagocytosis studies

THP-1 cells (0.5 × 10 6 cells per 35-mm dish) were first differentiated by stimulation with PMA (160 nM) for 72 h to obtain a macrophage-like phenotype that closely resembled that of human monocyte-derived macrophages. Kasumi-1 cells were cultured at a density of 0.2 × 10 6 cells/ml in the presence or absence of FK228 (5 nM) for 24 h, after which the medium was changed. PMA-treated THP-1 cells were washed with PBS, and Kasumi-1 cells (either treated or untreated with FK228) added. Cells were then incubated for 3 h at 37°C. Non-ingested cells were removed by three washes with cold PBS. The engulfment by macrophages was visualized by the immunofluorescence detection of macrophages with PE-conjugated anti-CD14 mouse monoclonal antibody.

For each experiment, the number of Kasumi-1 cells that adhered to macrophages was determined in at least five fields (× 200), and an average was calculated for duplicate wells.

For the ANXA1-neutralizing studies, macrophage-differentiated THP-1 and Kasumi-1 cells were treated for 24 h with the neutralizing anti-rabbit polyclonal ANXA1 antibody (1 : 100) that binds to full-length and N-terminal–truncated ANXA1 with and without FK228 before co-incubation, as described above.

Конфокална микроскопија

In preparation for confocal microscopy, cells were washed with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 10 min at room temperature, permeabilized with 90% methanol in TBST buffer (10 mM Tris, 15 mM NaCl, and 0.1% Triton X-100) for 15 min, and rinsed with PBS for 5 min. Next, cells were blocked with 5% goat serum in PBS for 30 min and incubated with anti-mouse monoclonal ANXA1 antibody (1 : 100) or anti-rabbit polyclonal ANXA1 antibody (1 : 100) overnight at 4°C. Excess antibody was removed by washing with PBS. Then cells were incubated with secondary FITC-labeled anti-mouse IgG (1 : 250, H+L; Calgat, Burlingame, CA, USA) for 30 min at 37°C. Cells were washed with PBS, mounted on slides, and analyzed under a Zeiss LSM 510 laser confocal microscope (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA).

Статистичка анализа

Резултати су изражени као средња вредност ± СД. Levels of significance were evaluated by a two-tailed, paired, Student's t -test, and P <0.05 was considered statistically significant.

Приступања

ГенБанк / ЕМБЛ / ДДБЈ

  • BC035993
  • NM_004364
  • U25414