Нпнт се изражава остеобластима и посредује ангиогенези активацијом ванћелијске сигнално-регулиране киназе | научни извештаји

Нпнт се изражава остеобластима и посредује ангиогенези активацијом ванћелијске сигнално-регулиране киназе | научни извештаји

Anonim

Субјекти

  • Изванстанични сигнални молекули
  • Анализа гена експресије
  • Исправљање овог чланка објављено је 21. новембра 2016

Овај чланак је ажуриран

Апстрактан

Ангиогенеза игра важну улогу у развоју костију и ремоделирању, а посредује га мноштво потенцијалних ангиогених фактора. Међутим, недостају подаци о специфичним ангиогеним факторима који се излучују у коштаном микроокољу да би се регулирала остеопороза. Овде извештавамо да се Нефронектин (НПНТ), члан фактора раста епидермалног раста (ЕГФ), који понови породичне протеине и хомолог ЕГФЛ6, изражава у остеобластима. Интригантно је експресија гена НПНТ смањена у костима Ц57БЛ / 6Ј оваријектомираних мишева и код оболелих од остеопорозе. Поред тога, утврђено је да су нивои протеина НПНТ и ЦД31 смањени и у тибијама ОВКС мишева. Егзогена додавања мишјег рекомбинантног НПНТ-а на ендотелним ћелијама ин витро стимулирају миграцију и формирање структуре у облику цеви. Поред тога, НПНТ промовише ангиогенезу у ек виво тесту метатарзалне ангиогенезе мишева фетуса. Показано је да НПНТ стимулира фосфорилацију ванћелијске сигнално регулисане киназе 1/2 (ЕРК1 / 2) и п38 митоген-активирану киназу (МАПК) у ендотелним ћелијама. Инхибиција ЕРК1 / 2 ослабљене НПНТ-индуковане миграције ендотелних ћелија, формирање структуре у облику цеви и ангиогенеза. Узето заједно, ови резултати показују да је НПНТ паракрински ангиогени фактор и да може играти улогу у патолошкој остеопорози. То може довести до нових циљева за лечење коштаних болести и повреда.

Увод

Ангиогенеза је блиско повезана с остеогенезом да посредује у развоју, преради и поправљању костију. Прекид овог процеса спајања може довести до остеопорозе, стања које је обично узроковано старењем и недостатком естрогена у пост-менопаузи 1 . На пример, старији мишеви су показали смањење ЦД31 ћелија са високим степеном ендотела и повезано је са падом остеопрогенера и запремином кости 2 . Поред тога, овариектомизовани (ОВКС) мишеви показали су смањење коштане запремине, праћено смањењем крвних судова 3 . Иако је повезаност ангиогенезе и остеогенезе критично важна, регулаторни фактори који посредују у овом сложеном процесу остају слабо разумети.

Познато је да су остеобласти, остеокласти и васкуларни ендотелни ћелије главни доприноси процесу ремоделирања унутар васкуларне структуре која се назива одељак за ремоделирање костију (БРЦ). Ове ћелије успостављају систем унакрсних разговора како би посредовали активности коштаних ћелија и регрутовање, пролиферација и диференцијација ћелија из мезенхималних и хематопоетских линија 4, 5 . Ендотелне ћелије могу да регулишу коштане ћелије на паракрински начин путем излучивања фактора који стимулише колонију макрофага (М-ЦСФ), активатора рецептора нуклеарног фактора каппа-Б лиганда (РАНКЛ) и разних других хемокина 6, 7, 8 . Супротно томе, остеобласти стварају ангиогене факторе као што су ВЕГФ, БМП7, ЕГФЛ6 и ТГФ-α како би посредовали ангиогенезу у коштаном микроко окружењу 9 . Даље, остеокласти и преостеокласти такође су недавно умешани у стварање костију и ангиогенезу излучивањем ММП-9 и ПДГФ-ББ, односно 3, 10 . Важно је да ангиогени фактори као што је ВЕГФ играју пресудну улогу у зарастању ломова и дистракцијској остеогенези 11, 12 .

Нефронектин (НПНТ) је протеин ванћелијског матрикса 70–90 КДа који је првобитно идентификован у ембрионалном бубрегу 13 . Претходне студије наводе да је НПНТ потребан за развој бубрега и срца 14, 15 . Надаље, нађено је да НПНТ потиче диференцијацију остеобласта преко понављања сличних ЕГФ-у у МЦ3Т3-Е1 ​​остеобластичким ћелијама, а регулише их ТГФ-β 16, 17 . Занимљиво је да дели сличну хомологију са ЕГФЛ6, протеином сличним ЕГФ-у који учествује у посредовању пролиферације стромалних васкуларних ћелија из масног ткива и ангиогенези 18, 19, 20 . За многе чланове породице протеина сличних ЕГФ-у, као што су ЕГФ, ХБ-ЕГФ и ЕГФЛ7, познато је да учествују у промоцији миграције ендотелних ћелија и ангиогенези 9, 21 . Иако НПНТ садржи домене сличне ЕГФ-у, његова потенцијална улога у посредовању ангиогенезе у костима и остеопорози остаје да се разјасни. У овој студији испитивали смо експресију НПНТ-а у коштаном локалном окружењу користећи ин витро и ин виво приступ. Надаље, окарактерисали смо улогу НПНТ-а у активностима ендотелних ћелија, ангиогенези и механизмима сигнализације који су укључени у функционалне тестове ин витро .

Материјали и методе

Ћелијска култура

Остеокласти су формирани третирањем примарних макрофага коштане сржи Ц57БЛ / 6Ј миша (БММ) са рекомбинантним РАНКЛ, као што је претходно описано 21 . Остеобласти су формирани култивацијом примарних ћелија калварије неонаталних Ц57БЛ / 6Ј мишева у остеогеном медијуму према објављеним протоколима 21, 22 . СВЕЦ (симијска вирусна 40-трансформисана ћелија мишје микроваскуларне ендотелне ћелије) и ЦОС-7 (ћелијска линија фибробласта бубрега мајмуна) узгајани су као што је претходно описано 21 .

Реверзна транскрипција у стварном времену (РТ) -кПЦР на остеобластима

Тотална ћелијска изолација РНА и РТ-ПЦР су изведени као што је претходно описано 23 . амплификација кПЦР је извршена коришћењем СИБР зелене боје (Киаген, Аустралија) и иЦицлер (БиоРад) користећи цикличке параметре: 94 ° Ц, 1 минут; 60 ° Ц, 30 секунди; 72 ° Ц, 45 секунди током 38 циклуса са прајмерима дизајнираним према следећим секвенцама миша: НПНТ (напред: 5′-ТГГГГАЦАГТГЦЦААЦЦТТТЦТ-3 ′; уназад, 5′-ТГТГЦТТАЦАГГГЦЦГАГГЦТ-3 ′), ОЦН (напријед: 5′-ГЦГТЦГТЦТТЦТТЦ 3 ′; обрнуто: 5′-АЦЦТТАТТГЦЦЦТЦЦТГЦТТ-3 ′), алкална фосфатаза (АЛП) (напријед: 5′-ААЦЦЦАГАЦАЦАЦААГЦАТТЦЦ-3 ′; обрнуто: 5′-ГЦЦТТТГАГГТТТТТТГГТЦА-3 ′), Цол1ГГГГГГГГГГ-3Г ′) 3 ′; обрнуто: 5′-ТЦЦАААЦЦАЦТГААГЦЦТЦГ-3 ′), 18С рРНА (напред: 5′-АЦЦАТАААЦГАТГЦЦГАЦТ-3 ′; обрнуто: 5′-ТГТЦААТЦЦТГТЦЦГТГТЦ-3 ′). РТ-кПЦР резултате анализирао је ВииА ™ 7 Софтваре.

Вестерн блоттинг

Вестерн блотирање је изведено као што је претходно описано 21 . Откривање и квантификација имунореактивности изведена је као што је раније речено 18, 21 . Додатни детаљни протоколи и информације о антителима су наведени у Додатним методама.

Трансфекција и детекција НПНТ у ћелијама ЦОС-7

Трансфекција је изведена према протоколима претходно описаним 18, 21 . Укратко, ЦОС-7 ћелије су трансфициране вектором експресије НПНТ пцДНА3.1-НПНТ-ц-миц / Хис или празним вектром пцДНА3.1 (контрола) коришћењем липофектамина 1000 (Инвитроген, Аустралија). После 6 сати, ћелије су испране два пута и инкубиране са Опти-МЕМ редукованим серумским медијумом (Гибцо). Супернатанти су сакупљени током 24 и 48 сати након трансфекције, а присуство НПНТ је испитано Вестерн блоттингом користећи антитело анти-ц-миц.

Модел оваријектомизованог миша

Женке мишеве Ц57БЛ / 6Ј, старе 5 недеља, купљене су од лабораторија животињских животиња Схангхаи Супер-Б&К Цорп. Лтд (Шангај, Кина). Све поступке са животињама одобрио је етички одбор (2015/081) болнице Схаокинг Пеопле (Схаокинг, Кина). Експерименти на животињама изведени су у складу са одобреним смерницама. Животиње су биле подвргнуте следећим условима: нормална исхрана, собна температура од 20 до 25 ° Ц, релативна влажност ваздуха од 50 до 60% и 12 сати светлосно-тамни циклус. После аклиматизације током две недеље, мишеви су подељени у лажну или ОВКС групу насумично (6 по групи). Мишеви из ОВКС групе примали су овариектомије билатерално, а само лажне операције су изведене у лажној групи. Животиње у обе групе биле су смештене још 3 месеца после операције, а потом је уследила еутаназија. Предње ноге и бутне кости прикупљени су за микроЦТ снимање и РТ-кПЦР (допунске методе).

Набавка узорака пацијената

Етичко одобрење свих поступака који укључују људске субјекте дао је етички одбор (2015/082) Народне болнице Схаокинг (Схаокинг, Кина). Информисана сагласност добијена је од свих укључених субјеката, а експериментални поступци спроведени су у складу са одобреним смерницама. Узорци цапут феморис прикупљени су од пацијената који су примили замену кука након фрактуре врата бедрене кости или остеоартритиса кука и чувани су на –80 ° Ц док нису анализирани. Ови узорци су подељени у групу остеопорозе (фрактура врата бедрене кости) и контролну групу (остеоартритис) (н = 20) за микроЦТ снимање и РТ-кПЦР (допунске методе). Детаљне информације о пацијентима који су учествовали у овој студији наведени су у Додатној табели 1.

Имунохистохемија (ИХЦ)

Делови кости кости мишјих тибија су депарафинисани и рехидрирани и инкубирани 30 минута са 1% хидроген пероксидазом у метанолу како би се блокирала активност ендогене пероксидазе. Неспецифична места везивања блокирана су козјим серумом 60 минута на собној температури пре инкубације са примарним антителом против НПНТ (1: 600, абцам) или ЦД31 (1: 800, абцам) преко ноћи на 4 ° Ц. За детекцију, одсеци су инкубирани са ХРП-коњугованим секундарним антителом током 60 минута, после чега је додато течно ДАБ супстрат. Секције су биле супротстављене хематоксилином и дехидриране су и монтиране са брзо сушећим средствима за монтирање (Унитед Биосциенцес, Аустралиа). Коришћен је софтвер за анализу светлосног микроскопа и слике (Слика плус 6.0) и узето је пет случајних региона сваког одељка за статистичку анализу ИХЦ-а.

Тестови ангиогенезе ин витро

СВЕЦ тест зацељења рана од огреботина, тест формирања структуре сличне цевици СВЕЦ и тест метатарзалне ангиогенезе фетуса миша изведени су као што је претходно описано 21 . За тест су купљени рекомбинантни мишји НПНТ (Р&Д Системс), хумани бФГФ (ПепроТецх, Инц.), хумани ВЕГФ (ПепроТецх, Инц.) и инхибитор ЕРК1 / 2 У0126 (Промега). Етичко одобрење добијено је од УВА комитета за животињску етику (РА / 3/100/1331) за спровођење испитивања метатарзалне ангиогенезе. Експерименти су изведени у складу са одобреним смерницама.

Додатни детаљни протоколи налазе се у Додатним методама.

Статистичка анализа и презентација података

Сви подаци су представљени као средства + СД. За појединачне поређења, разлика између два средства је процењена непарним, дворедним Студентовим т тестом. За поређење између више средстава спроведена је једносмерна АНОВА. Ниво П <0, 05 је сматран статистички сигнификантним. Статистичка анализа извршена је коришћењем СПСС софтвера верзија 19.0. Величине узорака за сваку животињску и болесничку групу представљене су као н / група. Сви приказани ин витро подаци представљају један од најмање три независна експеримента.

Резултати

Профили експресије гена НПНТ током диференцијације остеобласта и остеокласта

Претходна студија је објавила да се НПНТ изражава МЦ3Т3-Е1 ​​остеобластичном ћелијском линијом и током развоја дуге кости и калварије 16, али његова улога у ангиогенези и остеопорози није позната. У овој студији смо урадили микроарверолошку анализу и открили смо да се НПНТ регулише током примарне диференцијације остеобласта (7. дан), заједно са експресијом гена маркера остеобласта алкалном фосфатазом (АЛП), остеокалцином (ОЦН), коштаним сиалопротеином (БСП) и високом температурна протеаза А (ХтрА1), уобичајени маркер за остеобласт / остеокласт 23 (допунска слика, слика 1А). Међутим, експресија НПНТ није измењена током диференцијације остеокласта изазваног РАНКЛ-ом (дан 5), док су маркерски гени повезани са остеокластом, калцитонински рецептор (ЦТР), катепсин К (ЦтсК), трансмембрански протеин специфичан за ћелију дендритски (ДЦ-СТАМП) и ХтрА1 нерегулиран У складу са овом опажањем, даљом анализом експресије гена остеокласта изазване РАНКЛ-ом помоћу РТ-ПЦР није било могуће детектовати НПНТ експресију (допунска слика 1Б). Вишеструко поравнавање секвенци коришћењем УниПрота (ввв.унипрот.орг) показало је да су домени НПНТ-а добро очувани између миша и човека (допунска слика Сл. 1Ц). Они укључују сигналну пептидну секвенцу на Н-терминусу, ЕГФ-сличну секвенцу домена, РГД мотив и МАМ домен на Ц-терминусу. Даљња анализа упутстава за дрвеће такође је открила да је мишји НПНТ уско повезан са НПНТ за људе и орангутана у поређењу са НПНТ штакора (Допунска слика Сл. 1Д).

Да бисмо даље истражили образац експресије гена НПНТ у остеобластима, извршили смо РТ-кПЦР на мРНА-има издвојеним из примарних калваријалних остеобласта током диференцијације. Показали смо да су нивои НПНТ мРНА значајно виши 7, 14 и 21 дан у поређењу са предкултуром са остеогеним диференцијацијским медијумом на дан 0 (Сл. 1А). Диференцијација остеобласта потврђена је повећањем утврђених остеогених маркера АЛП, ОЦН и алгена-1 колагена типа 1 (Цол1А1) (Сл. 1Б-Д).

Image

( А ) РТ-кПЦР је изведен током диференцијације остеобласта коришћењем прајмера специфичних за ( А ) НПНТ, ( Б ) АЛП, ( Ц ) Цол1А1 и ( Д ) ОЦН. Експресија гена је нормализована на 18С и упоређена са експресијом у дану 0. Створена је конструкција НПНТ експресије (пцДНА3.1-НПНТ-ц-миц / Хис) која кодира НПНТ миша пуне дужине. ( Ф ) Детекција НПНТ протеина у кондиционираном медијуму ЦОС-7 ћелија трансфектираних с НПНТ експресијском конструкцијом коришћењем антитела анти-ц-миц. ( Г ) НПНТ је откривен у супернатантима остеобласта коришћењем анти-НПНТ антитела. ХтрА1 је кориштен као позитивни маркер за диференцијацију остеобласта, а β-актин је коришћен као контрола оптерећења. Слике западног блота представљене су у облику исеченог формата. Плочице пуне дужине приказане су на Додатној слици 4. * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001.

Слика пуне величине

НПНТ је тајни фактор од стране остеобласта

Затим смо испитивали ћелијску културу остеобласта на основу НПНТ експресије путем Вестерн блот анализе. Открили смо да је НПНТ протеин присутан у супернатанту (Сл. 1Г) и лизатима (Супплементарна слика 2Б), што указује да НПНТ луче остеобласти. Даље, генерисана је експресијска конструкција мишје пуне дужине НПНТ (пцДНА3.1-НПНТ-ц-миц / Хис) и пролазно је трансфектирана у ЦОС-7 ћелије да би се експримирао НПНТ рекомбинантни протеин (Слика 1Е). НПНТ је откривен у кондиционираном медијуму ЦОС-7 ћелија 24 и 48 сати после трансфекције коришћењем антитијела анти-ц-миц (Сл. 1Ф), а такође и у лизатима (Допунска слика Сл. 2А). Ово потврђује да је НПНТ излучени протеин, што је у складу са другим извештајима да је НПНТ екстрацелуларни матрикс протеин 13, 20 .

Експресија НПНТ-а је била регулирана доље код ОВКС мишева и остеопоротских болесника

Затим смо проучавали експресију гена НПНТ користећи ин виво моделе болести. Прво, генерисали смо ОВКС моделе миша да опонашамо патолошко стање пост-менопаузалне остеопорозе код људи (Сл. 2А). У групи ОВКС током 3 месеца након операције, Тб.БВ/ТВ и Тб.Н на проксималној тибији су били знатно нижи него код лажних (контролних) легла, са Тб.Сп значајно вишим у ОВКС групи (Сл. 2Б, Д, Е). Супротно томе, није уочена значајна разлика између Тб.Тх између група (Сл. 2Ц). Накнадни РТ-кПЦР показао је изразито смањење НПНТ експресије у ОВКС групи (Сл. 2Х), заједно са смањењем експресије остеогених маркера Рунк2 и ОЦН (Сл. 2Ф, Г).

Image

( А ) Тибије из лажне групе (лево) и ОВКС групе (десно) су визуелно приказане μЦТ скенирањем, а РОИ се фокусирао на трабекуларну регију испод плоче за раст за квантитативну анализу ( Б ) Тб.БВ/ТВ, ( Ц ) Тб.Тх, ( Д ) Тб.Н и ( Е ) Тб.Сп. Квантитативна анализа ПЦР у реалном времену експресије ( Ф ) Рунк2, ( Г ) ОЦН и ( Х ) НПНТ у предњим удовима миша. н = 6 / група. ( И ) μЦТ слике трабекуларне кости у подручју између главе и врата фемура код пацијената са остеоартритисом (одозго) и остеопорозом (доле), и квантитативна анализа ( Ј ) Тб.БВ/ТВ, ( К ) Тб.Тх, ( Л ) Тб.Н и ( М ) Тб.Сп. Квантитативна анализа ПЦР у реалном времену експресије ( Н ) Рунк2, ( О ) ОЦН и ( П ) НПНТ у људској фемори. н = 20 / група. Експресија гена је нормализована на β-актин и 18С. * П <0, 05

Слика пуне величине

Затим смо испитали експресију гена НПНТ у узорцима кости трабекуларне кости добивене од клиничких пацијената (Сл. 2И). Квантитативна анализа открила је да су Тб.БВ/ТВ и Тб.Тх значајно нижи у групи са остеопорозом у поређењу са остеоартритисом (контролна) група (Сл. 2Ј, К), док није примећена значајна разлика у Тб.Н и Тб.Сп између две групе (Сл. 2Л, М). Штавише, РТ-кПЦР је показао да су експресије НПНТ-а, заједно са Рунк2 и ОЦН, значајно ниже код остеопоротских пацијената у складу са резултатима експеримената на животињама (Сл. 2Н-П).

Поред тога, урадили смо имуно обојавање да бисмо испитали експресију протеина НПНТ и ЦД31 (ендотелни маркер) у тибијама лажних и ОВКС мишева (Сл. 3А). Открили смо да је експресија протеина НПНТ значајно смањена у тибијама ОВКС мишева, што је у складу са смањењем експресије гена НПНТ као што је претходно описано (Слика 3Б). Занимљиво је да смо такође открили да је експресија ЦД31 била значајно нижа у тибијама ОВКС мишева у поређењу са лажним мишевима (слика 3Ц).

Image

( А ) Репрезентативне микроскопске слике Х&Е и имуно обојења помоћу НПНТ и ЦД31 специфичних антитела на тибијанским одсецима лажних и ОВКС мишева. Квантитативна анализа експресије ( Б ) НПНТ и ( Ц ) ЦД31 у тибијама ОВКС мишева. * П <0, 05, ** П <0, 01.

Слика пуне величине

Индукција ћелијске миграције и формирање епрувете помоћу СВЕЦ ендотелних ћелија и метатарзалне ангиогенезе фетуса миша НПНТ-ом

Раније је објављено да НПНТ има хомологност секвенце са ЕГФЛ6 20 . С обзиром на ову сличност, желели смо да истражимо улогу НПНТ у активностима ендотелних ћелија и ангиогенези. Прво смо испитивали ефекте НПНТ на СВЕЦ миграцију тестом зарастања огреботинама. Као што је приказано на слици 4А, Б, егзогено додавање рекомбинантног НПНТ протеина значајно је повећало миграцију ендотелних ћелија за ~ 15% у поређењу са контролом ПБС. бФГФ је коришћен као позитивна контрола.

Image

( А ) Репрезентативни микроскопски приказ тестова зацељења рана огреботина изведених коришћењем СВЕЦ ћелија третираних рекомбинантним мишјим НПНТ (500 нг / мл) од 0 до 16 сати. Вага, 100 µм. ( Б ) Квантитативна анализа подручја миграције ћелије. ( Ц ) Репрезентативне слике које приказују стварање цевасте структуре од СВЕЦ ћелија после третмана рекомбинантним мишјим НПНТ (500 нг / мл) током 24 сата. Вага, 100 µм. ( Д, Е ) Квантитативна анализа тачака грана и дужине цеви. ПБС и бФГФ коришћени су као негативна и позитивна контрола. ( Ф ) Репрезентативне слике које показују да је рекомбинантни мишји НПНТ (200 нг / мл) индуковао раст посуда из метатарзалица сецираних из ембриона Е17.5. Вага, 250 µм. ( Г ) Квантитативна анализа клијања из посуда. ПБС и ВЕГФ (50 нг / мл) коришћени су као негативна и позитивна контрола. * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001.

Слика пуне величине

Формирање тродимензионалне структуре сличне цеви је важан корак у ангиогенези. Овде смо открили да је рекомбинантни протеин НПНТ стимулисао формирање структуре у облику цеви у СВЕЦ ћелијама, при чему су тачке грана и дужине епрувете значајно побољшане у поређењу са контролом ПБС (Сл. 4Ц-Е). Да бисмо потврдили улогу НПНТ у ангиогенези, додатно смо извршили ек-виво тест метатарзалне ангиогенезе фетуса мишева. Као што је приказано на слици 4Ф, Г, мишји рекомбинантни НПНТ значајно је промовисао стварање мрежних структура у култивираним метатарзалима.

НПНТ активира сигнале ЕРК1 / 2 и п-38

Да би се позабавили механизмом сигнализације активности ендотелијалних ћелија изазваних НПНТ, СВЕЦ ћелије су стимулисане рекомбинантним протеинима НПНТ у трајању од 0, 5, 10, 20, 30 и 60 минута, а затим је праћено Вестерн блотирањем да би се открила фосфорилација кључних сигналних молекула. Као што је приказано на слици 5А, НПНТ је индуцирао фосфорилацију ЕРК1 / 2 и п-38, док Акт остаје релативно константан. Чини се да је фосфорилација ЕРК1 / 2 и п-38 изазвана НПНТ-ом значајно урегулирана у поређењу са пре-стимулацијом (0 минута), а нивои су достигли 20 минута (Сл. 5Б, Ц). Није откривена значајна промена нивоа фосфорилације Акт (Сл. 5Д).

Image

( А ) Вестерн блот слике које приказују третирање СВЕЦ ћелија мишјим рекомбинантним НПНТ резултирало је фосфорилацијом ЕРК1 / 2 и п-38, али не и Акт. П-Актин је коришћен као контрола оптерећења. ( Б - Д ) Квантификација интензитета сигнала п-ЕРК1 / 2, п-п38 и п-Акт помоћу ИмагеЈ. Индукциони коефицијенти за сваку временску тачку су упоређени за 0 минута, при чему је п-ЕРК1 / 2 нормализован на ЕРК1 / 2, п-п38 нормализован на п-38, а п-Акт нормализован у Акт. Слике западног блота представљене су у облику исеченог формата. Плочице пуне дужине приказане су на Додатној слици 4. * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001.

Слика пуне величине

У0126 омета миграцију ендотелних ћелија посредовану НПНТ-ом, формирање структуре цеви и метатарзалну ангиогенезу

Затим смо истражили утицај У0126 (инхибитора МЕК1 / 2) на функције ендотела ћелија посредованих НПНТ-ом, као што је претходно описано 18, 21. Као што је приказано на слици 6А-Ц, миграција ендотелних ћелија изазвана НПНТ-ом и формирање структуре у облику цеви је значајно инхибирано у присуству У0126. Такође смо открили да је стварање крвних жила изазвано НПНТ-ом значајно смањено у присуству У0126 (Сл. 6Д, Е). Само лечење У0126 није имало значајног утицаја на ангиогенезу у поређењу са контролом ПБС (подаци нису приказани), у складу са претходном студијом 21 . Инхибиција фосфорилације ЕРК1 / 2 изазване НПНТ-ом помоћу У0126 у ендотелним ћелијама потврђена је анализом Вестерн блот-а (допунска слика 3).

Image

( А ) Репрезентативне микроскопске слике испитивања ране од огреботина које показују миграцију ендотелних ћелија изазваних НПНТ-ом блокиране су у присуству У0126 (5 µМ). Вага, 100 µм. Квантитативне анализе које показују да је миграција ендотелних ћелија изазвана ( Б ) НПНТ-ом и стварање ( Ц ) структуре у облику цеви у значајној мери инхибирала У0126. ПБС и бФГФ коришћени су као негативна и позитивна контрола, респективно. ( Д ) Репрезентативне слике које показују да је ангиогенеза изазвана НПНТ инхибирана у присуству У0126 (5 µМ). Вага, 250 µм. ( Е ) Квантитативна анализа клијања из посуда. * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001.

Слика пуне величине

Дискусија

Остеопороза је често повезана са смањеним квалитетом костију и повећаним ризиком од фрактуре. Важно је да је предложена повезаност измена васкуларне архитектуре и губитка коштане масе код старих мишева 2, ОВКС мишева 3 и људске примарне остеопорозе 24, што сугерише да је спајање ангиогенезе и остеогенезе можда пресудно за одржавање хомеостазе костију. Према томе, идентификовање нових ангиогених фактора у коштаном микроокољу могло би проширити наше знање о комуникацији између коштаних ћелија и ендотелних ћелија, као и улози које би оне могле играти у патолошким болестима костију. У овом истраживању смо показали да се НПНТ експримира и излучује током диференцијације остеобласта. Даље, открили смо да се генска експресија НПНТ смањује у узорцима фемура са ОВКС мишева и у остеопоротској фемори људи. Оно што је важно, ово запажање је повезано са смањењем коштане масе и смањеном експресијом кључних остеогених маркера, што имплицира да је НПНТ бар делимично регулисан од стране остеобласта у коштаном микроокољу. Такође смо приметили да смањење НПНТ експресије у костима ОВКС мишева корелира са смањењем експресије ЦД31 имунолошким бојењем, наиме подразумевајући да ћелије које експримирају ЦД31, укључујући ендотелне ћелије, могу да се регулишу НПНТ.

Раније је наша група показала да ЕГФЛ6 и ЕГФЛ7 промовишу ангиогенезу 18, 21 . Овде смо показали да НПНТ такође може да показује ангиогени потенцијал регулисањем миграције ендотелних ћелија, формирања структуре у цевима и раста крвних жила из мишјих метатарзалних фетуса. Штавише, открили смо да НПНТ може да регулише активности ендотелних ћелија и ангиогенезу активирањем ЕРК1 / 2 и п38 МАПК сигналних путева. У ствари, многи чланови породица слични ЕГФ-у могу посредовати у ангиогенези активацијом МАПК стаза 18, 25 . Занимљиво је да НПНТ није утицао на фосфорилацију Акт-а, који игра пресудну улогу у преживљавању ћелија и сузбијању апоптозе 26, 27, 28 . Чини се да је овај резултат сличан нашој претходној студији која је показала да ЕГФЛ6 активира ЕРК1 / 2, али не и Акт сигналне путеве у ендотелијалним ћелијама 18 . Како НПНТ дели врло сличну структуру хомологије са ЕГФЛ6, могуће је да су оба молекула могла да регулишу ангиогенезу на просторно-временски начин кроз сличне сигналне путеве. НПНТ је, за разлику од ЕГФЛ6, директна мета сигнализације Внт / β-катенина 29 . НПНТ експресија се регулише активирањем Внт / β-катенина, директно или путем инхибиције БМП сигнализације. Надаље, брисање НПНТ-а резултира урегулацијом ЕГФЛ6, што сугерира компензацијску регулацију између два протеина 29 . Занимљиво је да се НПНТ експримира у ендотелним ћелијама СВЕЦ, али не и у ЕГФЛ6 (подаци нису приказани).

ЕГФ-слични протеини садрже домене који су високо хомологни ЕГФ-у. Ово је уобичајена карактеристика међу члановима породице протеина сличних ЕГФ-у, као што су ХБ-ЕГФ, бетацелулин и амфирегулин 9 . Показано је да су многи чланови породица слични ЕГФ-у изражени у остеобластима и остеокластима 9, а њихова улога у регулисању ангиогенезе подразумевана је 25, 30, 31, 32, 33 . Стога је могуће да НПНТ може регулисати ангиогенезу помоћу истих механизама као и остали чланови слични ЕГФ-у. У ствари, НПНТ садржи РГД мотив који је критичан у везивању интеграла 13, 34, 35 . Заиста, за НПНТ је речено да је главни лиганд за α 8 β 1 целогрин, и има нижи афинитет везивања за друге цјеловине попут α в β 3, α в β 5, α в β 6 и α 4 β 7 13 . Иако тренутно недостају подаци у вези са присуством α 8 β 1 интегрина у ендотелним ћелијама, многи ендокуларни ћелије пријављени су са васкуларним рецепторима, укључујући α 1 β 1, α 2 β 1 36, α в β 5 37, α 5 β 1 38 и α в β 3 39 . Поред тога, претходне студије су показале да ЕГФЛ7, моћан ангиогени фактор сличан ЕГФ-у, посредује ангиогенезу везањем α в β 3 интегрина и активирањем сигналних каскада 21, 40 . Стога би будуће студије могле истражити могућност да НПНТ може регулисати активности ендотелних ћелија путем интеракгринске интеракције.

За многе болести костију пријављено је да су повезане са поремећајима и променама васкуларизације 9 . Надаље, ангиогенеза игра пресудну улогу током процеса зацјељивања прелома костију и повреда плоче раста 41, 42 . Стога, идентификација нових ангиогених фактора може олакшати развој нових терапијских третмана скелетних патологија и повреда. У новије време наша група је идентификовала да се ЕГФЛ2, ЕГФЛ3, ЕГФЛ5, ЕГФЛ6, ЕГФЛ7, ЕГФЛ8 и ЕГФЛ9 различито изражавају у коштаном микроокољу, од чега ЕГФЛ6 и ЕГФЛ7 играју важну улогу у регулисању ангиогенезе 18, 21 . Наша тренутна студија по први пут представља доказе да је експресија гена НПНТ под утицајем остеопорозе и да може потенцирати ангиогенезу ин витро . Стога је вероватно претпоставити да би НПНТ могао да посредује у процесу спајања ангиогенезе и остеогенезе у коштаном микроокољу. Будуће студије ће бити потребне за рјешавање ин виво улоге НПНТ-а у кости користећи генетски модификоване моделе миша.

Укратко, показали смо да се НПНТ изражава остеобластима, а његова експресија је смањена код остеопорозе. Надаље, открили смо и да НПНТ има директан утицај на активности ендотелних ћелија и регулише ангиогенезу путем п-38 и ЕРК путање. Ова студија показује улогу НПНТ-а као потенцијално важног молекула у комуникацији између остеобласта и ендотелних ћелија паракриним начином деловања. Ови подаци могу довести до развоја нових терапијских третмана за коштане болести и преломе.

Додатне Информације

Како цитирати овај чланак : Куек, В. и др . НПНТ се изражава помоћу ангиогенезе остеобласта и посредује активирањем киназе регулиране ванћелијским сигналом. Сци. Реп . 6, 36210; дои: 10.1038 / среп36210 (2016).

Напомена издавача : Спрингер Натуре остаје неутралан с обзиром на тврдње о надлежности у објављеним мапама и институционалној припадности.

Промени историју

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Додатне информације

Коментари

Подношењем коментара пристајете да се придржавате наших Услова и Смерница заједнице. Ако нађете нешто злоупотребно или то није у складу са нашим условима или смерницама, означите то као непримерено.