Нткрп, протеин кинезин-12, регулише величину ембриона / семена и клијање семена путем укључивања у напредовање ћелијског циклуса на прелазу г2 / м | научни извештаји

Нткрп, протеин кинезин-12, регулише величину ембриона / семена и клијање семена путем укључивања у напредовање ћелијског циклуса на прелазу г2 / м | научни извештаји

Anonim

Субјекти

  • Физиологија биљака
  • Развој семена

Апстрактан

Кинезини садрже супер-породицу моторних протеина заснованих на микротубулама који су укључени у есенцијалне процесе у развоју биљке, али је мало кинезина функционално идентификовано током развоја семена. Нарочито је идентификовано неколико кинезина који регулишу дељење ћелија током ембриогенезе. Овде извештавамо функционалну карактеризацију НтКРП, моторног протеина породице кинезин-12. НтКРП се претежно изражава у ембрионима и ембрионалним коренима. НтКРП РНАи линије приказале су смањење броја ћелија у меристематској зони, у дужини корена ембриона и у величини зрелог ембриона и семена. Поред тога, такође показујемо да се ЦДКА; 1 веже за НтКРП на местима консензусне фосфорилације и да је смањени број ћелија у ембрионима под притиском НтКРП услед кашњења у циклусу ћелијске деобе на прелазу Г2 / М. Поред тога, везивање између репног домена НтКРП и ЦДКА који се веже за терет; 1 је такође утврђена. Наши резултати откривају нови молекуларни пут који регулише развој ембриона / семена и критичну улогу кинезина у временској и просторној регулацији одређеног питања развоја ембриона.

Увод

Кинезини су важни моторички протеини који су свеприсутни у свим еукариотама. Хидролизирају АТП да производе директну силу дуж протофиламената микротубула (МТ) и покрећу вишеструке критичне ћелијске процесе, као што су транспорт везикула, кромосомска сегрегација и динамичка регулација МТ-а 1, 2, 3 . Сви чланови кинезинске супер-породице имају високо очуван језгрени моторни домен од 350 аминокиселина који садрже каталитичко место АТП-азе и вежуће место МТ-а 4 . Додатни домени варирају у својим аминокиселинским секвенцама и одговорни су за димеризацију, регулацију и интеракцију са другим молекулама 5 . Према филогенетској анализи заснованој на усклађивању моторичких домена, кинезини се могу груписати у 17 подгрупе 6, 7 . Будући да секвенце изван моторног домена често показују малу сличност, кинезини у истој поддружини нису нужно слични у својим функцијама 8 .

За време деобе ћелија, МТ се организују у динамичне структуре које покрећу различите фазе митозе. Кинезини су битан део овог процеса и делују као мотори, крећу се дуж МТ-а или контролишу њихову (де) полимеризацију. МТ низови биљака нису за разлику од оних животиња и укључују префазни појас и фрагмопласт, који играју критичну улогу у подели биљних ћелија. Биљкама недостају центросоми да организују МТ-ове при успостављању биполарног вретена и немају (или неколико) дининеина 9, који су такође минус-мотори. Дакле, биљкама су потребни нови кинезини за обављање специфичних биљних функција и за преузимање функција које дининеини обављају код животиња. До сада је показано да су за чланове кинезин-1, 4, 5, 7, 12, 13 и 14 подскупина укључене у митозу и мејозу у биљкама 10, 11, 12, 13, 14, 15 .

Међу кинезинима, они у поддружини кинезин-12 деле породични β-лист специфични за породицу и имају слабу хомологију на подручју завојнице завојнице Ц-терминала. Очување редоследа репа унутар ове породице указује на заједничку или сродну функцију (е) његових чланова 16 . И у животињама и у биљкама, чланови ове поддружине учествују у састављању биполарног вретена. У Арабидопсису , ПАКРП1 / Кинесин-12А и ПАКРП1Л / Кинесин-12Б су први функционално идентификовани кинезин-12 чланова 17 . Иста студија показала је њихову критичну улогу у организацији МТ-а фрагмопласта током цитокинезе у микроспори, што је битно за формирање ћелијских плоча. Фрагмопласт оријентисани кинезини 1 и 2 (ПОК1 / 2) су касније предложени да буду укључени у просторну контролу цитокинезе, будући да су одговарајући двоструки мутанти окарактерисани погрешним митотичким цитоскелетним низовима и погрешним ћелијским зидовима 18 . Занимљиво је да улоге кинезина ове поддружине у регулацији деобе ћелија током ембриогенезе и формирања семена захтевају опсежна испитивања.

Према анализама гена експресије у Арабидопсису , сачувана места о циклински зависној кинази А; 1 (ЦДКА; 1) фосфорилационих места присутна су у 14 од 23 кинезина који нису регулисани током митозе 19, што сугерише важност овог регулаторног механизма у функцији кинезина и у регулисању деобе ћелија. ЦДК-ови су део есенцијалне молекуларне машинерије која контролише напредовање ћелијског циклуса путем реверзибилне фосфорилације низводних ефектора 20, 21 . У животињским ћелијама ЦДКА фосфорилација регулише активност везања МТ чланова чланова кинезин-4, -5, -6 и -7 подгрупе, које су потребне за функционално митотичко вретено 22, 23, 24 . У биљкама је фосфорилација неопходна за тачну локализацију кинезина. Мутагенеза два суседна претпостављена места фосфорилације ЦДК у репној домени кинезина КЦА1 резултирала је да није успео правилно циљати протеин зелене флуоресценције (ГФП) на ћелијску плочу и мембрану плазме 25 . Штавише, фосфорилација сачуваних ЦДК места фосфорилације КЦА1 / КЦА2 у репној регији изазивала је конформацијске промене у њиховим структурама, што је имало последице за савијање и димеризацију 26 . У пиринчу, БЦ12, члан кинезин-4 подфамије, фосфорилира ЦДКА; 3 и умешан је у прогресију ћелијског циклуса 27 . До данас је само неколико места за везање ЦДК-а потврђено у кинезинима, мада су многи предвиђени. Заиста, врло мало кинезина активираних ЦДКА је идентификовано у биљкама. Будући да и кинезини и ЦДК чине велике породице, потребне су опсежне истраге да би се у потпуности разумели њихови функционални парови, специфична места везивања и јединствени утицај на развој биљака.

У овој студији, нови члан под-породице кинезин-12 изолован је од Ницотиана табацума . Овај цитоплазматски протеин, назван НтКРП (протеин Н. повезан с кинезином ), је димеризиран кроз своју стабљику завојницу завојнице. Непостојање консензусних места фосфорилације у репној домени НтКРП је значајна карактеристика и сугерише нову функцију овог протеина. Показало се да се НтКРП експримира у ткивима са активно дељеним ћелијама и у ембрионима у различитим развојним фазама. Смањење НтКРП резултирало је смањењем величине ембриона и семена услед смањеног броја ћелија узрокованих кашњењем преласка Г2 / М. Ови подаци подржавају виталну улогу НтКРП-а и у прогресији ћелијског циклуса и у проширењу ћелије у ембрионалном и постембрионском развоју. Ови подаци показују да НтКРП доприноси утврђивању величине ембриона / семена регулишући напредовање ћелијског циклуса.

Резултати

НтКРП кодира протеин кинезин-12

Фрагмент ДНК који садржи НтКРП прво је изолован из библиотеке цДНА дуванских ембриона. Одређивање кодирајуће секвенце показало је отворени оквир за читање пуне дужине (ОРФ) који кодира полипептид од 1194 аминокиселина (СФиг. 1А). Изведени полипептид има израчунату молекулску масу од 134 кДа и предвиђену изоелектричну тачку од 5, 52. Претрагом БЛАСТП-а у Националном центру за информације о биотехнологији (НЦБИ; //ввв.нцби.нлм.них.гов) открили смо да протеин дели карактеристике протеина повезаних са кинезином (КРП), укључујући сачувани моторни домен на Н-крајник, вратни везник одмах након овог домена, дугачка завојница завојнице и глобуларни репни домен. Н-терминални део протеина (аминокиселине 92–438) подсећа на кинезин моторни домен, који садржи добро очуване мотиве ССРСХ и ВДЛАГФЕ (СФиг. 1А), оба која су лоцирана на МТ-везним местима кинезина. Типична моторичка домена кинезина / КРП садржи АТП-везивно место које укључује високо очувани пептид ИФ / ВАИГКТГА / СГКС / Т. Одговарајућа секвенца у НтКРП била је ЛАИГКТГСГКТ (СФиг. 1А).

Да би се одредио однос НтКРП према члановима кинезинске супер породице, извршена је филогенетска анализа заснована на усклађивању секвенција моторних домена коришћењем методе спајања комшија (СФиг. 1Б). Резултат филогенетске анализе показује да гени кинезин-12 спадају у два потклапата, један садржи Арабидопсис ПАКРП1 и 1Л, а други садржи Арабидопсис ПОК1 / ПОК2 18 . НтКРП је у истој потклади као и Арабидопсис ПАКРП1 и 1Л (и Медицаго КИФ15) (СФиг. 1Ц).

НтКРП показује типичне кинезинске карактеристике

Кинесини често димерирају сами са собом ин виво кроз своје обмотане завојнице. У НтКРП-у, предвиђена област стабљике завојнице (СФиг 2) одмах следи везником врата. Да би се утврдило да ли је овај регион одговоран за димеризацију, аминокиселине 439–1194 НтКРП тестиране су у дво-хибридном тесту квасца. Резултати су показали да су ко-трансформанти добро расли на селективном медијуму (недостајали су Леу, Трп, Хис, и Аде; Сл. 1А), што указује на интеракцију између завојних области завојнице, за које се претходно показало да су одговорни за димеризацију. Ови резултати потврдили су способност НтКРП-а да димеризира кроз навојне калемове стабљике на исти начин као и типични кинезини.

Image

( А ) Идентификација димеризације НтКРП помоћу дво-хибридног теста квасца. Детаљи конструкција и мерења су описани у експерименталним поступцима. У доњем реду су приказани ко-трансформанти између намотаних намотаја у стабљици, а у горњем су негативни контроле. У првом реду су приказани ко-трансформанти који користе празан вектор као негативну контролу, а други ред показује ко-трансформаторе који користе фрагмент (ЦоилФ: 1315–2262 бп) намотаних завојница као негативну контролу. Завојница показује регион намотаних завојница (завојница: 1315–3582 бп) у НтКРП. Завојница као негативна контрола показује фрагмент (1315 бп – 2262 бп) намотане регије завојнице у НтКРП. ( Б ) Термограм седме ињекције у експерименту ИТЦ (плава: вредност експеримента; црвена: теоријско предвиђање са параметрима добијеним прилагођавањем криве). ( Ц ) Апсорбанција реакције на 340 нм да би се открила активност АТПазе пречишћеног моторног домена у присуству различите количине микротубула (МТ). М0 и М5 показују да су концентрације протеина рекомбинантног моторног домена одговарајуће 0 и 5 нМ. МТ0 и МТ3 и МТ5 указују да су концентрације микротубула (МТ) 0 µМ, 3 µМ и 5 µМ. ( Д ) Анализа способности НтКРП да везује микротубуле. Пречишћени МБП-НтКРП фузијски протеин моторног домена (МБП-Мотор) коришћен је за МТ (микротубуле) суод седиментацију, а албумин говеђег серума (БСА) је коришћен као негативна контрола. Микротубули и њихови повезани протеини су сакупљени центрифугирањем. Протеини супернатанта (С) и пелета (П) анализирани су помоћу СДС – ПАГЕ и визуелизовани Цоомассие плавим бојењем Р250. Промене промене су израчунате упоређивањем нивоа ко падавина са нивоом додавања АТП, који је постављен као 1.

Слика пуне величине

Глобуларна моторичка домена као део главе знак је кинезин суперфамилијских протеина. Овај добро очувани домен садржи и каталитички џеп за хидролизу АТП- и МТ-вежућих места 28, 29 . НтКРП такође поседује сачувани домен мотора. Да би се истражила његова својства, генерисан је рекомбинантни протеин који се састоји од моторног домена (аминокиселине 1-556) и затим се инкубира са МТ. Изотермална титрациона микрокалориметрија (ИТЦ) показала је да овај рекомбинантни моторни протеин показује активност АТП-а (Слика 1Б). При концентрацији МТ од 4, 4 µМ, Мицхаелисова константа (КМ , АТП ) је 2, 4 µМ, а каталитичка константа (к мачка ) 80, 3 с –1 . Ови подаци су у складу са уобичајеним карактеристикама кинезинске супер породице.

Даље смо испитали АТПазну активност рекомбинантног моторног домена у испитивању упареног ензима користећи различите концентрације МТ. Резултати су показали пораст ензимске активности моторног домена у присуству МТ-а и та активност била је пропорционална концентрацији МТ (слика 1Ц), што сугерише да НтКРП има АТПазну активност зависну од МТ (на ц АТП = 1 мМ, К 0, 5, МТ = 22 ± 12 µМ).

Способност НтКРП да везује МТ је испитивана на основу њихове ин витро седиментације. Протеин који веже малтозу (МБП) спојен са НтКРП-мотором који садржи домен НтКРП мотора је експримиран и пречишћен. У недостатку МТ-ова, овај протеин се појавио само у супернатанту (Сл. 1Д, стазе 1, 2), али када се инкубира са полимеризованим МТ-има у одсуству АТП-а, готово 50% МБП-НтКРП-Мотор коеципитира са МТ-ом. (Сл. 1Д, траке 5, 6). Када се нехидролизујући АТП аналог АМППНП користио уместо АТП-а, већина фузионисаних протеина остала је повезана са МТ-ом у пелету (Сл. 1Д, траке 7, 8), али сам МБП није приметио ко-талог са МТ. Додавање АТП значајно је смањило количину ко-седимената фузивног протеина (Сл. 1Д, траке 9, 10). Заједно, ови резултати подржавају идеју да се НтКРП веже за МТ на АТП осетљив начин.

НтКРП се изражава у меристематским ткивима и ембрионима у различитим развојним фазама

Експресија НтКРП је испитивана коришћењем РНА екстраховане из различитих ткива и РТ-ПЦР. Резултати су показали да су НтКРП транскрипти високо изражени у младим листовима, док сигнал није детектиран у стабљици, зрелом корену или цвећу (Сл. 2А). Овај образац експресије потврђен је Вестерн блоттингом користећи поликлонално анти-НтКРП антитело, у коме је сигнал детектован само у младом лиснатом ткиву (СФиг. 3).

Image

( А, Б ) РТ-ПЦР амплификација НтКРП у различитим органима, користећи ген α-тубулина као унутрашњу контролу. ( Ц – Л ) РНА ин ситу хибридизација НтКРП у биљкама дивљих врста. ( Ц ) Пресјек младог листа. ( Д ) Позадинске контроле ( Ц ), сондиране сензорском сондом. ( Е ) Пресјек празнине младог лишћа. ( Ф ) Контроле позадине ( Е ), сондиране сензорском сондом. ( Г ) Пресјек младог стабљике. ( Х ) Уздужни пресек младог стабљике. ( И, К ) Пресјек овула, приказује сигнале у глобуларном ембриону ( И ) и ембриону у облику срца ( К ), ( Ј, Л ) Позадинске контроле ( И, К ), сондиране сензорском сондом . Линија скале = 50 µм ( Ц - Ф ), 500 µм ( Г, Х ), 25 µм ( И, Ј ), и 50 µм ( К, Л ).

Слика пуне величине

Експресија НтКРП током ембрионалног развоја такође је испитивана коришћењем РТ-ПЦР, који је открио експресију гена углавном у зиготама и ембрионима, док је експресија у јајним ћелијама била врло слаба (Слика 2Б).

Користећи ин ситу хибридизацију, открили смо да је експресија НтКРП у младим листовима углавном ограничена на мезофил палисаде у ламинама (Сл. 2Ц, Д). Интензитет сигнала у петиолу био је нижи у васкуларном ткиву и епидерми него у ламини (Сл. 2Е, Ф); није откривен сигнал у стабљици (Сл. 2Г, Х). Исти приступ показао је да је НтКРП експримиран широм глобуларног ембриона (Сл. 2И, Ј), али у позном стадијуму ембриона у облику срца, позитивни сигнали су били углавном смештени у централним регионима, дуж апикално-базалне оси и горње тачке грана котиледони (Сл. 2К, Л).

Да бисмо стекли додатни увид у образац експресије НтКРП ин виво , генерисали смо трансгене биљке које носе проНтКРП :: ЕГФП и проНтКРП :: ГУС конструкте. Појачани ГФП (ЕГФП) био је снажно изражен у меристематским зонама коријена (Сл. 3А) и врха стабљике (Сл. 3Б) у младим листовима (Сл. 3Ц) и у овули (Сл. 3Д), али само слабо у постељица и једва да је зрело лишће. Интензивна флуоресценција такође је откривена у зиготама и ембрионима из двоцеличног проембриона до готово зрелог стадија ембриона, са много слабијим сигналом у јајним ћелијама (слика 3Е-Л), што указује да оплодња појачава његову експресију током процеса ембриогенезе. У суспензору је ЕГФП флуоресценција била јака у раној фази развоја (Сл. 3Х – К), али је брзо нестала из 32-целичног глобуларног ембриона према напријед, подударајући се са престанком деобе ћелије суспензора (Сл. 3Л-О). Откривање ГУС сигнала потврдило је да је промотор НтКРП активиран током ембриогенезе (СФиг. 4А-Ц), са високим нивоом ГУС активности у апикалном мерилном систему (СФиг. 4Д, Е), младим листовима (СФиг. 4Ф) и бочни коријен примордиал и врхови коријена (СФиг. 4Г, Х). Међутим, ГУС сигнал није дистрибуиран преко целог врха корена, већ је углавном локализован у региону дељења, и није откривен сигнал на врховима изван меристематске зоне (СФиг. 4Х, И). ГУС сигнал такође није постојао из зрелог лишћа, стабљика и цветова. Ови резултати су показали да се НтКРП углавном експримира у ткивима са активно дељеним ћелијама и у ембрионима, и самим тим да НтКРП игра улогу у процесима који се односе на ћелијску деобу, ембриогенезу и постембрионски развој.

Image

( А, Б ) ЕГФП се изражава углавном у меристематској зони врха коријена ( А ) и вршка стабљике ( Б ). ( Ц ) ЕГФП изражен у младим листовима. ( Д ) ЕГФП изражен у овулама. ( Е ) ЕГФП се слабо изражава у јајним ћелијама. ( Ф ) ЕГФП изражен у зиготама. ( Г ) Релативни интензитет флуоресценције јаја, зиготе и њихових дивљачи. ( Х - П ) ДИЦ слике. (Х1-П1) ЕГФП изражен у различитим развојним периодима ембриона. ( Х, Х1) Двоцелични проембрио. ( И, И1) Четвероцелични проембрио. ( Ј, Ј1) Осмеростатични заметак. ( К, К1) Мали куглични заметак. ( Л, Л1) Глобуларни ембрион. ( М, М1) Троугласти заметак. ( Н, Н1) Ембрион у облику срца. ( О, О1) ембрион у облику торпеда. ( П, П1) Зрели ембрион. Пошто је ћелијска подела хипокотила престала, флуоресцентни сигнал је нестао ( Л - О ); када је ембрион сазрео, интензитет флуоресцентног сигнала опада ( П ). (Р-З1) Различите фазе развоја заметака из СРИ дивљег типа као контроле. Ламеле скале = 20 µм ( А ), 50 µм ( Б ), 1 мм ( Ц, Д ), 10 µм ( Е, Ф ), 25 µм ( Х, И, Р, С, Х1, И1, Р1, С1), 50 μм ( Ј-О, Т-И, Ј1-О1, Т1-И1) и 100 μм ( П, П1, З, З1).

Слика пуне величине

НтКРП се налази искључиво у цитоплазми, а Тхр1104 у репној домени је неопходан за одређивање његове специфичне локације

Да бисмо проучили субцелуларну локализацију НтКРП, НтКРП у пуној дужини, моторни домен и репни домен су лиговани ЕГФП, дајући конструкте про35С :: НтКРП-ГФП , про35С :: Таил-ГФП и про35С :: Мотор-ГФП респективно, пролазна трансфекција плазмида у епидермалне ћелије Н. бентхамиана показала је сличне обрасце дистрибуције НтКРП-ГФП и Таил-ГФП фузионисаних протеина, са локализацијом у цитоплазми, али не и у језгру, док је мотор-ГФП откривен цитоплазме и у језгру (СФиг. 5А – Ц).

Субцелијска локација НтКРП-ГФП такође је испитана у дуванским БИ-2 ћелијама (СФиг. 6А, Б). Поново је контрола дистрибуирана у цитоплазми и језгру (СФиг. 6Ц, Д). Слично томе, у епидермалним ћелијама листа Н. бентхамиана , НтКРП-ГФП је такође био ограничен на цитоплазму (СФиг. 6Е, Ф). Ови подаци указују да специфична локација НтКРП зависи од његове репне домене.

У силиконској анализи НтКРП откривен је мотив ЛИГ_ФХА_1 у трећем домену намотаних завојница који је укључен у везивање терета. Хипотетизирали смо да Тх1104 овог мотива модулира интеракцију кинезина и протеина са доменом повезаним с вилицом (ФХА) да би одредио локализацију НтКРП. Да бисмо тестирали ову хипотезу, конструисали смо мутант-Тхрл104-супституирани. Мутант је изгубио своју ексклузивну цитоплазматску локализацију и налазио се у цитоплазми и језгру (СФиг. 5Д). Ови резултати сугерирају да је Тхр1104, у трећем домену завојнице завојнице, кључан за одређивање специфичне локације НтКРП.

НтКРП РНАи трансгене линије стварају мање ембрионе и семенке

Да бисмо истражили функцију НтКРП, конструисали смо прекомерну експресију и РНАи векторе покретане од 35С и нативног НтКРП промотора, за даљу трансгеничну анализу (СФиг. 7А). Ћелијске линије трансформисане празним векторима и дивљим типом СР1 коришћене су као контроле. Све трансгене линије су потврђене ПЦР-ом. Међутим, конструкцијом прекомерне експресије, нисмо успели да добијемо трансгене линије које су испољавале високе нивое НтКРП (подаци нису приказани). У трансгеничним биљкама које су биле заражене са два РНАи конструкта (КЦ и КФ), НтКРП је значајно смањен на око 10% дивљег нивоа, што је одређено квантитативном РТ-ПЦР (РТ-кПЦР; сл. 4А). Вестерн блоттинг потврдио је ефектан нокаут НтКРП у КЦ и КФ РНАи линијама (СФиг. 7Б). Ове линије са очигледном смањењем експресије НтКРП изабране су за даљу фенотипску анализу.

Image

( А ) Релативни нивои експресије НтКРП у РНАи садницама и дивљи тип помоћу РТ-кПЦР. Ниво експресије НтКРП у ВТ постављен је на 1. ** Означава статистички значајну разлику у поређењу са ВТ (т-тест, п <0, 01). ( Б - Д ) Зрели ембриони биљака дивљег типа ( Б ) и РНАи ( Ц ). ( Д ) За поређење, увећана слика приказује зреле ембрионе из РНАи (лево) и дивљих (десно) биљака. ( Е ) Дужина зрелих ембриона биљака дивљих врста и РНАи. Вредности су средња ± СД ( н ≥ 111). ( Ф, Г ) Уздужни прикази ћелија радикала у зрелим ембрионима биљака дивљег типа ( Ф ) и РНАи ( Г ). ( Х, И ) Уздужни прикази котиледонских ћелија у зрелим ембрионима биљака дивљег типа ( Х ) и РНАи ( И ). Ћелијске површине радикула ( Ј ) и котиледона ( К ) дивљих врста и РНАи биљака. Вриједности су средње вриједности ± СД ( н ≥ 87 и н ≥ 129, респективно). ( Л ) Број ћелија у радикалима дивљих врста и РНАи биљака. Вриједности су средње вриједности ± СД ( н ≥ 16). Линија скале = 500 µм ( А, Б ), 250 µм ( Ц ) и 15 µм ( Е-Х ).

Слика пуне величине

Пошто се НтКРП експримира на високим нивоима и током ембриогенезе, истраживали смо ембрионални развој трансгених биљака РНАи. Резултати су показали мали утицај избацивања протеина на брзину постављања семена, структуру ембриона и развој ендосперма. Користећи изоловане ембрионе, показали смо да иако РНАи ембриони достижу зрелост и имају нормалну структуру, они су значајно мањи од контролних (Сл. 4Б-Е). Да би се утврдио узрок овог смањења величине, зрели ембриони су сакупљени од дивљих и трансгених биљака, а величина ћелије и број ћелија квантификовани су. Због изразитих разлика у облицима и величинама радикала и котиледона, углавном смо истраживали ове две структуре. Ћелије у обе структуре су значајно мање у трансгеничним линијама него у контролним линијама (сл. 4Ф-К) и њихов број је био значајно мањи, око 15% у трансгеничним линијама РНАи у поређењу са контролним линијама (сл. 4Л).

Семе духана углавном заузимају зрели ембриони. Мерења величине семена и тежине хиљада зрна и трансгених линија РНАи и дивљег типа показала су да су семенке прве значајно мање (СФиг. 8А – Д) и да су тежиле знатно мање од својих дивљих врста (СФиг 8Е). Ови резултати указују да смањивање НтКРП утиче на развој ембриона узрокујући смањење величине ембриона / семена, а самим тим и приноса семена.

На клијање раста утиче током клијања семена у трансгеничним линијама НтКРП РНАи

Пошто је НтКРП такође изразито изражен у кореничном апикалном меристему, испитан је развој корена у трансгеничним линијама РНАи. У поређењу са контролама, трансгена садница је споро расла. Иако стопа клијања трансгених семенки није значајно измењена (СФиг. 9А), требало им је више времена да продуже своје радикуле на одговарајућу дужину и да продуже своје котиледоне (Сл. 5А-Д). Микроскопија је показала да је коријенска меристематска зона била значајно краћа у трансгеним линијама него у контроли (Сл. 5Е – Г). Криве раста ћелија коријена након клијања илустрирале су много спорији раст трансгених линија РНАи (Сл. 5Х). Даљњим мерењима је показано да је скраћивање зона дељења коријена биљака РНАи настало због значајно смањеног броја ћелија у меристематској зони (сл. 5И, Ј), упркос врло сличним количинама ћелија (подаци нису приказани) и да је мирни центар структура је остала непромењена (СФиг. 9Б). Поред тога, дужина зоне издужења је јасно смањена у односу на контролу (Сл. 5К). Меристематске ћелије живог коријенског врха су такође обојене пропидијум-јодидом (ПИ: 10 µг / мл). Резултати су показали да се ћелије мерено мешају да би створиле врло регуларни ћелијски узорак у врховном врху корена. Супротно томе, меристематске ћелије са коријенским врхом РНАи су имале неуредне ћелијске шаре и неправилне облике. Резултати сугерирају да је дошло до закашњених и погрешно оријентисаних дељења ћелија и можда су одговорни за неправилан образац ћелија (Сл. 10).

Image

( А - Д ) Семе 72 х и 96 х после клијања биљака дивљих врста ( А ) и КЦ1-5 ( Б ) и КФ18-2 ( Ц ) РНАи. ( Д ) Увећане слике садница са све три врсте биљака истовремено након клијања. ( Е - Г) Врхови коријена биљака дивљих врста ( Е ) и биљака КЦ1-5 ( Ф ) и КФ18-2 ( Г ) РНАи. Црвене линије означавају дужину меристематске зоне. ( Х ) Крива раста коријена дивљих врста и трансгених биљака РНАи. Вредности су средње вредности ± СД ( н ≥ 15). ( И ) Дужина коријенске меристематске зоне дивљих врста и РНАи биљака. Вредности су средња ± СД ( н ≥ 15). ( Ј ) Број ћелија у коренској меристематској зони биљака дивљих врста и РНАи. Вредности су средње вредности ± СД ( н ≥ 12). ( К ) Дужина ћелија у зони продужења коријена дивљих врста и РНАи биљака. Вредности су средња ± СД ( н ≥ 12). Ламеле скале = 4 мм ( А - Ц ), 2 мм (у Д ) и 20 μм ( Е - Г).

Слика пуне величине

Дакле, силазна регулација НтКРП-а углавном је резултирала ретардацијом раста ембрионалног корена смањењем броја ћелија у меристематској зони и променама у продужењу ћелија у зони диференцијације.

НтКРП је потребан за прелазак фазе Г2-М током дељења ћелије

Да би се дефинисала специфична фаза ћелијског циклуса која је захваћена НтКРП линијама, ДНК профили језгра коријенског врха дивљег типа и две трансгене линије прегледани су коришћењем проточне цитометрије (Сл. 6А). У трансгеничним коренима РНАи, мање ћелија је било у фази Г1 јер је већина била у Г2, што је резултирало нижим односом Г1 / Г2 него у коренима дивљег типа (слика 6Б), вероватно зато што су ћелије биле блокиране на прелазу Г2 / М, такав да је мало људи успело да пређе на М фазу.

Image

( А ) ДНК профили обојених ПИ језграма корена врха мере дивљи тип и НтКРП-ове линије у проточном цитометру. ( Б ) Квантификација ДНК профила у ( А ). ( Ц ) Релативни нивои експресије гена специфичних за фазу Г2-М у НтКРП линији и тихој врсти. Двоструке звездице означавају разлике у односу на дивљи тип (т тест при п <0, 01).

Слика пуне величине

Основни регулаторни механизми који управљају ћелијским циклусом и преласком Г2 / М ослањају се на ЦДК комплексе и транскрипционе факторе. Стога смо користили РТ-кПЦР за испитивање нивоа експресије циклинских гена (ЦИЦ), ЦДК гена и гена који кодирају Миб факторе транскрипције у трансгеничним и дивљим садницама РНАи. Два ЦИЦ гена, три ЦДК гена и два гена који кодирају транскрипционе факторе смањили су се за 25–50% у трансгеничним линијама РНАи у поређењу са дивљим типом. Ови подаци су указивали да је експресија гена специфичних за Г2 / М смањена у трансгеничним линијама расипаних НтКРП (Сл. 6Ц), и да је за Г2 / М транзицију потребна нормална функција гена.

НтКРП вероватно регулише ЦДКА; 1 током напредовања ћелијског циклуса

ЦДК комплекси доприносе прогресији ћелијског циклуса фосфорилирањем низводних ефектора 20 . Наши резултати показали су да НтКРП поседује пет мотива активирања митозе (МСА) 30, 31 смештених у 1280 бп узводно од НтКРП АТГ стартног кодона, два консензусна ЦДКА места фосфорилације (СПВК и СПРР) на Н-терминалу НтКРП и шест уништавања (Д-) поља (Табела 1). Ове карактеристике секвенце сугерирају да је активност НтКРП регулисана ЦДКА; 1 фосфорилација.

Табела пуне величине

Да би се утврдило интеракцију НтКРП са ЦДКА; 1, НтКРП фрагменти који садрже једно или два места фосфорилације тестирани су коришћењем квасаца са два хибрида (Сл. 7А). Сви фрагменти су у интеракцији са ЦДКА; 1. ГСТ тест пада даље је потврдио да НтКРП садржи две фосфорилационе локације које директно комуницирају са ЦДКА; 1 ин витро (слика 7Б). Ин виво интеракција НтКРП и ЦДКА; 1 је истражена БиФЦ анализом. Ћелије су трансформисане са фосфорилираним фрагментима НтКРП-П (НтКРП-П)-цИФП и ЦДКА; 1-нИФП који садржи две локације фосфорилације показао је снажну флуоресценцију, док флуоресцентни сигнали нису добијени из ћелија трансфицираних једним плазмидом или НтКРП-П -цИФП и Х2А-нИФП као негативне контроле (Сл. 7Ц). Узето заједно, ин виво и ин витро докази потврдили су да НтКРП фрагмент који садржи два места фосфорилације директно и специфично у интеракцији са ЦДКА; 1.

Image

( А ) Идентификација интеракције између места фосфорилације НтКРП и ЦДКА; 1 помоћу дво-хибридног теста квасца. Стрелице означавају два места фосфорилације на НтКРП. пГБКТ7-П53 / пГАДТ7-Т и пГБКТ7-Лам / пГАДТ7-Т служе као позитивна и негативна контрола. ( Б ) Идентификација фрагмента места фосфорилације НтКРП НтКРП-П (1-754аа) интерактивно делује са ЦДКА; 1 ин витро испитивањем. М представља маркер молекуларне тежине који показује 120 КДа, 100 КДа, 85 КДа, 70 КДа и 60 КДа од врха до дна, респективно. Хис-П указује да је протеин фракције НтКРП фосфорилације НтКРП-П (1-754Аа) означен са Хис. Негативна контрола указује да протеин у траци није могао успешно да сруши ЦДКА; 1 протеин. ( Ц ) Идентификација фрагмента места фосфорилације НтКРП НтКРП-П (1-754аа) у интеракцији је с ЦДКА; 1 ин виво помоћу БиФЦ теста. ( Д ) Анализа коекспресије НтКРП и ЦДКА; 1 у различитим ткивима биљке дувана. ( Е ) Тест ин витро киназе ЦДКА; 1. Хистон Х3.3 коришћен је као супстрат.

Слика пуне величине

Пошто је, генерално, протеин и његови интерактивни протеини просторно и временски коекспримирани, испитали смо експресију НтКРП и ЦДКА; 1 у различитим органима у биљкама дувана. РТ-кПЦР анализа је показала да су НтКРП и ЦДКА; 1 били високо експримирани у меристематским ткивима, као што су врх корена, ткива врхова врхова и ембриони, у различитим развојним фазама, и потврдили њихову просторну и временску коекспресију (Слика 7Д). Штавише, анализа киназе показала је да је ЦДКА1 клонирана из дуванског генома аутентична киназа која може фосфоритирати њен супстрат (Сл. 7Е).

НтКРП поседује треће ЦДКА везивно место у домену стабљике-репа

У горе описаном дво-хибридном тесту квасца, поделили смо НтКРП пуне дужине у неколико фрагмената и испитали интеракцију између места фосфорилације НтКРП и ЦДКА; 1. Будући да фрагменту репне домене (аминокиселине 754–1194) НтКРП недостају сачувана места фосфорилације, коришћен је као негативна контрола. Неочекивано је, међутим, интеракција између репне домене НтКРП и ЦДКА; 1 такође откривена у дво-хибридној анализи кваса (Сл. 8А). The authenticity of the interaction between this third site and CDKA;1 was verified in an in vitro GST pull-down assay (Fig. 8B) and an in vivo BiFC analysis (Fig. 8C). Data from both experiments showed that the tail domain of NtKRP directly and specifically interacts with CDKA;1, despite the lack of a conserved phosphorylation site in this region.

Image

( A ) Identification of the NtKRP tail domain NtKRP-T (754-1194aa) interaction with CDKA;1 by yeast two-hybrid assay. High-stringency selective plates lacking leucine, tryptophan, histidine and adenine were used to grow interacting clones. The yeast α-galactosidase activity was determined in plates containing X-α-gal (2 mg/ml) as a chromogenic substrate. The vectors and expressed proteins are indicated. pGBKT7-P53/pGADT7-T serves as positive control. pGBKT7-Lam/pGADT7-T and pGBKT7-NtKRP-TF/pGAD-CDKA;1 serve as negative controls. TF indicates the fragment (2263–2982 bp) of the tail domain. ( B ) Identification of the NtKRP tail region interaction with CDKA;1 in vitro by GST pull-down assay. M represents marker proteins showing 200 KDa, 150 KDa 120 KDa, 100 KDa, 85 KDa, 70 KDa and 60 KDa from the top to the bottom, respectively. ( C ) Identification of the NtKRP tail domain interaction with CDKA;1 in vivo by BiFC assay.

Слика пуне величине

Дискусија

Kinesins are MT-based motor proteins that release energy via ATP hydrolysis. That energy is used to move along the cytoskeleton and to perform a wide range of cell functions 1, 32, 33 specified by particular domains on the kinesin proteins 8, 34, 35 . The Arabidopsis genome contains the largest number of kinesins among all eukaryote genomes sequenced thus far 36 . In higher plants, PKH (pollen kinesin homolog) and NtKRP5 from tobacco pollen tubes and tobacco phragmoplasts, respectively, were the first to be identified 37, 38, 39, 40 . Some of kinesins and kinesin like proteins has been investigated and confirmed their role in cell division during menryogenesis 41, 42 . Unlike kinesins in animal cells, most plant kinesins (including many from Arabidopsis ) have yet to be adequately characterized 12, 43, 44, 45 .

In this study, we showed that NtKRP shares domains with other kinesins. A biochemical assay of the motor domain of NtKRP confirmed its MT-dependent ATP hydrolysis activity. An MT co-sedimentation assay in vitro demonstrated that NtKRP possesses ATP-dependent MT-binding activity and that its coiled-coil stalk domain is required for dimerization. Together, these results established NtKRP as an authentic kinesin. The result of phylogenetic analysis shows that NtKRP is in the same sub-clade as Arabidopsis PAKRP1 and 1L (and Medicago KIF15). Our work also showed that three CDK-binding sites exist in NtKRP. Consensus CDKA phosphorylation sites are characterized by the sequence S/TPXK/R, which targets them for phosphorylation. Of the three sites in NtKRP, two were shown to consist of the consensus CDKA;1-binding and phosphorylation sites, SPVK or SPRR, whereas yeast two-hybrid and GST pull-down assays followed by BiFC showed that the third is unlike all predicted conserved phosphorylation sites. This implies that NtKRP is a new member of the kinesin family with notable structural features and therefore, perhaps, unusual functions.

CDKs regulate cell-cycle progression by the reversible phosphorylation of downstream effectors 20, including kinesin. Genes encoding CDK-regulated kinesins are typically characterized by the presence of an MSA in the promoter sequence, a D-box, and consensus CDK phosphorylation sites. These three features coordinately drive the activation of gene expression at the start of M phase 31, 46 . In budding yeast, CDKA drives spindle pole separation by the direct phosphorylation of kinesin-5 motors 47 . Phosphorylation of kinesin-5 EG5 and KLP61F at a consensus CDKA phosphorylation site is necessary to localize these proteins to the mitotic spindle in Xenopus laevis egg cells and Drosophila melanogaster embryos, respectively 48, 49 . Other animal kinesins phosphorylated by CDKA;1 belong to the chromokinesin/kinesin-4, CENP-E/kinesin-7, and MKLP1/kinesin-6 subfamilies 22 . However, in plants, little is known about the kinesin activities regulated by CDKA phosphorylation. In Arabidopsis , phosphorylation at the consensus CDKA;1 phosphorylation site sequence in KCA provokes a conformational change in its structure, with implications for folding and dimerization 26 . Predicted CDKA phosphorylation sites are present in 14 of the 23 mitosis-related Arabidopsis kinesins identified thus far 19 . According to our work, NtKRP possesses not only the two classic conserved CDKA;1 phosphorylation sites, but also five MSAs in the 1280 bp upstream of the NtKRP ATG start codon as well as six D-boxes. These NtKRP sequence characteristics conform to features indicative of CDKA phosphorylation. We were able to verify a direct interaction between CDKA;1 and NtKRP at its phosphorylation sites in both in vitro and in vivo experiments. We also confirmed the capacity of CDKA;1 from tobacco to phosphorylate its substrate. Therefore, our data strongly suggest that NtKRP is regulated by CDKA;1 phosphorylation during cell division.

Previous work has indicated that the function of kinesin in transporting cellular cargoes involves the coiled-coil and globular regions of the tail domain 50 . We found that CDKA;1 binds to the stalk-tail part of NtKRP, which lacks conserved CDKA phosphorylation sites and is typically a region for cargo binding. According to the available classification, KIFs implicated in transporting identified cargoes belong to the kinesin-1, 2, 3, 4, 6, and 14 subfamilies. The interactions between kinesins and cargos have mainly been studied in fungi, animals, and humans, and little is known about these interactions in plants. Since the stalk-tail region was both necessary and sufficient for cargo association, the independent binding of CDKA;1 to this domain suggests the possibility that during cell division, CDKA;1 is delivered as cargo by NtKRP to its appropriate functional site.

In conclusion, NtKRP is a new member of the kinesin-12 subfamily required for ensuring the proper size of embryos/seeds and for seed germination. NtKRP may be regulated by CDKA;1 and involved in regulating cell-cycle progression and cell expansion. When NtKRP is downregulated, the cell cycle is delayed at G2/M, preventing entry of the cells into M phase and ultimately leading to smaller embryo/seeds due to the decreased cell number.

Материјали и методе

Биљке

N. tabacum L. cv. Petite Havana SR1 and Nicotiana benthamiana plants used in this study were grown in pots at 25 °C in a greenhouse under a 16-h light/8-h dark cycle or axenically in incubators.

Full-length NtKRP cDNA cloning and promoter isolation

Differential display RT-PCR was used to isolate a DNA fragment from a tobacco cDNA library of heart-shaped embryos prepared in our laboratory. The full-length NtKRP cDNA was cloned by rapid amplification of the cDNA ends (RACE) using the SMART (Invitrogen) technique according to the manufacturer's instructions. The NtKRP promoter was isolated using the Genome Walker DNA Walking method with the Genome Walker Universal Kit (Clontech). After sequencing, NtKRP promoter of 3153 bp upstream ATG regions was successfully isolated. The NtKRP promoter sequence ligated with EGFP and GUS sequences respectively was first cloned into pUC vector. They were then released by AscI and PacI restriction digestion and further cloned in pBINplus binary vector in the same restriction sites. The fusion constructs containing NtKRP promoter-EGFP/GUS in pBINplus were further transformed into N. tabacum wild-type SRI and generated transgenic plants carrying proNtKPR::EGFP and proNtKRP::GUS constructs.

Филогенетске анализе

Homologous sequences of NtKRP from different organisms were obtained from the NCBI using BLASTP. Multiple sequence alignments were conducted using CLUSTALW (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw). The resulting alignments were applied in the generation of neighbor-joining trees using MEGA5.0.

Biochemical properties of NtKRP

The ATPase activity of NtKRP was determined by ITC and UV spectrometry using the steady-state ATPase assay-coupled enzyme system (//www.proweb.org/kinesin). ITC measurements were carried out at 25.0 °C using VP-ITC titration calorimetry (MicroCal). Sample cells were loaded with 1.43 mL of 23.5 nM motor protein (amino acids 1–556), 1.67 μM of MTs, and 10 μM taxol (Sigma-Aldrich) in BRB80 buffer (80 mM PIPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 50 mM NaCl, pH 6.8); reference cells were loaded with double-distilled deionized water instead of motor protein. Titration was carried out using a syringe filled with 11.44 mM ATP in BRB80 buffer, with stirring at 300 rpm. A titration experiment consisted of 10 consecutive injections of a 25 μL volume. To correct for the heat effects of dilution and mixing, a control experiment was performed by injecting the ATP complex solution into buffer alone.

For the steady-state ATPase assay-coupled enzyme system, the pyruvate kinase-coupled assay for ATPase was performed using a spectrophotometer (Thermo Spectronic Biomate 5, Thermo Electron). The 150-μL solutions containing 10 μM taxol, 1 mM ATP, 3 mM phosphoenolpyruvate, 0.2 mM NADH, 3 U pyruvate kinase (PK), 3 U lactate dehydrogenase, 5 nM NtKRP protein, and 0–5 μM MTs were quickly placed into a UV-VIS spectrophotometer and the absorbance at 340 nm was measured at 10-s intervals.

MT sedimentation assay

MTs were prepared by incubating tubulin proteins suspended in PEM buffer (80 mM PIPES, 1 mM MgCl 2 and 1 mM EGTA, pH 6.8) containing 1 mM GTP and 10 μM taxol (Sigma-Aldrich) at 37 °C for 1 h. The MT pellet was collected by centrifugation; nonpolymerized tubulin proteins remained in the supernatant. The MT sedimentation assay was performed in 100-μL reactions containing 25 μg MTs, 50 μg NtKRP-motor, and 10 μM taxol in PEM in the presence or absence of ATP or AMPPMP (5 μM). The samples were incubated at room temperature for 30 min and then centrifuged for 20 min at 25, 000× g and 25 °C. Both the supernatant and the pellet were analyzed by sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Proteins in the two fractions were visualized by staining the gels with Coomassie Brilliant Blue R250 (Sigma-Aldrich).

Анализа гена експресије

Tobacco eggs and zygotes were isolated as described previously 51, 52, 53, 54 . The isolated single egg cells or zygotes were then thawed in a 10-μL reverse transcription (RT) mixture consisting of 0.025 g Oligo dT(18–20) (Invitrogen)/L, 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl 2, 100 μM dNTP, 20 mM dithiothreitol, 4 U RNaseOUTTM recombinant ribonuclease inhibitor (Invitrogen)/μL, and 5 U SuperScript II (Invitrogen)/μL. The RT reaction was performed in a thermocycler (T1 Biometra) at 42 °C for 90 min and the product was used in a PCR with LA Taq polymerase (TaKaRa) according to the manufacturer's instructions but with the cycle number adjusted to 45. The α-tubulin gene served as the internal control. Isolation of the embryos at different developmental stages and single-embryo RT-PCR were described previously 52 . Total RNA was extracted from roots, stems, leaves, root tips, stem tips, and flowers using the TRIzol reagent (Ambion). Total RNAs were digested with RNase-free DNase I (Promega) and cDNA was synthesized using Transcriptor reverse transcriptase (Roche), followed by RT-qPCR. All the primers used in this work are listed in Table 2.

Табела пуне величине

RNA in situ hybridization was performed as described previously 55 . The 3′ end of NtKRP was subcloned into the pGEM-T Easy vector (Promega) and used as a template to generate RNA probes. Hybridization was performed on wax-embedded transverse sections (10 μm thick) using the digoxigenin (DIG)-labeled probe (Roche). The reactions were visualized by the addition of 3-amino-9-ethylcarbazole and counterstained with hematoxylin. The slides were observed under a light microscope (Leica) and photographed using a charge-coupled device (CCD) camera.

For Western blotting, tissues of wild-type and transgenic plants were ground in liquid nitrogen and homogenized in extract buffer (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 20% glycerol, and 2 mM β-mercaptoethanol). After centrifugation at 12, 000 rpm for 15 min, SDS-PAGE of the supernatant was carried out using a 10% polyacrylamide gel. The separated proteins were blotted onto a nitrocellulose membrane (Amersham; //www. Gelifesciences.com) and probed with an anti-NtKRP polyclonal antibody against the polypeptides comprising amino acids 760–899 generated in rabbit as follows: The 420-bp segment (amino acids 760–899) (Fig. S2A) from NtKRP, corresponding to a 15.8-kDa protein, was amplified and expressed in E. coli BL21 cells (Fig. S2B) and then purified using affinity purification (Fig. S2C) followed by ion-exchange chromatography (Fig. S2D). The polyclonal antibody was collected from the serum of rabbits immunized with the protein and its specificity for NtKRP in tobacco was tested by Western blotting (Fig. S2E).

RNAi vector construction and tobacco transformation

The 181-bp conserved region, and the 218-bp flexibility region of NtKRP were cloned into pKANNIBAL vectors to generate pKANNIBAL-KC/KF respectively. After the constructs were confirmed by sequencing, they were subcloned as Not I fragments into the binary vector pART27 to produce intron-containing “hairpin” RNA-silencing constructs (pART27-KC, pART27-KF). The pART27-derived constructs and the control empty vector pART27 were introduced into A. tumefaciens GV3101 by electroporation and transformed into N. tabacum wild-type SR1 plants by the leaf disc method.

Seed germination and root growth curves

Tobacco seeds were germinated in glass culture dishes (ø 3 cm, 100 seeds/dish) containing 1 mL of ½ Murashige and Skoog (MS) liquid medium. Germination frequencies were calculated after 2 days of incubation at 25 °C in a growth chamber. At least three replicates were produced.

For root growth curves, tobacco seeds of wild-type and RNAi plants were surface-sterilized for 1 min in 70% ethanol and 8 min in 10% sodium hypochlorite (4% active chlorine), rinsed three times with sterile water, and vernalized for 48 h at 4 °C. The seeds were planted on ½ MS solid medium containing 1% sucrose and then incubated at 25 °C with 16 h of illumination. After seed germination, the locations of the root tips were recorded daily at the same time. At least three replicates were produced. Images were collected by scanning with and analyzed using ImageJ software (//rsb.info.nih.gov/ij/).

Embryo and root tip analysis

Embryo and root tips were fixed in Carnoy's fluid (ethanol:acetic acid = 3:1, v/v) on ice for 15 min, then placed directly into Hoyer's solution (30 g arabic gum, 200 g chloral hydrate, 20 g glycerine in 50 mL of water) for whole-mount clearing. After 24 h, the slides were observed under an inverted phase-contrast microscope (Olympus CK-30) and a Leica DMIRE 2 fluorescence microscope equipped with a cooled CCD camera (RS image MicroMAX, Princeton Instruments). Images were analyzed using ImageJ software.

Flow cytometric analysis of nuclear DNA content

To determine cell-cycle progression, the nuclear DNA contents of wild-type and NtKRP -silenced transgenic plants were compared by flow cytometry. Root tips (1–2 mm) were collected and chopped immediately in Galbraith's buffer using fresh razor blades for each sample. The released nuclei were filtered through a 300-μm mesh into a sample tube. Propidium iodide (50 μg/mL) was used to stain nuclear DNA in the presence of RNase (50 μg/mL). The stained cells were analyzed by flow cytometry, measuring at least 10, 000 nuclei per sample 56 .

Yeast two-hybrid screening and assay

Yeast two-hybrid screening was performed according to the protocol provided and the Matchmaker GAL4 two-hybrid system manual (Clontech). NtKRP-Tail (amino acids 754–1194) was cloned in pGBKT7, generating a fusion with the Gal4 DNA-binding domain, pGBKT7-NtKRP-Tail. A tobacco shoot apex and young leaf tissue cDNA library was constructed using the vector pGADT7 containing the Gal4 activation domain (AD) in host strain AH109. The yeast host strain Y187 was transformed with pGBKT7-NtKRP-Tail as bait, and the cDNA library was screened using the yeast mating method. Cells were selected on medium lacking Leu, Trp, His, and Ade (SD/–Leu/Trp/His/Ade), resulting in ~1000 clones, 408 of which were positive for X-α-gal activity. After analyzing their cDNA inserts via restriction enzyme digestion and sequencing, these plasmids were used to transform E. coli DH5α cells. To verify these clones, we retransformed yeast strain AH109 with either pGBKT7-NtKRP-Tail or the pGBKT7 empty vector together with the candidate plasmids to repeat the two-hybrid assays. The final positive candidate plasmids were selected and confirmed by sequencing.

Fragments including both phosphorylation sites (1–2262 bp), the first site (1–450 bp), the second site (1315–2262 bp), or the tail domain (2263–3582 bp) were generated by PCR and ligated into the pGBKT7-Rec vector (Clontech). CDKA;1 was amplified from N. tabacum SRI cDNA and inserted in-frame into the pGADT7-Rec (Clontech) to generate pGADT7-CDKA;1. All of the constructs were confirmed by sequencing. Yeast strain AH109 was co-transformed with pGBKT7-NtKRP-Px (where x indicates the various NtKRP fragments) and pGADT7-CDKA;1 using a standard lithium acetate transformation protocol. The co-transformants were then screened on medium without Leu and Trp. The strength of the protein–protein interactions was measured by the ability of the cells to grow on SD/–Leu/Trp/His/Ade medium.

Site-specific mutagenesis and subcellular localization of NtKRP

To determine the exact subcellular localization of NtKRP and its different regions, cDNAs of full-length NtKRP (amino acids 1–1194), its motor (1–556) and the tail fragment (755–1194) were fused in-frame with EGFP and inserted between the CaMV 35S promoter and the NOS terminator in the pUC19 vector. Onion epidermal cells were transfected with the expression constructs or with a control construct containing EGFP alone using the PDS-1000/He System according to the manufacturer's protocol (Bio-Rad). In addition, full-length NtKRP expression constructs were used to transiently transfect leaf epidermal cells of N. benthamiana to observe the cellular locations of the encoded proteins.

To mutate threonine 1104 (Thr1104), full-length NtKRP cDNA was first digested using Xho I and Xmn I. In the resulting fragment, Thr1104 was replaced with alanine during PCR amplification. The Xho I– Xmn I digested fragment in the vector was displaced by the mutated Xho I– Xmn I fragment. The mutant construct was confirmed by sequencing and then used to transform E. coli DH5α cells.

Bimolecular fluorescence complementation (BiFC)

For BiFC, the vectors pSPYNE-35S and pSPYCE-35S were digested with Hin dIII and Eco RI. Fragments containing the expression cassettes were inserted into the plant transformation vector pCAMBIA1300, generating pCAMBIA-SPYNE and pCAMBIA-SPYCE. The cDNA regions encoding the tail domain and both phosphorylation sites of NtKRP were inserted into pCAMBIA-SPYNE to generate pCAMBIA-SPYNE-Tail and pCAMBIA-SPYNE-P. CDKA;1 and negative control histone H2A were cloned into pCAMBIA-SPYCE, yielding pCAMBIA-SPYCE-CDKA;1. The BiFC constructs were introduced into A. tumefaciens strain GV3101 via electroporation, and the resulting bacterial suspension was delivered into N. benthamiana leaf cells by infiltration 57, 58 . The transformed plants were kept at 25 °C for 2 days. Enhanced YFP signals in leaf epidermal cells were observed using fluorescence microscopy.

ГСТ падајући тестови

CDKA;1, the phosphorylation sites (P: 262–1812 bp), and the tail domain (Tail: 2263–3582 bp) of NtKRP were cloned into the prokaryotic expression vectors pGEX4T-1 and pET28a to generate pGEX4T-1-CDKA;1, pET28a-P and pET28a-Tail, respectively. The GST/His-tagged proteins were expressed in E . coli BL21 (DE3) cells. GST-CDKA;1, GST-Tail and His-P/His-Tail were incubated with 50 μL of immobilized glutathione resin at 4 °C for 1 h and 2 h, respectively. The resins were then washed with 1 mL of 100 mM glutathione elution buffer (Pierce), and the eluted proteins were transferred to nitrocellulose membranes. GST- and His-tagged proteins were detected using mouse anti-GST and mouse anti-His monoclonal antibodies (1:10, 000 and 1:6000 dilution, respectively; Tiangen Biotech).

Kinase activity assay

The experiment was performed as described previously 59 . Briefly, recombinant human histone H3.3 was phosphorylated by GST-CDKA;1 in a 50-μL reaction containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2, 0.2 mM ATP, 40 μg of histone H3.3, and 2500 U of GST-CDKA;1. After incubation of the samples at 37 °C for 30 min, the reaction was stopped by the addition of 2× SDS-PAGE loading buffer. The kinase activity of GST-CDKA;1 was examined by Western blotting.

Accession Numbers

Sequence data used in this work can be found in the GenBank (//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank) under following accession number: NtKRP (KP100646), CDKA;1 (L77082).

Додатне Информације

How to cite this article : Tian, S. et al. NtKRP, a kinesin-12 protein, regulates embryo/seed size and seed germination via involving in cell cycle progression at the G2/M transition. Сци. Rep. 6, 35641; doi: 10.1038/srep35641 (2016).

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Додатне информације

Коментари

Подношењем коментара пристајете да се придржавате наших Услова и Смерница заједнице. Ако нађете нешто злоупотребно или то није у складу са нашим условима или смерницама, означите то као непримерено.