Пин1 инхибира пп2а посредовану рб депхосфорилацију у регулацији ћелијског циклуса и оштећења ДНА на с-фази | ћелијска смрт и болест

Пин1 инхибира пп2а посредовану рб депхосфорилацију у регулацији ћелијског циклуса и оштећења ДНА на с-фази | ћелијска смрт и болест

Anonim

Субјекти

  • Оштећења и поправка ДНК
  • Онкогенеза
  • Пост-транслационе модификације

Апстрактан

Инактивација протеина ретинобластома (Рб) има кључну улогу у туморигенези. Добро је утврђено да је функција Рб у великој мери регулисана динамичном равнотежом фосфорилације и депосфорилације. Иако је урађено много истраживања да би се разумели механизми и функција РБ фосфорилације, регулација Рб депосфорилације још увек није добро схваћена. У овој студији показујемо да Пин1 има важну улогу у регулацији функције Рб у прогресији ћелијског циклуса и контролној тачки С-фазе при оштећењу ДНК. Показујемо да се џеп Рб Ц директно везује за Пин1 ВВ домен ин витро и ин виво , те да је фосфорилација Рб Ц-џепа помоћу комплекса киназе зависних од Г1 / С од Циклин / Циклин критична за посредовање ове интеракције. Даље показујемо да заустављање ћелијског циклуса посредовано Рб и прерано ћелијско старење изазвано са Рб ефикасно инхибирају експресијом Пин1. Поред тога, оштећење ДНК индукује Рб депосфорилацију на ПП2А-зависан начин, а овај процес инхибира Пин1. Надаље, прекомјерна експресија Пин1 промовира Рб хиперфосфорилацију након оштећења ДНА на С-фази. Важно је да су и ефект на контролној тачки С-фазе потребни и Пин1 ВВ домен и активност изомеразе. Штавише, превелика експресија Пин1 је у корелацији са Рб хиперфосфорилацијом у биопсијама рака дојке. Ови резултати показују да Пин1 има критичну улогу у модулацији Рб функције регулирањем депосфорилације Рб, што може имати важну патолошку улогу у развоју рака.

Главни

Протеин ретинобластома (Рб), кодиран геном РБ1 , је критични регулатор напредовања ћелијског циклуса и има важну улогу у бројним аспектима биологије, укључујући одговор оштећења ДНК, апоптозу, старење и диференцијацију. 1, 2, 3, 4, 5 Рб је важан регулатор ћелијског циклуса који делује претежно везањем и инхибицијом трансактивације гена факторима транскрипције Е2Ф, што би у супротном изазвало експресију гена који појачавају напредовање ћелијског циклуса. Рб веже Е2Ф протеине кроз Рб домен великог џепа (РбЛП), који укључује две сачуване домене А и Б, као и џеп са Ц-терминалом (РбЦ). А и Б домени, који се заједно називају мали џеп Рб (РбСП), посредују везивање за специфичне регулаторне протеине и онкопротеине који садрже сачувани ЛКСЦКСЕ мотив. 6, 7, 8, 9 Показало се да је џеп за Рб Ц неопходан за посредовање интеракције Рб са Е2Ф. 10 Поред тога, РбЦ се директно везује за МДМ2, који инхибира Рб надмећући се са Е2Ф за везивање, као и промовишући разградњу Рб протеасомом. 11, 12

Биолошка функција Рб је критично регулисана фосфорилацијом протеина. Хипофосфорилирани Рб у интеракцији је с Е2Ф, чиме дјелује као биолошки активни облик Рб. Супротно томе, хиперфосфорилирани Рб није у стању да веже Е2Ф протеине, омогућавајући тако Е2Ф да промовише напредовање ћелијског циклуса. 1, 13 Током ћелијског циклуса, Рб фосфорилација се примарно изводи од Цицлин / Цицлин-зависне киназе (ЦДК) комплекса; 4, 14, 15, 16 Циклин Д / ЦДК4 / 6 су почетне киназе до фосфорилата Рб, затим Циклин Е / ЦДК2, а затим Циклин А / ЦДК2. Већина места фосфорилације Цицлин / ЦДК налазе се у РбЦ. 4, 17 Дефосфорилација Рб протеин-фосфатазом 1 (ПП1) и протеин-фосфатазом 2А (ПП2А) током митотског излаза враћа Рб у хипофосфорилирано стање, у складу са потребном регулацијом новог ћелијског циклуса. 18, 19, 20

Рб има кључну улогу у регулисању напредовања ћелијског циклуса током нормалних и стресних услова. Оштећење ДНК на С-фази изазвано зрачењем, оксидативним стресом или хемотерапеутским агенсима као што су цисплатин или етопозид, доводи до брзе депосфорилације и активације зависне од ПП2А, што резултира сузбијањем синтезе ДНК и заустављањем ћелијског циклуса. Штавише, показало се да ПП2А побољшава функцију Рб према инхибицији репликације ДНК врбовањем хипофосфорилираног Рб на места за контролу репликације. 19, 20, 21, 22

Пролил изомераза Пин1 веже се и модулира бројне протеине који учествују у ћелијској пролиферацији, диференцијацији, одговору оштећења ДНК, апоптози и развоју. 23, 24 Пин1 се састоји од Н-терминала ВВ домена за специфичну интеракцију протеина и Ц-терминалног каталитичког пептидил-пролил изомеразе (ППИасе) домена. Пин1 специфично катализује цис до транс изомеризације остатака пролина у строго фосфорилираним деловима серина / треонин-пролина (пС / ТП), утичући на функцију супстрата, стабилност, субцелуларну локализацију и / или својства која међусобно делују. 25, 26, 27

У овој студији описујемо молекуларни механизам помоћу којег Пин1 модулира Рб функцију у прогресији ћелијског циклуса и у контролној тачки индукованој оштећењем ДН-а на С-фази. Показујемо да се Пин1 специфично везује за хиперфосфорилирани Рб и инхибира ПП2А-посредовану Рб-депосфорилацију. Поред тога, заустављање ћелијског циклуса посредовано Рб и прерано ћелијско старење изазвано са Рб ефикасно се инхибирају експресијом Пин1. Слично томе, недостатак Пин1 доводи до ненормалног Рб депосфорилације након оштећења ДНА на С-фази, што резултира неисправном контролном тачком С-фазе. Стога ова студија сугерира нови молекулски механизам у којем Пин1-посредована модулација Рб-фосфорилације има важну улогу у развоју рака.

Резултати

Пин1 се посебно везује за џеп Рб Ц

Термин Рб Ц садржи неколико С / ТП мотива, што су вјероватно мјеста за везање Пин1. Стога смо испитали да ли Пин1 може физички да комуницира са Рб користећи падајући тест. Као што је приказано на слици 1а, и ГСТ-Пин1 и ГСТ-Пин1-ВВ су ефикасно повукли ендогени Рб из ћелија лизата остеосаркома У2-ОС, док домен ГСТ-Пин1-ППИасе није могао да веже Рб. Поред тога, точкасте мутације у домену Пин1 ВВ код В34А или И23А, две аминокиселинске резидуе критичне за везивање супстрата Пин1, 28 је укинуо Пин1-Рб интеракцију (слика 1а). Ови резултати указују на то да Рб посебно комуницира са Пин1 ВВ доменом.

Image

Пин1 ВВ домен директно се везује за хиперфосфорилирани Рб Ц џеп. ( а ) У2-ОС ћелијски лизати су инкубирани целовитом дужином, скраћеним или мутираним Пин1-ГСТ фузионим конструкцијама и након тога подвргнути ГСТ падајућем тесту, као што је приказано. Протеини су раздвојени помоћу СДС-ПАГЕ и имуноблотирани антителом специфичним за Рб (горња плоча). Упоредиви нивои улазних ГСТ или ГСТ фузијских протеина су приказани Цоомассие плавим бојењем (доњи панел). ( б ) У2-ОС ћелије су пролазно трансфициране са целом дужином Рб, РбЛП, Рб мали џеп (РбСП) или Рб Ц-џепом (РбЦ). Укупни протеин (500 µг) подвргнут је пада ГСТ теста користећи рекомбинантни ГСТ-Пинл или ГСТ као контролу, а затим је анализиран западним блотлингом ради везивања Рб. Укупни протеин (10 μг) из сваког лизата ћелије директно је учитан као улазна контрола. ( ц ) Х1299 ћелије су подвргнуте имунофлуоресценцији, као што је приказано. (д) Ћелијски лизати из ћелија Х1299 који стабилно експримирају ФЛАГ-Пин1 или пЛВКС вектор су подвргнути имунопреципитацији са анти-ФЛАГ М2 афинитетним гелом и имуноблотирани за фосфорилирани Рб (пРб) на Сер807 / 811 (С807 / 811) или Пин1, као што је приказано . ( е ) У2-ОС ћелијске лизате подвргнуте су имунопреципитацији антителом специфичним за Пин1 или контролним ИгГ и имуноблокираним за Рб, као што је приказано

Слика пуне величине

Да бисмо даље дефинисали интеракцију Пин1-Рб, изразили смо различите конструкције Рб протеина у ћелијама У2-ОС и подвргли ћелијске лизате ГСТ-Пин1 спуштању. Као што је приказано на слици 1б, Пин1 је у интеракцији са РбЛП целе дужине, као и са РбЛП (укључујући домене А, Б и Ц), али не и са малим џепом Рб (РбСП, укључујући А и Б домене), што сугерише да је Рб Ц-џеп (РбЦ) је важан за Пин1 интеракцију. Заправо, сам РбЦ добро је комуницирао са Пин1, што указује да је Рб Ц џеп неопходан и довољан за интеракцију Рб-Пин1. Штавише, приметили смо ендогену ко-локализацију Пин1-Рб имунофлуоресценцијом у не-станичним ћелијама карцинома плућа Х1299 (слика 1ц), као и везивањем ин виво ко-имунопреципитацијом у ћелијама Х1299 и У2-ОС (слике 1д и е ).

Пин1-Рб интеракција је индукована Г1-С Цицлин посредованом Рб фосфорилацијом

ЦДК су првенствено одговорни за фосфорилацију Рб. Како се већина места фосфорилације ЦДК налази у џепу Рб Ц, 4, 17, испитали смо да ли ЦДК-посредовани Рб сигнали фосфорилације за Пин1-Рб интеракцију. Пин1 је преференцијално везан за хиперфосфорилиране, спорије мигрирајуће Рб врсте. Третман У2-ОС ћелија росковитином, моћним инхибитором ЦДК, резултирао је значајном акумулацијом хипофосфорилираног Рб, што показује бржа миграција хипофосфорилираних врста Рб. Третман росковитином укида Пин1-Рб интеракцију, што указује да је фосфорилација Рб потребна за везање Пин1-Рб и да се Пин1 преферирано везује за хиперфосфорилирани Рб, али не и за хипофосфорилирани Рб (слика 2а).

Image

Пин1-Рб интеракција је индукована Г1-С Цицлин посредованом фосфорилацијом. ( а ) У2-ОС ћелије су третиране вехиклом (диметил сулфоксид, ДМСО) или 30 μМ росковитина током 18 х. Ћелијски лизати (500 µг укупног протеина) су уклоњени са ГСТ-Пин1, а затим је прошао западни блотмент за Рб. Укупни протеин (30 μг) је учитан као улазна контрола. Хипер-пРб, хиперфосфорилирани Рб; Хипо-пРб, хипофосфорилирани Рб. ( б ) Дијаграм РбЛП-а који означава седам пС / ТП места на којима се веже Пин1 везање унутар Рб Ц-џепа (РбЦ), као и две мутације са двоструком тачком на Ала (С807А; С811А, деноминовано 2С и Т821А; Т826А, деноминовано 2Т) и мутације свих Сер или Тхр остатака на Ала остатке (7А) коришћене за студије везивања РбЦ-Пин1. ( ц ) У2-ОС ћелије су трансфициране са ВТ или мутантним РбЛП. Ћелијски лизати су подвргнути ГСТ-Пинл тесту и пропадање западног блота за Рб ради процене везивања. ( д ) Саос-2 ћелије су кофефициране са Рб заједно са Цицлин А, Цицлин Б1, Цицлин Д1, Цицлин Е или векторском контролом, као што је приказано. Ћелијски лизати су подвргнути пуцању ГСТ-Пин1, а затим западном блотирању за Рб

Слика пуне величине

Рб Ц џеп садржи седам пС / ТП мотива (слика 2б). Да бисмо истражили улогу ових претпостављених Пин1-везујућих места у интеракцији Пин1-Рб, изразили смо дивљи тип (ВТ) или мутантни РбЛП у ћелијама У2-ОС и упоредили њихову способност да вежу Пин1. Двострука супституција С807 и С811 аланиним остацима (РбЛП-2С) практично је укинула Пин1-Рб интеракцију. Исто тако, комбиноване мутације Т821А и Т826А (РбЛП-2Т) значајно инхибирају везање Пин1-Рб, мада у мањем степену. Штавише, РбЛП-7А, у коме је свих седам остатака серина или треонина супституисано аланином, потпуно је изгубила интеракцију са Пин1 (слика 2ц).

Затим смо испитали утицај специфичних Цицлин / ЦДК комплекса на Рб-Пин1 интеракцију. Кофефицирали смо ћелије Саос-2 са Рб и разним Цицлин-експресионирајућим плазмидима и подвргли лизатима ћелија ГСТ-Пин1 тесту, а затим имуноблотирањем за Рб. Одлучили смо да користимо Саос-2 ћелије јер су Рб-нулл и показују низак ниво ендогене ЦДК активности. Као што је приказано на слици 2д, коекспресија Рб са Цицлин Д1, Цицлин Е или Цицлин А драматично је повећала Пин1-Рб интеракцију, док је коекспресија Цицлин Б1 имала мало ефекта, упркос упоредивим нивоима експресије протеина. Ови подаци указују на то да је фосфорилација Рб помоћу Г1- и С-фазе циклин-повезаних киназа пресудан сигнал за Рб-Пин1 интеракцију.

Пин1 инхибира ПП2А посредовану Рб депосфорилацију

Како су наши резултати показали да се Пин1 веже за хиперфосфорилирани Рб, истражили смо да ли интеракција Пин1-Рб утиче на Рб фосфорилацију. Као што је приказано на слици 3а, ћелије мишјег ембрионалног фибробласта (МЕФ) са недостатком Пин1 показале су очигледан пад хиперфосфорилираних врста Рб код Сер807 и Сер811. Поред тога, аблација Пин1 резултирала је повећаним нивоом хипофосфорилираног Рб у ћелијама Х1299 (Слика 3б). Хипофосфорилирани Рб чврсто се повезује с нуклеарном овојницом и захтијева високе концентрације соли за дисоцијацију, док је хиперфосфорилирани Рб растворљив у нижим концентрацијама соли. 29 Према томе, да бисмо даље испитивали утицај Пин1 на Рб фосфорилацију, третирали смо хумане епителијске ћелије МЦФ-10А хумане нетрансформисане ћелије које експримирају Пин1 или векторску контролу са или без екстракционог пуфера који садржи 0, 1% Тритон-Кс-100 и 250 мМ НаЦл. Третирање ћелија које експримирају Пин1 екстракцијским пуфером резултирало је дисоцијацијом Рб из језгра у знатно већем обиму него у контролним ћелијама (слика 3ц), што указује да се Рб веже мање чврсто на нуклеарни матрикс након експресије Пин1. Ови подаци заједно показују да је Пин1 важан у одржавању хиперфосфорилације Рб.

Image

Пин1 инхибира Рб ПП2а-посредовану дефосфорилацију. ( а ) МЕФ ћелијски дефицијентни ВТ или Пин1 (Пин1 - / - ) подвргнути су Вестерн блот анализи за укупне нивое Рб (Пан-Рб), фосфорилирани Рб (пРб) на Сер807 / 811 (С807 / 811), Пин1 или Ацтин. ( б ) Х1299 ћелије су инфициране рекомбинантним ретровирусом који експримира схРНА против Пин1 или векторском контролом. Целоћелијски лизати подвргнути су се западном блотирању, као што је приказано. ( ц ) МЦФ-10А ћелије су стабилно трансфициране са ПЛВКСпуро векторском контролом (Вец) или ПЛВКС-Пин1 (Пин1). Стабилне ћелије су третиране са или без екстракционог пуфера и накнадно подвргнуте имунофлуоресценцији за Рб и супротстављене ДАПИ. ( д ) Пептиди Рб Ц-џепа (РбЦ) ин витро су фосфорилирани и обележени комплексима Цицлин Е / ЦДК2 са γ - [ 32 П] -АТП као што је описано у Материјалима и поступцима. [ 32 П] фосфорилирани РбЦ пептиди са обележјем су затим инкубирани са БСА, окадеичном киселином или ВТ или мутантним ГСТ-Пин1 фузионим протеинима, пре инкубације са ПП2А назначени пута. Реакције дехосфорилације заустављене су додавањем СДС пуфера за узорке. Узорци су анализирани помоћу СДС-ПАГЕ праћене ауторадиографијом

Слика пуне величине

Како је показано да Пин1 регулише активност ПП2А, 26, 30, 31 и да је ПП2А важан за Рб депосфорилацију, 19, 20, изводили смо ин витро експерименте са дефосфорилацијом да бисмо испитали утицај Пин1 на дефосфорилацију Рб посредовану са ПП2А. РбЦ фрагменти су ин витро фосфорилирани и радиоактивно обележени коришћењем [ 32 П] Цицлин Е / ЦДК2, претходно инкубираном са ВТ или мутантом Пин1, и инкубирани са ПП2А у назначеним временским интервалима, након чега је уследила СДС-полиакриламид гел електрофореза (СДС-ПАГЕ) и ауторадиографија. Као контрола коришћена је паралелно окадаинска киселина, која посебно инхибира активност ПП2А у малим концентрацијама, 32 или говеђи серумски албумин (БСА). Као што је приказано на слици 3д, [32П] означен РбЦ је брзо дефосфорилиран ПП2А када је прединкубирана БСА, док је преинкубација окадаичном киселином потпуно блокирала Рб депосфорилацију. Запањујуће је да дефосфорилација Рб помоћу ПП2А значајно инхибира ВТ Пин1, али не и мутантним дериватима. Ови резултати указују да је Пин1 способан да ин витро инхибира Рб-посредовану Рб депосфорилацију.

Пин1 инхибира заустављање ћелијског циклуса посредованог Рб и старење изазвано Рб

Како наши подаци показују да Пин1 инхибира Рб депосфорилацију, задржавајући на тај начин Рб хиперфосфорилирану, која није у стању да веже Е2Ф, истражили смо утицај Пин1 на Рб функцију према инхибицији активности Е2Ф. У ту сврху користили смо репортер луциферазе (ДХФР-Луц) вођен промотором дихидрофолат редуктазе, који је доброверни низ Е2Ф. Кофефицирали смо ДХФР-Луц са или ВТ Пин1 или Пин1-В34А у Рб-позитивне У2-ОС ћелије, након чега су проведени тестови активности луциферазе. ВТ Пин1, али не Пин1-В34А, значајно је стимулисао активност Е2Ф репортера у У2-ОС ћелијама. Са друге стране, ектопична експресија Пин1 у Рб-нулл Саос-2 ћелијама није успела да индукује Е2Ф репортерску активност (Слика 4а). Да бисмо проценили биолошки значај ове регулације, утишали смо Рб и / или Пин1 експресију у ћелијама Х1299. Опет, аблација Пин1 довела је до повећања хипо-пРб и смањеног нивоа хипер-пРб (Слика 4б). Анализа проточне цитометрије ових ћелија показала је да је кноцкдовн Пин1 резултирао заустављањем Г1 ћелијског циклуса, што је ефективно враћено након истодобног рушења Рб (Слика 4ц). Поред тога, показало се да ектопична експресија Рб у Саос-2 ћелијама (Рб-нулл и п53 нула) индукује прерано станично старење. 33 У складу са овим опажањима, експресија Рб у Саос-2 ћелијама довела је до повећане ћелијске старосценције, што се манифестује равном и повећаном морфологијом ћелија (слика 4д), те повећаном активношћу β- галактозидазе (СА- β -Гал) са старосценцијом. (Слика 4е). Приметно, истодобна Пин1 експресија у ћелијама које експримирају Рб значајно је поништила ове ефекте, док мутирани Пин1 (В34А) није могао да утиче на ћелијску старење изазвану Рб (слике 4д и е). Ови подаци сугерирају да Пин1 инхибира заустављање заустављеног ћелијског циклуса и Рб-индуцирано старење.

Image

Пин1 инхибира Рб функцију у напредовању и старењу ћелијског циклуса. ( а ) У2-ОС (Рб-позитивне) или Саос-2 (Рб-нулл) ћелије кофефициране су ВТ или мутираним Пин1, или векторском контролом, заједно са ДХФР-луцифераразом (ДХФР-Луц) који реагује на Е2Ф1 репортер и експресиони плазмид β- галактозидазе. Ћелије су лизиране 24 сата након трансфекције и подвргнуте испитивању активности луциферазе и П- Галактозидазе. Активност ДХФР-Луц је нормализована на активност β- галактозидазе као што је описано у Материјалима и поступцима и представљена је као кратка активација. Резултати представљени као средства и СЕ од три независна експеримента изведена у троструком извештају. ** П <0, 01 ( б ) Х1299 ћелије су биле стабилно заражене схРНА против Рб, Пин1 или контролне групе, и одабране резистенцијом на пуромицин. Ћелијски лизати су подвргнути Вестерн блотингу, као што је назначено. ( ц ) Стабилне ћелије Х1299 су подвргнуте проточној цитометрији ради анализе стадијума ћелијског циклуса. ( д и е ) Саос-2 ћелије су кофефициране са Рб и / или ВТ или мутираним Пин1, или векторском контролом, и одабране резистенцијом пуромицина, како је описано у Материјалима и поступцима. Стабилне ћелије су узгајане у нормалном медију за раст уз додатак 0, 5 µг / мл пуромицина током 10 дана. Ћелије су затим визуелно приказане под светлосним микроскопом за анализу великог / равног фенотипа ( д ) или су подвргнуте обојењу с β- галактозидазом ( е ). Ћелије су оцењене и представљене као проценат обојених ћелија у односу на укупне ћелије. Резултати су представљени као репрезентативне слике и средње вредности и СЕ из три независна експеримента. Најмање 300 ћелија се броји за свако стање

Слика пуне величине

Пин1 модулира Рб фосфорилацију током напредовања ћелијског циклуса

Рб има важну улогу на контролној тачки С-фазе у ћелијском одговору на оштећење ДНК. Након γ- зрачења или оксидативног стреса, Рб се активира помоћу дефосфорилације, што резултира блокадом синтезе ДНК и заустављањем ћелијског циклуса С фазе. 19, 20 Како Пин1 модулира Рб фосфорилацију, истраживали смо улогу Пин1 у регулацији Рб фосфорилације током контроле контролне тачке С фазе. ВТ или Пин1 - / - МЕФ ћелије су синхронизоване на С-фази третманом апхидицолином, што је довело до повећања хиперфосфорилираног Рб и у ВТ и Пин1 - / - МЕФ (слика 5а, траке 2 и 8), што указује да је Рб хиперфосфорилиран током С-фаза γ- зрачење ВТ МЕФ фаза С-фазе резултирало је Рб депосфорилацијом у 8 сати након зрачења. Супротно томе, дефосфорилација Рб код Пин1 - / - МЕФ је била евидентна већ 2 сата након озрачивања, што је довело до значајно смањеног нивоа Рб фосфорилације у поређењу са ВТ МЕФ (слике 5а и б).

Image

Пин1 модулира Рб депосфорилацију у контроли ћелијског циклуса. ( а ) ВТ или Пин1 - / - МЕФ ћелије су синхронизоване са ахидицолином и затим γ- озрачене (20 Ги). Узорци су сакупљени сваких 2 сата током 8 сати и подвргнути се западном блотирању, као што је приказано. ( б ) Рс фосфорилација је квантификована анализом дензитометрије и изражена је у проценту Рб фосфорилације у нули. ( ц ) ИМР90 ћелије су биле стабилно заражене аденовирусом који експримира ГФП и ХА1-означен Пин1 (Ад-Пин1), сам СВ40 мали т антиген (Ад-ст), или сам ГФП (Ад-ГФП). Ћелије су синхронизоване са 1.0 мМ хидроксиурее током 18 х, ослобађане и затим γ- зрачене (20 Ги). Узорци су прикупљени 6 сати након озрачивања и подвргнути се западном блотирању, као што је приказано. ( д ) Х1299 ћелије су стабилно заражене Ад-ГФП, Ад-ст или Ад-Пин1. Шест сати након инфекције, ћелије су синхронизоване са 100 нг / мл нокодазола током 18 сати. Митотске ћелије су уздрмане и узгајане у свежем медију током назначених времена. Целоћелијски лизати подвргнути су се западном блотирању како је назначено. Фосфорилација Рб квантификована је дензитометријском анализом и изражена је у проценту Рб фосфорилације у нули. ( е ) Рс фосфорилација је квантификована дензитометријском анализом, нормализована на актин и изражена као проценат Рб фосфорилације у нули

Слика пуне величине

Испитали смо да ли ектопична експресија Пин1 може утицати на Рб фосфорилацију на контролној тачки С-фазе. Ћелије ИМР90 које стабилно експримирају или Пин1 или ГФП су синхронизоване хидроксиурејом (ХУ) и затим су пуштене у С-фазу пре излагања γ- зрачењу. Као контрола, анализирали смо ћелије које експримирају СВ40 мали т антиген (ст), за који се показало да инхибира активност ПП2А, што доводи до виших нивоа хиперфосфорилираног Рб. 34, 35 и- зрачење драматично је смањило хиперфосфорилирани Рб. Експресија СВ40 ст довела је до значајно повећаног нивоа хиперфосфорилираног Рб након γ- зрачења. Слично томе, ектопична експресија Пин1 резултирала је Рб хиперфосфорилацијом у С-фази, иако мањој него у ћелијама које експримирају СВ40 ст (слика 5ц). Узето заједно, ови подаци сугерирају да Пин1, попут СВ40 ст, може одржати Рб фосфорилацију инхибицијом ПП2А као одговор на оштећење ДНК у С-фази.

Како је показано да Рб остаје хиперфосфорилиран током целијског циклуса до касне М-фазе 15, 16, истраживали смо да ли је Пин1 утицао на Рб-депосфорилацију на М-фази. Ћелије Х1299 стабилно експримирају ГФП, ст или Пин1 синхронизоване су са нокодазолом и затим су ослобођене. Као што се очекивало, Рб се брзо ослобађа од дефосфорилирања након ослобађања из нокодазола у контролним ћелијама (слике 5д и е), док је СВ40 драматично инхибирао дефосфорилацију. Слично томе, експресија Пин1 касни са Рб депосфорилацијом (слике 5д и е). Према томе, ови подаци сугерирају да Пин1 има улогу у регулацији Рб фосфорилације на митотичком излазу.

Пин1 има улогу на контролној тачки С фазе

Како Рб има критичну улогу у контроли контролне тачке С фазе по оштећењу ДНК, а наши подаци указују да Пин1 може да регулише активност Рб модулацијом Рб фосфорилације, истражили смо улогу Пин1 у контроли контролне тачке на оштећењу ДНК током С-фазе. Ћелије Х1299 стабилно експримирају Пин1, СВ40 ст или ГФП синхронизоване су на С-фази са ХУ, а затим су ослобођене и потом изложене зрачењу од 20 Ги γ . Ћелије су затим обележене са БрдУ. γ -зрачење је довело до значајне инхибиције синтезе ДНК у контролним ћелијама, као што се очекивало, док је експресија СВ40 ст или Пин1 резултирала вишим нивоима уградње БрдУ након оштећења ДНК (слика 6а), што сугерише да Пин1 може да спречи контролну тачку С фазе као одговор на оштећење ДНК.

Image

Пин1 има критичну улогу у контроли контролне тачке С фазе. ( а ) Х1299 ћелије су заражене аденовирусом који експримира ГФП и ХА1-означен Пин1 (Ад-Пин1), сам СВ40 мали т антиген (Ад-ст) или сам ГФП (Ад-ГФП). Ћелије су синхронизоване са 1.0 мМ ХУ током 18 х, а затим су ослобођене, праћене и-зрачењем и обележене са 5-бромо-2'-деоксиуридином (БрдУ). Ћелије су затим фиксиране, обојене анти-БрдУ антителом, супротстављене ДАПИ и визуелизоване флуоресцентном микроскопијом. Резултати су нормализовани на нетретиране контроле. За свако стање је забележено најмање 100 ћелија. Резултати су изражени као средство и СЕ из три независна експеримента. * П <0, 05 ( б ) Х1299 ћелије су стабилно трансфициране са схРНА против Пин1 (схПин1) или векторском контролом (Вец), и аденовирусом који кодира Пин1 (Ад-Пин1), као што је назначено. Стабилне ћелије су подвргнуте РДС тесту на следећи начин: ћелије су претходно обележене са [14Ц] -тимидином ради обезбеђивања унутрашње контроле садржаја ДНК, синхронизоване са 1.0 мМ ХУ током 18 х, а затим ослобођене. Ћелије С-фазе су биле изложене градијентним дозама γ- зрачења, а затим су пулс обележен са [3Х] -тимидином у току 15 мин. Релативна ДНК синтеза је одређена као однос уградње [3Х] -тимидина у [14Ц] -тимидина и нормализована у одговарајућу нерадирадилирану контролу. ( ц ) РДС испитивања су изведена у ВТ или Пинл - / - МЕФ ћелијама као што је горе описано. * П <0, 05; ** П <0, 01 ( д и е ) ВТ или Пинл - / - МЕФ ћелије су трансфициране са ХА означеним ВТ или мутантним Пин1 (В34А или Р68, 69А), или са векторском контролом, као што је приказано. ( д ) Експресија протеина је процењена Вестерн блоттингом. ( е ) Ћелије су подвргнуте РДС тесту као што је горе описано. Резултати представљени као средња [3Х] -тимидинска инкорпорација и СЕ из три независна експеримента

Слика пуне величине

Затим смо испитали ефекте пригушивања Пин1 у контролној тачки С-фазе изазване инфрацрвеном употребом тестова радиорезистентне ДНК (РДС). Стабилне ћелије које експримирају схРНА специфичну за Пин1 прво су обележене метил- [14Ц] -тимидином, синхронизоване на С-фази и ослобођене, а затим подвргнуте γ- зрачењу (5 или 10 Ги), након чега је следило пулсно обележавање метил- [ 3Х] -тимидин за одређивање количине текуће синтезе ДНК након оштећења ДНК. Изложеност зрачењу са 5 и 10 Ги γ довела је до смањења од 15 и 20% у примени [3Х]-тимидина. Приметно, аблација Пин1 даље је смањила синтезу ДНК након оштећења ДНК, што је резултирало смањењем уградње [3Х]-тимидина за преко 30%. Поред тога, ови ефекти су ефективно враћени реконституцијом Пин1 експресије (слика 6б). Ови подаци указују на чињеницу да Пин1 има важну улогу у контролној тачки С-фазе коју индукује ИР.

Да бисмо даље испитали улогу Пин1 у контроли контролне тачке С фазе, извели смо РДС тестове у МЕФ-има са недостатком Пин1 и ВТ. Иако је γ- зрачење ВТ МЕФ ћелија довело до смањења синтезе ДНК зависног од дозе, недостатак Пин1 довео је до даље смањене синтезе ДНК (слика 6ц). Затим смо поново увели или ВТ Пин1, Пин1 са недостатком везивања Р1 (В34А), или Пин1 (Р68, 69А) са оштећењем у изомеразној активности, 36 у Пин1 - / - МЕФ. Експресија ВТ и мутантног Пин1 потврђена је Вестерн блоттингом (слика 6д). Доследно, тестови РДС показују да је недостатак Пин1 довео до смањене уградње [3Х]-тимидина након γ- зрачења, што је ревертирано ВТ Пин1, али не и Пин1 (В34А) или Пин1 (Р68 / 69А) (Слика 6е). Ови подаци сугеришу да су способност Пин1 да веже Рб и његова активност изомеризације од суштинског значаја за функцију Пин1 на контроли контролне тачке на С фази.

Прекомерна експресија Пин1 корелира са хиперфосфорилацијом Рб код рака дојке код људи

Пин1 је често прекомерно изражен код различитих хуманих карцинома, укључујући рак дојке. 37 Како наши резултати показују да Пин1 инхибира Рб функцију одржавањем Рб хиперфосфорилације, испитали смо да ли постоји клиничка важност. Обавили смо имунохистохемијско бојење узорака биопсије хуманог тумора дојке и оценили за Пин1 и Рб фосфорилацију (пС807 / 811). Као што је приказано на слици 7а, хиперфосфорилација Рб на С807 / С811 пронађена је у 42, 9% свих узорака (12 од 28), док је прекомерна експресија Пин1 пронађена у ~ 35% свих узорака (10 од 28). Приметно, скоро сви тумори који садрже више нивое Пин1 (9 од 10) показују знатно више нивое хиперфосфорилираног Рб (пС807 / 811), док тумори који испољавају ниже нивое Пин1 (15 од 18) слично показују ниже нивое хиперфосфорилираног Рб. . Статистичка анализа показала је значајну позитивну повезаност између експресије Пин1 и хиперфосфорилације Рб, што је утврђено Спеармановим корелацијским тестом ( П <0, 001; Слика 7б и Додатна слика С1). Узето заједно, ови резултати показују да је прекомерна експресија Пин1 упоредо са Рб хиперфосфорилацијом у карциному дојке код људи.

Image

Прекомерна експресија Пин1 је у корелацији са хиперфосфорилацијом Рб код рака дојке код људи. ( а ) Узастопни одсеци рака дојке су подвргнути имунохистохемији због експресије Пин1 или хиперфосфорилираног нивоа Рб (пС807 / 811) и фотографисани под светлосним микроскопом. Затим су микрографије анализиране и класификоване као високе или ниске, у зависности од интензитета бојења и процента позитивних ћелија. Приказане су репрезентативне слике за сваки ниво. ( б ) Резиме нивоа експресије Пин1 и хиперфосфорилираног нивоа Рб (пС807 / 811; ппРб). Корелација је анализирана Спеарман-овим ранг тестом ( П <0, 001)

Слика пуне величине

Дискусија

Рб протеин је критично важан за регулисање напредовања ћелијског циклуса и одговор оштећења ДНК. Дакле, уска регулација активности Рб је кључна за спречавање ћелијске трансформације и туморигенезе. Овде смо показали да Пин1 има важну улогу у регулацији ћелијског циклуса посредованом Рб и контролном тачком С фазе након оштећења ДНК. Прво, Пин1 се специфично везује за РбЦ и та интеракција зависи од Рб фосфорилације индуковане Г1 / С циклинима. Друго, Пин1 ин витро инхибира ПП2А посредовану Рб депосфорилацију. Треће, експресија Пин1 ефикасно инхибира прерано станично старење изазвано Рб. Четврто, прекомерна експресија Пин1 поспешује Рб хиперфосфорилацију и доводи до неисправне контролне тачке С-фазе након оштећења ДНК. Штавише, прекомерна експресија Пин1 значајно је у корелацији са Рб хиперфосфорилацијом у узорцима биопсије рака дојке код људи.

Показано је да више протеина делује у интеракцији са хипофосфорилираним Рб, који је биолошки активна врста Рб. До данас, осим протеинских фосфатаза, нису познати ћелијски протеини који посебно интерактивно делују на хиперфосфорилирани Рб. Овде смо показали да се Пин1 специфично веже за РбЦ на начин који зависи од фосфорилације. Изразито, РбЦ садржи више С / ТП делова које фосфорилирају Цицлин / ЦДК комплекси и имају критичну улогу у регулисању Рб функције. 17, 38 Открили смо да мутација ових места на аланин укида интеракцију Пин1-Рб, док експресија Цицлин А, Цицлин Д1 или Цицлин Е појачава везивање Пин1-Рб. Ова запажања су у складу са недавним извештајем који показује да ЦДК2 или ЦДК4 / 6 експресија јача Рб-Пин1 интеракцију у мултиформним ћелијским линијама глиобластома. 39 Треба напоменути да су аутори такође известили да мали џеп Рб, који искључује РбЦ, делује у интеракцији са Пин1, као што показују ГСТ тестови у ћелији од 293ФТ. 39 Разлози тих одступања су непознати. Иако су ове студије показале да је хиперфосфорилација посредована ЦДК претпоставком за Пин1-Рб интеракцију, молекуларни механизми одговорни за Пин1 посредовану регулацију Рб функције још увек нису расветљени. Функција Рб одређена је њеним статусом фосфорилације, што зависи од кинетике фосфорилације помоћу Цицлин / ЦДК комплекса и дефосфорилације фосфатазама, као што су ПП1 и ПП2А. Овде смо открили да ВТ Пин1, али не и Пин1 деривати мутанта који имају недостатак у везивању Рб, инхибирају Рб функцију у напредовању ћелијског циклуса и у прерани ћелијској старењу. Штавише, Пин1 спречава дефосфорилацију Рб на контролној тачки С-фазе, спречавајући тако заустављање заустављања ћелијског циклуса посредованог Рб. Наши подаци показују да Пин1 директно инхибира ПП2А, чиме одржава Рб хиперфосфорилацију. Занимљиво је да ПП2А нормално дефосфорилира фосфо-Сер / Тхр-Про изомере у трансконформацији, 26, 40 и Пин1-посредованом цис - транс пролином изомеризацијом генерално промовише ПП2А-посредовану дефосфорилацију одређеног броја протеина, као што је Пим-1 киназа, 41 раф-1, 30 ц-Миц, 31 Цдц25Ц 26 и Тау. 26 Ипак, показало се да Пин1 инхибира и ПП2А посредовану дефосфорилацију неурофиламентних протеина у кортикалним неуронима. 42 Дакле, специфични молекуларни механизми који су у основи инхибиције ПП2А од стране Пин1 захтевају даљу истрагу. Могуће је да специфичне конформацијске промене након изомеризације посредоване Пин1 могу маскирати места веза за ПП2А и, према томе, исход Пин1 акције за ПП2А може варирати у зависности од супстрата и контекста сигнализације.

Без обзира на то, Пин1 може побољшати Рб хиперфосфорилацију другим механизмима. На пример, за Пин1 је објављено да индукује Цицлин Д1 експресију и појачава његову функцију. 27, 37, 43 Дакле, могуће је да Пин1 модулира Рб фосфорилацију комбинованим ефектима активирања циклин Д1 и инхибиције ПП2А. Међутим, Цицлин Д протеини имају главну улогу у посредовању Рб фосфорилације током Г1 фазе, али мање вероватно током С-фазе. Занимљиво је да је објављено да оштећење ДНА на С-фази снижава ЦДК2 и Цицлин Д1. 44, 45 Стога би могло бити да је смањење фосфорилације Рб након оштећења ДНК на С-фази последица смањене активности Цицлин / ЦДК. Међутим, нагомилавање ДНК изазвано оштећењем хипофосфорилираног Рб током С-фазе не захтева ЦДК инхибиторе п16 ИНК4А или п21 ВАФ1 / ЦИП1 (реф. 21). Стога, иако се потенцијални допринос променама активности ЦДК-а не може у потпуности искључити, вероватно је да посматрано Рб хипофосфорилација на оштећењу ДН-а у С фази потиче углавном од дефосфорилације изазване ПП2А и да Пин1 инхибира тај процес директном интеракцијом са хиперфосфорилираном Рб .

Поред тога што има улогу у контроли оштећења ДНА на С-фази, показали смо да Пин1 инхибира Рб депосфорилацију на митотичком излазу. Могуће је да је Пин1 укључен у временску регулацију Рб депосфорилације и да ненормално високи нивои Пин1 могу да поремете овај процес, што доводи до оштећења у напредовању ћелијског циклуса.

Дисрегулација Рб директно је повезана са туморигенезом и напредовањем рака. Мутације герлине у гену РБ1 често резултирају ретинобластомом у детињству. 46 Слично томе, мутације РБ1 пронађене су и у многим карциномима људи, укључујући карцином плућа малих ћелија, остеосарком и меланом. 47, 48, 49 Штавише, код рака рака људи често се јављају аберације које доводе до ненормалне активације Рб киназа, као што је прекомерна експресија циклин Д1 и инактивација п16 ИНК4А . 50 Слично, прекомерна експресија Пин1 често је повезана са напредовањем рака. 37, 51 Штавише, показано је да Пин1 појачава туморигенезу и метастазе изазване мутантним п53 у мишјим моделима. 52 Међутим, много је мање познато о вези између Рб депхосфорилације и туморигенезе. Овде смо открили да прекомерна експресија Пин1 корелира са повећаном Рб фосфорилацијом у карциному дојке. Раније смо извештавали да је Пин1 прекомерно изражен и уско је повезан са Рб фосфорилацијом код тумора изазваних ДМБА код мишева, у поређењу са нормалним млечним жлездама. 53 Такође, Пин1 експресија је у корелацији са фосфорилацијом Рб у узорцима хуманог глиома, 54 сугеришући да повећана експресија Пин1 може, барем делимично, да објасни инактивацију Рб. Примјећује се да анализа ТЦГА базе 55 открива јасну повезаност између нивоа п1 мРНА и фосфорираног Рб (С807 / 811) у Глиобластома ( Н = 70, П <0, 01). Међутим, анализа базе података ТЦГА не открива јасну повезаност инвазивног аденокарцинома дојке 56 . Разлози за неусклађеност ове анализе и ове студије још нису јасни. Могуће је да нивои мРНА Пин1 не одражавају стварне нивое протеина, као што је изнето пре 57 . Заједно ово истраживање сугерира да прекомерна експресија Пин1 и касније одржање Рб хиперфосфорилације могу имати важну патолошку улогу у развоју рака.

Материјали и методе

Ћелијска култура и синхронизација

Хумане остеосаркоми Саос-2 и У2-ОС ћелије и хумани не-ситноћелијски карцином плућа Х1299 су одржавани у Дулбеццовом модификованом медијуму орао (ДМЕМ; Инвитроген Инц., Царлсбад, Калифорнија, САД) који садржи 4, 5 г / л глукозе са додатком било 10% серума новорођенчади телета (НЦС; У2-ОС) или 10% феталног говеђег серума (ФБС; Саос-2) или 5% ФБС (Х1299). Хумане нетрансформисане ћелије МЦФ-10А млека су одржаване у 1: 1 мешавини ДМЕМ и Хам, с медијум Ф12 са редукованим Ца2 + (0, 04 мМ; Инвитроген Инц.), 20 нг / мл епидермалног фактора раста (Инвитроген Инц.), 100 нг / мл колереног токсина (Сигма, Ст. Лоуис, МО, САД), 10 μг / мл инсулина (Сигма), 500 нг / мл (95%) хидрокортизона (Сигма) и 5% коњског серума третираног Цхелек-ом ( Инвитроген Инц.). Примарне ћелије ИМР90 хуманих фибробласта плућа одржаване су у ДМЕМ-у допуњеном са 10% ФБС и 0, 1 мМ небитним аминокиселинама (ГИБЦО Лифе Тецхнологиес, ​​Роцквилле, МД, УСА). ВТ и Пин1-нулл МЕФ одржавани су у ДМЕМ-у допуњеном са 10% ФБС-а. За студије синхронизације, ћелије су узгајане до 60% сутока и третиране са 1.0 мМ ХУ током 18 сати или 2.0 μг / мл ахидицолина током 24 сата или 100 нг / мл нокодазола током 18 сати. Ћелије су ослобођене испирањем двапут физиолошком отопином пуферираном фосфатом (ПБС) и једном са медијумом за раст, а затим су инкубиране у нормалном медију за раст.

Трансфекције плазмида, вирусне инфекције и РНА сметње

Пролазне трансфекције су изведене коришћењем ФуГЕНЕ 6 (Роцхе, Индианаполис, ИН, САД) за У2-ОС ћелије, Липофецтамине 2000 (Инвитроген Инц.) за ћелије Х1299, МЕФ и Саос-2 (где је назначено) или ЦалПхос кит за трансфекцију сисара (Цлонтецх, Моунтаин Виев, ЦА, УСА) за ћелије Саос-2, према упутствима произвођача. Плазмиди пролазне експресије укључују пЦМВ-Рб (пуна дужина, мутант за брисање или тачку), ХА-означени пХоок2-Пин1 (ВТ и точкасти мутант), ПЛВКСпуро-Пин1 (ВТ или поинт мутант), а плазмиди аденовирусне експресије укључују Пин1-пАдТрацк-ЦМВ, СВ40 мали т антиген (ст) -пАдТрацк-ЦМВ и ГФП-пАдТрацк-ЦМВ. Ови плазмиди су претходно описани. 11, 25 РНА кратке длаке против Пин1 (5'-АГГЦЦГАГТГТАЦТАЦТАЦТТЦАА-3 ') клонирана је у ретровирусни вектор пСМ2 (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, САД). Ретровирус и аденовирус су амплифицирани трансфекцијом ћелија 293ФТ одговарајућом кичмом и паковањем плазмида; супернатанти су сакупљени након 48 х, филтрирани и употребљени одмах или су чувани на -80 ° Ц. Ретровирус је концентрован ултрацентрифугирањем при 27 000 о / мин током 90 минута на 4 ° Ц. За вирусну трансдукцију, ћелије на 60% -тном сипању инкубиране су ретровирусом (вирусни титри од 10 8 до 10 9 ЦФУ / мл) или аденовирусом (МОИ од 1: 100) током 90 минута на 37 ° Ц уз благо мешање у интервалима од 20 минута., после чега је додата подлога за културу допуњена 10 μг / мл полибрена и инкубација током 24 сата.

Анализа активности луциферазе

У2-ОС или Саос-2 ћелије у плочама са шест јажица су кофефициране са 1.5 µг (У2-ОС) или 4.0 µг (Саос-2) ВТ или мутираним ХА означеним пХоок2-Пин1, заједно са 0.5 µг (У2-ОС) или 2.0 μг (Саос-2) ДХФР-луцифераза, и 100 нг (У2-ОС) или 400 нг (Саос-2) пЦМВ- П- Галактозидаза плазмида, и сакупљени 24 сата након трансфекције. Активност луциферазе је мерена коришћењем комплета система за испитивање луциферазе (Промега, Мадисон, ВИ, УСА) према упутствима произвођача и нормализована на активност β- галактозидазе. За активност П- галактозидазе, 30 μл лизати ћелија инкубирани су у 500 μл ЛацЗ пуферу (60 мМ На2П04, 40 мМ НаХ2П04, 10 мМ КЦл и 1, 0 мМ МгСО4, пХ 6, 95) и 100 μл супстратни раствор (2 мг / мл О- нитрофенил β -Д-галактопиранозида у 60 мМ На2 ХПО 4 и 40 мМ НаХ2П04) на 37 ° Ц током 20 минута. Реакција је заустављена додавањем 250 μл 1.0 М На2Ц03 и апсорбанција је измерена на 420 нм.

Анализа Вестерн блот-а, експерименти имунопреципитације и имунофлуоресценција

Ако није назначено, ћелије су лизиране у ЕБЦ 250 пуферу за лизу (250 мМ НаЦл, 50 мМ Трис · ХЦл, пХ 8, 0, 0, 5% Нонидет П-40, 0, 2 мМ ПМСФ, 2 μг / мл апротинина и 2 μг / мл леупептина, 5 мМ НаФ и 0, 5 мМ НаВО 4 ), кратко синоницирано и затим центрифугирано на 14 000 × г током 15 мин на 4 ° Ц. Супернатанти су сакупљени, а концентрације протеина одређене су реагенсом за анализу протеина Био-Рад (Био-Рад, Херцулес, ЦА, САД). За западну блотму, узорци су раздвојени помоћу СДС-ПАГЕ, пребачени на мембрану поливинилилидин дифлуорида (НЕН Лифе Сциенцес, Валтхам, МА, САД), и хибридизирани у одговарајуће примарно антитело и коњугирано хрен пероксидаза за детекцију појачаном хемилуминисценцијом (Тхермо Фисхер Сциентифиц Инц., Роцкфорд, Илиноис, САД). За имунопреципитацију, Х1299 ћелије су лизиране у 0, 25% НП-40 пуферу (20 мМ Трис-ХЦл, пХ 7, 8, 125 мМ НаЦл, 0, 25% Нонидет П-40, 0, 2 мМ ЕДТА, 5 мМ МгЦЛ2, 1 мМ ПМСФ, 5 мМ НаФ, 2 мМ На3ВО4), 2, 0 мг / мл укупног протеина се инкубирају 8 х са анти-ФЛАГ М2 афинитетним гелом (А2220, Сигма). За имунопреципитацију у ћелијама У2-ОС, прво је претходно очишћено 2, 0 мг / мл укупног протеина нормалним мишем или зечјим ИгГ (Санта Цруз Биотецхнологи, Санта Цруз, Калифорнија, САД) током 1 сата, а затим додатком протеина А / коњугираног агарозом. Г куглице (Санта Цруз Биотецхнологи) и инкубирају се 30 мин уз благо мешање. Супернатанти су затим инкубирани са специфичним примарним антителом или контролним ИгГ током 2 сата, после чега је додавано агарозно зрно протеина А / Г коњугираног агарозом (Санта Цруз Биотецхнологи) и инкубирано током 1 сата. Имуни комплекси су затим испрани три пута са пуфером за лизу и разрешени СДС-ПАГЕ и Вестерн блоттингом. Све инкубације су изведене на 4 ° Ц. Антитела која се користе за Вестерн блот обухватају Пан-Рб (Г3-245, БД Биосциенцес, Сан Јосе, ЦА, САД; и смеша моноклонских антитела КСЗ77 и КСЗ91), хипофосфорилирана Рб (Г99-549; БД Биосциенцес), фосфорилирани Сер780 (пС780 ), пС795 или пС807 / 811 Рб (# 9307, # 9301 и # 9308, респективно; ћелијска сигнализација, Данверс, МА, САД), Пин1 (Аб-1, Онцогене Ресеарцх Продуцтс, Цамбридге, МА, САД; Х123, сц- 15340, Санта Цруз Биотецхнологи) и Ацтин (Ц-11, Санта Цруз Биотецхнологи). За имунофлуоресценцију, ћелије су фиксиране са 4% параформалдехида, имуно обојене са примарним антителом Рб и секундарним антителом Алека Флуор 488 (А11001; Санта Цруз Биотецхнологи) у 4% БСА и супротстављене 4, 6-диамидино-2-фенилиндолу (ДАПИ). За анализу Рб асоцијације са нуклеарним матриксом, ћелије су третиране са или без екстракционог пуфера (250 мМ НаЦл, 10 мМ ХЕПЕС-КОХ, пХ 7, 9, 0, 1% Тритон Кс-100, 0, 5 мМ дитиотреитола, 0, 2 мМ ПМСФ, 2 μг / мл апротинина и 2 μг / мл леупептина, 5 мМ НаФ и 0, 5 мМ НаВО 4 ) пре имунофлуоресценције. Слике ћелија снимљене су микроскопом Акиоверт 200 М (Царл Зеисс, Оберкоцхен, Немачка) и анализиране софтвером Акиовисион 3.1 (Царл Зеисс).

ГСТ падајући тестови

ГСТ тестови за спуштање су изведени у основи као што је претходно описано. 58 Укратко, ћелије су лизиране у ЕБЦ 200 пуферу (исти као ЕБЦ 250, али који садржи 200 мМ НаЦл) са додатком 10% (в / в) глицерола. Једнаке количине протеина су инкубиране са 20 μл перлама Глутатион-Сепхаросе 4Б напуњене различитим протеинима ГСТ-Пин1 или контролним ГСТ током 3 х на 4 ° Ц. Куглице су затим испране са ЕБЦ 200 пуфером и подвргнуте Вестерн блот анализи.

Ин витро фосфорилација и дефосфорилација

Прво, 400 нг протеина РбЦ (ћелијска сигнализација, # 6022) обележено је ин витро фосфорилацијом у реакционом систему који садржи 40 нг Цицлин Е / ЦДК2 (ћелијска сигнализација, # 7524), 30 µ Ци γ - [ 32 П] -АТП (НЕН Лифе Сциенцес), 100 μМ АТП, 50 мМ Трис-ХЦл пХ 7, 5, 10 мМ МгЦл2, 1 мМ ЕГТА, 2 мМ ДТТ и 0, 01% (в / в) Бриј-35 инкубацијом на 30 ° Ц током 30 мин. Реакција је заустављена повећањем температуре на 65 ° Ц током 10 мин. Слободни и - [32П] -АТП је уклоњен центрифугирањем кроз три колоне Сепхадек-Г25 (Роцхе) при 3200 о / мин током 10 мин. Друго, да се одреди ефекат Пин1 на Рб депхосфорилацију ин витро , 200 нг ин витро фосфорилираног РбЦ протеина се инкубира било са БСА (0, 04 µг / μл), 10 нМ окадаичне киселине, или пречишћеним ГСТ-Пин1 протеином (0, 04 µ г / μл ) у дефосфорилационом пуферу од 50 µл (10% глицерол, 20 мМ МОПС пХ 7, 4, 0, 1 М НаЦл, 1 мМ МгЦл 2, 0, 1 мМ МнЦл2, 60 мМ β -меркаптометанол, 1 мМ ЕГТА, 1 мМ ДТТ и 0, 1 μг / μл БСА) на 30 ° Ц током 15 мин. Затим је реакционој смеши додато 5.0 нг пречишћеног ПП2А (Упстате Биотецхнологи, Лаке Плацид, НИ, УСА), чиме је коначни волумен доведен до 100 μл и инкубиран на собној температури. Аликвоти су уклоњени сваких 10 мин и потом разрешени СДС-ПАГЕ. [ 32 П] Означен РбЦ откривен је ауторадиографијом.

Проточна цитометрија

Ћелије су прво инкубиране у пуферу А (4, 0 мМ Натријум цитрат пХ 7, 8, 0, 1% Тритон-Кс-100, 100 μг / мл РНазе А и 50 μг / мл пропидијум јодида) на собној температури током 10 мин. Додата је једнака запремина пуфера Б (400 мМ НаЦл, 0, 1% Тритон-Кс-100, 50 μг / мл ПИ) и инкубирана преко ноћи на 4 ° Ц. Ћелије су затим подвргнуте проточној цитометрији анализом помоћу ФАЦСцан Флов Цитометер-а (Бецтон Дицкинсон Биосциенцес, Франклин Лакес, Њ, УСА), а подаци су анализирани помоћу софтвера Целл Куест (Бецтон Дицкинсон Биосциенцес).

РДС тест

За РДС тестове, ћелије су се инкубирале са метил- [14Ц] -тимидином (10 нЦи / мл) (НЕН Лифе Сциенцес) током 24 сата ради обележавања. Ћелије су затим синхронизоване као што је горе описано, и подвргнуте степеним дозама γ- зрачења. Након 45 мин, ћелије су пулсиране обележеним 2, 0 µЦи / мл метил- [3Х] -тимидина (НЕН Лифе Сциенцес) током 15 мин. Ћелије су испране једном са ледено хладним ПБС-ом и три пута са 5% трихлоро сирћетном киселином, а затим сушењем сушене на собној температури преко ноћи и убране. Радиоактивност је мерена у течном сцинтилацијском бројачу, а синтеза ДНК је представљена као однос броја [ 3 Х] у односу на [ 14 Ц] и нормализована на одговарајућу контролу.

БрдУ инкорпорацијски тест

Ћелије су обележене са 3 µМ БрдУ (Роцхе) током 3 х, фиксиране са 70% етанолом допуњеним 15 мМ глицина пХ 2, 0 током 30 минута на -20 ° Ц и имуностаниране са анти-БрдУ антителом (Роцхе) после чега је обојено са Ци3-коњугирани козји анти-мишји ИгГ (Јацксон ИммуноРесеарцх Лабораториес, Вест Грове, ПА, УСА; 115-165-146) и контрастиран са ДАПИ. БрдУ-позитивне ћелије су оцењене под флуоресцентним микроскопом. Анализирана су три различита поља и пребројано је најмање 100 језгара по пољу. Резултати су нормализовани на нетретиране контроле.

Анализа фенотипа повезаних са старењем

За тестове супресије раста Рб, Саос-2 ћелије су трансфициране са пЦМВ-Рб и / или ПЛВКС-Пин1 (ВТ или мутант) Липофецтамине 2000 (Инвитроген Инц.) и изабране резистенцијом на пуромицин (0, 5 µг / мл). Стабилне ћелије су узгајане у нормалном медију раста током 10 дана. Затим су ћелије визуелизоване под светлосним микроскопом и процењене за проценат велике, равне ћелијске морфологије. За старење повезано са β- галактозидазом (СА- β- Гал), ћелије су фиксиране са 3, 7% формалдехида у ПБС у трајању од 15 минута на собној температури, испране и обојене раствором Кс-Гал (Беиотиме, Шангај, Кина) 16 х на 37 ° Ц. Ћелије су затим визуелизоване под светлосним микроскопом и процењене за проценат ћелија -Пал-позитивних ћелија.

Имунохистохемијске анализе

Парафински одсеци ткива узорака биопсије рака дојке код човека купљени су од болнице Западне Кине са Универзитета Сечуан (Цхенгду, Сицхуан, Кина). За имунохистохемију, клизачи су деактивирани у ксилену, рехидрирани у етанолу и затим претходно третирани са 1% Х202 / 10% метанола у ПБС у току 15 минута на собној температури да би се угасила активност ендогене пероксидазе. Секције су блокиране са 2% БСА током сата на собној температури, а затим је следила инкубација преко анти-Пин1 (Х123; Санта Цруз Биотецхнологи) или анти-пС807 / 811-Рб (# 9308; ћелијска сигнализација) преко ноћи. После опсежног прања, тобогани су инкубирани са биотинилираним коњским анти-зечјим ИгГ (БА-1000; Вецтор Лабораториес, Бурлингаме, ЦА, САД). Продукти реакције су визуелизовани са АБЦ Елите китом (Вецтор Лабораториес) према упутствима произвођача. Затим су слајдови супротстављени хематоксилином и еозином (Сигма). Затим је извршено двоструко слепо бодовање за Пин1 и Рб према интензитету бојења и проценту позитивних ћелија. Статистичка анализа извршена је Спеармановим корелацијским ранг тестом.

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Додатне информације

Речник

Рб

Ретинобластома протеин

РбЛП

Рб домен великог џепа

РбЦ

Џепни домен Ц-терминала Рб

РбСП

Рб домен малог џепа

ЦДК

Циклин-зависне киназе

ПП1

Протеин фосфатаза 1

ПП2А

Протеин фосфатаза 2А

ППИасе

Пептидил-пролил изомераза

пС / ТП

мотив фосфорилираног серина / треонин-пролина

С / ТП

Мотив серина / треонин-пролина

МЕФ

Мишји ембрионални фибробласт

БСА

Говеђи серум албумин

СА- β -Гал

Senescence-associated β -Galactosidase

Ст

SV40 small t antigen

РДС

Radioresistant DNA synthesis assays

ПБС

Phosphate-buffered saline

Додатне информације прате овај рад на веб локацији Целл Деатх анд Дисеасе (//ввв.натуре.цом/цддис)