Питавастатин смањује оксидативни стрес и ублажава прекомјерну ремоделирање леве клијетке изазване хипоксијом код витких мишева | истраживање хипертензије

Питавастатин смањује оксидативни стрес и ублажава прекомјерну ремоделирање леве клијетке изазване хипоксијом код витких мишева | истраживање хипертензије

Anonim

Субјекти

  • Хипоксија
  • Механизам дејства
  • Метаболизам
  • Васкуларне болести

Апстрактан

Раније смо извештавали да испрекидана хипоксија повезана са апнејом у сну индукује кардиоваскуларно ремоделирање секундарно оксидативном стресу. Циљ ове студије био је испитивање ефекта питавастатина као антиоксиданса за спречавање прекомерне ремоделирања леве коморе (ЛВ) изазване хипоксијом код мишева без хиперхолестеролемије. Мишеви Ц57БЛ / 6Ј, стари осам година, ( н = 35) били су изложени повременој хипоксији (30 с 5% кисеоника, затим 30 с 21% кисеоника) током 8 сати дневно током дана или одржавањем у нормоксична стања; поред тога, или су лечени питвастатином (3 мг кг -1 на дан) или носачем 10 дана. Након срчане катетеризације и узорковања крви прегледан је миокард ЛВ. Системски крвни притисак и ниво укупног холестерола у плазми били су слични у четири групе. Испрекидана хипоксија значајно је повећала нивое експресије протеина 4-хидрокси-2-нонална (4-ХНЕ), ТНФ-α и ТГФ-β мРНА, као и број означавања дУТП-биотина, посредованог терминалним деоксинуклеотидил трансферазом (ТУНЕЛ) - позитивне ћелије миокарда у миокарду ЛВ. Поред тога, код мишева који су били изложени хипоксичном стресу примећена је појачана хипертрофија кардиомиоцита, периваскуларна фиброза и хистолошка дегенерација. Третман питавастатином значајно је сузбио нивое експресије 4-ХНЕ протеина, цитокина, производње супероксида и ћелија миокарда позитивних на ТУНЕЛ, што је умањило хистолошке промене изазване хипоксијом. Питавастатин је бар делимично сачувао морфолошку структуру миокарда ЛВ код витких мишева који су били изложени повременој хипоксији, захваљујући његовом антиоксидативном дејству.

Увод

Синдром апнеје у сну познат је као важан фактор ризика за кардиоваскуларне болести попут системске хипертензије, плућне хипертензије, конгестивне срчане инсуфицијенције и цереброваскуларних догађаја. 1, 2, 3 Неколико механизама, укључујући упалу, ендотелну дисфункцију и повећану производњу реактивних врста кисеоника, сугерисано је да буду укључени у развој кардиоваскуларне дисфункције код ових пацијената.

Познато је да оксидативни стрес има важну функцију у прогресији ремоделирања леве коморе (ЛВ). Недавно смо известили да повремени хипоксични стрес индукује кардиомиоцитну хипертрофију и интерстицијску фиброзу, а такође повећава производњу супероксида у миокарду ЛВ. Ови налази се не примећују код мишева који имају гп91пхок, састојак НАДПХ оксидазе, који је главни извор реактивних врста кисеоника. 5 Оксидативни стрес заједно може бити важан циљ да се спречи преградња ЛВ узрокована повременом хипоксијом.

За инхибиторе ХМГ-ЦоА (3-хидрокси-3-метилглутарил-коенцим А) редуктазу или статине објављено је да имају плеиотропне ефекте као што су побољшање ендотелне функције, 6 повећање стабилности атеросклеротских плакова, 7 убрзање ангиогенезе изазване исхемијом, 8 смањење оксидативни стрес, 6 сузбијање упале 9 и инхибирање тромбогеног одговора. 10 Штавише, за статине се извештава да смањују хипертрофију ЛВ, 11, 12 и Гиргис и др. Слика 13 показује да симвастатин ублажава плућну хиперксију изазвану хроничном хипоксијом код пацова. Према томе, питавастатин, један од инхибитора ХМГ-ЦоА редуктазе, потенцијално може спречити карадиоваскуларно преуређење повезано са повременим хипоксичним стресом. У овом истраживању процењујемо хипотезу да питавастатин може смањити оксидативни стрес и заштитити га од преустроја ЛВ изазваног повременим хипоксичним стресом код нехиперлипидемских витких мишева.

Методе

Животиње

За истраживање су коришћени осмонедељни мушки Ц57БЛ / 6Ј мишеви (купљени у компанији Цлеа Јапан, Осака, Јапан). Животиње су биле смештене у циклусу 12:12 сати светла и мрак, и био им је дозвољен бесплатан приступ стандардној води од црева и воде. Експериментални протокол и методе неге животиња током експеримената одобрени су од стране Експерименталног комитета за истраживање животиња, Универзитета фармацеутских наука у Осаки, а све студије су спроведене у складу са смерницама Националног института за здравље за негу и употребу лабораторија Животиње.

Експериментални протокол

Животиње су подељене у две групе. Једна група је смештена у комору како би излагала животиње повременој хипоксији (30 с изложености 5% кисеонику, затим 30 сати изложености 21% кисеоника) 8 сати дневно током дана, а друга група је смештена под нормоксично услови у истој соби 10 дана заредом. Свака група је даље подељена у две групе, једна је третирана питвастатином одмерком од 3 мг кг -1 дневно, а друга примењена носач (0, 5% карбоксиметил целулоза). Доза питавастатина коришћена у претходним студијама кретала се у распону од 0, 3 до 10 мг кг -1 дневно, а ми смо усвојили исти распон доза у овој студији, уз очекивање антиоксидативног дејства лека код мишева. 14, 15, 16

Двадесет сати након последњег хипоксичног излагања, извршена је катетеризација срца под анестезијом индукованом интраперитонеалном ињекцијом натријум-пентобарбитала (50 мг кг -1, ип), за мерење систолног притиска десног вентрикула и систолног притиска ЛВ претходно пријављеном методом. 5 Прикупљање крви коришћено је за мерење нивоа липидног пероксида у плазми (ЛПО) и укупног холестерола (ЦХО). Срце је било изрезано, а горња половина је подвргнута микроскопском прегледу. Слободни зид миокарда ЛВ је такође изрезан ради микроскопског прегледа, имунохистохемије и РТ-ПЦР.

Хистолошки преглед

Изолована вентрикуларна ткива су фиксирана у 10% формалдехид, уграђена у парафин и исечена на 4 μм секције. Да би се проценио средњи пречник кардиомиоцита, измерени су најкраћи пречници од 100 кардиомиоцита у сваком узорку помоћу НИС-Елементс вер.3.07 софтвера (Никон, Токио, Јапан), само у нуклеираним попречним пресецима обојеним хематоксилином-еозином под светлосним микроскопом (Никон ЕЦЛИПСЕ 80и) са увећањем од × 400. После бојења Сириус црвеним проценатом површине интерстицијске фиброзе израчунато је претходно пријављеном методом. 17, 18

Студија означавања дУТП-биотина крајњег испитивања дексинонуклеотидил-трансфераза-посредованог терминалном

За одређивање апоптозе кардиомиоцита у ЛВ миокарду, извршено је испитивање терминалног деоксинуклеотидил-трансферазе дУТП-биотинског краја (ТУНЕЛ). За ову студију је употријебљен комплет за откривање апоптозе пероксидазе апопТаг ин ситу (Миллипоре Јапан, Токио, Јапан) према препорукама произвођача. Као негативне контроле коришћена је дестилована вода уместо терминалног растворног ензима деоксинуклеотидил трансферазе, а ендометријум је коришћен за позитивну контролу. Након супротстављања Маиеровом хематоксилину, број ТУНЕЛ-позитивних ћелија миокарда се рачуна помоћу раније објављене методе. 19

Имунохистохемија за експресију 4-хидрокси-2-ноналног протеина

Имунохистохемијско бојење за одређивање нивоа експресије 4-хидрокси-2-нонална (4-ХНЕ) изведено је претходно описаним поступком. 5 Укратко, парафински одсеци миокарда ЛВ инкубирани су моноклонским антителом за 4-ХНЕ (производ бр. МХН-20, Јапан институт за контролу старења, Схизуока, Јапан) и секундарним антителом (биотинилирани анти-мишји ИгГ), праћено додавањем Вецтастаин Елите АБЦ реагенса (Вецтор Лабораториес, Бурлингаме, Калифорнија, УСА). Процентуална површина обојења 4-ХНЕ мерена је квантитативном анализом, као што је раније објављено. 20

Откривање супероксида у миокарду ЛВ

Да би се открила производња РОС ин ситу , свеже смрзнути одељци миокарда ЛВ обојени су дихидроетхидијумом (ДХЕ; Молецулар Пробес, Еугене, ОР, УСА). 21 Смрзнути одељци (дебљине 20 µм) прекривени су са 10 µмол 1-1 ДХЕ раствора и инкубирани током 30 минута у влажној заштићеној комори на 37 ° Ц. Затим су секције покривене и посматране под флуоресцентним микроскопом (КЕИЕНЦЕ БЗ-8000; Осака, Јапан). Интензитет флуоресценције 22 ДХЕ квантификован је коришћењем НИХ Имаге 1.61 софтвера и изражен је у проценту укупне површине попречног пресека.

Квантитативни РТ-ПЦР у реалном времену

Укупна РНА је екстрахована из ткива миокарда ЛВ помоћу РНеаси Мини комплета, у складу са упутствима произвођача (Киаген, Валенциа, ЦА, САД). Обрнута транскрипција изведена је случајним хексамерима и Суперсцрипт реверзном транскриптазом (Инвитроген, Царлсбад, ЦА, САД). Квантитативна ПЦР у реалном времену изведена је детектором АБИ корака један корак (ПЕ Апплиед Биосистемс, Фостер Цити, Калифорнија, САД). Сонда Такман и прајмери ​​за циљану мРНА (Ма00443258 за ТНФ-а, Ма00441724 за ТГФ-П) су набављени од Апплиед Биосистемс. Услови реакције су били следећи: 50 ° Ц током 2 мин, 95 ° Ц током 10 минута и затим 40 циклуса од 95 ° Ц током 15 с и 60 ° Ц током 1 мин. Ниво циљне мРНА је нормализован за ниво мРНА ГАПДХ.

Статистичка анализа

Подаци су представљени као средња вредност ± статистичка анализа изведена је коришћењем двосмерне АНОВА, хипоксични стрес (нормоксија вс хипоксија) и лечење (питавастатин наспрам вехикла) сматрани су факторима који укључују интеракцију, а затим су праћени вишеструки упоредни тестови Тукеи-Крамер. Значај је препознат код П <0, 05.

Резултати

Тежине срца и тела

Прекидајући хипоксични стрес значајно је смањио телесну тежину и тежио је повећању срчане тежине, резултирајући значајним повећањем односа срчане тежине и телесне тежине. Третман питавастатином није имао утицаја на телесну тежину, тежину срца нити на однос срчане масе / телесне тежине (Табела 1).

Табела пуне величине

Хемодинамичка мерења

РВСП је повећан код мишева који су били изложени повременој хипоксији ( П = 0, 0954), на који није утицао третман питавастатином. Није било значајних разлика у систолном притиску ЛВ међу четири групе (Табела 1).

Ниво ЛПО и ЦХО у плазми

Нивои ЛПО у плазми значајно су порасли повременом хипоксијом, што је значајно смањено лечењем питавастатином. Није било значајних разлика међу четири групе, иако је питавастатин имао тенденцију да смањује ЦХО у плазми код мишева који су били изложени повременој хипоксији (Табела 1). Интеракција П- вредности односи се на интеракцију хипоксичним стресом и лечење статином сугерише да је питавастатин ефикасан за снижавање нивоа ЦХО у хипоксичним условима (Табела 2).

Табела пуне величине

Хистолошки налази

Испрекидана хипоксија значајно је повећала средњи пречник кардиомиоцита, поремећај миофибре и периваскуларну фиброзу миокарда ЛВ (слике 1 и 2). Лечење питавастатином значајно је смањило пречник кардиомиоцита и тежину периваскуларне фиброзе (Табела 2). Поред тога, дегенерација кардиомиоцита, укључујући поремећај и недостатак миофибрила, изазвана хипоксичним стресом, била је ослабљена.

Image

( а ) Репрезентативне светлосне микрографије миокарда ЛВ. Испрекидана хипоксија узроковала је хипертрофију кардиомиоцита, поремећај миофибре и нуклеарну дегенерацију. Мрља од хематоксилина-еозина; оригинално увећање × 200. ( б ) Утицај хипоксичног стреса на средњи пречник кардиомиоцита у миокарду ЛВ. Средњи пречник кардиомиоцита је значајно повећан код мишева који су били изложени повременој хипоксији. Третман питвастатином (статином) значајно је потиснуо пречник кардиомиоцита и спречио дегенерацију кардиомиоцита индуковану хипоксичним стресом. Вредности су средња ± сем броја животиња у заградама. # П <0, 01 у односу на нормоксичне мишеве третиране статином.

Слика пуне величине

Image

( а ) Репрезентативне светлосне микрографије миокарда ЛВ. Сириус црвена мрља; оригинално увећање × 200. ( б ) Утицај хипоксичног стреса на удио колагена у количини (проценат периваскуларне фиброзе) у миокарду ЛВ. Периваскуларна фиброза је значајно повећана код мишева који су били изложени повременој хипоксији, што је значајно сузбијено лечењем питавастатином. Вредности су средња ± сем броја животиња у заградама. # П <0, 01 вс нормоксични мишеви третирани статином.

Слика пуне величине

ТУНЕЛ студија

Број ћелија миокарда позитивних на ТУНЕЛ значајно се повећао код мишева који су били изложени повременој хипоксији, што је значајно сузбијено третманом питавастатином (Слика 3; Табела 2).

Image

Студија терминалног деоксинуклеотидил-трансферазом посредоване дУТП-биотинске крајње ознаке (ТУНЕЛ). ( а ) Миокардијалне ћелије (стрелице) позитивне на ТУНЕЛ и интерстицијске ћелије повећане су код мишева који су изложени повременој хипоксији. ( б ) Број ћелија миокарда позитивних на ТУНЕЛ значајно се повећао код хипоксичних мишева, што је значајно сузбијено третманом питавастатином. Вредности су средња ± сем броја животиња у заградама. # П <0, 01 вс нормоксични мишеви третирани статином.

Слика пуне величине

Имунохистохемија за 4-ХНЕ и ДХЕ обележавање

Експресија протеина 4-ХНЕ, специфичног продукта липидне пероксидације и маркера оксидативног стреса, значајно је повећана у ЛВ миокардуму мишева који су били изложени повременој хипоксији (Слика 4). Оштећење ДХЕ миокарда ЛВ такође је значајно повећано код мишева који су били изложени повременој хипоксији, што сугерише повећану производњу супероксида (Слика 5). Третман питавастатином довео је до значајног смањења нивоа експресије 4-ХНЕ протеина и бојења ДХЕ у миокарду ЛВ. Дошло је до интеракције између лечења питавастатином и хипоксичног стања у утицајима на производњу супероксида (Табела 2).

Image

( а ) Имунохистохемија за експресију 4-ХНЕ у ЛВ миокарду. ( б ) Утицај хипоксичног стреса на експресију 4-ХНЕ у миокарду ЛВ. Експресија 4-ХНЕ је значајно повећана код мишева изложених повременој хипоксији, која је враћена у нормалу након лечења питавастатином. Вредности су средња ± сем броја животиња у заградама. # П <0, 01 вс нормоксични мишеви третирани статином.

Слика пуне величине

Image

( а ) ДХЕ бојење миокарда ЛВ. ( б ) Утицај хипоксичног стреса на експресију ДХЕ у миокарду ЛВ. Интензитет бојања ДХЕ је значајно повећан код мишева који су били изложени повременој хипоксији, што сугерише повећану производњу супероксида. Лечење питавастатином довело је до значајног смањења степена обојења ДХЕ у миокарду ЛВ. Вредности су средња ± сем броја животиња у заградама. # П <0, 01 вс нормоксични мишеви третирани статином.

Слика пуне величине

Квантитативни РТ-ПЦР у реалном времену

Прекидајући хипоксични стрес значајно је повећао ниво експресије мРНА ТНФ-а и ТГФ-β у миокарду ЛВ, који су значајно смањени третманом питавастатином (Слика 6; Табела 2).

Image

( а ) Квантитативни РТ-ПЦР у реалном времену за ТНФ-а ( а ) и ТГФ-β ( б ) у миокарду ЛВ. Прекидајући хипоксични стрес значајно је повећао мРНА експресију ТНФ-а и ТГФ-β у миокарду ЛВ, који су значајно смањени третманом питавастатином. Вредности су средња ± сем броја животиња у заградама. # П <0, 01 вс нормоксични мишеви третирани статином.

Слика пуне величине

Дискусија

Извештавали смо да питавастатин смањује оксидативни стрес, производњу супероксида и упалну експресију цитокина у миокарду ЛВ, последично смањујући ТУНЕЛ-позитивне ћелије миокарда и ублажавајући хистолошке промене изазване хипоксијом код витких мишева, независно од притиска ЛВ.

Извештава се о постојању корелације између тежине апнеје у сну и појаве хипертензије. 23 У овој студији, повремена хипоксија у трајању од 10 дана изазвала је ремоделирање ЛВ-а, наиме, хипертрофију кардиомиоцита и периваскуларну фиброзу миокарда ЛВ, без утицаја на систолни притисак ЛВ. Већ смо показали да повишени РВ притисак може имати мало утицаја на ЛВ миокард. 24 Према томе, преградња НН која је примећена у овој студији може бити узрокована испрекиданим хипоксичним стресом. Међутим, Дематтеис и др. 25 су показали да је изложеност повременој хипоксији током 35 дана била повезана са хипертензивним налетима током излагања хипоксичним стањима. Због тога је праћење крвног притиска током изложености хипоксији и посматрање током дужег периода неопходно за расветљавање патофизиологије ремоделирања кардиоваскуларног система изазваног хипоксијом.

Недавна испитивања показала су значајан пораст оксидативног стреса код пацијената са синдромом опструктивне апнеје у сну у поређењу са оним код неизмерених испитаника. 26 У нашем експерименту, повремена хипоксија повећала је ниво плазме ЛПО, нивое експресије 4-ХНЕ и ДХЕ флуоресценције у ЛВ миокарду. Повећање међућелијског оксидативног стреса и продукција РОС могу се приписати наглом повећању напетости кисеоника након поновне оксигенације после ћелијске адаптације у окружење са мало кисеоника током излагања хипоксији. 27 Сматра се да кардиомиоцити, посебно ћелијски митохондрији имају функцију осетљивости на кисеоник и стварају РОС после излагања хипоксији, што може изазвати хипертрофију срца и затајење срца. 28 У овој студији, повремена хипоксија значајно је повећала број ћелија миокарда позитивних на ТУНЕЛ, што сугерише да апоптоза може бити подстакнута повременим хипоксичним стресом. Објављено је да су про-апоптотски протеини регулисани, а антиапоптотски протеини регулисани у хроничној хипоксији. 29 Поред тога, показало се да повремена хипоксија индукује ранији и обимнији апоптотски одговор ПЦ-12 ћелија феокромоцитома штакора него што је одржала хипоксију. 30 Интригантно, Иосхида и др. 31 извештава да је питавастатин ефикасан у сузбијању пута оксидативне ДНК-АТМ-п53-апоптозе кроз инхибицију активности Рац1. Иако нисмо потврдили апоптотичка тела у миокарду ЛВ-а, даљње студије усредсређене на апоптозу изазвану повременом хипоксијом требало би да се баве у блиској будућности.

С друге стране, НАДПХ оксидаза је замишљена као алтернативни молекул способан за О2 сензитирање, а за РОС је предложено да има улогу у сигнализацији низводних ефекторских молекула током акутних промена као реакције на измењену напетост кисеоника. 32 Надаље, показало се да је активност НАДПХ оксидазе повезана са хипертрофијом срца и патогенезом срчане инсуфицијенције. 33, 34 Показали смо да је хистолошка дегенерација изазвана хипоксијом спречена код мишева гп91 - / -, што сугерише да гп91 фосадна НАДПХ оксидаза која садржи фокс има пресудну улогу у патофизиологији ремоделирања ЛВ изазване хипоксијом повезаног с повећањем оксидативног стреса. 5 Питавастатин је значајно смањио ниво ЛПО у плазми, који је повећан излагањем повременој хипоксији, без утицаја на ниво холестерола у плазми. Поред тога, нивои експресије 4-ХНЕ и продукције супероксида у миокарду ЛВ такође су значајно сузбијени. Ови подаци сугерирају да је питавастатин ефикасан против оксидативног стреса и има антиоксидативни ефекат у ткивима који показују висок ниво потрошње кисеоника. Нисмо процењивали остала ткива попут мозга, бубрега или јетре и потребна је даља анализа како би се показали селективни ефекти питавастатина на ткиво.

Извештавали смо да је лечење блокатором рецептора ангиотензина ИИ спречавао хипоксију преуређивање ЛВ код мишева и да би систем ренин-ангиотензин могао да буде укључен у развој срчане ремоделације повезан са излагањем хипоксији. 18, 24 Штавише, инхибитор химазе успешно је сузбио ревитализацију ЛВ узроковане хипоксијом. 35 Извештава се да систем ренин-ангиотензин делује са про-упалним цитокинима и активира редокс-осетљиви транскрипциони фактор назван нуклеарни фактор-κБ (НФ-κБ). 36 Активација НФ-кБ ангиотензином ИИ може бити пресудна за активацију молекула душичног оксида, хемокина и ћелијске адхезије. 37 Поред тога, Калра ет ал. 38 су известили да ангиотензин ИИ индукује ТНФ-а мРНА и синтезу протеина у срцу одраслих путем пута зависног од НФ-кБ.

Недавна испитивања показала су да се ниво ТНФ-а у серуму значајно повећава код пацијената са апнејом у сну и метаболичким синдромом. 39, 40 Такође смо пријавили повишену активност интерлеукин-6, ТНФ-α мРНА и НФ-кБ-везујућу активност у ЛВ миокардуму мишева који су били изложени повременој хипоксији. 5, 18 Ови резултати сугерирају да би инфламаторни цитокини могли бити укључени у ремоделирање ЛВ-а изазвано повременом хипоксијом. У овој студији питавастстин је смањио ниво експресије мРНА ТНФ-а у миокарду ЛВ-а, спречавајући преградња ЛВ-а. За Атровастатин се наводи да инхибира активност НФ-κБ и смањује експресију гена хемокина у ћелијама глатких мишића васкула и мононуклеарним ћелијама стимулисаним ангиотензином ИИ или ТНФ-α. 41 Флисер ет ал. 42 извештава да је терапија правастатином смањила серумски ниво високо осетљивог Ц-реактивног протеина, ТНФ-α и интерлеукин-6 код пацијената са есенцијалном хипертензијом. Узето заједно са нашим резултатима, смањење нивоа инфламаторних цитокина у плазми помоћу третмана статином може бити уско укључено у сузбијање ремоделирања ЛВ.

ТГФ-β има главну улогу у фибро-упалном одговору ткива. 43 Извештава се да је прекомерна експресија ТГФ-β појачала синтезу протеина ванћелијског матрикса и довела до хипертрофије кардиомиоцита. 44 Иаги и др. 16 су известили да ангиотензин ИИ индукује хипертрофију ЛВ и оксидативни стрес и да је лечење питавастатином ублажило ове промене сузбијањем сигналног пута ТГФ-β / смадс, иако прецизни механизми који су укључени у тај пут још увек нису јасни. У овом истраживању, експресија ТГФ-п мРНА у миокарду ЛВ је значајно повећана излагањем испрекиданој хипоксији, која је сузбијена лечењем питавастатином. Познато је да су мастоцити чували ТГФ-П у интраћелијским гранулама и да га издвајају, да би га активирали химаза. 45, 46, 47 Потребна су додатна испитивања да се утврди улога мастоцита у преградњама ЛВ изазваних хипоксијом.

Закључно, повремена хипоксија може изазвати ремоделацију кардиоваскуларног система оксидативним стресом и изазивањем упале. Питавастатин може спречити морфолошке промене изазване повременом хипоксијом, бар делимично, сузбијањем оксидативног стреса и упале. Агресивно лечење питавастатином код пацијената са синдромом апнеје у сну може ослабити кардиоваскуларно ремоделирање изазвано повећаним оксидативним стресом код ових пацијената.