Протеомски скрининг идентифицира калретицулин као мир-27а директну мету која потискује изложеност мхц класе и површине ћелије код колоректалног карцинома | ћелијска смрт и болест

Протеомски скрининг идентифицира калретицулин као мир-27а директну мету која потискује изложеност мхц класе и површине ћелије код колоректалног карцинома | ћелијска смрт и болест

Anonim

Субјекти

  • Апоптоза
  • Ћелијска сигнализација
  • Колоректални канцер
  • миРНА

Апстрактан

Оштећење имуног одговора и аберантна експресија микроРНА су нови заштитни знаци иницијације / прогресије тумора, поред мутација гена покретача и епигенетских модификација. Обавили смо прелиминарно истраживање независних скупова података миРнома аденома и колоректалног карцинома (ЦРЦ), а међу најрегулиранијим миРНА одабрали смо миР-27а и открили да је он већ регулисан у аденом и даље се повећава током еволуције до аденокарцинома. Да бисмо идентификовали нове гене и путеве регулисане овом миРНА, користили смо диференцијалну 2ДЕ-ДИГЕ анализу протеоме. Показали смо да миР-27а модулира групу протеина који су укључени у површинску изложеност ћелија МХЦ класе И и, механички је показао, да је калретицулин директна мета миР-27а одговорна за већину ефеката низводно у експериментима са епистазама. Ин витро миР-27а утицао је на пролиферацију ћелија и ангиогенезу; мишји ксенографти хуманих ЦРЦ ћелијских линија који изражавају различите нивое миР-27а потврдили су варијације протеина и рекапитулирали ћелијски раст и ефекте апоптозе. Ин виво миР-27а обрнуто је повезан са МХЦ молекулама класе И и експресијом калретицулина, инфилтрацијом ЦД8 + Т ћелија и цитотоксичном активношћу (излагање ЛАМП-1 и ослобађање перфорина). Тумори са високим инфилтрацијом ћелија миР-27а, ниским калретицулином и ЦД8 + Т били су повезани са удаљеним метастазама и лошом прогнозом. Наши подаци показују да миР-27а делује као онкомиРНА, потискује експресију МХЦ класе И путем смањене регулације калретицулина и утиче на прогресију тумора. Ови резултати могу отворити пут за бољу дијагнозу, стратификацију пацијената и нове терапијске приступе.

Главни

Колоректални карцином (ЦРЦ) трећи је главни узрок рака у свету. 1, 2 Поред мутација гена и епигенетских модификација, слабљење имунолошког одговора и дисрегулација микроРНА појављују се својства иницијације / прогресије тумора. 3, 4, 5 Туморске ћелије изазивају нативни и адаптивни имуни одговор посредован различитим типовима ћелија који имају за циљ да искоријене тумор. 6 Прерада антигена и презентација главних молекула хистокомпатибилности (МХЦ) молекула класе И је критичан догађај за постизање специфичног антитуморског одговора. 7 Антигенски пептиди класе И потичу од пропадања посредованих протеасомима унутарћелијских протеина и транспортују се у ендоплазматски ретикулум преко транспортера повезаних са протеинима за обраду антигена (ТАП1 и 2). Овде се учитавају на комплекс који оптерећује пептиде (ПЛЦ) формиран од ГРП78, калнекина и тапасина на коме се калретицулин и ЕРп57 регрутују за интеракцију са МХЦ молекулама класе И. 8, 9 Након што се напуне „оптималним“ антигенима, ови последњи молекули се одвајају од ПЛЦ-а и премештају на ћелијску површину где их ћелије имунолошког система препознају, доприносећи имунолошком надзору. 9, 10, 11

Дефекти презентације антигена класе МХЦ јављају се великом фреквенцијом солидних тумора и карактеристика је имунске евазије тумора која ћелије рака чини невидљивим за цитотоксичне Т ћелије. Селективни губитак или смањени ниво МХЦ класе И опћенито је повезан са напредовањем болести и смањењем преживљавања пацијената. Специфично, силазна регулација МХЦ класе И откривена је у> 74% колоректалних тумора и повезана је са знатно краћим средњим преживљавањем специфичним за болест у поређењу са МХЦ-високо-експресивним туморима класе И. 6, 12

Дисрегулација микроРНА је уобичајена карактеристика људских малигнитета јер делују као онкомиРНА или миРНА-супресорски тумори. 4, 5, 13 Допринос миРНАс антитуморском имунолошком одговору је још увек недефинисан и тема је која се интензивно истражује. У овој студији смо урадили прелиминарно истраживање независних скупова података миРнома аденома и ЦРЦ-а, а међу најрегулиранијим миРНА-има изабрали смо миР-27а и показали да је он већ регулиран у аденому и даље се повећава током еволуције до аденокарцинома. Након тога, користећи протеомски приступ, идентификовали смо серију нових протеина модулисаних миР-27а који су укључени у изложеност површинских ћелија МХЦ класе И. У експериментима са добитком и губитком функције пружамо доказе да миР-27а оштећује овај пут директно циљајући на калретицулин. Даље, миР-27а у великој мери утиче на пролиферацију ћелија и ангиогенезу ин витро и на ксенографте миша где су ови резултати рекапитулирани. Доследно, миР-27а је прекомерно изражен у великом делу спорадичних ЦРЦ-а код људи, обрнуто је у корелацији са МХЦ молекулима И класе и инфилтрацијом и активношћу ћелија ЦД8 + Т. Комбинација високог миР-27а / ниског каретицулина повезана је са удаљеним метастазама и лошијим исходима.

Резултати

миР-27а је регулиран у хуманом аденому и ЦРЦ-у

Прелиминарно смо анализирали јавно доступни скуп података о аденом за профил експресије миРНА (Е-МТАБ-813); 14 топлотна карта извештава о списку оних који су регулирани или регулисани. Такође смо анализирали два независна скупа података миРнома ЦРЦ-а (ГСЕ35602_мицроарраи и ТЦГА_миРНА-сек) 15, 16 и, пресеком резултата као што је приказано у Веннов дијаграму, идентификовали смо три уобичајена нерегулисана миРНА (слике 1А-Ц). Ми смо одабрали миР-27а за даљу анализу и проценили његову експресију у нашој серији аденом ( н = 32) и спорадичним ЦРЦ-има ( н = 80) квантитативном РТ-ПЦР анализом. миР-27а је већ повишен у око 60% аденома и додатно је порастао током прогресије тумора (стадијуми И – ИИ, н = 48; стадији ИИИ – ИВ, н = 32), што сугерише да је његова аберантна експресија рани догађај у тумореригезе дебелог црева. (Слика 1Д). Ови подаци потврђени су ин ситу хибридизацијом која је показала високе нивое аденома који су се повећали у диференцираном и још више у недиференцираним узорцима тумора (Слика 1Е).

Image

Урегулација мир-27а препозната је у силикону и потврђена је анализом аденома и ЦРЦ ткива. ( А ) Топлотна карта приказује различито изражену микроРНК у серији ткива аденома ( н = 21) у односу на нормалну мукозу (Е-МТАБ-813). 14 Црвена стрелица указује на високе вриједности миР-27а у узорцима аденома. ( Б ) различито изражене миРНА у 13 епителних узорака ЦРЦ-а и четири нормална ткива (ГСЕ35602) су приказани на плочи вулкана (црвени квадрати; промена набора> 2, П ≤ 0, 05); 15 миР-27а (зелени квадрат) је стрелицом. Зелене линије означавају промену прегиба и П- вредност прага. ( Ц ) Веннов дијаграм приказује број различито изражених миРНА идентификованих у независним и јавно доступним ЦРЦ скуповима анализираних микрорезом (плави; ГСЕ35602) 15 или РНА-сек (жути; ТЦГА ЦОАД скуп података). 16 У табели испод дијаграма наведени су само дељени миРНА и њихови релативни нивои експресије. Промјена савијања> 1, 5; П <0, 01 ( Д ) Оквир кутије приказује нивое миР-27а процењене квантитативном реверзном транскриптазом-ПЦР у нашим нормалним ткивима, аденомима ( н = 32) и узорцима ЦРЦ-а ( н = 80) класификованим у складу са стадијима тумора (стадијуми И-ИИ, н = 48; фазе ИИИ – ИВ, н = 32). ( Е ) Репрезентативна хибридизација ин ситу (ИСХ) миР-27а у различитим фазама колоректалне тумоуригенезе (оригинална увећања × 10 и × 5)

Слика пуне величине

Идентификација нових гена и путева регулисаних миР-27а диференцијалном анализом протеома

Да бисмо идентификовали нове протеине и путеве модулисане миР-27а, користили смо протеомски приступ. Прво смо проценили његову експресију у низу ћелијских линија добијених ЦРЦ-ом и изабрали ХЦТ116 међу онима који прекомерно изражавају (Слика 2а). Вектор плазмида који носи кратку укосницу анти-миР-27а РНА (схРНА) и ГФП (зелени флуоресцентни протеин) касету стабилно је трансфектиран у ХЦТ116 ћелије (ЦТРЛ); за даље студије одабран је ћелијски клон, у даљем тексту дефинисан миР27а_КД (Слика 2б). Ефикасност пригушивања утврђена је проценом смањења миР-27а и повећањем потврђених циљева ( ППАРГ , ЗБТБ10 и ФБКСВ7 ) (слика 2ц и додатна слика С1А). 17, 18, 19, 20 Такође смо инфицирали ћелије ХЦТ116 плазмидом који носи мимику миР-27а, и међу клоновима који прекомерно експримирају, изабрали смо једну у даљем тексту која се зове миР27а_ОЕ. Екстракти из ЦТРЛ и миР27а_КД ћелија анализирани су упоредним протеомским 2ДЕ-ДИГЕ показујући различите експресијске профиле и конзистентну експерименталну обновљивост (Додатна слика С1Б, Додатна табела С1). Од 51 различито изражених тачака, 27 је идентификовано помоћу ЛЦ-МС / МС, корелирано са одговарајућим тачкама и разврстано у 9 функционалних класа према њиховим биолошким активностима (слике 2д и е, допунска табела С2). Квантификација одабраних тачака приказана је у тродимензионалном приказу заједно са одговарајућим стандардним обиљем у две различите ћелијске линије (слика 2ф). Валидација западном блот анализом открила је пораст калретицулина (ЦРТ), тапасина (ТАПБП), ГРП78, ЕРп57 и анексина А1 (АНКСА1) и смањење ТРАП1 у миР27а_КД у односу на ћелије ЦТРЛ; инверзни резултати добијени су у миР27а_ОЕ (слика 2г).

Image

Протеомско (2ДЕ-ДИГЕ) профилирање идентификује нове протеине и путеве модулиране миР-27а у ЦРЦ ћелијским линијама. ( а ) Експресија миР-27а је анализирана квантитативном реверзном транскриптазом-ПЦР у назначеним ћелијским линијама ЦРЦ. Хистограм извјештава о промјени набора у односу на ХТ29 ћелије узете као контролу. У6 РНА ​​је коришћена као калибратор. ( б ) ХЦТ116 ћелије су стабилно трансфициране вектором миР-Зип-27а, носећи антисенсе миР-27а и ГФП репортерски ген, или са празним вектором као контролом. Ћелије су изоловане за ГФП експресију и за миР-27а клонове са ниском експресијом (миР27а_КД); ** П ≤0, 01 (дворедни т- тест ученика). ( д ) Шематски приказ поступка 2ДЕ-ДИГЕ / МС од припреме узорка и обележавања до анализе гела и идентификације протеина. Репрезентативна слика гела пуњеног екстрактима из ХЦТ116 ЦТРЛ и миР27а_КД ћелија: око 1200 протеинских места је идентификовано, квантификовано, нормализовано и интергелирано. Протеини су препознати кратком променом одговарајућих места. ( е ) Протеини идентификовани помоћу 2ДЕ-ДИГЕ класификовани су у девет функционалних класа, у складу са њиховим биолошким активностима, како је приказано на графикону пита. ( ф ) Тродимензионални приказ квантификације 2ДЕ-ДИГЕ илустрован је заједно са стандардним обиљем интересантних места идентификованих у геловима добијеним из екстракта ћелија ХЦТ116 ЦТРЛ и миР27а_КД. ( г ) Анализа западног блотирања одабраних протеина идентификованих као различито изражене у 2ДЕ-ДИГЕ / МС анализи у ХЦТ116 ЦРТЛ, миР27а_КД и миР27а_ОЕ ћелијама (ћелијска линија добијена ХЦТ116 која прекомерно изражава егзогени миР-27а). Релативна промена набора протеина, добијена дензитометријском анализом и нормализацијом на β -Актин, извештава се у одговарајућем хистограму. * П ≤ 0, 05; ** П ≤0, 01 (дворедни т- тест ученика). Подаци су репрезентативни за три независна експеримента, а траке грешака представљају СД техничких реплика (средња вредност ± СД) у панелима ( а ), ( б ), ( ц ) и ( г )

Слика пуне величине

миР-27а смањује изложеност МХЦ класе И површинске површине

Да бисмо препознали путеве у које су укључени идентификовани протеини, испитивали смо алгоритам Анализе пута интензитета (ИПА): алгоритам презентације антигена, имунолошки и упални путеви били су највише обогаћени (слика 3а, додатна слика С1Ц). Сходно томе, проценили смо изложеност ћелијских површина молекула МХЦ класе И у три различите ћелијске линије (ХЦТ116, ХТ29 и РКО) и њихове дериватне клонове било са миР-27а или пригушеним или прекомерно израженим. У проточној цитометрији ћелије миР27а_КД су приказале више протеина МХЦ класе И на површини него родитељске ћелије ЦТРЛ, док ћелије миР27а_ОЕ имају мање протеина (слика 3б). Слично томе, у имунофлуоресцентном обојењу, специфично антитело је препознало малу количину протеина класе МХЦ И на мембрани непермеабилисаних ХЦТ116 ЦТРЛ ћелија које су се значајно повећале на површини миР27а_КД, док су умањене у миР27а_ОЕ ћелије (Слика 3ц). Специфичност бојења је потврђена супротстављањем језгара са ДАПИ: спајањем, две бојења су остале одвојене док обележавају различито субцелијско одељење. Да бисмо добили квантитативнију оцену протеина изложених на ћелијској површини, успоставили смо поступак за селективну изолацију протеина плазма мембране и процену оних који су укључени. Фракција мембрана ћелија миР27а_КД садржавала је најмање четири пута више молекула МХЦ класе И од ЦТРЛ и чак више од миР27а_ОЕ ћелија. Да траке одговарају стварним мембранским протеинима, потврђено је изазивањем исте фракције са Е-кадхерином, интегралним мембранским протеином, као позитивном контролом, и са β -Актином, цитосолним протеином као негативном контролом (Слика 3д). Сви ови подаци показују да је површинска експресија молекула МХЦ класе И смањена миР-27а.

Image

Излагање површини ћелија МХЦ класе И је смањено миР-27а у ћелијама ЦРЦ. ( а ) На цртежу су приказане најбогатије мреже генерисане из листе различито експримираних (ДЕ) протеина (црвени елементи = урегулирани протеини; зелени елементи = дерегулирани протеини) након ћутања миР-27а коришћењем ИПА. ( б ) Анализа проточне цитометрије открива различиту изложеност ћелијске површине молекула МХЦ класе И у ХЦТ116, РКО, ХТ29 и њиховим дериватним клоновима миР27а_КД или миР27а_ОЕ. ( ц ) Бојење имунофлуоресценције коришћењем антитела против хуманих МХЦ молекула класе И у ХЦТ116 ЦТРЛ и њихових деривативних клонова миР27а_КД или миР27а_ОЕ (скала скале, 50 µм ). ( д ) Обогаћивање молекула МХЦ класе И у изолованој фракцији плазма мембране. Позитивност на Е-кадхерин, мембрански протеин и негативност на β -Актин, цитосолни протеин, доказали су да су идентификовани протеини заиста интегралне компоненте мембране. Описана је релативна промена набора, добијена дензитометријском анализом и нормализацијом на Е-кадхерин, испод појаса. * П ≤ 0, 05; ** П ≤0, 01 (дворедни т- тест ученика). Подаци представљају три независна експеримента и траке грешака представљају СД техничких реплика (средња ± СД)

Слика пуне величине

миР-27а директно циља каретицулин који утиче на изложеност МХЦ класе И

Да бисмо идентификовали директну мету миР-27а међу различито експримираним протеинима, испитивали смо неколико алгоритама и предвидјели калретицулин као претпостављени циљ захваљујући сачуваној секвенци за препознавање семена у 3'УТР одговарајуће мРНА (Слика 4а). 22 МиСцрипт циљни заштитник (ТП) дизајниран је против ове секвенце препознавања да селективно спречи везивање миР-27а на одговарајућу мРНА, не ометајући деловање миРНА на друге циљеве. Након трансфекције ТП, каретицулин се повећао у ХЦТ116 и миР27а_ОЕ више од миР27а_КД ћелија (Слика 4б). Занимљиво је да се такође повећала когнитивна мРНА, вероватно због ефекта стабилизације, доприносећи порасту протеина откривеном у ћелијама ХЦТ116 и миР27а_ОЕ (слика 4ц). Трансфекција три независна сиРНА против калретикулинске мРНА у ХЦТ116, миР27а_КД и миР27а_ОЕ ћелијама успешно је утишала протеин, а сиРНА # 3 је најефикаснија (Слика 4д). Да бисмо одредили утицај оси миР-27а / каретицулин на површинску изложеност молекула МХЦ класе И, трансфектирали смо калретицулин ТП и сиРНА у три ћелијске линије. У проточној цитометрији ТП није створио значајне разлике, док сиРНА, посебно сиРНА # 3, повећавају приказ МХЦ класе И за 50% у миР27а_КД и 25-30% у ЦТРЛ и миР27а_ОЕ ћелијама (слика 4е), у складу са укупни садржај изоловане фракције мембране плазме (слика 4ф). Калретицулин је, дакле, директна мета миР-27а и посредује ефекте на изложеност МХЦ класе И.

Image

Калретицулин је миР-27а мета и утиче на изложеност ћелија површинске класе МХЦ класе И. ( а ) Схематски приказ мРНА хуманог калретицулина (ЦРТ): високо очувана локација за везивање миР-27а која се налази у 3'УТР приказана је црвеном бојом. ( б ) Имуноблотска анализа нивоа ЦРТ у ХЦТ116 ЦТРЛ и дериватним клоновима миР27а_КД или миР27а_ОЕ ћелија после трансфекције специфичним циљним заштитником (ЦРТ-ТП) или негативном контролом (НЦ-ТП) током 72 х. П- Актин је коришћен као контрола оптерећења. * П ≤ 0, 05, нс = незначајно. ( ц ) ЦРТ мРНА кРТ-ПЦР анализа ХЦТ116 ЦТРЛ и дериватних клонова миР27а_КД или миР27а_ОЕ ћелије трансфектиране са специфичним ЦРТ-ТП или негативном контролом (НЦ-ТП) у току 72 х. * П ≤ 0, 05 (Студент'с т -тест). ( д ) ЦРТ имуноблотска анализа ХЦТ116 ЦТРЛ и дериватних клонова миР27а_КД или миР27а_ОЕ ћелија трансфектирана са три специфичне ЦРТ сиРНА или контролном сиРНА у току 72 х. Денситометријска анализа је дата испод опсега. ** П ≤0, 01 (Студент'с т -тест). ( е ) Процена проточне цитометрије површинских молекула МХЦ класе И у истим ћелијама као у ( б ) после трансфекције ЦРТ-ТП или ЦРТ-сиРНА или релативне негативне контроле у ​​току 72 х. ( ф ) Имуноблотска анализа молекула МХЦ класе И присутних у фракцији ћелија ХЦТ116 ЦТРЛ и њихових деривативних клонова миР27а_КД или миР27а_ОЕ трансфицирани са ЦРТ-сиРНА или кодираном сиРНА контролом (Цтрл-сиРНА). Подаци нормализовани на Е-кадхерин приказани су у хистограмима. * П ≤0.05, ** П ≤0.01 у односу на ХЦТ116 ЦТРЛ ћелије; # П ≤0, 05 насупрот Цтрл-сиРНА трансфектираним ћелијама

Слика пуне величине

Мишеви ксенографти рекапитулишу ефекте миР-27а на протеомски профил и раст ћелија

Да бисмо истражили модулацију миР-27а на протеинима идентификованим помоћу 2ДЕ-ДИГЕ ин витро , генерисали смо ксенографте миша. ХЦТ116 и ХТ29, репрезентативни за ћелије миР-27а-прекомерне експресије или -декпресије, поткожно су трансплантиране у голе мишеве. Након 2 недеље, миР-27а инхибитор или кодирана контрола су интратумоурално убризгавани сваких 7 дана по четири пута у туморе добијене ХЦТ116. Алтернативно, миР-27а мимичне или кодиране контроле убризгаване су у туморе добијене ХТ29. На дан 36 од трансплантације, мерене туморске масе су измерене, изрезане и анализиране. Величина малигних обољења изведених од ХЦТ116 била је невероватно већа (> 50%) од оних које су убризгане антисенсе миР-27а. Такође, тумори добијени ињекцијом миР-27а мимике у масе добијене из ћелије ХТ29 били су> 50% већи од оних из родитељских ћелија (Слика 5а). Специфичност и ефикасност инхибиције или прекомерне експресије миР-27а је верификована кРТ-ПЦР на укупним РНА издвојеним из две различите врсте тумора. У складу са величином, позитивност на Ки67 била је јача у високим миР27а експримирајућим туморима од доњих, подржавајући улогу ове миРНК у ћелијској пролиферацији (допунске слике С3А и Б). Супротно томе, апоптоза је знатно смањена код истих тумора, док су велике површине апоптозе откривене код оних који изражавају ниски миР-27а тестом крајњег деоксинуклеотидил-трансферазе (ТдТ) посредованог дУТП-овог низа испитивања теста означавања (ТУНЕЛ) (слике 5б и ц)

Image

миР-27а делује као онкогена миРНА у мишјим ксенографима. ( а ) Репрезентативне фотографије маса ксенографта изрезаних из сваке експерименталне групе. инхибитор миР-27а (анти-миР-27а; н = 5) и кодирана контрола (миР-Цтрл; н = 5) у ХЦТ116 ћелијама или миР-27а опонаша (миР-27а; н = 5) и кодирано контролише (миР- Цтрл; н = 5) у ћелије ХТ29 интратумуално се убризгава сваких 7 дана током четири циклуса почевши од дана када су тумори достигли запремину од 200 мм3. Кривуља тумора раста пријављена је за обје врсте ксенографта. ( б ) репрезентативне фотомикрографије обојења хематоксилином и еозином, калретицулин и ИХЦ анализа ИХЦ класе МХЦ, и ТУНЕЛ теста, рађене на одсецима истих ткива уграђених парафином; скале скале, 200 µм . ( ц ) Хистограм приказује апоптотски индекс како је утврђено ТУНЕЛ тестом. ( д ) Анализа западног блотирања одабраних гена протеина идентификованих помоћу 2ДЕ-ДИГЕ изведена на укупним протеинским екстрактима мишјих ксенографта и ( е ) њихова релативна квантификација. Подаци су представљени као средство ± СД са најмање два независно третирана тумора; * П ≤ 0, 05; ** П ≤0.01 ( т- тест ученика)

Слика пуне величине

Цалретицулин, ЕРп57, ГРП78 / БиП, Аннекин1 и Тапакин су смањени у западној блот-анализи екстраката ХЦТ116 тумора, док су сви били регулирани у онима са тихом миР-27а. ТРАП1 је показао обрнуто понашање, у складу са резултатима 2ДЕ-ДИГЕ ин витро (слике 5д и е). Анализа истих маркера у ХТ29 туморима произвела је супротан сценарио, у складу са нижим изразом миР-27а који је обрнут након убризгавања одговарајућег мимика. Нису примећене варијације за све назначене протеине у западним блотовима екстраката тумора убризганих кодираном контролом у односу на туморе који потичу од ХЦТ116 или ХТ29 (подаци нису приказани).

Експресија МХЦ класе И је праћена имунохистохемијом (ИХЦ). Сигнал откривен на пресецима ткива из миР-27а антисенс убризганих тумора био је јачи него од кодираних тумора убризганих или родитељских ћелија. При већем увећању, обојење је локализовано на ћелијској мембрани, што је у складу са стимулацијом МХЦ транслокације ћелијске класе И класе након утишања миР-27а. Квантитативнија анализа блокаде западњака на екстрактима из истих тумора потврдила је на мишјем моделу да је миР-27а пригушивање повезано са укупним порастом протеина класе И МХЦ (слике 5б, д и е). Доследно, каретицулин показује слабу и углавном цитосолну позитивност на одсецима ХЦТ116 тумора од стране ИХЦ. Уместо тога, бојање је било сјајно локализовано као „закрпе“ на ћелијским мембранама код тумора убризганих антисенсе миР-27а (слика 5б). Вестерн блот-анализа екстраката из истих ткива показала је целокупно повећање калретицулина само код оне масе са смањеним миР-27а (слике 5д и е). Колективно, мишји ксенографти потврдили су да миР-27а утиче на раст ћелије и апоптозу такође у ЦРЦ и јасно показали да негативно модулира специфични скуп протеина идентификованих ин витро који посебно доприносе експресији МХЦ класе И. Ови резултати дефинитивно показују да је миР-27а фактор који индукује ЦРЦ тумор који делује као онкомиРНА.

Експресија миР-27а у ЦРЦ обрнуто је у корелацији са експресијом МХЦ класе И и калретицулином и са инфилтрацијом / активацијом ЦД3 + и ЦД8 + Т ћелија.

Да бисмо повезали податке добијене ин витро и на ксенографима миша са људским ЦРЦ, извршили смо квантитативну анализу западног блотмента неких репрезентативних узорака: ЦРЦ-ови високи миР-27а који показују експресију ниских МХЦ молекула класе И калретицулина (слике 6а и б). Сходно томе, ИХЦ ткивних микрорачуна показао је да високи миР-27а експресионирајући тумори често показују слабо или одсутно мембрано обојење молекула МХЦ класе И и каретицулина; бојање је било јаче код тумора са експресијом миР-27а (слика 6ц). Поред тога, миР-27а обрнуто је корелиран са инфилтрацијом и перфорином позитивности ЦД3 + и ЦД8 + Т чија је релативна бројност одређена (слике 6ц и д). Перфорин и ЛАМП-1 су два мембранска протеина који се користе као сурогатски маркери цитотоксичне активности ЦД8 + Т ћелија. 23 Дакле, ЦД8 + / перфорин + и ЦД8 + / ЛАМП-1 + двоструко позитивне ћелије, детектиране имунофлуоресценцијом на узорцима ЦРЦ-а, биле су веће код тумора са експресијом миР-27а (слике 7А и Б). Све у свему, ови резултати сугерирају да миР-27а може смањити инфилтрацију, активирање, пролиферацију и дегранулацију Т ћелија. 24 Конзистентно, Капланова и Меиерова анализа преживљавања пацијената показале су да су ниска калретицулинска експресија ( П <0, 001) и ЦД3 + и ЦД8 + ниски инфилтрати ( П <0, 001), узимани сами, значајно повезани са краћим укупним преживљавањем, док су високи миР -27а је показао само тренд ( П = 0, 104; допунске слике С4А и Б). Ниска калретикулинска / висока миР-27а асоцијација ( н = 26) била је она с најгорим исходом када су се те карактеристике комбиновале; Анализа омјера ризика свих могућих асоцијација идентифицирала је калретицулин као доминантну варијаблу која је била још дискриминаторнија у комбинацији са високом експресијом миР-27а. Када су ЦД8 + инфилтрати повезани са нивоима миР-27а, комбинација ниска ЦД8 + / висока миР-27а имала је лошију прогнозу; Анализа омјера ризика свих могућих асоцијација истакла је присуство ЦД8 + инфилтрата као доминантне варијабле (слике 7Ц и Д). Високи миР-27а / низак каретицулин такође је био повезан са развојем метастаза у јетри, а инфилтрати ћелија ЦД3 + / ЦД8 + Т су смањени у метастазама у поређењу са матичним примарним туморима (допунске слике С4Ц-Е).

Image

Пораст регулације миР-27а у узорцима ЦРЦ-а корелира са смањеном МХЦ класе И и калретицулинском експресијом и инфилтрацијом ЦД3 + и ЦД8 + Т ћелија. ( а ) Вестерн блот анализом ЦРТ и МХЦ молекула класе И у репрезентативној групи нормалних ткива ( н = 5) и узорака ЦРЦ ( н = 9) класификованих према изразу миР-27а; П- Актин је коришћен као контрола оптерећења. ( б ) Оквирне плоче извештавају о нивоима ЦРТ и МХЦ класе И у нормалним насупрот туморским ткивима (горње) и у туморским ткивима према нивоима миР-27а (доњи). ( ц ) ИХЦ анализа МХЦ ћелија инфилтрације класе И, ЦРТ, ЦД3 + и ЦД8 + Т у парафинске узорке нормалних и ЦРЦ узорака класификованих према нивоима миР-27а (скала бар, 50 μм ). ( д ) Прикази на кутијама извештавају о инфилтрацији ЦД3 + и ЦД8 + Т ћелија која се односи на нивое миР-27а. П- вредности су израчунате упареним т- тестом на панелима ( б ) и ( д )

Слика пуне величине

Image

миР-27а је обрнуто повезан са инфилтрацијом и активацијом ЦД8 + Т ћелија која утиче на агресивност тумора и опстанак пацијената. ( А ) ИХЦ анализа миР-27а, ЦД8 + Т ћелија и перфорина у узорцима ЦРЦ-а уграђених у парафин класификовани према различитим стадијима тумора (стадијуми И – ИИ насупрот ИИИ – ИВ) (скала скале, 50 µм ). Хистограми у наставку извештавају о квантификацији обојења ЦД8 / перфорином израженом као средњи број позитивних ћелија у пољима велике снаге (ХПФ). ( Б ) Имунофлуоресцентна анализа двоструко обојених ЦД8 + (црвена) и ЛАМП1 + (зелена) или ЦД8 + и перфорин + ћелија (скале: 20 µм у панелима а и б, и 5 µм у панелима б и д ) . Хистограми са десне стране показују проценат двоструко позитивних ЦД8 + / ЛАМП1 + и ЦД8 + / перфорин + ћелија у туморским ткивима према миР-27а нивоима ** П ≤ 0, 01 (двоструки студентов т- тест). ( Ц и Д ) Каплан-Мејерова анализа преживљавања пацијената са ЦРЦ-ом на основу комбинација ( Ц ) ЦРТ / миР-27а и ( Д ) ЦД8 + / миР-27а. Лог-ранк тест; П = 0, 012, П = 0, 096. Анализе омјера опасности приказују се у оквирима с десне стране

Слика пуне величине

Биолошку релевантност ових података потврдила су два јавно доступна скупа података. Експресија 15, 16 миР-27а изразито се повећала стагнирањем тумора и обрнуто је корелирала са укупним преживљавањем пацијената, у складу са резултатима нашег скупа података (допунска слика С5А). Занимљиво је да је мРНА калретицулина повишена у свим скупима података, а одговарајући протеин је смањен, а одступање је објашњено посттранскрипцијском контролом посредованом миР-27а овде (Допунске слике С6А и Б; Слике 6а-ц). миР-27а обрнуто повезана и са мРНА ЦД3 + и ЦД8 + Т ћелија из раних стадијума тумора и повезана са лошом прогнозом, подржавајући резултате наше серије (допунске слике С6Ц – Е). МиР-27а колективно делује као онкомиРНА из раних фаза тумореригезе дебелог црева, смањује МХЦ класу И и калретицулинску експресију, корелира са инфилтрацијом ЦД3 + / ЦД8 +, развојем удаљених метастаза и лошијим исходом који вероватно утиче на имунолошки одговор домаћег антитуморског одговора ин виво .

Дискусија

Откривање читавог спектра функција микроРНА је главни задатак јер су укључени у огроман низ биолошких процеса. Поред тога, истовремено циљају многе гене који делују на различите путеве, чије интеракције стварају мрежу која може бити различита у различитим контекстима и типовима ћелија. 4, 5, 13 Протеомским приступом 2ДЕ-ДИГЕ идентификујемо низ протеина модулисаних миР-27а који су укључени у експресију МХЦ класе И. Специфично, миР-27а сузбија површинску изложеност МХЦ класе И, директно усмерену на каретицулин, протеин који је укључен у контролу квалитета склопа овог мулти-подјединица, што доприноси његовој стабилности и проналажењу суптимистично састављених молекула МХЦ класе И. 7, 8, 9, 10, 11 Механички, каретицулин је главни ефектор миР-27а низводно у потискивању површинске изложености МХЦ класе И, што је најважнији догађај у изазивању ефикасног имуног одговора и искорјењивању тумора. Дефекти у овом процесу су уобичајено средство да ћелије рака избегну препознавање Т ћелија. 25, 26 Подаци ин виво подржавају овај појам: високи миР-27а експресионирајући тумори обрнуто су у корелацији са експресијом МХЦ класе И у нашој ЦРЦ серији. Иако су потребна даљња испитивања како би се пружио механички увид у везу између миР-27а и презентације антигена класе МХЦ и, на крају, препознавања и активације ЦД8 + Т ћелија, наши данашњи подаци показују да ос миР-27а / калретицулин регулише класу МХЦ И ћелијска површинска експресија. УРЕГУЛАЦИЈА миР-27а настаје од најранијих фаза колоректалне тумореригенезе и траје током прогресије, што представља агресивнији развој. У складу са тим, ЦРЦ-и који изражавају комбинацију високог миР-27а / ниског калретицулина повезани су са смањеном инфилтрацијом ЦД3 + / ЦД8 + Т ћелија и цитотоксичном активношћу, агресивнијим понашањем, метастатским ширењем и лошијим исходом. Нови сценариј је да тумор и суседне ћелије, посебно инфилтрирајуће имуне ћелије, успостављају специфично микро окружење кроз замршену мрежу унакрсних везе. 27, 28 миР-27а је пресудно у имунолошким ћелијама, јер инхибира сазревање ДЦ-а и пролиферацију и активирање Т ћелија, док индукује сазревање подтипова М2б и М2ц макрофага. 29, 30, 31 Овде пружамо доказе да миР-27а има кључну улогу такође у туморским ћелијама притиском изложености површини МХЦ класе И. Чини се да је миР-27а вишеструки сигнални молекул који може утицати на имунолошке интеракције ћелија-домаћина и вјероватно онеспособити компоненте имуног система које су отпремљене да их елиминишу.

Закључно, демонстрирамо први пут да миР-27а модулира површинску изложеност МХЦ класе И директним циљањем на калретицулин. Наши подаци подржавају да миР-27а има критичну улогу у тумоуригенези дебелог црева која вероватно утиче на антитуморски имуни одговор. Идентификација регулаторне оси миР-27а-каретицулина отвара путеве за тражење нових стратегија усмерених на побољшање прогнозе пацијента и побољшање терапијског одговора.

Материјали и методе

Ћелијска култура

Хумане ћелије рака карцинома дебелог црева ХЦТ116, ХТ29, ЦаЦо-2, ЛоВо, РКО и СВ480 купљене су из америчке колекције типова култура (АТЦЦ, Роцквилле, МД, УСА). Све ћелијске линије су одржаване у Дулбеццовом модификованом медијуму Еагле или РПМИ 1640 са додатком 10% феталног говеђег серума, 2 мМ Л-глутамина, пеницилина и стрептомицина. Ћелије су култивисане у влажном 37 ° Ц инкубатору при 5% Ц02. Ендотелне ћелије пупчане врпце набављене су од АТТЦ-а и одржаване у ЕГМ БуллетКит медијуму (Лонза, Аллендале, Њ, УСА).

Трансфекција олигонуклеотида и плазмида

Синтетички миР-27а мимик (Син-хса-миР-27а), инхибитор миР-27а (анти-хса-миР-27а) или одговарајуће кодиране контроле (АллСтар или мирСцрипт Инхибитор-негативна контрола) су купљене од компаније Киаген (Хилден, Немачка ). МиР-27а-антисенс (МЗИП27а-ПА-1), експресивни пре-миР-27а конструкти (ПМИРХ27а-онлиПА-1) и кодирани контролни миРНА (МЗИП000-ПА-1; ПМИРХ000ПА-1) плазмиди (Систем биознаности, Моунтаин Виев, ЦА, УСА) су трансфициране у различитим ЦРЦ ћелијским линијама. функционална испитивања микроРНА изведена су инхибирањем интеракција циљне миРНА-мРНА било са прилагођеним дизајнираним калретицулин-миСцрипт Таргет Протецтор или негативним контролним миСцрипт Таргет Протецтор-ом (МТП0075035; Киаген). Детекција без варијација у неповезаним протеинима валидирајући специфичност ТП. За пролазне трансфекције коришћен је генско-специфични пакет од три претходно одабрана сиРНА против калретицулина (Флеки Тубе сиРНА ГС811) или негативне контролне сиРНА (СИ03650325) (Киаген). Функционални тестови, анализа РНК и протеина изведени су у року од 24/72 х од трансфекције. У сваком експерименту, степен мировања / прекомерне експресије и калретицулинског ћутања миР-27а су процењени кРТ-ПЦР и Вестерн блоттинг анализом, респективно. Плазмиди и олигонуклеотиди су трансфектирани коришћењем Липофецтамине 2000 (Тхермо Фисхер, Валтхам, МА, САД), ХиПерФецт Трансфецтион Реагент (Киаген) или РНАи Мак (Тхермо Фисхер), у складу са препорукама произвођача.

екстракција мРНА / миРНА и кРТ-ПЦР анализа

Укупна РНА је екстрахована из ћелија и ткива помоћу ТРИзола (Тхермо Фисхер) и третирана ДНазом И. микроРНА су екстрахована помоћу Киаген миРНеаси Мини Кит (Киаген) према протоколу произвођача. Процена чистоће и количине РНА изведена је као што је описано. 32 Секвенце специфичних примера приказане су у Додатној табели С3.

Вестерн блоттинг анализа

Протеински екстракти из ћелијских линија и ткива су припремљени и анализирани као што је раније објављено. 32 Антитела на калретицулин (аб2907), ТАПБП (аб140982), ЕРП57 (аб13506) и МХЦ класе И (аб70328) била су из компаније Абцам (Цамбридге, МА, САД); ППАР и (сц-7273), ТРАП1 (сц-9134), ГРП78 (сц-13968), анти-миш (сц-2031) и зец (сц-2004) били су из Санта Цруз Биотецхнологи (Даллас, ТКС, УСА) ); АНКСА1 (71–3400) из Термо-Фишера, β- Актин (Ф-3022) из ​​Сигма-Алдрицха (Милано, Италија); Е-кадхерин (БД 610405) из БД трансдукције (БД Биосциенцес, Сан Јосе, Калифорнија, САД). За анализу површинских протеина користили смо методу екстракције засновану на објављеном поступку. Позитивност за Е-кадхерин, протеин плазма мембране и негативност за β -Актин, цитосолни протеин, доказали су да су идентификовани протеини заиста интегралне компоненте мембране. Цомассие плаво обојење такође је коришћено за процену еквивалентне оптерећења протеином. Протеини су потом анализирани са Вестерн блоттингом као што је раније објављено. 32, 33

2ДЕ ДИГЕ анализа

Диференцијална анализа протеоме на ХЦТ116 ЦТРЛ и ХЦТ116 миР27а_КД изведена је као што су претходно описали Милоне ет ал. 34 Протеомски експерименти укључују: (а) припрему протеина и обележавање ДИГЕ бојама; (б) изоелектрофокусирање (ИЕФ); (ц) прибављање, анализа и обрада слике; и (д) идентификација протеина коришћењем ЛЦ-МС / МС. Експериментални дизајн који користи тробојни приступ приказан је у Додатној табели С1.

Покуси на животињама

За ксенографт генерације, 20 × 106 6 ЦРЦ-изведених ћелија (ХЦТ116 или ХТ29) супкутано је трансплантирано у бок 20 женских атимичних голих мишева (старих 6–8 недеља; Цхарлес Ривер, Леццо, Италија). Мишеви су одржавани у складу са смерницама Уједињеног краљевства за координацију истраживања рака, а запремина тумора, израчуната као (дужина тумора × ширина2) / 2, праћена је два пута недељно мерењем калибра. 35, 36 Две недеље након трансплантације, када су тумори достигли запремину од 200 мм 3, мишеви су груписани ( Н = 5 / група) и интратумуларно убризгавани сваких 7 дана по четири пута са анти-миР-27а (4 нг / мм 3 ) за ХЦТ116 или са миР-27а мимиком (2 нг / мм 3 ) за ХТ29 ксенографт моделе. У оба случаја коришћени су одговарајући кодирани РНА (назначени као анти-миР-Цтрл и миР-Цтрл, респективно). На дан 36, масе тумора су измерене, изрезане и даље анализиране; кРТ-ПЦР је извршен на РНА од ксенографта да би се утврдила ефикасност инхибиције / прекомерне експресије миР-27а. Овај експеримент је изведен у дупликату. Нису примећени штетни или токсични ефекти Сви експерименти на животињама прегледани су и одобрени од стране Етичке комисије у Менарини Рицерцхе, у складу са смерницама Европске директиве (2010/63 / УЕ).

ТУНЕЛ тест

Да би се проценила апоптотска стопа на ткивима ксенографта, масе тумора уграђене парафином су анализиране по ДеадЕнд Флуорометриц ТУНЕЛ систему (Промега, Мадисон, ВИ, УСА), према упутствима произвођача. Прикупљање слика и анализа података обављени су помоћу ласерског скенирања микроскопа Царл Зеисс ЛСМ700 (Царл Зеисс, Јена, Немачка).

Имунофлуоресценција и ИХЦ

Имунофлуоресцентно бојење је изведено на непермеабилизованим ХЦТ116 и дериватним клоновима. Ћелије су посађене на покривачима, фиксиране у пара-формалдехиду (4% у ПБС) на собној температури током 10 мин, блокиране у албуму говеђег серума (3% у ПБС) током 30 минута пре инкубације са специфичним антителима на МХЦ класу И (1: 100 разблажења) током 1 сата на собној температури. Након тога, антитијело ИгГ-Р секундарно антитело (сц-2092, разблажење 1: 1000) (Санта Цруз Биотецхнологи) инкубирано је 1 х на собној температури. Поклопци су испрани ПБС-ом, обојени ДАПИ-ом и, након још три прања хладним ПБС-ом, монтирани у мовиол 4–88 (Мерцк-Миллипоре, Дармстадт, Немачка) на стакленим тобоганима. For double-immunofluorescence staining, after an initial block with 10% normal serum in PBS, tissue sections were incubated overnight at 4 °C with an unconjugated primary antibody specific for CD107a (also known as LAMP-1) FITC (ab25406) or a monoclonal antibody to perforin (Clone 5B10; Diagnostic Biosystems, Pleasanton, CA, USA) and CD8-PerCP-Cy5.5 fluorescence conjugated (BD Biosciences). For negative controls, primary antibodies were replaced with preimmune serum and IgG isotype controls. The fluorescence signals were observed and captured using a Carl Zeiss LSM700 laser-scanning microscope (Carl Zeiss). IHC and haematoxylin and eosin staining on human CRC tissues and mouse xenografted tissues were performed and evaluated as previously reported 32 using antibodies against Ki67 (Dako, Milan, Italy), Calreticulin and MHC class I, CD3 (CD3-565-L-CE) and CD8 (CD8-295-CE) (Novocastra, Milan, Italy) and perforin (Diagnostic Biosystems). Image acquisition and analysis were performed on DM100 Leica Photosystem 40.106.206 (Leica, Milan, Italy).

Проточна цитометрија

Flow cytometry was employed to detect MHC Class I molecules on the cell surface of HCT116, RKO and HT29 and their derivative clones miR27a_KD or miR27a_OE. Briefly, cells were plated, harvested and washed twice with PBS and incubated for 1 h in darkness at 4 °C with PE-Cy-7-labelled anti-MHC class I (561349) (BD Biosciences). Cells were then washed and resuspended in cold PBS for FACS analysis. All flow cytometry results were analysed with the FACSuite Software v.1.0.5.3841 (BD Biosciences).

In vitro angiogenesis assay

The tube-formation assay was performed as previously described 32 and is illustrated in Supplementary Figure S2A.

In situ RNA hybridization

Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) sections of tubular adenomas with low-grade/high-grade dysplasia or colorectal adenocarcinomas (G1, G2 and G3) were stained for miR-27a. Three cases per pathological sub-group were analysed. Three normal colonic mucosa biopsy samples, used as control, were obtained from patients who underwent colonoscopy for irritable bowel syndrome. miR-27a probe was labelled with 5-digoxigenin and synthesized by Exiqon (Vedbaek, Denmark). In situ hybridization was performed as described, with minor modifications. 37 Negative controls included omission of the probe and the use of a scrambled LNA probe; U6 was used as positive control (Exiqon). Slides were counterstained in fast red solution. For miR-27a/CD8 + /perforin expression analysis, primary sporadic CRCs were considered. Serial sections obtained from the original paraffin blocks were stained for miR-27a, CD8 + and perforin. Only cytoplasmic miR-27a intensity was retained for scoring, and miRNA expression was quantified analysing chromogen-specific intensity by Image J. 38 IHC for CD8 + (Clone C8/144B; Dako) and perforin (Diagnostic Biosystem) were performed on the Benchmark LT automated system from Leica Microsystems Bondmax (Leica, Wetzlar, Germany) according to the manufacturer's specifications. The results of CD8 + /perforin staining are expressed as the mean number of positive cells in high-power fields.

Клинички узорци

Paraffin-embedded and liquid nitrogen–frozen specimens from adenoma ( n =32) and primary sporadic CRCs ( n =80) (stages I–II, n =48; stages III–IV, n =32) were included in this study. Each sample was matched with the adjacent apparently normal mucosa ( n =80) removed during the same surgery. Patients' familial history and tumour classification have been reported. 32 Patients were followed up for a median of 89.79 months or until death. All patients gave informed consent for sample collection, and study protocols were approved by the Institutional Review Board of the Fatebenefratelli Hospital in accordance with the ethical guidelines of the Declaration of Helsinki.

Independent data sets' analysis

The following independent, publicly available adenoma and CRC data sets, deposited in the Gene Expression Omnibus (GEO) as adenoma E-MTAB-813, 14 (GEO) GSE35602 series (//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo website) and TCGA COAD series (//tcga-data.nci.nih.gov/docs/publications/coadread_2012), respectively, were analysed for miR-27a expression in adenoma and CRC tissues to evaluate its prognostic significance. The adenoma data set consists of 21 patients while the data set GSE35602 counts on 59 RNA samples separately extracted from stroma and epithelium of 13 CRC tissues and four normal tissues. 15 mRNA expression analysis was performed on Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); for miRNA analysis, Agilent-019118 Human miRNA Microarray 2.0 G4470B was used. Robust multichip average normalization was performed using GeneSpring 11.5 (Agilent Technologies). 39 The information from this data set was used to identify differentially expressed miRNAs having a fold change ≥2 and P <0.05, as determined by Welch t -test statistical analysis. We performed Volcano plot analysis to visualize differential expression. TCGA COAD data set 16 consists of 224 colorectal tumours and normal pairs. Normalized Level 3 data were used for our analysis. IPA (Ingenuity Systems, (//www.ingenuity.com website) was used for gene set enrichment analysis and gene network analysis.

Статистика

All statistical analyses were made using Statistical Package from Social Science (SPSS; version 16.0) for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) and R/Bioconductor (Seattle, WA, USA). Association between miRNA expression and tumour stage was assessed using Fisher exact test or Pearson χ2 test (where indicated). The Kaplan–Meier method was used to estimate survival; log-rank test was used to test differences between the survival curves; the hazard ratios were calculated by combining the variables at 95% confidence interval to correlate the chance of events. Data are reported as means±SD, and mean values were compared using Student's t -test or Mann–Whitney test. Results were considered statistically significant when P ≤0.05 was obtained.

Додатне информације

Ворд документи

  1. 1.

    Додатне информације

Речник

ЦРЦ

колоректални канцер

ПЛЦ

peptide-loading complex

МХЦ

major histocompatibility complex

Додатне информације прате овај рад на веб локацији Целл Деатх анд Дисеасе (//ввв.натуре.цом/цддис)