Трговина адам10 посредованом сап97 трговином из голгијевих станова зависи од фосфорилације пкц | ћелијска смрт и болест

Трговина адам10 посредованом сап97 трговином из голгијевих станова зависи од фосфорилације пкц | ћелијска смрт и болест

Anonim

Субјекти

  • Алцхајмерова болест
  • Ћелијска сигнализација
  • Трговина мембранима

Апстрактан

Дезинтегрин и металопротеиназа 10 (АДАМ10) је главна α -секретаза која катализује просијавање ектодомаина прекурсора протеина амилоида у мозгу и спречава стварање амилоида. Његова активност зависи од правилног интрацелуларног промета и од уметања синаптичке мембране. Овде смо описали да у хипокампалним неуронима протеин-97 (САП97), који је повезан са синапсом, узбуњујући скени, управља АДАМ10 трговином од дендритичних Голгијевих испољавања до синаптичких мембрана. Овај процес је посредован претходно не-карактеризованом протеином киназом Ц фосфоситом у САП97 СРЦ хомологији 3 домену који модулира повезаност САП97 са АДАМ10. Такав механизам је од суштинског значаја за АДАМ10 трговину са претпоставки Голгије до синапсе, али не утиче на транспорт АДАМ10 из ендоплазматског ретикулума. Значајно је да је овај процес измењен у мозгу Алзхеимерове болести. Ови резултати помажу у разумевању механизма одговорног за модулацију АДАМ10 интрацелуларног пута и могу представљати иновативну терапијску стратегију за фино подешавање активности избацивања АДАМ10 према АПП.

Главни

Генетске студије о Алзхеимеровој болести (АД) указују на гене фактора ризика који кодирају протеине са познатом функцијом у локалној трговини. 1 Са различитим приступима, такође је описан интрацелуларни транспорт дезинтегрина и металопротеиназе 10 (АДАМ10), ензима одговорног за цепање α -секретазе који спречава стварање амилоида β у примарним неуронима, 2, 3 . АДАМ10 садржи сигнал задржавања ендоплазматског ретикулума (ЕР) 4, док је његова активност углавном локализована у транс- Голги мрежи или на плазма мембрани. 2, 5

Претходно смо идентификовали протеин-97-САП-асоциран на синапси (САП97), члан породице протеинских скела повезаних са мембраном који управљају трговином глутаматним рецепторима, као партнера АДАМ10. САП97 се везује за пролином богате секвенце цитосолног домена АДАМ10 са доменом СРЦ хомологије 3 (СХ3), чиме доводи до протеазе на постсинаптичку мембрану и повећавајући цепање α -секретазе. 6 Интересантно је да је интеракција АДАМ10 / САП97 смањена у хипокампусу болесника са АД7, а поремећај асоцијације АДАМ10 / САП97 код глодара доводи до стварања нетрансгеничног модела болести. 8 С друге стране, проналажење мембрана АДАМ10 посредује механизам зависан од АП2-клатрина укључен у динамичку регулацију синаптичке локализације / активности АДАМ10. 9 Сви ови подаци тврде да постоји улога АДАМ10 трговине у патогенези АД.

Упркос овим сазнањима, интрацелуларни сигнални путеви који регулишу трговину АДАМ10 и даље се ограничавају. Неколико студија неовисно је објавило да протеин киназа Ц (ПКЦ) и протеин киназа активирана митогеном чине два централна сигнална чворишта за регулисање цепања α -секретазе. 10

Нарочито, активирање ПКЦ-а подстиче пут цепања не-амилоидогеног а -секретазе, 11, 12, 13, 14, а третман ПКЦ активатором повећава цепање АДАМ10 супстрата. 15 Поред тога, способност ПКЦ-а да регулише АДАМ10 активност може бити повезана са модификацијом АДАМ10 субцелуларне локализације. 15

Овде смо идентификовали локацију ПКЦ фосфорилације у СХ3 домену САП97 која може модулирати интеракцију са АДАМ10 и промовисати њену трговину од дендритичних Голгијевих одлагалишта до синапсе. Ови резултати допринели су разумевању механизма одговорног за модулацију АДАМ10 интрацелуларног пута и могли би пружити позадину за развој ефикасне терапијске стратегије за подешавање активности АДАМ10.

Резултати

ПКЦ активација подстиче АДАМ10 / САП97 интеракцију

Прво смо верификовали ефекат ПКЦ активације на интеракцију АДАМ10 / САП97 помоћу експеримената преноса енергије биолуминисценције (БРЕТ). Након потврђивања методологије (слика 1а), БРЕТ анализа у реалном времену показала је да ПКЦ активација повећава тренд БРЕТ сигнала након примене ПКЦ активатора (слика 1б).

Image

ПКЦ активација промовише АДАМ10 / САП97 асоцијацију. ( а ) БРЕТ експерименти на живим ћелијама бубрега 293 (ХЕК293). Спојили смо Ц крај АДАМ10 са донирајућом енергијом Ренилла луциферазом (АДАМ10-Рлуц) и Н крај САП97 на акцептор ИФП (ИФП-САП97). Под условом константног нивоа експресије АДАМ10-Рлуц, БРЕТ сигнал се хиперболично повећао као функција нивоа експресије ИФП-САП97. Засићење БРЕТ сигнала када су сви молекули донатора били повезани са акцептором указивало је на специфичну интеракцију између АДАМ10 и САП97 протеина ( Р2 = 0, 9824, нелинеарна регресијска једнаџба, претпостављајући једно вежуће место; ГрапхПад Присм, Ла Јолла, ЦА, САД) . ( б ) Третман форбол 12-миристат-13-ацетатом (ПМА) повећава БРЕТ сигнал после 30 мин у ћелијама које су трансфициране АДАМ10-Рлуц и ИФП-САП97 (Флуо / Луми = 0, 091 ± 0, 009). Подаци представљају средњу вредност ± СЕМ за три независна експеримента. ( ц ) Укупни хомогенати (ХОМО) и ТИФ контролне (ЦТРЛ) и одсечене хипокамеле третиране ПДБу имунопреципитирани су (ИП) са пАб до АДАМ10 и су-падавина САП97 је процењена. ПДБу повећава су-падавине АДАМ10 / САП97 само у ТИФ-у, али не и у ХОМО-у. ( д ) Квантификација експеримената у ( ц ) ( н = 3, * П = 0, 006, ПДБу наспрам ЦТРЛ, упарени т- тест). У овој и свим наредним бројкама подаци представљају средњу вредност ± СЕМ

Слика пуне величине

Ко-имунопреципитацијски (ИП) тестови на кришке хипокампа открили су значајно повећање АДАМ10 / САП97 везивања 30 мин након ПКЦ активације и показали су да се он појављује у специфичном одељку, то јест у Тритон нетопљивој фракцији (ТИФ), синаптичкој и ћелијској субфракција мембране 16 (слике 1ц и д).

ПКЦ фосфорилација САП97 Т629 промовише АДАМ10 / САП97 интеракцију

Затим смо проценили да ли је АДАМ10 или САП97 ПКЦ супстрат. Прво, анализа аминокиселина (аа) открила је С741 као претпостављено место фосфорилације ПКЦ у домену АДАМ10 у интеракцији са САП97 6 (слика 2а). 17 Тестови фосфорилације ин витро открили су укључивање фосфора-32 ( 32 П) у зависности од ПКЦ-а само у домен дивљег типа (вт) АДАМ10-Ц-терминал (Цт). И мутатанти секвенцијалних делетација репа АДАМ10 и мутант С741 до Мутанта нису показали инкорпорацију 32 П, што потврђује да је С741 место ПКЦ фосфорилације (слике 2б и ц). Да бисмо проценили улогу идентификованог места ПКЦ фосфорилације у модулацији интеракције АДАМ10 / САП97, извршили смо падајуће тестове са глутатион- С -трансферазом (ГСТ) фузионим протеинима који фосфорилирају или не ПКЦ. Ни фосфорилација АДАМ10-Цт, нити мутације у А ПКЦ фосфосита С741 не утичу на везање АДАМ10 на САП97 (слике 2д и е), што сугерише да није релевантно за стварање комплекса АДАМ10 / САП97.

Image

Фосфорилација АДАМ10 репа зависна од ПКЦ-а не утиче на повезаност са САП97. ( а ) АДАМ10 цитоплазматски реп (Цт) и делетацијски мутанти аа секвенци. Масним словима је предпостављени ПКЦ фосфосит. ( б ) ГСТ-АДАМ10-Цт и мутанти за делецију су инкубирани или не са ПКЦ у присуству [ γ - 32 П] АТП. Само ГСТ-АДАМ10-Цт је фосфорилиран. Ниво фузијских протеина је био упоредив као што показује Цоомассие бојење (доњи панел). ( ц ) Ин витро фосфорилација ГСТ-АДАМ10-С741А фузивног протеина. Мутација С741А доводи до снажног смањења фосфорилације АДАМ10-Цт. Нивои фузивних протеина су били упоредиви као што показује Цоомассие обојење (доњи панел). ( д ) Након ПКЦ фосфорилације, ГСТ фузиони протеини репа АДАМ10 коришћени су за вршење падајућег теста за откривање САП97. ПКЦ фосфорилација АДАМ10 не утиче на везивање САП97. ( е ) Квантификација експеримената у ( д ) ( н = 3, П > 0, 05 фосфорилираног у односу на не-фосфорилирани, упарени т- тест). У овом и свим наредним падајућим експериментима, подаци су нормализовани на ГСТ оптичку густину (ОД) и приказани као проценат нефосфорилираних протеина у истом експерименту

Слика пуне величине

У другом кораку, истражили смо да ли је САП97 супстрат ПКЦ, спроводећи експерименте метаболичког обележавања са [ 32 П] ортофосфатом у жутим флуоресцентним протеинима (ИФП) -САП97вт-трансфектним ћелијама ЦОС-7. Ауторадиографија је открила специфичан радиоактивни опсег који одговара ИФП-САП97 у узорцима ћелија обрађених са фхорбол 12, 13-дибутиратом (ПДБу), показујући да САП97 подвргава ПКЦ фосфорилацији у живим ћелијама (слика 3а). Тестирали смо присуство локација ПКЦ фосфорилације унутар различитих САП97 домена. ГСТ-САП97вт и ГСТ-САП97-СХ3 фузиони протеини, али не и други мутанти за делецију, фосфорилирани су (слика 3б). Штавише, мутант за брисање ГСТ-САП97-ГКΔ фосфорилира се у истој мери као САП97вт, демонстрирајући одсуство релевантних ПКЦ фосфозита у ХООК-ГК домену (слика 3ц). Анализа СХ3 секвенце предвиђала је четири ПКЦ консензусна мотива (С582, С597, Т629 и С642; Слика 3д). Тестови фосфорилације ин витро са ГСТ-САП97вт или С / Т до А мутантима на претпостављеним ПКЦ фосфосима показали су да обе мутације Т629 и С642 до А смањене фосфорилације САП97, док замена С582 и С597 нису значајно утицала на уграђивање 32 П (Слике 3е и ф). Конзистентно, губитак и Т629 и С642 у мутанту за брисање ГСТ-САП97-624Δ који недостаје Цт регион САП97 значајно је смањио уградњу од 32 П (слике 3д, г и х). Да бисмо проценили да ли ПКЦ фосфорилација САП97 мења интеракцију АДАМ10 / САП97, извршили смо падајуће тестове са ГСТ фузионим протеинима, фосфорилираним или не ПКЦ. Анализа је открила да фосфорилација и ГСТ-САП97вт и ГСТ-САП97-СХ3 значајно повећава повезаност са АДАМ10 (слике 3и и ј).

Image

ПКЦ фосфорилација САП97 Т629 покреће АДАМ10 / САП97 асоцијацију. ( а ) ћелије ЦОС-7 трансфициране са ИФП-САП97вт инкубиране су са [32П] ортофосфатом и потом изложене или не ПДБу. Ћелијски лизати су ИП са анти-ГФП антителом (Аб). Ауторадиографија је открила специфичан радиоактивни опсег који одговара ИФП-САП97 у ћелијама третираним ПДБу. ( б ) Ин витро фосфорилација ГСТ-САП97вт и ГСТ фузионисаних протеина различитих САП97 домена. Ауторадиографија је открила два специфична опсега која одговарају ГСТ-САП97вт и ГСТ-САП97-СХ3. ( ц ) Ин витро фосфорилација ГСТ-САП97вт и ГСТ-САП97-ГКΔ. Протеини су раздвојени натријум-додецил-сулфат-полиакриламид гел електрофорезом (СДС-ПАГЕ) и откривени су ауторадиографијом. Узорци потичу из истог експеримента и гела, али траке нису биле суседне у гелу. Недостатак САП97 ХООК-ГК домена не утиче на ПКЦ фосфорилацију САП97 ( н = 3, ГСТ-САП97-ГКΔ = + 0, 4 ± 7, 7%; П > 0, 05, ГСТ-САП97-ГКΔ наспрам ГСТ-САП97вт, упарени т- тест ). ( д ) САП97-СХ3 домен и САП97-624Δ мутантни секвенци за брисање. Масним словима подебљани су претпостављени ПКЦ фосфозити. ( е ) Ин витро фосфорилација ГСТ-САП97 фузијских протеина који носе појединачне мутације претпостављених ПКЦ фосфозита. Само мутанти ГСТ-САП97-Т629А и ГСТ-САП97-С642А показују смањење ПКЦ фосфорилације у поређењу са ГСТ-САП97вт. ( ф ) Квантификација 32 П уградњом експеримената у ( е ) ( н = 3, * П = 0, 0096 ГСТ-САП97-Т629А насупрот ГСТ-САП97вт; П = 0, 0063 ГСТ-САП97-С642А насупрот ГСТ-САП97вт, непарни т- тест ). ( г ) Ин витро фосфорилација ГСТ-САП97вт и ГСТ-САП97-624Δ. Недостатак Т629 и С642 значајно смањује ПКЦ фосфорилацију САП97. Узорци потичу из истог експеримента и гела, али траке нису биле суседне у гелу. ( х ) Квантификација 32 П уградње експеримената у ( г ) ( н = 3, * П <0, 05 ГСТ-САП97-624Δ у односу на ГСТ-САП97вт, упарени т- тест). Подаци су изражени као проценат ГСТ-САП97вт. ( и ) ГСТ-САП97вт и ГСТ-САП97-СХ3 су или ин витро фосфорилирани ПКЦ-ом и затим инкубирани са ХОМО мозга штакора да се исталожи АДАМ10. ПКЦ фосфорилација повећава АДАМ10 везивање. ( ј ) Квантификација експеримената у ( И ) ( н = 3, * П = 0, 01 ГСТ-САП97-СХ3 фосфорилирани у односу на не-фосфорилирани; П = 0, 0026 ГСТ-САП97 фосфорилирани у односу на нефосфорилирани, упарени т- тест). ( к ) Пуштајућа анализа АДАМ10 везивања за различите мутанте ГСТ-САП97 након ин витро ПКЦ фосфорилације. Недостатак Т629 спречава ПКЦ-индуковано повећање асоцијације АДАМ10 / САП97. ( л ) Квантификација експеримената у ( к ) ( н = 3, * П = 0, 011 ГСТ-САП97в фосфорилирано у односу на нефосфорилирано; П = 0, 0475 ГСТ-САП97-С642А фосфорилирано у односу на нефосфорилирани, упарени т- тест)

Слика пуне величине

Изразито, елиминација оба фосфозита у мутанту за брисање ГСТ-САП97-624Δ укида пораст падавина АДАМ10 изазвано ПКЦ-ом (слике 3к и 1). Међутим, мутација Т629 на А, али не и мутација С642 на А, спречила је ПКЦ-индуковано повећање асоцијације АДАМ10 / САП97, што указује да је једино место фосфорилације Т629 релевантно за интеракцију АДАМ10 / САП97 (слике 3к и л). Коначно, нити мутација других претпостављених ПКЦ фосфозита нити брисање домена ХООК-ГК не утичу на везање АДАМ10 изазваног ПКЦ на САП97 (допунске слике 1А и Б).

Подржавајући специфичност, ПКЦ фосфорилација ГСТ-САП97вт и појединачних мутаната којима недостају фосфосити СХ3 нису променили везивање за друге САП97 партнере, то је сидрени протеин А-киназе 150 (АКАП150), ГлуА1 и ГлуН2А (допунске слике 1Ц – Е) .

Ови резултати показују да фосфорилација САП97 на Т629 позитивно модулира интеракцију АДАМ10 / САП97.

Фосфорилација Т629 утиче на структуру САП97

Да бисмо додатно истражили како фосфорилација САП97 Т629 утиче на везивање АДАМ10 / САП97, извели смо моделну студију.

3Д структура СХ3-ГК домена протеина САП97 недавно је решена рендгенском кристалографијом. 18 СХ3 домен САП97 формиран је од пет β- низова и дефинисан је као „подељен“ СХ3, 18 због својеврсне особине: ланац β 5 је смештен након интервентног домена који се назива ХООК домен и није повезан са редоследом остале четири нити (слика 4а). 18 Т629 је смештен на почетку такозване 'дисталне петље' која спаја жице β 3 и β 4, док се С642 налази на почетку ХООК домене (слике 4а и б).

Image

ПКЦ фосфорилација остатка Т629 утиче на структуру САП97. ( а ) Аа секвенца и топологија СХ3 домена САП97. Плаве стрелице представљају β- праменове, а линије представљају петље. Наведена је и домена ХООК. Остаци Т629 и С642 приказани су подебљаним словима. ( б ) Риббон ​​репрезентација СХ3-ХООК-ГК домена САП97. СХ3 домен је приказан плавом бојом, а домени ХООК и ГК у плавој боји. Остаци Т629 и С642 приказани су у облику плавих штапића. ( ц и д ) Електростатички потенцијал мапиран на молекуларној површини СХ3 домена у одсуству ( ц ) или присутности ( д ) фосфорилације на остатку Т629. Домене ХООК и ГК су приказане у плавоплавој боји, док је СХ3 домен обојен према електростатичком потенцијалу, плава је позитивна, бела је неутрална, а црвена негативна. Остаци К607 и Т629 приказани су као штапићи. ( е ) РМСФ РТ и удаљене петље. Пермисијски РМСФ РТ и дисталне петље у присуству (плава линија) и у одсуству (црвена линија) фосфорилације Т629. ( ф ) Риббон ​​репрезентација СХ3 домена САП97 издвојеног из симулације у одсуству (црвена) или присутности (плава) фосфорилације. Преостали део протеина је у светлоплавој боји. СХ3 домени намештени САП97-СХ3 доменом приказани су у светло сивој боји, а кокристализовани пептиди у тамно сивој боји. Остаци Т629 и К607 приказани су као штапићи

Слика пуне величине

Фосфорилирано место Т629 моделирано је у 3Д структури домена САП97-СХ3 након чега је енергија сведена на минимум. Као што се очекивало, увођење набијене фосфатне групе изазива промену електростатичког потенцијала (слике 4ц и д). Главне разлике у електростатичком потенцијалу налазе се у РТ и дисталним петљама домена САП97-СХ3 (слике 4ц и д). Инспекција минимизиране структуре сугерира да фосфорилација омогућава стварање електростатичке интеракције фосфата са К607 смјештеним на РТ петљи, интеракције која се не може успоставити у одсуству фосфорилације (слике 4ц и д). Очекује се да ће то повећати крутост РТ петље, укључене у интеракцију са другим молекуларним партнерима, као АДАМ10.

Да би се верификовала ова хипотеза, за САП97-СХ3 комплекс спроведене су симулације молекуларне динамике од 10 нс у присуству и одсуству фосфорилације Т629. Слика 4е показује средњу квадратну флуктуацију коријена (РМСФ) израчунату за РТ и дисталну петљу у присуству и одсуству фосфорилације Т629. У недостатку фосфатне групе, две петље су покретне и претпостављају различите конформације повећавајући структурну флексибилност места интеракције (Слика 4е). Након фосфорилације, структура домена СХ3 постаје чвршћа, посебно на нивоу РТ и дисталних петљи које су закључане у одређеној конформацији (слике 4е и ф). Чврстоћа ових петљи утиче на структуру везивног места специфичног за ПккП мотив.

На слици 4ф приказане су структуре 15 различитих СХ3 домена кокристалисаних са различитим партнерима и намештених на снимцима са слика 4а и б. Сви пептиди кокристалисани са СХ3 доменима су у директном контакту са ланцима β 3 и β 4 и са РТ петљом (слика 4ф), што, према томе, потенцијално представља место везивања за АДАМ10.

Узимајући у обзир ове резултате, очекује се да фосфорилација Т629 углавном утиче на РТ петљу. Као последица тога, везно место САП97 претпоставља чвршћу конформацију која води до јаче интеракције са Цт регионом АДАМ10.

Фосфорилација САП97 код Т629 има функционалну и патолошку улогу

Интеракција АДАМ10 / САП97 смањена је код хипокампа пацијената са АД на Браак 4, што сугерише дисфункцију терета САП97 у патологији. 7 Стога смо питали да ли промјена ПКЦ фосфорилације у остатку Т629 од САП97 може бити одговорна за смањење повезаности АДАМ10 / САП97 код пацијената са АД.

У ту сврху произведено је фосфо-специфично антитело (Аб) узгајано против Т629 (САП97-Т629П Аб), афинитет је пречишћен и тестиран на специфичност (додатне слике 2А и Б).

Анализирали смо нивое фосфорилације САП97 на Т629 код хипокампа код пацијената са АД-ом код Браака 4 19 и здравих контрола (ХЦ) прилагођених старосној доби. Укупни хомогенати хипокампа пацијената са ХЦ и АД били су ИП са САП97-Т629П Аб и укупна САП97 је процењена. Квантитативна анализа показала је значајно смањење фосфорилације САП97 код АД хипокампа у поређењу са ХЦ-има (слике 5а и б). ИП је био специфичан јер није откривен сигнал у одсуству фосфо-Аб (допунска слика 2Ц). Као што је раније показано, група узорка није утицала на укупне нивое САП97. 7

Image

Фосфорилација САП97 код Т629 је смањена код хипокампа пацијената са АД и утиче на локализацију / активност АДАМ10. ( а ) ИП спроведен од пацијената са ХЦ и АД пост мортем хипокампи хомогената (ХОМО) са Аб узгојеним против фосфорилираног Т629 (анти-САП97-Т629П). ВБ анализа изведена је са САП97 Аб. Фосфорилација САП97 Т629 је смањена код пацијената са АД у поређењу са ХЦ. Лева крајња трака, ВБ изведена на ХЦс и АД хипокампи ХОМО није показала промене нивоа САП97. ( б ) Квантификација ИП експеримената у ( а ) ( н = 12, * П = 0, 012 АД у односу на ХЦ, упарени т- тест). ( ц ) Репрезентативна ВБ сАППа и укупни сАПП ослобођени ћелијама људског ембрионалног бубрега 293 (ХЕК293) који стабилно експримирају АПП и трансфектирани било ИФП-САП97вт или фосфомиметицним мутантима. Експресија САП97вт стимулише активност АДАМ10, а мутирани опонашајући Т629 фосфорилацију додатно појачава тај ефекат. ( д ) Квантитативна анализа експеримената у ( ц ). Нивои сАППα нормализовани су на укупном сАПП-у, а подаци су изражени као проценат мацк ћелија ( н = 4, * П <0, 05 у односу на мацк; # П <0, 05 насупрот ИФП-САП97-Т629Д, једносмерна анализа варијанце (АНОВА ), Бонферронијев пост хоц тест). ( е ) Ћелије ЦОС-7 биле су трансфициране самим АДАМ10 целом дужином (фл) или ко-трансфициране било ИФП-САП97вт или фосфомиметски мутанти и обојене за површинску / укупну експресију АДАМ10. Сам АДАМ10фл био је слабо локализован на површини упркос интензивном интрацелуларном обележавању. Супротно томе, ко-трансфекција АДАМ10фл и ИФП-САП97вт или мутаната повећала је површинску експресију АДАМ10фл. Изразито, мутант ИФП-САП97-Т629Д имао је најјачи ефекат на површинску експресију АДАМ10фл. Линија скале, 10 µм. ( ф ) Квантификација експеримената у ( е ) (* П <0, 05 према АДАМ10фл; # П <0, 05 насупрот ИФП-САП97-Т629Д; 16 ћелија по услову из два независна експеримента; једносмерна АНОВА, Бонферронијев пост хоц тест)

Слика пуне величине

Да би се проверило да ли може доћи до генетске модулације интеракције АДАМ10 / САП97, регрутовано је 100 пацијената са 20 АД, а процењен је генетски полиморфизам унутар СХ3 домена САП97. Нису откривене генетске варијације унутар СХ3 домена САП97 код пацијената са АД, што сугерише да би други ћелијски механизми могли бити одговорни за смањену ПКЦ фосфорилацију САП97 код Т629 у АД.

Пошто САП97 регулише локализацију и активност АДАМ10 синаптичке мембране, 6 тестирали смо да ли ова специфична фосфорилација може имати улогу у контролисању активности АДАМ10. Отпуштање растворљивог амилоидног прекурсора протеина α (сАППа) је значајно повећано када су ћелије ХЕК293, које стабилно експримирају људски АПП, биле трансфициране ИФП-САП97вт. Међутим, нивои сАППа даље су порасли када су ћелије изразиле мутант опонашајући фосфорилацију САП97 на Т629 (ИФП-САП97-Т629Д), али не и на С642 (ИФП-САП97-С642Д), што указује да фосфорилација Т629 посебно појачава активност АДАМ10 (слике 5ц и д).

Даље, ћелије ЦОС-7 су трансфициране самим АДАМ10 или кофефициране било ИФП-САП97вт или фосфомиметски мутантима. Коекспресија САП97 даје скоро двоструко повећање нивоа АДАМ10 на површини. Ипак, ћелије које експримирају САП97 мутиране у Т629, али не и у С642, показују јаче површинско обележавање АДАМ10 у поређењу са ћелијама које су биле трансфековане САП97вт. Квантитативна анализа потврдила је да фосфорилација САП97 на Т629, али не и на С642, значајно повећава површински / укупни ниво АДАМ10 (слике 5е и ф).

Ови подаци указују на функционалну улогу фосфорилације САП97 овисне о ПКЦ на Т629 у регулацији локализације / активности АДАМ10 и укључености овог процеса у АД.

ПКЦ активација индукује САП97 посредовану САП97 прометом АДАМ10 од Голгијевих станица до постсинаптичке густине

На основу ових налаза истражили смо како фосфорилација САП97 зависна од ПКЦ утиче на АДАМ10 трговину неуронским ћелијама.

Да бисмо анализирали дистрибуцију АДАМ10 и САП97 дуж секреторног пута, прочистили смо ТИФ и микросомалну фракцију (П3), обогаћену протеинима Голги и ЕР, од кришки хипокампала (допунска слика 2Д). Квантитативна анализа ИП тестова открила је значајан пораст САП97-Т629П у укупном хомогенату (ХОМО) и у ТИФ, али не и у П3 фракцији, у одрезима третираним ПДБу у поређењу са контролом (допунске слике 2Е и Ф), дакле сугерирајући да се фосфорилација САП97 код Т629 углавном јавља у фракцији синаптичке мембране, као што је претходно показано повећање повезаности АДАМ10 / САП97 (слике 1ц и д).

Поред тога, нивои АДАМ10 су повећани у ТИФ и истовремено смањени у П3 фракцији након третмана ПДБу, што указује да ПКЦ активација покреће промет АДАМ10 из ЕР и Голги на мембрану. Нису утврђене промјене укупног нивоа АДАМ10 и САП97 (слике 6а и б).

Image

ПКЦ активација поспешује испоруку АДАМ10 у постсинаптичко одељење. ( а ) Репрезентативна ВБ локализација АДАМ10 и САП97 у ХОМО, ТИФ и П3 фракцији након ПКЦ активације у кришке хипокамеле (ПДБу, 100 нМ, 30 мин). ПКЦ активација мења ћелијску дистрибуцију АДАМ10 и САП97. ( б ) Квантификација експеримената у ( а ) ( н = 7, АДАМ10, * П = 0, 008, ТИФ, ПДБу у односу на контролу (ЦТРЛ); П = 0, 008, П3, ПДБу наспрам ЦТРЛ; САП97, П = 0, 02, П3, ПДБу према ЦТРЛ, упарени т- тест). У овом и свим наредним експериментима фракционације, подаци се исказују у проценту ЦТРЛ. ( ц ) Репрезентативна ВБ од АДАМ10 и САП97 локализације у кришке хипокампа третиране БФА пре активирања ПКЦ. БФА утиче на АДАМ10, али не и на САП97 трговину. ( д и е ) Квантификација експеримената у ( ц ) ( н = 5, * П <0, 05 насупрот ЦТРЛ; # П <0, 05 насупрот ПДБу, једносмерна анализа варијанце (АНОВА), Бонферронијев пост хоц тест). ( ф ) Бојење АДАМ10 / дсРед-ЕР и АДАМ10 / ГМ130 у дендритима и сома неурона након третмана ПДБу. ПКЦ активација смањује ниво АДАМ10 у дендритичким и соматским ЕР и Голги. У свим експериментима, примарни неурони су чувани у култури 14 ДИВ пре експеримента лечења и бојења. Вага, 10 µм . ( г ) Квантификација експеримената у ( ф ) (24 неурона по стању из три независна експеримента, дсРЕД-ЕР: дендрити, * П = 0, 001; сома, * П = 0, 009; ГМ130: дендрити, * П = 0, 0017; сома, * П = 0, 0006, ПДБу у односу на ЦТРЛ непарни т- тест). ( х ) бојење АДАМ10 / ПСД-95 које показује да ПКЦ активација повећава ниво АДАМ10 у ПСД-у. Вага, 10 µм . ( и ) Квантификација експеримената у ( х ) (24 неурона по стању из три независна експеримента, * П = 0, 00001, ПДБу наспрам ЦТРЛ, непарни т- тест). ( ј ) репрезентативно бојење САП97 / ГМ130 у дендритима и сома неурона после лечења ПДБу-ом; ПКЦ активација смањује ниво САП97 код дендритичних и соматских Голгија. Вага, 10 µм . ( к ) Квантификација експеримената у ( ј ) (24 неурона по стању из три независна експеримента, дендрити, * П = 0, 0001; сома, * П = 0, 0006, ПДБу наспрам ЦТРЛ, непарни т- тест)

Слика пуне величине

Да бисмо одредили који је ћелијски одељак укључен у АДАМ10-узроковану ПКЦ-ом, користили смо брефелдин-А (БФА), који инхибира транспорт протеина из ЕР до Голгија. 21 Пре третмана са БФА спречава ПКЦ-индуковано смањење нивоа АДАМ10 у П3 фракцији и одговарајуће повећање ТИФ-а, док на САП97 трговину није утицало (слике 6ц и е). Због тога, ПКЦ активирање покреће АДАМ10 транспорт из ЕР, док ПКЦ-индуцирана трговина САП97 укључује одељења после ЕР.

Како ови резултати начелно указују на непостојање сличног ћелијског обрасца дистрибуције АДАМ10 и САП97 након активирања ПКЦ-а, извршили смо колокализацијске анализе у културама хипокампала да бисмо разјаснили ове податке.

Трансфектирали смо дсРед-ЕР да бисмо визуелизовали и соматске ЕР и ЕР подкомпоненте. 22, 23 имунореактивност Цис -Голги маркера 130 (ГМ130) идентификовала је и соматске Голгијеве и дендритичне Голгијеве преткаше, док је постсиптично бојење густине-95 (ПСД-95) показало постинаптичку густину (ПСД).

ПКЦ активација значајно смањује и АДАМ10 / дсРед-ЕР и АДАМ10 / ГМ130 колокализацију у дендритима и сома и истовремено повећава колокализацију АДАМ10 / ПСД-95 (слике 6ф-и).

Супротно томе, ПКЦ активација значајно смањује колокализацију САП97 / ГМ130 и у дендритима и у соми, не утичући на колокализацију САП97 и са дсРед-ЕР и ПСД-95 (слике 6ј и к и допунске слике 3А и Б).

Ови подаци говоре да активирање ПКЦ-а покреће АДАМ10 транспорт из ЕР и Голгија, док ПКЦ-изазвана трговина САП97 почиње од Голгија.

ПКЦ фосфорилација САП97 на Т629 је релевантна за локалну трговину АДАМ10

Да бисмо испитали субцелуларну локализацију АДАМ10 / САП97 комплекса, користили смо претходно окарактерисани про пептид који продире кроз ћелију, а који је способан да интерферира са интеракцијом АДАМ10 / САП97 (допунска слика 3Ц). 6, 8, 24 Третмани контролним пептидом (Ала) коришћени су као контрола.

Третман про пептида у неуронима хипокампала довео је до накупљања АДАМ10 у Голгијевим одлагалиштима, пошто ензим није успео да се транспортује до постсинаптичког одељка, што је доказано смањењем степена колокализације АДАМ10 / ПСД-95 (слике 7а и б). Нису уочене промене у локализацији АДАМ10 код соматских Голгија и соматско / дендритичких ЕР (допунске слике 3Д и Е) и измене у дистрибуцији САП97 у ЕР, Голги и ПСД (допунске слике 3Ф-Х) у ћелијама третираним Про пептидима. Ови резултати указују да се стварање АДАМ10 / САП97 комплекса догађа у дендритичним Голгијевим станицама, што наговештава да трговина АДАМ10 посредована САП97 следи неконвенционални тајни пут. 23, 25

Image

ПКЦ фосфорилација САП97 на Т629 покреће трговину АДАМ10 од Голгијевих одлагалишта до синапсе. ( а ) бојење АДАМ10 и ПСД-95 / ГМ130 у дендритима неурона после третмана Ала или Про пептидом. Про пептид утиче на образац дистрибуције АДАМ10 у Голгијевим станицама и у ПСД-у. Вага, 10 µм . ( б ) Квантификација експеримената у ( а ) (24 неурона по стању из три независна експеримента, ГМ130, * П = 0, 0006; ПСД-95, * П = 0, 04, Про у односу на Ала, непарни т- тест). Подаци су изражени као проценат Ала. ( Ц ) Репрезентативни ВБ од АДАМ10 и САП97 локализације у кришке хипокампа претходно третиране с Ала или Про пептидом и изложене ПДБу; Про пептид спречава промет АДАМ10 на синапсу без утицаја на САП97 дистрибуцију. ( д ) Квантификација експеримената у ( ц ) ( н = 5, * П <0, 05 насупрот ЦТРЛ; # П <0, 05 насупрот Про + ПДБу, једносмерна анализа варијанције (АНОВА), Бонферронијев пост хоц тест). ( е ) локализација АДАМ10 у дендритичним и соматским Голгијевима било хипокампалних неурона који су претходно били третирани Ала пептидима или Про пептидима који су изложени ПДБу. Про пептид спречава трговину АДАМ10-ом изазвану ПДБу-ом из дендритичних Голгијевих залеђа. Вага, 10 µм . ( ф ) Квантификација експеримената у ( е ) (24 неурона по стању из три независна експеримента, * П <0, 05 према ЦТРЛ; # П <0, 05 у односу на Про + ПДБу, једносмерна АНОВА, Бонферронијев пост хоц тест). ( г ) обојење АДАМ10 / ПСД-95 у дендритима неурона Ала / Про третираних пре инкубације ПДБу. Про лечење утиче на испоруку АДАМ10 на ПСД. Вага, 10 µм . ( х ) Квантификација експеримената у ( г ) (24 неурона по стању из три независна експеримента, * П <0, 05 у односу на ЦТРЛ; # П <0, 05 у односу на Про + ПДБу, једносмерна АНОВА, Бонферронијев пост хоц тест). ( и ) Репрезентативно дендритично АДАМ10 / ГМ130 обојење неурона који су трансфицирани било ИФП-САП97вт или фосфоситним мутантима. Мутанти САП97 који опонашају или укидају Т629 фосфорилацију утичу на локализацију АДАМ10 у Голгијевим станицама. Вага, 10 µм . ( ј ) Квантификација експеримената у ( И ) (16 неурона по стању из два независна експеримента, * П <0, 05 у односу на ИФП-САП97вт; # П <0, 05 у односу на ИФП-САП97-Т629Д или ИФП-САП97-Т629А, једносмерна АНОВА, Бонферронијев пост хоц тест). ( к ) АДАМ10 / ПСД-95 бојење неурона који експримирају или ИФП-САП97вт или фосфоситне мутанте. Мутације Т629 модификују синаптичке нивое АДАМ10. Вага, 10 µм . ( л ) Квантификација експеримената у ( к ) (16 неурона по стању из два независна експеримента, * П <0, 05 у односу на ИФП-САП97вт; # П <0, 05 у односу на ИФП-САП97-Т629Д или ИФП-САП97-Т629А, једносмерна АНОВА, Бонферронијев пост хоц тест)

Слика пуне величине

Затим смо закључили да ако САП97 посредује транспорт АДАМ10 изазваног ПКЦ-ом од Голгијевих одлагалишта до ПСД-а, одвајање АДАМ10 / САП97 комплекса требало би то спречити.

За то су кришке хипокампала претходно третиране или про пептидом или Ала пептидом пре активирања ПКЦ-а. Третман про пептида спречио је ПКЦ-индуковано повећање нивоа АДАМ10 у ТИФ-у, али није утицао на смањење АДАМ10 у П3 фракцији (слике 7ц и д). Као што се очекивало, инкубација са Про пептидом не утиче на ПКЦ изазване промене нивоа САП97 у П3 фракцији (Слика 7ц).

Ови резултати су у потпуности разјашњени сликовним експериментима у неуронским културама. Присуство Про пептида блокира трговину АДАМ10 изазваном ПКЦ-ом од дендритичног Голгија до ПСД, али није утицало на транспорт АДАМ10 изазван ПКЦ-ом из соматских Голгија и из ЕР-а (слике 7е и ф и додатне слике 4А и Б). Штавише, Про пептидни третман није ометао ПКЦ-индуковане промене у ћелијској дистрибуцији САП97 (допунске слике 4Ц-Е). Ови подаци показују да је САП97 одговоран за трговину АДАМ10 изазваном ПКЦ-ом из дендритичних Голгијевих испостава према ПСД-у.

Да ли су ефекти ПКЦ активације на трговину АДАМ10 посебно последица фосфорилације САП97 на Т629? Да бисмо се позабавили овим питањем, проценили смо ефекте мутаната који опонашају или укидају фосфорилацију САП97 код Т629 на локализацију АДАМ10.

Хипокампални неурони су трансфицирани или ИФП-САП97-Т629Д или ИФП-САП97-Т629А и фиксирани за анализу АДАМ10 колокализације са ГМ130 или ПСД-95.

Прекомјерна експресија ИФП-САП97-Т629Д узроковала је значајно смањење нивоа АДАМ10 у дендритичним Голгијевим станицама и дописно повећање процента преклапања између дендритичних пункција АДАМ10 и ПСД-95. Супротно томе, у ћелијама зараженим мутираним ИФП-САП97-Т629А, АДАМ10 се акумулира у дендритичним Голгијевим замецима и не успева да се прометује ка постиндаптичком одељку. Поред тога, трансфекција мутанта САП97 на С642, ПКЦ фосфосит који није релевантан за асоцијацију АДАМ10 / САП97, не утиче на локализацију АДАМ10 и у дендритичним Голгијем и у ПСД, искључујући неспецифичне ефекте (слике 7и-л). Нису уочене промјене у дистрибуцији АДАМ10 код соматског Голгија (допунска слика 4Ф).

Дискусија

Синаптичка трговина је кључни модулатор активности α -секретазе. Међутим, сигналне стазе које су у стању да подстакну локалну трговину кичмом АДАМ10 још увек нису познате.

Овде идентификујемо нови ПКЦ фосфосит у САП97, протеин одговоран за испоруку АДАМ10 кичми. 6 ПКЦ фосфорилира САП97-СХ3 домен, модулирајући тако АДАМ10 / САП97 асоцијацију, тако и АДАМ10 синаптичку испоруку. Овај механизам има патогену улогу, јер смо приметили значајно смањење фосфорилације САП97 код пацијената са АД, што може бити одговорно за раније пријављени квар у синаптичкој трговини и активности АДАМ10. 7 Коначно, показали смо да трговина АДАМ10 подразумева транзит кроз дендритичне Голгијеве крајине где се дешава стварање АДАМ10 / САП97 комплекса.

Наши резултати показују да ПКЦ активација подстиче трговину АДАМ10 према напријед на постинапсе изазивајући излаз АДАМ10 из ЕР. 4 Показали смо да ПКЦ стимулација доводи до смањене локализације ЕР / Голги АДАМ10 и до истодобног повећања нивоа ензима у ПСД.

Паралелно смо проценили локализацију САП97, за коју је раније пронађено да се обогаћује у ЕР, где је предложено да пренесе АМПА ( α- амино-3-хидрокси-5-метил-4-изоксазолепропионску киселину) рецепторе. 26 Штавише, САП97 је идентификован као партнер за везивање и супстрат за ПКЦ и такође је потребан за ПКЦ-зависну стимулацију ћелијске миграције. 27 Анализа слике открила је да ПКЦ активација смањује локализацију САП97 како у соматским Голгијевим, тако и у дендритичним Голгијевим станицама.

Голгијеве претказе сматрају се продужетком соматског Голгијевог 25 или места биосинтезе за интегралне мембранске протеине преведене из дендритички локализованих мРНА. 28, 29 Како се раније показало да је САП97 потребан за трговину НМДАР-ом преко неконвенционалне тајне стазе која користи дендритичке Голгијеве одлазе, 23 смо питали да ли АДАМ10 / САП97 комплекс такође пролази кроз ово одељење.

Када се мешамо у формирање комплекса АДАМ10 / САП97, коришћењем пептида пропусног за ћелију, 6, 8 АДАМ10 се не испоручује у синапсу и накупља се у дендритичним Голгијевим замецима, што сугерише да се АДАМ10 повезује са САП97 у овом подћелијском оделу.

Штавише, одвајање АДАМ10 и САП97 спречава ПКЦ-ово активирање транспорта АДАМ10 од Голгијевих одлагалишта до ПСД, а да не утиче на сортирање ензима путем ЕР-соматског конвенционалног пута Голги. Стога је интеракција АДАМ10 / САП97 неопходна за ПКЦ-индуцирани АДАМ10 промет преко неконвенционалног секреторног пута, који може пружити платформу за локалну контролу уметања АДАМ10 у синапсу, омогућавајући тако неуронима да чвршће и локалније регулишу своју активност.

Надаље, открили смо да ПКЦ активација позитивно модулира придруживање АДАМ10 САП97. Иако се испоставило да су и АДАМ10 и САП97 ПКЦ супстрати, само ПКЦ фосфорилација САП97 утиче на формирање АДАМ10 / САП97 комплекса. Идентификовали смо Т629 унутар САП97-СХ3 домена као нови ПКЦ фосфосит, чија фосфорилација повлачи за собом повећану интеракцију са АДАМ10. Напомињемо, да фосфорилација САП97 Т629 не утиче на интеракцију са другим партнерима за везивање САП97, искључујући шансу да ова посттранслациона модификација генерално утиче на способност везивања САП97. Симулације молекуларне динамике показале су да фосфорилација Т629 доводи до чвршће конформације везивног места САП97 и, самим тим, вероватно доводи до јаче интеракције са цитоплазматским репом АДАМ10.

Фосфорилација САП97 Т629 има важне импликације на АДАМ10 активност, јер утиче на нивое АДАМ10 мембране и, заузврат, на цепање АПП. У хетерологним системима, прекомерна експресија мутанта САП97-Т629Д, који опонаша фосфорилацију, подстиче транспорт АДАМ10 до плазма мембране и повећава ослобађање сАПП α . Затим су имиџинг студије откриле да фосфорилација САП97 Т629 посебно поспешује транспорт АДАМ10 из Голгијевих одлагалишта у постинаптичко одељење. Супротно томе, губитак овог специфичног ПКЦ фосфосита узрокује накупљање АДАМ10 у Голгијевим одлагалиштима и смањује његове синаптичке нивое.

Претходно смо показали да је смањење активности α -секретазе централно у раним фазама патогенезе АД и последица је неуспеха у процесима егзоцитозе / ендоцитозе АДАМ10. 7, 9 Овде смо описали значајно смањење фосфорилације зависне од ПКЦ-а САП97 Т629 код хипокампа болесника са АД, што је исход у складу с претходним студијама које откривају да пацијенти са АД имају нижи ниво ПКЦ активности. 30 Штавише, ова промена није повезана са присуством генетских варијација у СХ3 домену САП97.

Ови резултати додају још једну плочицу нашем разумевању сложене унутарћелијске каскаде догађаја одговорних за неисправни промет АДАМ10 и цепање АПП-а у АД неуронима. Да ли су АДАМ10 трговина напријед и ендоцитоза независни путеви или дјелују синергијски на развој неисправног цијепања АПП-а још увијек није разумљиво.

Недавна истраживања показала су да смањење активности α -секретазе може изазвати АД. 31 Штавише, скромно повишење активности АДАМ10 може бити корисно за АД и добро се толерише у мозгу одраслих, подржавајући хипотезу да се терапијске стратегије за повећање активности α -секретазе преко уреагулације АДАМ10 предвиђају као ефикасне за АД. 31, 32, 33

Дакле, наша открића пружају неуронски специфичан механички оквир према којем је АДАМ10 дендритично трговање од Голгијевих одлагалишта до синапсе и његово депонирање под контролом фосфорилације САП97 Т629 од стране ПКЦ-а. Како се овај механизам мења у раним фазама АД-а, он може представљати молекуларну мету за терапију засновану на α -секретази заснованој на мозгу која би могла бити корисна алтернативна или комбинована терапија тренутним терапеутицима.

Материјали и методе

Студије на људима

Хипокампи од шест пацијената са АД и шест ХЦ-а добивени су од Нетхерланд Браин Банк (НББ, Амстердам, Холандија). Утврђени Браак и Браак критеријуми коришћени су за категоризацију АД ткива. 19 пацијената са АД је испунило Браак 4 фазу. Сходно томе, у случајевима хипокампуса постојали су тангице и неуритични плакови. ХЦ немају историју психијатријске или неуролошке болести и немају доказе о неуродегенерацији која је повезана са годинама. Ткива су сакупљена у року од максимално 6–8 х након смрти, како би се смањила разградња.

ТИФ и П3 припрема

ТИФ и П3 су изоловани од акутних криза хипокампала штакора. Резови су хомогенизовани на 4 ° Ц у ледено хладном пуферу за лизу са инхибиторима протеазе, инхибиторима фосфатазе, 0, 32 М сахарозе, 1 мМ ХЕПЕС, 0, 1 мМ ПМСФ, 1 мМ МгЦл 2 користећи хомогенизатор стакло-тефлона (ВВР, Раднор, ПА, САД). ХОМО је центрифугиран на 10 000 × г током 20 мин на 4 ° Ц. Пелет (П1) је коришћен за прочишћавање ТИФ и супернатант (Сл) да би се добила П3 фракција. Екстракција П1 Тритон Кс-100 изведена је на 4 ° Ц током 20 минута у екстракционом пуферу (0, 5% Тритон Кс-100, 150 мМ КЦл и инхибитори протеазе). Након екстракције, узорци су центрифугирани на 100 000 × г током 1 х на 4 ° Ц и пелет (ТИФ) је ресуспендиран у 20 мМ ХЕПЕС са инхибиторима протеазе. Тритон растворљива фракција задржана је за Вестерн блот (ВБ) анализу. Супернатант Сл је центрифугиран на 100 000 × г током 2 сата на 4 ° Ц и микросомална пелета (П3) ресуспендирана у пуферу за лизирање. 34

Имунолошки падавине

Either aliquots of human hippocampi HOMO or HOMO/TIF/P3 fraction from hippocampal slices were incubated overnight at 4 °C in RIA buffer (200 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na 2 HPO 4, 0.5% NP-40, 0.1% SDS) in a final volume of 150 μl with an Ab against ADAM10 or SAP97-T629P Ab. Protein A/G beads (Tebu-bio, Peterborough, UK) were added and incubation was continued for 2 h by shaking at RT. Beads were collected by centrifugation and washed three times with RIA buffer. In IP assays performed with SAP97-T629P Ab, the samples were incubated and washed with RIA buffer containing SDS 1% to avoid any interference of protein–protein interactions. Sample buffer for SDS-PAGE was added and the mixture was heated for 3 min. Beads were collected by centrifugation and a volume of supernatants was applied onto SDS-PAGE; the immunocomplex precipitated was revealed by anti-SAP97 Ab.

Испитивање

Aliquots of rat HOMO were diluted with TBS 1 × to a final volume of 1 ml and incubated 2 h with 26 μl of cold phosphorylated or not GST fusion proteins. After incubation, beads were washed five times with TBS and 0.1% Triton X-100. Bound proteins were resolved by SDS-PAGE and subjected to immunoblot analysis with anti-SAP97, anti-ADAM10, anti-AKAP150, anti-GluA1, anti-GluN2A and anti-GST Ab.

Immunocytochemistry and colocalization analysis

Primary neurons were kept in culture 14 days in vitro (DIV) before treatment and staining experiments. For colocalization analysis, transfected neurons were fixed in 4% PFA with 4% sucrose in PBS (pH 7.4) at 4 °C or in methanol at −20 °C and immunostained for ADAM10, SAP97 and GM130 or PSD-95; primary and secondary antibodies were applied in GDB buffer 35 (30 mM phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.2% gelatin, 0.5% Triton X-100 and 0.8 M NaCl). To evaluate surface and total staining, transfected COS-7 cells were fixed with 4% PFA, 4% sucrose in PBS (pH 7.4) and then incubated with anti-ADAM10 Ab. To visualize surface expression, cells were then blocked with 4% normal serum, followed by a 555-conjugated secondary Ab. Afterwards, cells were permeabilized with 0.1% Triton X-100 for 10 min and intracellular expression of ADAM10 and SAP97 was determined by incubating cells with the appropriate Ab, anti-ADAM10 Ab or anti-green fluorescent protein (GFP) Ab (for SAP97wt and mutants constructs), and then with a 488- or 633-conjugated secondary Ab.

In vitro fusion protein phosphorylation assay

GST-purified fusion proteins were incubated or not with 10 ng of active PKC for 30 min at 37 °C, in the presence of 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM MgCl 2, 0.5 mM CaCl 2 and 10 μ M ATP ([ γ - 32 P]ATP 2 μ Ci per tube; 3000 Ci/mmol; Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA). Proteins were separated on SDS-PAGE and phosphoproteins were revealed by autoradiograph.

Microscope image acquisition and data analysis

Fluorescence images were acquired using the AIM 4.2 software (Zeiss, Jena, Germany) and the confocal LSM510 Meta system (Zeiss) with a × 63 objective and a sequential acquisition setting at 1024 × 1024 pixel resolution; for each image, 0.5 μ m sections were acquired to span the entire cell and z-projection was obtained using the AIM 4.2 software. Images were processed using ImageJ (National Institute of Health, Bethesda, MD, USA) and Adobe Photoshop software (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA, USA). Quantification analyses were performed blind after randomization of the images. Quantification of WB analysis was performed by means of computer-assisted imaging (ImageJ) after normalization on tubulin or GST levels. Values are expressed as mean±SEM of at least three independent experiments. For surface/total ratio assays and colocalization analysis, cells were chosen randomly for quantification from four different coverslips (two or three independent experiments), images were acquired using the same settings/exposure times and at least eight cells for each condition were analyzed. Colocalization analysis was performed using AIM 4.2 software (Zeiss) on a pixel basis. We draw an ROI of the area of interest and we evaluated the colocalization coefficients and expressed it as the percentage of colocalization. For quantification of surface/total ratios, all images were analyzed using Image J. The average intensity of surface fluorescence staining was determined after cell tracing, and normalized to the total intensity to correct for differences in expression. Surface ratios were obtained by dividing the background subtracted fluorescence intensities.

Статистика

Statistical evaluations were performed by using two-tailed Student's t -test (a P -value <0.05 was considered significant) or, when appropriate, by using one-way ANOVA followed by Bonferroni's post hoc test.

Study approval

All experimental procedures were carried out with care to minimize discomfort and pain to treated animals, in accordance with the guidelines of the European Communities Council (Directive of November 24, 1986, 86/609/EEC). For the experiments carried on human brain samples, all procedures were in accordance with the NIH Guide for Care and Use of laboratory human tissues and were approved by the Ethics Committee of the University of Milan. For the genetic analysis, written informed consent (from the subject or from the responsible guardian if the subject was incapable) was obtained, before study initiation, for blood collection and genotyping. The work conformed to the Declaration of Helsinki and approved by the local Ethics Committee.

Додатне информације

Ворд документи

  1. 1.

    Допунски материјал и методе

  2. 2

    Допунске слике легенде

Датотеке слика

  1. 1.

    Допунска слика 1

  2. 2

    Допунска слика 2

  3. 3.

    Допунска слика 3

  4. 4.

    Допунска слика 4

Речник

А

alanine

АД

Алцхајмерова болест

ADAM10

A disintegrin and metalloproteinase 10

AKAP

A-kinase anchor protein

АПЛИКАЦИЈА

Amyloid Precursor Protein

BFA

brefeldin-A

BRET

bioluminescence resonance energy transfer

Цт

C terminal

CTRL

контрола

ЕР

ендоплазматични ретикулум

ГФП

зелени флуоресцентни протеин

GM130

cis -Golgi marker 130

ГСТ

глутатион С- трансфераза

ХЦ

healthy control

HOMO

homogenate

ИП

имунопреципитација

32 P

phosphorus-32

PDBu

phorbol 12, 13-dibutyrate

ПКЦ

протеин киназа Ц

PSD-95

postsynaptic density-95

П3

microsomal fraction

С

serine

SH3

SRC homology 3

Т

threonine

TIF

Triton-insoluble fraction

Вт

wild-type

YFP

yellow fluorescent protein

Додатне информације прате овај рад на веб локацији Целл Деатх анд Дисеасе (//ввв.натуре.цом/цддис)