Генотип транспортера серотонина повезан је са интермедијарним фенотиповима мозга који зависе од контекста изазивања стресора | молекуларна психијатрија

Генотип транспортера серотонина повезан је са интермедијарним фенотиповима мозга који зависе од контекста изазивања стресора | молекуларна психијатрија

Anonim

Апстрактан

Варијанта алела у промоторском региону гена за транспортовање серотонина, СЛЦ6А4 , с алел, повезана је са повећаном рањивошћу како би се развиле особине повезане са анксиозношћу и депресија. Даље, функционална испитивања магнетне резонанце (фМРИ) откривају да су носиоци повећали реактивност амигдале као одговор на аверзивне подражаје, за које се сматра да су интермедијарни фенотип који посредује у утицају алела на емоционалност. Користили смо скенирање микроПЕТ [ 18 Ф] флуоро-2-деокси-Д-глукозе (ФДГ) високе резолуције за процену регионалне метаболичке активности мозга код резуса мајмуна како бисмо даље истражили интермедијарне фенотипове везане за алеле. Мајмуни резуси пружају одличан модел за разумевање механизама на којима почива људска анксиозност, а ФДГ микроПЕТ омогућава процену можданих активности повезаних са натуралистичким окружењима ван скенера. Током уноса ФДГ, мајмуни су били изложени различитим етолошки релевантним стресним ситуацијама (пресељење и претња), као и мање стресном познатом окружењу свог кућног кавеза. Носачи су показали повећану активност орбитофронталног кортекса као одговор на пресељење и претњу. Међутим, током пресељења показали су повећану реактивност амигдале, а као одговор на претњу појачали су повећану реактивност лежишта језгра стриа терминалис. Није дошло до повећања активности ниједног од ових региона када су животиње давале ФДГ у кућним кавезима. Ови налази показују интермедијарне фенотипе који зависе од контекста код носача који пружају оквир за разумевање механизама који стоје на основу рањивости малих носача изложених различитим врстама стресора.

Увод

Многе студије су испитивале утицаје функционалног полиморфизма (5-ХТТЛПР) унутар промотивног региона гена за транспортовање серотонина ( СЛЦ6А4 ) на развој емоционалних особина и психопатологије. Иако нису у потпуности конзистентни, значајни докази упућују на то да ће особе са кратким алелима у поређењу са онима који су хомозиготни за дуги алел ( л ) вероватније имати особине повезане са анксиозношћу. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 Поред тога, доказано је да су интеракције гена и околине које укључују овај генетски полиморфизам такви да су носиоци који имају историју значајног излагања стресу повећан ризик од развоја депресије. 5, 6 Истраживања су такође извршена на мајмунима резусу, показујући да ова врста има сличан, али не идентичан полиморфизам у истој промоторској регији 10 који такође може показати сличне гене интеракцијама околине. 11, 12 Поред тога, бројна испитивања хумане функционалне магнетне резонанце (фМРИ) показују да носачи показују повећану реактивност амигдале (АМИГ) када су изложени, у скенеру, потенцијално аверзивним стимулансима. 13, 14, 15, 16 Извршено је неколико сликовних студија у вези са психопатологијом. Студија протока протока [ 15 О] -Х20 о позитронској емисији томографија (ПЕТ) показала је да људи са социјалном фобијом који носе с алел, у поређењу са онима с л / л генотипом, повећавају реактивност АМИГ као одговор на изазивање анксиозности. подстицај. 17 Међутим, исцрпљивање триптофана који се користи као стимуланс за изазивање депресивних симптома код ремитованих пацијената са великом депресијом није успео да покаже значајан утицај алела на метаболичку активност АМИГ, процењено на [ 18 Ф] флуоро-2-деокси-Д-глукозу ( ФДГ). 18 Пошто је код носача повећан ризик за развој особина повезаних са анксиозношћу и депресије, а у бројним истраживањима је показано да имају повећану активност АМИГ, предложено је да хиперактивност АМИГ која се примети код с превозника представља интермедијарни фенотип који посредује у односу између с алелом и утицајима стреса на рањивост за развој психопатологије. 19

Сликовне студије које су испитивале однос између алела и активности мозга изведене су код људи већином помоћу фМРИ 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25 који укључују подражавање подстицаја унутар скенера. Критично за тумачење налаза из ових студија је препознавање да је околина у којој су стимулуси ограничени и да бити у скенеру може изазвати анксиозност. Иако су генерално доследни у доказивању да су носиоци изменили реактивност АМИГ као одговор на потенцијално аверзивне подражаје, интерпретација овог налаза варирала је у односу на коришћене парадигме и услове који су упоређени. Једна група истражитеља сугерише да носачи више реагују на аверзивне стимулансе као и на окружење које скенер изазива 23, 25 док друга група сугерира да су носиоци веће АМИГ активности у стању мировања. 21, 22 Употреба других врста функционалног снимања може помоћи у разјашњењу сродних интермедијарних фенотипа. Због временског тијека преузимања ФДГ у мозак, ФДГ ПЕТ студије омогућавају процену регионалне мождане активности у етолошки релевантним окружењима изван скенера. Разумевање регионалних реакција метаболизма мозга с носача у односу на релевантне контролисане стресоре, изван окружења скенера, као и код куће, нестресног окружења, додало би тренутним налазима фМРИ и помогло разјашњењу њихове интерпретације.

Мајмуни резуси су идеална врста коју треба користити за спровођење таквих истраживања, јер имају полиморфизам унутар транспортера серотонина који је сличан људском алелу, одлична је врста за проучавање механизама који стоје на основу људске анксиозности и високе резолуције истраживања регионалног метаболизма мозга у њима се може обављати активност. Поред тога, код ове врсте су добро описани утицаји различитих врста етолошки релевантних стресора на бихевиоралне, неурохемијске, физиолошке и мождане функционалне реакције. 26, 27, 28 Ми смо вршили ФДГ микроПЕТ скенирања високе резолуције код мајмуна резуса да бисмо истражили однос између образаца метаболичке активности мозга и индивидуалних разлика у особинама повезаним са анксиозношћу. На пример, претходно смо показали да када су угрожени од стране људског уљеза током 30-минутног периода, мајмунске индивидуалне разлике у метаболичкој активности у језгри стрије терминала (БНСТ) снажно прогнозирају индивидуалне разлике у мајмуновим тесноћама. замрзавање одговора. 27 У овој студији генирали смо мајмуне за полиморфизам транспортера серотонина и обавили ФДГ микроПЕТ студије када су мајмуни остали у кућним кавезима, као и када су били изложени различитим врстама стреса (сами повезани са пресељењем и претњом). Полиморфизам који понавља промотор у гену транспортера гена серотонина је аналоган али није идентичан полиморфизму људског поновионог промотора. 10, 29 Међу резусним мајмунима постоје два уобичајена алела који се разликују уметањем од 21 бп, а овај полиморфизам мења ниво експресије 5-ХТТ гена, с тим што кратак или с алел показује ниже нивое експресије од дугих алел. 29 Ово је невероватно слично ефектима кратких и дугих алела људског промотора који се понављају. Стресори који се користе у овој студији, пресељење и претња, изабрани су јер су аналогни људским стресорима који укључују излагање новостима и потенцијално претећим ситуацијама.

Будући да емоција која посредује у склоповима укључује бројне компоненте, а различити стресори регрутују активност различитих регија мозга, хипотетирали смо да би поред повећане реактивности АМИГ, ти носачи показали измењене функције и у другим компонентама афективног кола. Међутим, предвидјели смо да ће се ове промјене открити тек као одговор на представљање интензивнијих, дуготрајнијих, природистичких стресора који регрутују ове регије мозга. 27 Посебно су нас занимали АМИГ, БНСТ, нуклеус аццумбенс (НАцц), инсула и орбитофронтални кортекс (ОФЦ), јер су то међусобно повезане компоненте неуронског круга које посредују у изражавању и регулацији емоција, 30, 31, 32, 33 Сматра се да промјене у тим структурама леже у основи рањивости за развој афективних и анксиозних поремећаја. 30, 34 Надаље, чини се да су различите регије мозга укључене у посредовање различитих врста емоционалних одговора изазваних стресом. На пример, предклиничка испитивања сугеришу укључивање АМИГ-а у реакције на страх, док БНСТ има истакнуту улогу у посредовању анксиозности. 31

Методе

Субјекти

Испитаници су били 30 мајмуна резуса (21 женка и 9 мушкараца; просечна старост је био 30, 6 ± 1, 2 месеца). Сви мајмуни су били одгајани. Смештај и експериментални поступци за животиње били су у складу са институционалним смерницама.

Ова група експерименталних предмета није била уско повезана. Просечно сродство за свих 30 испитаних испитаника (435 пари испитиваних животиња) било је 0, 003, што је еквивалентно двема јединкама раздвојеним за пет генерација (појединац би имао ту вредност сродства заједничку са претком пет генерација уназад). Од 435 родбинских парова у скупу података, постојао је један пар полубраће од којих су обојица имала л / л генотип. Пола браће дијеле заједничко двоје бака и дједова. Од 435 родбинских парова, остала су само четири пара која су била сродна једнако као рођаци. У скупу података било је само 11 парова од 435 који су били не-нулто сродство. Ти једанаест парова били су један пар полубраће, четири пара који су повезани као рођаци и шест осталих парова који су били више удаљени од рођака.

Генотипизација полиморфизма транспортера серотонина

За прикупљање ДНК, интравенозно узимање крви извршено је венипунктуром. Појачали смо полиморфну ​​регију понављања јединице промотора транспортера 10 серотонинског мајмуна резуса, користећи следеће прајмере: напред: 5 '-цагцаццтаацццццтаатгтцццтг-3' и натраг: 5 '-гаттцтггтгццаццтагацгццаг-3'. Предњи прајмер је био флуоресцентно обележен. ПЦР појачавања су извршена у термичким циклусима АБИ9700 са 10 μл укупне реакционе запремине и следећим реагенсима: 50 нг геномске ДНК, 10 μМ сваки прајмер, 200 μМ сваки дНТП, 0, 5 У ХотСтар Так ДНК полимеразе, ХотСтар пуфер и без додатних магнезијум (крајња концентрација МгЦл2 од 1, 5 м М). Нуклеотидна мешавина укључује 7-деаза дГТП у омјеру девет дијелова 7'-деаза дГТП и један дио дГТП. ПЦР топлотни циклуси састојали су се од 15 мин на 95 ° Ц, а затим 40 циклуса од 94 ° Ц током 30 с, 61 ° Ц током 30 с и 72 ° Ц током 30 с. Појачање је завршено продужењем за 10 мин на 72 ° Ц и затим задржавањем на 4 ° Ц. Добијени ПЦР производи анализирани су на АБИ3130 Аутоматизираним ДНК секвенцијама користећи АБИ софтвер за прикупљање података. Генотипови су оцењени коришћењем софтвера АБИ ГенеМаппер.

Услови испитивања

Током основног стања у домаћем кавезу (БСЛН), животиње су остале у свом кавезу 30 минута без свог кавеза. Током самог периода који је био повезан са селидбом (АЛН), испитаници су одвојени од својих кавеза и пресељени у кавез у испитној соби где су остали сами 30 минута. Стање без контакта са очима (НЕЦ) укључивало је пресељење субјекта у кавез за тестирање у соби за испитивање. Потом је човек упао у собу за испитивање и стајао потпуно миран на удаљености од 2, 5 метра и представио свој профил испитиваном 10 минута. Затим је уљез напустио собу за тестирање 5 минута, остављајући субјект сам. Затим је уљез поновно ушао у собу за тестирање и, као и раније, представио профил у трајању од 5 минута, након чега је уследило још 5 минута паузе и последњих 5 минута уљеза, укупно 30 минута. Временски ток услова био је дизајниран тако да изазове континуирани одговор током 30 минута који је одговарао карактеристикама преузимања ФДГ. Услови испитивања су избалансирани према условима и седмици теста.

ФДГ микроПет скенирање

Свака животиња је примила интравенску ињекцију од 10 мЦи ФДГ пре теста понашања од 30 минута, што је оптимално време за унос ФДГ. Након убризгавања ФДГ, животиње су биле изложене једном од три стања понашања. Субјекти су затим анестезирани са 15 мг / кг кетамина интрамускуларно за постављање ендотрахеалне епрувете, а затим су постављени у прилагођени држач за главу и одржавани на изофлурану.

У просеку, снимање је почело 33, 5 мин након престанка парадигме понашања (аве + сем = 33, 5 + 0, 58 мин, распон = 24–60 мин). Кинетика ФДГ је таква да се током овог периода он у основи налази у клопци ћелија у које је преузет током парадигме понашања. Скенирање је изведено помоћу микроПЕТ скенера (Цонцорде Инц.) са изотропном резолуцијом 2 мм 3 .

Анализа слике

Свака ФДГ слика коегистрирана је на стандардни простор заснован на Пакинос атласу 35 помоћу поступка више корака. МРИ образац у стандардном простору 35 створен је комбиновањем података из свих доступних МРИ скенирања ( н = 35), укључујући додатне упоредиве предмете из других студија. МРИ слике свих испитаника ручно су маскиране да би се изоловао мозак, а затим су поравнате са МРИ шаблоном у стандардном простору користећи нелинеарну трансформацију израчунату помоћу АИР. 35 ФДГ сума је креирана за сваки предмет тако што је регистровала ФДГ слике из свих услова на једну ФДГ слику, збрајајући их да би креирали појединачни образац, а затим регистровали ФДГ слике сваког субјекта у сопствену суму. Затим је ФДГ зброј сваког испитаника регистрован на МРИ слику користећи трансформације крутог тела у ФСЛ. 36 Трансформисане матрице су кумулиране према потреби да би се МРИ и ПЕТ подаци унели у регистар помоћу шаблона који је базиран на Пакиносу. За сваку слику је извршен пажљив ручни преглед како би се осигурала ваљана регистрација. ФДГ слике у стандардном простору су смањене тако да се исправе за глобалне разлике у интензитету на основу средње концентрације ФДГ у целом мозгу. 37 МРИ слике стандардног простора сегментиране су кориштењем поновљене процедуре сегментације у ФСЛ-у. 38 Коначне слике вероватноће ФДГ-а и сиве материје затим су изглађене коришћењем Гауссовог филтера пуне ширине 4 мм. 39 Сви подаци су визуелно прегледани како би се осигурала тачна претходна обрада пре обављања статистичких анализа. Статистичке анализе су рађене на бази воксила у целом мозгу исправљајући анатомске разлике измерене стандардним морфометријским техникама на бази воксела, као што је претходно описано у Оакес ет ал. 40 користећи прилагођену верзију Фмристата. 41 Идентификација одређених региона мозга извршена је уз помоћ Пакиноса ет ал. атлас. 35

Резултати

Генотипизација је открила следеће фреквенције с и л алела код 30 мајмуна резуса тестираних: ( л / л = 20; неповезани с носиоци = 10 ( с / с = 2, с / л = 8)). Упоређујући л / л са особама које су примењивале ФДГ у кућном кавезу, нису пронађене значајне разлике у метаболичкој активности у АМИГ, БНСТ, НАцц, инсули или ОФЦ (коришћење П <0, 005 (некоректорисано) као праг). Једине разлике које су примећене када су животиње тестиране у кућном кавезу биле су то да су носиоци имали обострано повећану активност у мождану ( т = 4, 19) и смањену активност билатерално у соматосензорном кортексу ( т = -4, 07) и у левом видном кортексу (В1; т = –3.77).

Извршене су Т- тестове интеракције између генотипа и типа стресора: с (АЛН-БСЛН) вс л / л (АЛН-БСЛН) или с (НЕЦ-БСЛН) вс л / л (НЕЦ-БСЛН). Резултати статистичких анализа су приказани на локацији ( к , и , з ) у мм у односу на предњу комисију. Упоређивање АЛН вс БСЛН показало је да с носиоци, у поређењу са л / л мајмунима, значајно повећавају своју метаболичку активност унутар више регија мозга са локалним максимумима унутар АМИГ (максимум = −9.98, -3.75, -8.75; т = 4.21), предња инсула (врх = -15, 58, 7, 55, 2, 55; т = 4, 88) и површина 11 ОФЦ (максимум = 7, 53, 22, 55, 6, 25; т = 5, 24; Слика 1а) ( П <0, 005, дворедни, некоректорисани). Остале интересантне области које су показале значајно повећану активност у поређењу са АЛН-БСЛН код с носача ( П <0, 005, дворедни, некоректорисани) укључују бочни префронтални кортекс (подручја 45, 46 и 47), супериорни темпорални сулкус и хипокампус. Визуелна кортикална подручја (В1, В2 и В3) показала су значајно смањену активност код носача у поређењу са л / л јединкама.

Image

Носачи промотора транспортера серотонина имају већи пораст метаболичке активности амигдале као одговор на једини период (АЛН) у поређењу са основном линијом (БСЛН) у односу на појединце л / л ( а ); и веће повећање активности БНСТ / нуклеус ацумбенс (НАцц) као одговор на контакт без очију (НЕЦ) у поређењу са БСЛН ( б ). Слике мозга представљају значајне вокселе ( П <0, 005 и П <0, 0005, двокраки, некоректорисани) за интеракцију генотипа и типа стресора: л / л (АЛН-БСЛН) вс с (АЛН-БСЛН) плаве и л / л (НЕЦ-БСЛН) вс с (НЕЦ-БСЛН) црвене боје (преклапање између два теста у љубичастој боји) прекривено на МРИ шаблону резус мајмуна. Графови представљају вршне вокселе кластера унутар амигдале ( а ) и БНСТ / НАцц ( б ) истакнутих жутим крстовима који су прекривени на сликама мозга.

Слика пуне величине

Упоређивање НЕЦ и БСЛН показало је да су, као одговор на увођење претње, носиоци значајно повећали своју метаболичку активност у различитим регионима мозга, укључујући стриатум са локалним максимумима у региону који граничи са БНСТ и НАцц (БНСТ / НАцц) (врхунац = −13, 78, 7, 55, 2, 55; т = 5, 11; Слика 1б), предња инсула (врх = -13, 78, 7, 55, 2, 55; т = 4, 58) и површина 11 ОФЦ (врх = 3, 73, 20, 05, 3, 75; т = 3, 72 ) ( П <0, 005, дворезно, некоректно). С носачи су такође имали значајно већу активност ( П <0, 005, дворедни, некоректорисани) у регионима медијале (подручја 24б и 24ц) и бочном префронталном кортексу (подручја 45, 46 и 47) и смањену активност у видном кортексу (В1). Ове анализе су такође урађене брисањем било ког полубраће и резултати су остали значајни.

Накнадне анализе испитале су утицај генотипа на активност АМИГ и БНСТ између два стресора; с (НЕЦ-АЛН) вс л / л (НЕЦ-АЛН). Поређење НЕЦ-а и АЛН-а показало је да су током АЛН- а носачи имали значајно већу АМИГ активност (врх = −8, 78, -4, 35, -8, 75; т = 2, 8) ( П <0, 05, дворедни, некоректорисани), док су током НЕЦ-а с носачи су показали значајно већу БНСТ / НАцц активност (максимум = 7, 53, 3, 15, –3, 15; т = 2, 66) ( П <0, 05, дворедни, некоригирани).

Дискусија

У складу са подацима из истраживања о фМРИ на људима, ови налази ФДГ код мајмуна резуса показују да алел утиче на активност 13, 14, 15, 16 АМИГ као и на активност мозга у бројним другим регионима мозга. 21 Слично као полиморфизам хуманог транспортера серотонина, изгледа да резус кратки и дуги алели имају функционалне ефекте на молекуларном нивоу, разликујући се у нивоима њихове експресије гена. 29 Штавише, наша открића показују стресор контекст интеракцијом генотипа тако да алел утиче на различите области мозга током излагања различитим стресним ситуацијама. Појачање АМИГ активности примећено као одговор на стање АЛН паралелно је са демонстрацијом код људи која је повећала реактивност АМИГ и измењено везивање АМИГ цингулата код носача изложених стимулисима који активирају емоције. 14, 18, 19 Међутим, другачији образац активирања зависног од генотипа догодио се као одговор на дуготрајно излагање претњи које се дешавало у стању НЕЦ-а тако да је изражен одговор настао у БНСТ / НАцц регији, а не у АМИГ. Овај образац активације мозга који укључује БНСТ и НАцц је у складу са претходним истраживањима која показују да су ове регије анатомско уско повезане и да могу бити укључене у посредовање аверзивних одговора. 27 За разлику од ових ефеката специфичних за стресор, без обзира на тип стресора, иста инсула, ОФЦ и бочна префронтална кортикална подручја показала су већу активацију у носачима. Интересантно је да региони отока и ОФЦ захваћени с алелом имају директне неуронске везе са АМИГ и БНСТ / НАцц 33 и такође су укључени у обраду емоција. Инсула је од посебног интереса, јер студије људског снимања показују да је активирање у овом региону повезано са интеграцијом соматских, аутономних и емоционалних информација повезаних са обрадом анксиозности и страха. 42, 43 Бочни префронтални кортикални региони који показују повећану активност у с носачима нису директно повезани са АМИГ и БНСТ, већ су умешани у регулацију емоција преко њихових индиректних утицаја на лимбичку активност. 30, 44

Упоређујући стресне услове са БСЛН кућним кавезом, носачи су имали повећану активацију многих компоненти склопа за које се зна да посредују анксиозност и емоције. Разлике у метаболичкој активности ових регија између носача и л / л јединки нису биле очигледне када су мајмуни тестирани у њиховом стресном окружењу у кућним кавезима. Користећи фМРИ, Харири и др. 23 првобитно су известили да су људи са с алелом имали већу АМИГ реактивност када је њихов БОЛД одговор на љута или уплашена лица упоређен са сензимоторним подударним неутралним стимулансом. Ова повећана АМИГ реактивност је интерпретирана као појачан одговор на стресне подражаје. Међутим, две недавне студије показале су да с носачи показују смањену АМИГ активацију као одговор на неутралне подражаје у односу на фиксациони крст. 21, 25 Цанли и др. 21 је овај налаз протумачио као доказ да су носиоци повећали реактивност АМИГ у мировању (гледајући фиксациони крст) реагујући на неутралне подражаје са релативним падом активирања АМИГ. Они су то предложили зато што су у тексту Харири и др. Одговори студије на аверзивне подражаје су упоређени са одговорима неутралних подражаја на које би опажени појачани АМИГ одговор с носача могао да буде последица смањеног одговора на неутралне подражаје, а не до повећаног одговора на аверзивне стимулусе. Супротно томе, Хеинз ет ал. 25 је протумачио налаз да су носиоци показали смањену активацију на неутрални подражај у поређењу са фиксационим крстом као демонстрацију да носачи имају већу АМИГ реактивност на неизвесну природу „афективно недефинисаног симбола као што је фиксациони крст“ и да је овај одговор може се повећати стресном природом окружења за скенирање. Квантитативни подаци из перфузне фМРИ студије пружили су додатне доказе да су носиоци повећали активност АМИГ у мировању. Наши подаци о ФДГ мајмуна са носиоцима подржавају идеју да је повећана реактивност АМИГ, као и других компоненти кола емоција, последица појачаног реаговања на стресне подражаје.

Важно је нагласити разлике у БСЛН условима између студија. Проценили смо активност мозга када је мајмун остао у свом кућном кавезу, док је БСЛН коришћен у истраживању фМРИ на људима представљао фиксациони крст док су испитаници били у скенеру. Поред тога, студије фМРИ проучавају промене у релативно кратком временском размаку (1–10 с) које се односе на промене функције хемодинамичког одговора, док наши подаци о ФДГ одражавају просек одговора током 30-минутног периода.

Наша открића показују да генетска разлика између с- носиоца и л / л појединаца доводи до промена у интермедијатним фенотиповима мозга повезаних са колањем емоција после излагања стресним изазовима, али да ефекат генотипа зависи од специфичних карактеристика стреса. Различита укљученост АМИГ-а и БНСТ / НАцц-а је од посебног интереса јер се верује да су ове регије мозга укључене у различите функције у односу на емоцију, страх и анксиозност. 27, 31 Коришћењем различитих стресних контекста, по први пут показујемо контекст генотипном интеракцијом која утиче на анатомско одвојиве компоненте склопа које посредују емоцијом. Наша открића сугеришу да алел утиче на функцију мозга у различитим окружењима, али да то чини кроз различите интермедијарне фенотипе у тим различитим контекстима. Могуће је да би различита активација АМИГ и БНСТ / НАцц региона код носача као одговор на различите стресоре, који се понављају и током дужег временског периода, могла објаснити рањивост с носача да развију различите типове повезане са анксиозношћу особине и афективна психопатологија.

Прилози аутора : НК је осмислио истраживање, анализирао податке и написао рад. СС је дизајнирао и извео истраживање и написао рад. ЈР обавио анализе генотипа и написао рад. АФ, ТО и РД анализирали су податке и написали рад.