Једна једнострука супституција остатака представља значајну разлику у термостабилности између две изоформе хумане цитосолне креатин киназе | научни извештаји

Једна једнострука супституција остатака представља значајну разлику у термостабилности између две изоформе хумане цитосолне креатин киназе | научни извештаји

Anonim

Субјекти

  • Рачунална биофизика
  • Молекуларна конформација
  • Агрегација протеина
  • Савијање протеина

Апстрактан

Креатин киназа (ЦК) помаже у одржавању хомеостазе нивоа унутарћелијског АТП-а катализацијом реверзибилног фосфотрансфера између АТП-а и фосфокреатина. Код људи постоје две цитосолне ЦК изоформе, мишићни тип (М) и мозак (Б), који често делују као хомодимери (хММЦК и хББЦК). Занимљиво је да ови изоенцими показују значајно различите термостабилности, упркос великој сличности у аминокиселинским секвенцама и терцијарним структурама. Да бисмо истражили механизам овог феномена, у овом раду смо прво користили замену домена и мутагенезу усмерену на локацију да бисмо претражили кључне остатке одговорне за термостабилност специфичну за изоенцим. Запањујуће је да се разлика у термостабилности углавном темељи на једној јединој супституцији остатака на положају 36 (Про у хББЦК у односу на Леу у хММЦК). Затим смо укључили симулације молекуларне динамике да бисмо проучавали молекуларни механизам. Прорачуни подразумијевају да супституција П36Л уводи додатне локалне интеракције око остатка 36 и на тај начин додатно стабилизира димер интерфејс путем сложене интеракцијске мреже, што рационализује запажање да је хММЦК отпорнији на термалну инактивацију од хББЦК. Коначно смо ово молекуларно објашњење потврдили тестовима термалне инактивације на мутантима Асп36 који су предложени за девастацију локалних интеракција и самим тим димерске асоцијације у оба изоензима.

Увод

Креатин киназа (ЦК, ЕЦ 2.7.3.2) спада у супер-породицу фосфаген-киназе и функционише као "резервоар енергије" за повезивање производње и потрошње АТП-а у различитим ћелијским оделцима 1, 2 . Историјски гледано, ЦК је узета као макромолекула модела за механичка испитивања о савијању протеина. Помоћу хемијске и / или термичке денатурације, механизми инактивације и вишестатично савијање ЦК су интензивно истражени, користећи бројне биофизичке методе, укључујући ултраљубичасту апсорпцију, флуоресценцију, инфрацрвени спектар, кружни дихроизам и брзину седиментације 3, 4, 5, 6 . Поред тога, присуство неколико изоформа ЦК у разним ткивима и / или субцелуларним органелама омогућава проучавање молекуларне еволуције и прилагођавања животне средине коришћењем овог ензима 7, 8 .

Иако је присутан код многих хордата и бескраљежњака, ЦК је једина фосфагена киназа код кичмењака 9 . До сада су идентификована четири ЦК изоензима у вишим кичмењацима, међу којима се два цитосолна изоформа, мишићни тип (МЦК) и мозак тип (БЦК), могу комбиновати да би се формирали или хомодимер (ММЦК и ББЦК) или хетеродимер (МБЦК) ) 10, док се две митохондријске изоформе (свеприсутни и саркомерни тип) могу саставити као октамер или димер, зависно од услова животне средине 11 . Релативно ниска идентичност секвенци између цитосолних и митохондријалних ЦК изоформа од ~ 60–65% сугерира њихову рану дивергенцију у филогенији 12, 13 . За два цитосолна ЦК гена се препоручује да касно еволуирају од истог претка дупликацијом гена 14, и сходно томе показују високи идентитет секвенци од 80%.

Упркос великој сличности у секвенци, ММЦК и ББЦК су прилично различити у својој расподјели ткива, међућелијским партнерима за везивање, каталитичкој ефикасности и стабилности 7, 15, 16, 17 . ММЦК се углавном дистрибуира у мишићима и срцу, а може се регрутовати у саркомере и функционално је повезан са миозином преко миозеина или МиБПЦ 18, 19, 20. ББЦК, који се широко изражава у многим ткивима, посебно у мозгу, мрежници и неким жлездама, може активирати специфични за неурон К + -Цл - ко-транспортер КЦЦ2 21 и може утицати на ширење и миграцију астроцита и фибробласта 22 . Важно је да је инактивација ББЦК-а оксидацијом у цитоплазми ћелија људског мозга повезана са бројним неуродегенеративним поремећајима, укључујући Алзхеимерову болест и Пицкову болест, 23, 24 . На нормалној телесној температури, људски ББЦК (хББЦК) показује већу каталитичку снагу као и много нижу термичку стабилност од људског ММЦК (хММЦК) 7 . Ова различита својства између изоформа чине цитосолни ЦК потенцијалним кандидатом за проучавање молекуларне еволуције и прилагођавања изоензима на различите околинске услове.

Према расположивим кристалним структурама, две људске цитосолне ЦК изоформе (хББЦК и хММЦК) усвајају веома сличне терцијарне структуре 16, 25, са сваком подјединицом (МЦК или БЦК) састављеном од малог Н-терминалног домена (НТД), великог Ц -терминални домен (ЦТД) и дугачак повезивач за њихово повезивање. Значајно је да се активно место налази у расцепу између НТД и ЦТД 16, 25 . Као што је приказано на слици С1, два димерна изоензима деле готово идентичну језгрену структуру са мањим структуралним одступањима која се налазе на Н- и Ц-терминима, као и неке интервентне петље 16 . Упркос великој структурној сличности, хММЦК је много стабилнији (за ~ 15 ° Ц) од хББЦК током денатурације топлоте. Поред тога, два изоензима инактивирају се на различите начине након загревања 7 . Иако обојица имају димерну дисоцијацију 7, 26, термичка инактивација је неповратна за хММЦК, али је високо реверзибилна за хББЦК на температурама испод 55 ° Ц 7 .

Међу факторима предложеним у претходним истраживањима који доприносе хипертермостабилности термофилних ензима 27, 28, 29, 30, број јонских парова се конвенционално сматра најважнијим, јер је то једини показатељ који статистички значајно расте у термофилном ензима у поређењу са њиховим мезофилним хомолозима 31 . Овај фактор, међутим, не показује значајну разлику између хББЦК и хММЦК изоензима, па стога не успева да објасни драстичну разлику у њиховим топлотним стабилностима. Стога је од великог интереса истражити факторе који одређују изоенцим специфичну термостабилност хумане цитосолне ЦК.

Узимајући у обзир високи идентитет секвенци и структурну сличност хББЦК и хММЦК, њихова значајна разлика у термичкој стабилности треба да произлази из малог броја аминокиселина које се разликују у два изоензима. У овом раду смо се прво укључили у анализу мутација и биофизичко испитивање како бисмо утврдили ове кључне остатке. Користећи стратегију комбиновања замене домена и мутагенезе усмерене на место, остатак 36 (Про у хББЦК у односу на Леу у хММЦК) идентификован је као најважнији одговорни за термостабилност специфичне за изоенцим термостабилност хуманих цитосолних ЦК. Затим смо спровели симулације молекуларне динамике (МД) како бисмо истражили молекуларни механизам горе поменутог феномена на атомистичком нивоу. На основу симулација, када Леу36 буде замењен са Про36 у оба изоензима, афинитет везивања на димер интерфејсу је знатно ослабљен, што олакшава дисоцијацију димера. Накнадна анализа на хББЦК имплицира да промена на интерфејсу димера може произаћи из ширења локалне узнемирености око остатка 36 кроз интеракциону мрежу и да додатна локална интеракција формирана око Леу36 стабилизира димер интерфејс потискујући режим кретања дисоцијације димера . Ово молекуларно објашњење коначно је потврђено контролним експериментом и у хББЦК и у хММЦК, где је Асп уведен у положај 36 да потпуно укине локалне интеракције и у великој мери наруши термостабилност.

Резултати

Регион који одређује термостабилност специфичну за изоенцим је сужен заменом домена

Да би се идентификовали аминокиселински остаци који доприносе изоензиму специфичној термостабилности, химере су прво конструисане разменом НТД (остаци 1–116) два изоензима (МнБц и БнМц на слици 1а). ХММЦК је 14, 5 ° Ц стабилнији од хББЦК, док топлотна стабилност химера пада између две изоформе дивљих врста (ВТ) (слике 1б и С2а; табела С1). Посебно, замена НТД хББЦК са хММЦК (МнБц) подиже средњу тачку инактивације ( Т 0, 5 ) за 10, 3 ° Ц. Супротно томе, Т 0, 5 повисује само за 5 ° Ц када на исти начин супституише ЦТД хББЦК оном хММЦК (БнМц) (Сл. 1б). Ова запажања сугеришу већи допринос НТД-а за изоенцим-специфичну термостабилност хумане цитосолне ЦК.

Image

(а) Шематски приказ израђених ЦК химера. (б) Полуактивацијске температуре ( Т 0, 5 ) за ВТ ЦК и химере. Оригиналне кривуље термалне инактивације приказане су на допунској слици С2а.

Слика пуне величине

Да би се даље идентификовали кључни остаци унутар НТД-а, НТД је подељен на два региона, остатке 1–53 и остатке 54–116. Конструисане су четири химере, означене као Б 1–53 М, М 1–53 Б 54–116 М, М 1–53 Б и Б 1–53 М 54–116 Б респективно, где Б и М означавају изворе амино киселинске секвенце и претплатници означавају распон остатака (Сл. 1а). Кривуља термалне инактивације од М 1–53 Б 54–116 М готово се не може разликовати од оне ВТ хММЦК (Сл. С2а), са готово идентичним вредностима Т 0, 5 (Сл. 1б и Табела С1). Слично томе, Б 1–53 М 54–116 Б и ВТ хББЦК показују криве термичке инактивације које се преклапају (Сл. С2а) и затварају вредности Т 0, 5 (Сл. 1б и Табела С1). Ови резултати негирају значајан допринос остатака 54–116 у термостабилности специфичној за изоенцим. У међувремену, кривуље термалне инактивације и вредности Т 0, 5 за химере са остацима 1–53 (Б 1–53 М и М 1–53 Б) подсећају на оне химере са НТД-ом (БнМц и МнБц) (Сл. 1б & С2а и Табела С1), која подржава значај остатака 1–53 у оквиру НТД-а.

Извршено је пододељење региона остатака 1–53 да би се даље сузило претраживање (Сл. 1а). Као што је приказано на сликама 1б и С2а и табели С1, замена остатака Н-терминала 26 (М 1–26 Б и Б 1–26 М) не мења значајно топлотну стабилност ни хББЦК, ни хММЦК. Супротно томе, замена остатака 27–53 (Б 1–26 М 27–53 Б и М 1–26 Б 27–53 М) враћа понашања термалне инактивације МнБц и БнМц. Стога је област остатака 27–53 углавном одговорна за разлику топлотне стабилности између хББЦК и хММЦК.

Упркос доминантној улози остатака 27–53 у термичкој стабилности, овај регион је мање укључен у изоензим специфичну катализу ЦК. Као што је приказано у Табели С1, замјена овог региона само мало мијења релативне активности ВТ изоформа, док размјена ЦТД-ова готово пребацује каталитичке моћи хББЦК и хММЦК. Због тога, термостабилност специфична за изоенцим и каталитичка снага хуманих цитосолних ЦК може настати из разлика у секвенци у НТД-у и ЦТД-у.

Коначно је утврђено да је остатак 36 одговоран за термостабилност специфичну за изоенцим

У кључној регији (остаци 27–53) којом се одређује термостабилност специфична за изоенцим, како је горе идентификовано, само 6 од 27 аминокиселинских остатака је различито између хББЦК и хММЦК (Сл. 2а). Да би се проценио допринос ових остатака, изведена је мутагенеза усмерена на локацију на свакој од 6 позиција, како би се мутирали хББЦК и хММЦК један према другом. Већина мутација има благе ефекте на ЦК активност на собној температури, осим мутаната К41Е и В53Л у хММЦК групи (Табела С2). Први повећава релативну активност за 41%, док други смањује каталитичку снагу за 56%.

Image

(а) Поравнавање редоследа хББЦК и хММЦК. Идентични остаци приказани су белом бојом и обојени су црном бојом. (б) Полуактивацијске температуре ( Т 0, 5 ) за хББЦК и његове мутанте. (ц) Полуактивациона температура ( Т 0, 5 ) за хММЦК и његове мутанте. Оригиналне кривуље термалне инактивације приказане су на додатним Сликама С2б и С2ц.

Слика пуне величине

Према кривуљама термалне инактивације и вриједностима Т 0, 5 мутаната сажетих на сликама 2б и С2б и табели С2, П36Л и Е41К мутације најзначајније утичу на топлотну стабилност хББЦК, повећавајући вриједности Т 0, 5 за 8, 2 ° Ц и 4, 6 ° Ц респективно Супротно томе, мутација Л53В уопште не мења топлотну стабилност, док А40К, А44Д и С46Е само незнатно стабилизују хББЦК (са порастом вредности Т 0, 5 за 1–2 ° Ц). С друге стране, као што је приказано на сликама 2ц и С2ц и табели С2, термичка стабилност хММЦК је ослабљена за 7, 7 ° Ц, 2, 1 ° Ц, 5, 8 ° Ц и 5, 8 ° Ц у мутантима Л36П, Д44А, Е46С и В53Л, респективно, али није значајно под утицајем мутације К41Е. Изненађујуће, вредност Т 0, 5 хММЦК расте за 4, 7 ° Ц у мутанту К40А. Ипак, термичка стабилност и хББЦК и хММЦК се мења у највећем степену међусобном мутацијом на остатку 36 (Сл. 2), што сугерише највећи допринос овог остатка изоензимској термостабилности цитосолних ЦК човека.

Остатак 36 модулира термостабилност специфичну за изоенцим, утичући на дисоцијацију димера

Наш претходни рад 7 извештава да термичка инактивација и хББЦК и хММЦК прати димерну дисоцијацију и да је релативна активност директно пропорционална садржају нативних димерних ензима. Према томе, молекулски механизам топлотне инактивације за хумане цитосолне ЦК треба да буде повезан са дисоцијацијом подјединице на димерном интерфејсу.

Да бисмо открили да ли остатак 36 доприноси изоензимској термостабилности хумане цитосолне ЦК утичући на дисоцијацију димера, извели смо конвенционалне МД (цМД) симулације на четири протеина, укључујући хББЦК, хММЦК и одговарајуће мутанте на остатку 36 (означени као БП36Л и МЛ36П респективно) (Табела С3). Иако временски распон процеса дисоцијације димера може премашити границу посматрања типичних симулација МД, афинитети везивања између парова подјединица могу се израчунати да квантитативно процене тенденцију дисоцијације димера. БП36Л и МЛ36П протеини су конструисани из кристалних структура хББЦК и хММЦК, путем мутације у тачки. Након 30 нс пред-равнотеже, сва четири циљна протеина су структурно стабилна током 100 нс продуктивних симулација (Сл. С3). Слободне енергије везивања између парова подјединица израчунате су методом Молецулар Мецханицс ​​/ Поиссон-Болтзманнова површина (ММ / ПБСА), при чему су ентропије изостављене узимајући у обзир сличне структуре међу свим протеинима. Током 100 нс симулације, енергија везивања без хББЦК конвертира се до средње вредности од око -181 кцал / мол, знатно слабија од средње вредности од око -202 кцал / мол у БП36Л са п-вредношћу <1 × 10 - 7 (Табела 1). Због тога, димерна интеракција у хББЦК постаје стабилизована мутацијом П36Л, у складу са порастом вредности Т 0, 5 у БП36Л (Сл. 2б). Приметно, величина разлике у слободним енергијама везивања (~ 21 кцал / мол) је мање важна, имајући у виду несигурност у процени слободне енергије услед ограничења ММ / ПБСА методе. У међувремену, ослобађајућа енергија хММЦК је значајно ослабљена са око -192 кцал / мол на око -165 кцал / мол са п-вредношћу <1 × 10 -7 (Табела 1) реверзном мутацијом Л36П, што се слаже са смањена вредност Т 0, 5 у МЛ36П (Сл. 2ц). Значајно да се слободне енергије везања између система хББЦК и хММЦК не могу директно упоредити, обоје јер кристалној структури хММЦК недостају Н-терминални остаци који су присутни на димерном сучељу у кББЦК кристалној структури и зато што два система имају не- идентични остаци на димерном сучељу. Горња израчунавања слободне енергије подржавају нашу тврдњу да остатак 36 одређује термостабилност хумане цитосолне ЦК која је специфична за изоенцим, утичући на димерну дисоцијацију.

Табела пуне величине

Након тога, слободна енергија везања даље се декомпонује на доприносе из појединих остатака. Кључни остаци који нарочито стабилизирају мутант преко ВТ-а у хББЦК систему изабрани су на основу разлике у слободној енергији везања између БП36Л и хББЦК. Првих 18 остатака са ΔΔГ <-1 кцал / мол наведени су у силазном редоследу у Табели С4. Слично томе, горњи остаци који нарочито дестабилизирају МЛ36П преко хММЦК такође су одабрани на основу разлике у енергији слободног везивања (ΔΔГ> 1 кцал / мол). Предложена су два низа остатака идентификованих да дају значајан допринос стабилизацији димер интеракције у системима хББЦК и хММЦК, када је Про36 мутиран на Леу36. Занимљиво је да су сви ови остаци распоређени на димера-интерфејсу (Сл. С4), а многи од њих су напуњени остаци (Табела С4). Коначно смо изабрали 7 уобичајених остатака у два скупа (Арг209, Асп55, Асп62, Глу19, Лис156, Арг148 и Асп210) као кључне остатке интерфејса који рачунају на стабилизацију на димер интеракцији мутацијом П36Л. Као што се очекивало, сви ови 7 набијених остатака формирају солне мостове и / или водоничне везе са партнерима у супротној подјединици да би се стабилизирало сучеље (Сл. С5 и Табела С5).

Да бисмо потврдили горе наведено у силиконским симулацијама и прорачунима, урадили смо тестове ин витро гел филтрирања како бисмо проверили композиције четири протеина (хББЦК, хММЦК, БП36Л и МЛ36П) након термичке инактивације (Сл. С6). Слично претходним резултатима 7, хББЦК се делимично дисоцира у мономере при 45 ° Ц, док за хММЦК током термичке инактивације не може се утврдити мономерни интермедијар. Штавише, БП36Л одржава димерну структуру добро на 45 ° Ц, док је стабилни мономерни облик детектиран за МЛ36П на 52 ° Ц. Релативно низак вршни интензитет у МЛ36П узрокован је јаком агрегацијом. Укратко, запажања у експериментима гел филтрирања су у складу са прорачунима слободне енергије, оба показују да је дисерцијација димера суштински потиснута када је Про36 мутиран на Леу36 у системима хББЦК и хММЦК.

Дисерцијација димера може се инхибирати сузбијањем амплитуде кретања остатака интерфејса

Иако се афинитет везања између подјединица на димер сучељу може процијенити помоћу ММ / ПБСА израчунавања у претходном одјељку, конформацијске промјене великих размјера попут дисоцијације димера не могу се директно примијетити у симулацијама цМД због ограниченог времена симулације. Међутим, тенденција крупних колективних покрета могла би се препознати декомпозицијом симулационих путања на међусобно ортогоналне начине кретања коришћењем анализе главних компоненти (ПЦА). Колективно кретање интереса често се дистрибуира на неколико главних компонентних модова (ПЦ) изведених из ПЦА анализе. У овом раду смо усвојили анализу функционалног режима (ФМА) коју су развили де Гроот и колеге 32, 33 да би идентификовали колективне покрете повезане са димерном дисоцијацијом. ФМА техником се може наћи линеарна комбинација ПЦ модова (која се назива функционални режим) која је максимално повезана са самоодређеном биолошком функцијом. Овде смо користили укупну површину доступну растварачима (САСА) свих остатака интерфејса као биолошку функцију за квантификацију степена дисоцијације димера. Специфично, интерфејсни остаци су дефинисани из статичке структуре кристала, као остаци чије се САСА вредности смањују током удруживања две круте структуре подјединице.

Функционални режим изведен из ФМА анализе може се проценити коефицијентом Пеарсонове корелације (ПЦЦ) између пројекције дуж израчунатог режима и димерне дисоцијације, чији се последњи процењује укупним САСА остацима интерфејса. Опћенито, већа апсолутна вриједност ПЦЦ указује на јачу тенденцију дисоцијације димера. Као што је приказано у Табели С6, хББЦК показује најјачу корелацију (ПЦЦ = 0.690), а затим слиједе МЛ36П (ПЦЦ = 0.543), БП36Л (ПЦЦ = -0.437) и хММЦК (ПЦЦ = -0.286). Ова наредба се слаже са експериментом термалне инактивације, чиме се даље подржава наша тврдња да се термичка стабилност ЦК људи у принципу нарушава димерном дисоцијацијом. Одабрали смо функционални мод ВТ хББЦК (са највишим апсолутним ПЦЦ) као колективни покрет који најбоље одражава димерну дисоцијацију у људским цитосолним ЦК. Међутим, слабе међусобне корелације између функционалних модуса идентификованих из четири протеина негирају могућност истраживања овог одабраног најбољег начина у свим системима. Као компензација, овај најбољи мод је тада пројектован на 20 најбољих ПЦ модуса са сва четири протеина како би се открио најбољи ПЦ начин за описивање димерашке дисоцијације унутар сваког система. Као што је приказано на слици С7а, други ПЦ модуси (ПЦ2) и у ВТ и у мутанту хББЦК путање показују значајан слагање са колективним кретањем дисерцијације димера (0, 90 за хББЦК и 0, 55 за БП36Л респективно у смислу апсолутних ПЦЦ вредности). Поред тога, два ПЦ2 начина показују међусобно слагање (апсолутни ПЦЦ = 0, 66), што имплицира могућност да се употребе за поређење понашања димерне дисоцијације између мутанта и ВТ у хББЦК систему. У путањама хММЦК и МЛ36П, иако први ПЦ модуси (ПЦ1) могу делимично описати колективно кретање димерне дисоцијације, корелације су релативно слабе (0, 53 за хММЦК и 0, 38 за МЛ36П).

С обзиром на горње резултате, изабрали смо ВТ и мутант хББЦК система за даљу анализу и упоредили кретање остатака у њиховим најбољим ПЦ модовима (ПЦ2) два протеина. Иако су оба ПЦ2 модуса нормализована, већина остатака, посебно оних у ланцу А, показује мање амплитуде кретања у БП36Л него у хББЦК (слика С8а). У Табели 2, помичне амплитуде остатка 36 као и седам кључних остатака интерфејса (идентификовани слободним прорачуном енергије у горњем одељку, види Табелу С4) у ПЦ2 модусима су наведени један поред другог за хББЦК и БП36Л. Сви остаци показују знатно потиснуто кретање у БП36Л него у хББЦК, осим Лис156 у ланцу Б са упоредивим амплитудама кретања у два протеина. Супротно томе, правци кретања остатака у оба протеина се углавном слажу (Табела 2 и С8б). Закључно, мутација П36Л у хББЦК сузбија кретање већине остатака, посебно резидуа кључног интерфејса, у ПЦ моду који најбоље одражава дисоцијацију димера, имплицирајући да Леу36 може стабилизовати димер интерфејс инхибирајући остатке покрета који узрокују дисоцијацију подјединице.

Табела пуне величине

Кретање остатака интерфејса модулира се променом компактности мреже за интеракцију остатака

Иако горња анализа показује да П36Л мутација може стабилизирати димер интерфејс потискивањем покрета који се односе на дисоцијацију, остатак 36 и они смјештени на интерфејсу не остварују директан контакт, што захтијева присуство путева интеракције како би их повезали. Обавили смо мрежну анализу да бисмо идентификовали ове путеве интеракције. Специфично, сваки остатак је представљен као чвор у мрежи и два чвора су повезана само ако су истовремено задовољена следећа два критеријума: 1) два остатка показују корелирана кретања у режиму ПЦ2 са скаларним углом између смерова кретања <45 ° ; 2) два остатка остварују физички контакт, захтевајући да се бар један пар тешких атома из два кандидатна остатка приближи растојању од <4, 5 А у најмање 75% оквира у укупној симулацији путање. Опћенито, топологија мреже у великој мјери овиси о вриједностима параметара одабраним за изградњу мреже. Овде смо тестирали нашу мрежну анализу користећи различите вредности параметара и добили сталне резултате (видети детаље о методама у додатним информацијама), што подржава робусност нашег израчуна.

Изграђена мрежа БП36Л садржи више чворова и ивица него код хББЦК, што је оправдано различитим мрежним својствима приказанима у Табели 3, посебно просечним степеном чворова и просечним коефицијентом кластера, који просечно процењују опсег веза око сваког чвора. Ова разлика у топологији мреже је потом потврђена као статистички значајна користећи протокол за покретање, случајним одабиром 80% оквира из сваке путање за изградњу мреже и понављањем процеса 10 пута (Табела С7). Стога, мутација П36Л појачава мрежу интеракција хББЦК система, што интринично сузбија кретање остатака у ПЦ режиму, што најбоље одражава дисоцијацију димера.

Табела пуне величине

Да бисмо даље дешифровали како појединачна супституција остатака изазива такве промене у интеракционој мрежи, усредсредили смо се на локалну мрежу око остатка 36. Након мутације из Про у Леу, остатак 36 формира интеракције са додатним остацима, Ала16 и Глу17 (Сл. 3 и Табела С8). Такве додатне локалне интеракције требале би с временом ојачати компактност цјелокупне мреже. Штавише, остатак 36 повезан је са свим кључним остацима интерфејса у обе протеинске мреже (Табела С9), што омогућава даљинску модулацију кретања остатака интерфејса локалном променом на остатку 36. Препознатљиво је пресек између остатка 36 и интерфејса појачан је у БП36Л у поређењу са хББЦК, што показује или смањена дужина најкраће стазе или повишени број стаза када се дужина не мења (Табела С9). Ово запажање је робусно међу 10 поновљених израчунавања покретања, при чему је 80% кадрова насумично бирано из путање за изградњу мреже у сваком понављању (Табела С10). Коначно, мутација Про на Леу јача даљинску интеракцију између остатка 36 и интерфејса и тако помаже у стабилизацији димер интерфејса сузбијајући кретање остатака интерфејса.

Image

Мрежне везе око остатка 36 у (а) ланцу А хББЦК, (б) ланцу Б од хББЦК, (ц) ланцу А од БП36Л и (д) ланцу Б од БП36Л. Структуре су снимљене из последњих оквира цМД путања. Све структурне фигуре су направљене коришћењем ВМД 1.9.1 53 .

Слика пуне величине

Горе наведене мрежне анализе показују да стабилизација димерне асоцијације у БП36Л може произаћи из локално интензивиране интеракције остатака око Леу36. Као што је приказано на слици 3, остаци повезани са бочном групом Про36 / Леу36 у мрежама су непополарни, осим за Глу17 који врши интеракцију користећи свој атом β-угљеника. Стога би хидрофобна бочна група Леу36 требала побољшати локалне интеракције, а на тај начин додатно стабилизирајући интерфејс димера. Теоретски, увођење киселог остатка на позицији 36 требало би да уништи све горе наведене интеракције (укључујући Глу17), што наводно покреће димерну дисоцијацију нарушавајући мрежу интеракција. Затим смо извршили експеримент валидације ин витро , увођењем мутације Асп36 у оба система хББЦК и хММЦК и мерењем кривуља термалне инактивације. Као што се очекивало, термостабилност хББЦК је мутацијом озбиљно ослабљена, при чему је Т 0, 5 у БП36Д пао за 7 ° Ц (Сл. С9). Сличан тренд је примећен и код хММЦК, при чему је Т 0, 5 у МЛ36Д смањен за 12 ° Ц (Сл. С9). Стога је наше механичко објашњење добијено из мрежне анализе на хББЦК применљиво на хММЦК, што указује на тачност нашег предлога да остатак 36 модулира дисерцијацију димера (и термостабилност) хуманих цитосолних ЦК кроз интеракциону мрежу. Примјетно, мутација остатка 36 до Асп у великој мјери смањује, али не може у потпуности уклонити разлику у термостабилности између два изоензима хуманих цитосолних ЦК (Сл. С9), што указује на присуство додатних фактора који доприносе термостабилности специфичној за изоенцим.

Дискусија

Рекапитулација молекуларног модела

У овом раду смо прво потражили остатке који су одговорни за термостабилност хумане цитосолне ЦК специфичне за изоенцим променом секвенце хББЦК и хММЦК једни према другима и испитивањем ефекта помоћу термичке инактивације. Кроз низ замена домена и мутација тачака, коначно смо идентификовали остатак на положају 36 као кључни допринос разлици топлотне стабилности између две изоформе хуманих цитосолних ЦК. Занимљиво је да се кључни остатак 36 налази на капици Н-терминала треће α-хелик (α3) у НТД-у и стога није директно укључен ни у димер асоцијацију ни у ензимску катализу. Иако је пријављено да мутације из Про на друге остатке (нпр. Глу, Тхр и Ала) нарушавају стабилност хипертермофилне аденилат киназе, како са МД симулацијама, тако и са НМР експериментима 34, наше истраживање је показало супротан образац код ЦК, тако да мутација од Про до Леу-а стабилише протеин.

На основу накнадних симулација МД-а и тестова гел филтрације, открили смо да остатак 36 контролира термостабилност модулирајући афинитет везивања на димер интерфејсу, иако се не налази ни на интерфејсу, ни на активном месту. Даљњи прорачуни на хББЦК систему показују да мутација П36Л стабилизира димер интерфејс потискујући амплитуде кретања остатака интерфејса у режиму глобалног кретања што најбоље одражава дисерцијацију димера. Иако остатак 36 не прави физичке интеракције са остацима интерфејса, наша мрежна анализа сугерише присуство путева интеракције за њихово повезивање. П36Л мутација тако индиректно утиче на остатке интерфејса мењајући компактност интерактивне мреже.

На основу тих налаза коначно смо предложили молекулски модел да објаснимо механизам термостабилности специфичне за изоенцим термостабилности хуманих цитосолних ЦК (слика 4). Разлика у термичкој стабилности два изоензима настаје углавном од промене тенденције у дисоцијацији димера изазване једноструком супституцијом аминокиселина у положају 36. У присуству Про36, релативно слаба комуникација између остатка 36 и интерфејса омогућава последњу да се крећу на релативно флексибилнији начин, што олакшава димерну дисоцијацију и нарушава термичку стабилност. П36Л мутација, међутим, сузбија кретање остатака интерфејса јачањем мреже за интеракцију остатака. Сходно томе, Леу36 може ефикасно побољшати топлотну стабилност хуманих цитосолних ЦК индиректно стабилизирајући димер интерфејс. Овај модел може осветлити однос између структурне варијације и стабилности протеина као и еволуцију изоензима у прилагођавању физиолошком окружењу на структуралном нивоу.

Image

When Pro36 (red) is mutated to Leu36 (blue), the more local interaction connections formed around residue 36 (a) can help suppress the motion of interface residues (b) through an interaction network, which finally inhibits the dimer dissociation (c) .

Слика пуне величине

Thermal inactivation is partially caused by conformational changes other than dimer dissociation

The cMD simulations performed in our preceding analyses are incapable of monitoring the large-scale conformational change of proteins due to the limited simulation time. In the thermal inactivation experiment, however, the proteins are expected to greatly deviate from the native conformations by absorbing heat. To simulate such large-scale conformational changes, we performed accelerated MD (aMD) simulations 35, 36, a popular enhanced sampling technique, on the last snapshots of pre-equilibrations of cMD simulations for the four proteins including hBBCK, hMMCK, BP36L and ML36P (Table S3). All proteins undergo drastic conformational changes during the 200 ns aMD simulations. As shown in Fig. S10a, root-mean-square deviation (RMSD) of α-carbon atoms keeps rising in the aMD simulation of hBBCK to >12 Å, while the value remains relatively stable at ~5–6 Å for hMMCK. Meanwhile, the RMSD curves of BP36L and ML36P are between the two WT proteins. This order in the degree of structural deviation is consistent with the thermal inactivation experiment, because proteins experiencing larger conformational changes in enhanced sampling simulations are more prone to become denatured and inactivated upon heating. Further analysis shows that the large conformational change in hBBCK comes more from the inter-chain movement than from the intra-chain one, as indicated by RMSD and root-mean-square fluctuation (RMSF) curves for the single subunits (chain A and B) (Fig. S10c–f). However, the drastically changed conformation (called misfolded in the following discussion) observed in hBBCK does not reflect the dimer dissociation, since the distance between the centers of subunits drops greatly (Fig. S10b).

To identify the new conformation sampled in the aMD simulation of hBBCK, all structural snapshots were clustered according to pairwise RMSD values. The optimal cutoff value was chosen to allow the top 8 clusters to contain >90% of the structural snapshots (Table S11), and the structures closest to cluster centroids were taken as representatives of the clusters. Consistent with the above RMSD and domain distance calculations, the 3rd cluster in the hBBCK trajectory exhibits the largest conformational change with RMSD of 11.6 Å on average, while none of the other three proteins exceed 8 Å (Fig. S11a). Consequently, the representative structure of the 3rd cluster in hBBCK was taken as the major misfolded conformation after the large-scale structural change. As expected, the two subunits in this conformation rotate towards each other to form a collapsed structure (Fig. S12a), which explains the reduction in the distance between the subunit centers during the aMD simulation of hBBCK (Fig. S10b). In the hBBCK native structure, the opening and closing of the substrate binding site are controlled by a pair of flexible loops from the opposing subunits 16 . However, the representative misfolded structure of hBBCK completely blocks the substrate entrance in both chains through rotation of subunits, even when the pair of flexible loops adopts the open conformation (Fig. S13). As shown by the curves of radii calculated by HOLE2 37, 38, the narrowest point in the substrate entering pathway is less than 2.3 Å in chain A and is nearly zero in chain B (Fig. S14), thereby completely inhibiting the binding of substrates.

Therefore, apart from the effect of dimer dissociation, the thermal inactivation of hBBCK may partially arise from the formation of a misfolded structure that disallows the substrate binding. This effect, however, makes weak contribution to the thermal inactivation of the other three proteins, considering their relatively well-preserved conformations in the aMD simulations (Fig. S12).

Inferences to protein design

Manipulation on the thermal stability of enzymes is one of the basic topics in protein design and engineering. Conventionally, the thermal stability is optimized through iterative random residue mutations and in vitro screening 39, 40, 41, 42 . Recently, numerous bioinformatics tools have been developed to facilitate the rational design on the protein stability using evolutionary information 43 . In this work, we adopted an experimental strategy of systematic domain swapping and site-directed mutagenesis to identify and to validate the key amino acid residues in isoenzymes that significantly differ in thermostability. Heppel et al. used a similar approach to identify the key residues responsible for the difference in activities between two homologous enzymes TT2 and PAP4 44 . This method directly utilizes evolutionary information that is implicitly involved in the sequences of a pair of isoenzymes, and therefore can substantially reduce time and expense. Particularly, isoenzymes widely exist in nature, and isoenzyme-specific properties may be general due to the differential adaption to distinct tissue-specific environments 45, 46 . Moreover, such an approach can be applied in a more general manner. As long as two homologous proteins exhibit significant difference in some biophysical property, the above procedure can be initiated to identify the determining residues, and the obtained information can facilitate the rational protein design in return.

Once the key residues are identified, computer simulations and biophysical examinations can be adopted to uncover and to validate the molecular mechanism respectively, and the in-depth understanding on mechanism can further improve the accuracy of rational protein design. Particularly, the simulation technique has exhibited its strength in mechanistic studies on protein stability. In several previous simulation studies, the structures and energies of proteins with different thermostabilities were compared, and the collective motion mode analysis was engaged to study the interacting relationship between residues 34, 47, 48 . Noteworthy, in this work, our computational model, which combines the analyses of functional modes and interaction networks to investigate the relationship between structure and stability, was uniquely designed by us and has never been adopted by previous studies to our knowledge.

Ограничења

Although the tendency of dimer dissociation was numerically evaluated for all proteins and statistically significant difference was identified between the proteins carrying Pro and those carrying Leu at position 36 in both hBBCK and hMMCK systems, direct observation of dimer dissociation, which might exceed the timescale of cMD or aMD simulations performed in this work, was not achieved. Longer and more enhanced sampling simulations should be conducted in the future to visualize the molecular details of the dimer dissociation process. In addition, the low absolute PCC values in the FMA analysis suggest the contribution of non-linear correlation in the collective motion. Other correlation measurements such as mutual information 32 will be tested in the future work to remedy this omission.

Закључак

In this work, we systematically investigated the difference in thermostabilities between two isoforms of human cytosolic CKs, hBBCK and hMMCK. By combining domain swapping and mutual point mutation, the residue 36 was identified as the main contributor for the large difference in semi-inactivation temperatures between the two isoenzymes. We subsequently conducted MD simulations to explore the molecular mechanism of this phenomenon. Using free energy calculations, we found the higher propensity of dimer dissociation in proteins carrying Pro than those carrying Leu at position 36 and identified seven key interface residues. Through the subsequent analyses on functional modes and interaction networks, we affirmed the presence of conserved interaction pathways between residue 36 and these interface residues, which can facilitate the remote stabilization on dimer association by the enhanced local interactions around residue 36 introduced by the P36L mutation. Both simulation results and the proposed mechanism were validated by biophysical examinations. In summary, this work combined in silico computer simulations and in vitro biophysical examinations, and successfully uncovered the isoenzyme-specific thermostability in human cytosolic CKs at the mechanistic level.

Методе

Construction of CK chimeras and site-directed mutagenesis

The cloning of hBCK and hMCK genes has been described elsewhere 7 . Ten chimeras were constructed with the swapping of the corresponding segments in hMMCK or hBBCK (Fig. 1a). Except for mutating residue 36 to the acidic Asp residue, site-directed mutagenesis was carried out mutually, ie the amino acids in hMMCK were mutated into their counterparts in hBBCK, and vice versa. All these mutants were verified by sequencing. The genes of chimeras were cloned into pET21b expression vector (Novagen, Germany). All enzymes were expressed in Escherichia coli BL21 [DE3]-pLysS (Stratagene, Germany) and purified as described previously 7 . Детаљне информације могу се наћи у Додатним информацијама.

Thermal inactivation

Thermal inactivation of the enzymes was carried out using the same procedure as described elsewhere 49 . In brief, thermal inactivation was performed by incubating 0.2 mg/ml enzyme in 5 mM Tris-HCl, pH 8.0 at a given temperatures for 10 min, and then the residual activities of the samples were measured at 25 °C according to the pH-colorimetry method 3 in the phosphocreatine formation direction. The gel filtration assays of the thermal inactivated samples were performed on a Superdex 200 10/300 GL column (Pharmacia, America), using an ÄKTA purifier as described in our previous paper 7 . Детаљне информације могу се наћи у Додатним информацијама.

Грађење модела

Crystal structures without substrates were used in this work for the hBBCK (PDB ID: 3DRE) and hMMCK (PDB ID: 1I0E) systems. The missing residues in chain B of hBBCK (residues 321–329) were directly generated from the complete chain A. The gap residues in both chains of hMMCK (residues 323–331) were modeled by Modeller 50, 51, 52 using the counterpart in chain A of hBBCK as template. Therefore, both structural are called modified crystal structures (or native structures) in this work. The missing residues in N-termini of hMMCK were not built because of their great flexibility that may destabilize the structures during simulations. Site-directed mutagenesis of residue 36 was implemented by VMD 1.9.1 53 based on the modified crystal structures. The four proteins were then placed in water boxes containing ~29150 water molecules and neutralized with 0.01 mol/L NaCl.

Параметри симулације

Amber12SB force field 54 and TIP3P water model 55 were engaged to quantify the atomic interactions. Both cMD and aMD 35, 36 simulations were run using NAMD 2.9 56 with periodic boundary conditions (PBC) applied. The temperature was held at 298 K while the pressure was controlled at 1 atm. The time step was set to 2 fs and the SETTLE algorithm 57 was used to enable the rigid bonds connected to all hydrogen atoms. All four proteins followed a 3-step pre-equilibration of 32.9 ns, the last snapshots of which were chosen as the start structure for 100 ns cMD and 200 ns aMD productive simulations (Table S3) without constraints. Dual boost potentials 58 were applied in aMD simulations according to previous works 59, 60 . Детаљне информације могу се наћи у Додатним информацијама.

Методе анализе

Dimeric binding free energies were calculated using the MM/PBSA method implemented in AMBER12 61 . FMA based on partial least-squares algorithm 32, 33 was implemented using GROMACS 5.1-dev 62 to find out the collective movements related with dimer dissociation. PCA was performed on α-carbon atoms only, using ProDy 63 . Network analysis was performed using NetworkX 64 to identify the interaction pathways between residue 36 and key interface ones. Other parameter values for network construction were also tested. Clustering analysis was carried out using VMD 1.9.1 53 according to pairwise RMSD values. The radii of substrate entering pathway to the active site were calculated by HOLE2 37, 38 . Детаљне информације могу се наћи у Додатним информацијама.

Додатне Информације

Како цитирати овај чланак : Лиу, Х. ет ал. A single residue substitution accounts for the significant difference in thermostability between two isoforms of human cytosolic creatine kinase. Сци. Rep. 6, 21191; doi: 10.1038/srep21191 (2016).

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Додатне информације

Коментари

Подношењем коментара пристајете да се придржавате наших Услова и Смерница заједнице. Ако нађете нешто злоупотребно или то није у складу са нашим условима или смерницама, означите то као непримерено.