Инхибиција мале молекуле лиганд-стимулисане раге-диапх1 трансдукције сигнала | научни извештаји

Инхибиција мале молекуле лиганд-стимулисане раге-диапх1 трансдукције сигнала | научни извештаји

Anonim

Субјекти

  • Развој лекова
  • Сцреенинг

Апстрактан

Рецептор за напредне производе гликације (РАГЕ) веже различите лиганде повезане са хроничном упалом и болешћу. Студије НМР спектроскопије и рендгенске кристализације ванћелијских домена РАГЕ показују да се РАГЕ лиганди везују помоћу различитих механизама зависних од набоја и хидрофобности. Цитоплазматски реп (цт) РАГЕ је важан за РАГЕ лиганд посредовану трансдукцију сигнала и последичну модулацију експресије гена и ћелијских својстава. РАГЕ сигнализација захтева интеракцију цтРАГЕ са интрацелуларним ефектом, сисавцима дијафаничним 1 или ДИАПХ1. Приказали смо библиотеку од 58 000 малих молекула и идентификовали 13 малих молекуларних конкурентских инхибитора интеракције цтРАГЕ са ДИАПХ1. Ова једињења, која показују ин витро и ин виво инхибицију молекуларних процеса зависних од РАГЕ, представљају привлачне молекуларне скеле за развој терапија против болести посредованих РАГЕ, као што су она повезана са дијабетичким компликацијама, Алзхеимеровом болешћу и хроничном упалом и пружају подршка изводљивости инхибиције интеракције протеин-протеин (ППИ).

Увод

Рецептор за напредне крајње производе гликације (РАГЕ) је мулти-лигандски рецептор имуноглобулинске супер породице породичних ћелија 1, 2, 3, 4 . Изванстанични део РАГЕ се састоји од три домена слична имуноглобулину, В, Ц1 и Ц2, након чега слиједи један трансмембрански распонски домен и кратак цитоплазматски домен 5, 6, 7, 8 . Цитоплазматски домен људске РАГЕ, цТРАГЕ, је високо набијен и састоји се од 43 аминокиселине (ЛВКРРКРРГ ЕЕРКАПЕНКЕ ЕЕЕЕРАЕЛНК СЕЕПЕАГЕСС ТГГП) 5 . Стимулација лиганда РАГЕ активира путеве трансдукције сигнала, као што су протеини киназе које се активирају митогеном (МАПК); Рхо ГТПасес; и фосфатидилинозитол 3-киназа (ПИ3К) / Акт, на начин који зависи од типа ћелије и акутности насупрот хроничности потицајног сигнала 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 . цтРАГЕ је неопходан за трансформацију РАГЕ сигнала; експерименти ин витро и ин виво у којима је овај домен рецептора избрисан открили су да је пресудно за преношење ефеката који су започети од РАГЕ лиганда 17 .

Претходно смо испитивали ближе механизме помоћу којих је цтРАГЕ извршио ове ефекте на сигнализацију стимулисану лигандом користећи дво-хибридну анализу квасца и идентификовао је да цтРАГЕ комуницира са ФХ1 доменом (формин хомологни домен 1) сисара у облику дијафоне 1 (ДИАПХ1) 11, 18, 19 . Експерименти ко-имунопреципитације и имунокализације потврдили су ову интеракцију у ћелијским моделима. Мала интерференција (си) РНА-посредована редукција експресије ДИАПХ1, али не и кодирајући сиРНА-и, блокирала је ефекте РАГЕ лиганда, као што су карбокси метил лизин, напредни продукти гликовања (ЦМЛ-АГЕс) и С100 / калгранулини 20, 21 на ћелијску сигнализацију у различитим типови ћелија, укључујући васкуларне ћелије, имуне ћелије, кардиомиоците и трансформисане ћелије 11, 16, 22, 23 . Ин виво , у макрофазима који потичу из коштане сржи и ћелијама васкуларног глатког мишића (СМЦ) лишени Диапх1 (гена који кодира ДИАПХ1), РАГЕ лиганди нису успели да покрену ћелијску сигнализацију 16, 23 . Супротно томе, ћелијски подражаји, који нису РАГЕ лиганди, као што је фактор раста који потиче из тромбоцита (ПДГФ) -ББ, стимулисали су активацију Акт ћелијске сигнализације, миграцију и пролиферацију СМЦ услед смањене експресије ДИАПХ1 16 . Ови подаци сугеришу да обарање експресије ДИАПХ1 не даје генерализовано и неспецифично сузбијање интрацелуларних ефекторских путева.

На основу ових података који указују да је ДИАПХ1 потребан за трансдукцију сигнала РАГЕ, рабљена НМР спектроскопија је коришћена за идентификацију површина интеракције између цтРАГЕ и ДИАПХ1 ФХ1 домена. Мапирање уочених промена хемијског померања на молекуларну површину цтРАГЕ показало је да се површина интеракције између РАГЕ цитоплазматске домене и ФХ1 ДИАПХ1 састоји од малог позитивно наелектрисаног фластера формираног од К3, Р4, Р5 и К6 са укупном површином мањом од 200 А 2 24 . Кад су Р6 / К6 мутирани на аланинске остатке, примарни мишји СМЦ инкубирани са РАГЕ лигандом С100Б или ЦМЛ-АГЕ показали су значајно смањену сигнализацију (фосфорилација Акт) и СМЦ миграцију и пролиферацију насупрот векторској контроли или РАГЕ дивљих врста. ПДГФ-ББ, а не РАГЕ лиганд, покренуо је сигнализацију и покренуо пролиферацију и миграцију у СМЦ, чак и у присуству ових мутација у РАГЕ цитоплазматском домену 24 .

Експериментални докази упућују на то да се различити лиганди РАГЕ вежу на изванстаничне домене рецептора помоћу различитих биофизичких механизама. Парк и његове колеге демонстрирали су да се препознавање РАГЕ лиганда С100Б по РАГЕ догађа помоћу ентропијски посредованог процеса који укључује хидрофобну интеракцију зависну од Ца2 + са РАГЕ изванстаничним доменима В-Ц1 7 . Коцх и његове колеге такође су идентификовали значај РАГЕ В-Ц1 у везивању за С100Б 6 . Међутим, Ксие и његове колеге показали су да се различити С100, С100А12, веже за Ц1-Ц2 домене РАГЕ 25, а Лецлерц и колеге показали да се други С100 лиганд од РАГЕ, С100А6, такође везује за Ц1-Ц2 изванстаничне РАГЕ домене 14 . Супротно томе, РАГЕ везивање за АГЕ посредује препознавањем негативних набоја који показују АГЕ-модификовани протеини. Ксуе и његове колеге показали су да се специфични АГЕ, карбоксиетиллизин (ЦЕЛ) и хидроимидазолон уклапају у позитивно набијене џепове унутар В домена 8, 26 . У случају амилоид-ß-пептида, докази сугерирају да је В домен главно препознавање овог лиганда 27, 28 . Узети заједно, ови примери подвлаче сложеност везања РАГЕ лиганда на ванћелијске домене рецептора. Стога смо закључили да је од суштинске важности идентификовати различито средство за спречавање интеракције лиганд-РАГЕ. Због захтева да се утврди веродостојност везивања РАГЕ цитоплазматских домена на ДИАПХ1 као кључни механизам трансдукције РАГЕ сигнала, узета заједно са чињеницом да инхибиција ванћелијске домене РАГЕ још увек није показала да је потпуно безбедна и ефикасна у различитим пато-биолошке поставке окарактерисане поступцима РАГЕ у људским болестима, фокусирали смо се на циљање интеракције цтРАГЕ-ДИАПХ1.

С обзиром на сложену, мулти-лигандну природу лиганда које се вежу за ванћелијске домене РАГЕ, ми смо уместо тога покушали да откријемо мале инхибиторе молекула интеракције цтРАГЕ са ДИАПХ1. Иако се развој инхибитора интеракције протеина и протеина (ППИ) сматра изазовним, објављени докази снажно подржавају снажно интересовање за ову класу циљева лекова, посебно пошто је ППИ веома важан у већини биолошких процеса 29, 30 . Отуда смо развили тест пробира велике пропусности којим смо испитали малу библиотеку молекула од 58.000 једињења. Од ових молекула, 13 је показало инхибицију везања цтРАГЕ на ДИАПХ1 и, помоћу НМР спектроскопије, показало директно везивање за цтРАГЕ. Ови идентификовани молекули инхибирају ин витро и ин виво експерименте инхибирају РАГЕ лиганд трансдукцију сигнала. Свеукупно, ови подаци утврђују да је цитоплазматски домен РАГЕ-а најпоштенија мета за терапијску интервенцију у РАГЕ посредованим патологијама и илуструју нови механизам за специфичну инхибицију РАГЕ сигнализације.

Резултати

Скривање високе пропусности и идентификација инхибитора малих молекула цтРАГЕ интеракције са ДИАПХ1

Слика 1а илуструје шематски приказ људског цтРАГЕ; приказане су хомологије између цтРАГЕ људи, штакора, миша и паса. Да бисмо идентификовали инхибиторе интеракције људског цтРАГЕ са ДИАПХ1, успоставили смо тест везивања за испитивање ЦхемБридге-ове 58.000 ДИВЕРСет библиотеке, ЦТ488А. Протокол и резултати испитивања везивања приказани су у Додатној Табели С1. Анти-ДИАПХ1 ИгГ је обложен на јажицама плоча за тестирање са 384 јажица, након чега је уследило блокирање невезаних места на јажицама са говеђим серумским албумином (БСА). Након овог корака, плоче обложене антителом инкубирају се са лизатом хумане ХеЛа ћелије (извор ДИАПХ1) након чега следи инкубација са тестним малим молекулима (10 µМ) и цтРАГЕ означеним са ГФП. 777 малих молекула који су показали ≥50% инхибиције специфичног везивања подвргнути су понављању и одговору на дозу од четири тачке (10 µМ, 1 µМ, 0.1 µМ и 0.01 µМ). Укупно 97 једињења су показала инхибицију везивања цтРАГЕ-ДИАПХ1 у зависности од дозе. Допунска слика С1а-м показује резултате испитивања у одговору на дозу у четири тачке за једињења 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 13 и идентификује сложене структуре. Имајте на уму да је једињење 3, које није члан почетне библиотеке једињења, близак аналогу једињења 4 и купљено је за додатну подршку овој серији након примарног испитивања.

Image

( а ) Шематски приказ РАГЕ и поравнавање редоследа цтРАГЕ. Хомолошки остаци су црвене боје. "ТМХ" означава трансмембранску хеликсу, а "ЕКСРАГЕ" означава ванћелијски део РАГЕ. Остаци Р5 и К6, укључени у РАГЕ сигнализацију, су плаве боје. ( б, ц ) Прекривање 1 Х { 15 Н} ХСКЦ НМР спектра слободних [ У- 15 Н] цтРАГЕ (црно) и [ У- 15 Н] цтРАГЕ везано на једињење 3 ( б ) и 6 ( ц ) ( црвено). Означени су НМР врхови цтРАГЕ остатака који су претрпели екстензивно ширење услед интеракције са библиотечким једињењима. ( д, е ) Површина за интеракцију између цтРАГЕ и једињења 3 ( д ) и 6 ( е ). Остаци К3, Р4, Р5 и К6 претходно се умешају у везивање цтРАГЕ на ДИАПХ1.

Слика пуне величине

После ових експеримената, изведена је НМР спектроскопија да би се утврдила тачна места интеракције ових 97 једињења са цтРАГЕ. Промјене хемијских помака протеина НМР су изузетно осјетљиве на везивање протеина-лиганда и рутински се користе за идентификацију површина интеракције протеин-лиганд 31 . На основу НМР експеримената, тринаест једињења је показало специфично везивање за цтРАГЕ. На пример, 1 Х { 15 Н} ХСКЦ НМР спектри [ У- 15 Н] цтРАГЕ откривају да се обе једињења 3 и 6 везују за површину цтРАГЕ која се састоји од К3, Р4, Р7, Г9 и Р12, што је слично РАГЕ цитоплазматски домен - место интеракције ДИАПХ1 24, на тај начин сугеришући да оба једињења директно ометају ову везујућу интеракцију (Једињење 3, Сл. 1б, д и Једињење 6, Сл. 1ц, е). Напомена, места интеракције цтРАГЕ са једињењима 3 и 6 се у потпуности не преклапају, јер једињење 6 такође захвата Р8, С30 и С39. Даље, једињење 3 такође укључује Р5 и К6 цт РАГЕ.

НМР спектри [ У- 15 Н] цтРАГЕ везани за преосталих једанаест одабраних једињења приказани су на Додатним сликама на следећи начин: једињења 1, 2, 4, 5 (допунска слика С2а-д); једињења 7, 8, 9 и 10 (допунска слика С2е-х); и једињења 11, 12 и 13 (допунска слика С2и-к). Места интеракције цтРАГЕ са преосталим једињењима се не преклапају у потпуности и такође садрже остатке укључене у интеракцију цтРАГЕ-ДИАПХ1 24 . Узето заједно, ови подаци показују да је из оригиналне библиотеке идентификовано тринаест једињења, која су показала константе дисоцијације нМ за њихово специфично везивање за РАГЕ цитоплазматски домен. Допунска таблица С2 резимира ове податке.

Нативна триптофанска флуоресценција цтРАГЕ коришћена је за мерење афинитета везивања тринаест једињења која су показала инхибицију инхибиције цтРАГЕ-ДИАПХ1 зависне од дозе и показала специфично везивање за цтРАГЕ. У овим експериментима титрације флуоресценције константе дисоцијације, Кд, су процењене на основу промене интензитета највеће флуоресценције као функције концентрације слободног једињења, а подаци су одговарали једначини, (Ф - Ф 0 ) / Ф мак = [једињење] / (К д + [једињење]), где је Ф интензитет флуоресценције при датој концентрацији једињења, Ф 0 је интензитет флуоресценције у слепоти, а Ф мак је максимални интензитет флуоресценције. Тринаест једињења, илустрованих на слици 2а-м, показала су низак наномоларни афинитет за цтРАГЕ.

Image

( а –м) Везивање једињења 1–13 са цтРАГЕ је праћено нативном триптофанском флуоресценцијом цТРАГЕ. Константе дисоцијације (К д ) приказане су на слици.

Слика пуне величине

На основу ових налаза, покушали смо да утврдимо да ли тринаест једињења утиче на последице РАГЕ лиганда у ин витро ћелијским испитивањима и ин виво.

Утицај једињења 1–13 на РАГЕ лиганд-стимулисану ћелијску сигнализацију: Акт и ЕРК1 / 2

Тестирали смо ефекте једињења 1–13 на ћелијску сигнализацију у примарним СМЦ мишјим аортама. У СМЦс смо претходно показали да мутација двеју кључних аминокиселинских остатака цтРАГЕ, Р5 / К6, блокира станичну сигнализацију индуковану РАГЕ лигандима. У примарним мишјим аортним СМЦ-има тестирали смо ефекте ЦМЛ-АГЕ РАГЕ лиганда на Акт и ЕРК1 / 2 фосфорилацију, пошто су ти путеви семенски повезани са основним својствима ових ћелија и њиховим реакцијама на стрес, као што су раст, пролиферација, хипертрофија, миграције и опстанак 32 . Као што је приказано на слици 3а, б, у поређењу са медијумом без серума (на слици означеним као СФМ или С), третман примарних мишјих аортних СМЦ са РАГЕ лигандом ЦМЛ-АГЕ (10 μг / мл) (означено као ЦМЛ или Ц у слика) резултирало је 1, 4- и 1, 9 пута повећањем фосфо / укупно-ЕРК1 / 2 и фосфо / укупног Акт; п <0, 001, респективно. Претходна обрада ћелија током 1, 5 х са једињењима 1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, 11 и 13, 1 µМ резултирала је значајном супресијом фосфо-посредоване ЦМЛ-АГЕ / укупне ЕРК1 / 2. Само једињења 6, 7, 8 и 12 нису значајно утицала на сигнализацију ЕРК1 / 2 (Сл. 3а). Претходна обрада ћелија током 1, 5 х једињењима 1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 11 и 13, 1 µМ резултирала је значајном супресијом ЦМЛ-АГЕ-посредоване стимулације фосфо / тотал-Акт (Сл. 3б). Само једињења 5, 7, 8 и 12 нису значајно потиснула Акт сигнализацију посредовану РАГЕ лигандом (Сл. 3б).

Image

Примарни мишји СМЦ инкубирани су 1, 5 х са једињењима 1–13 (1 µМ) и затим третирани са РАГЕ лигандом ЦМЛ-АГЕ (10 µг / мл) током 20 минута. Ћелије су сакупљене и укупни лизати су подвргнути Вестерн блотирању антителом против фосфо-ЕРК и фосфо-АКТ. Блотови су затим поново испитивани антителом на тотал-ЕРК и тотал-АКТ и релативну оптичку густину (РОД). ( а ) Приказани су квантификовани нивои фосфорилираног / укупног ЕРК-а нормализованог на укупни ЕРК. ( б ) Приказани су квантификовани нивои фосфорилираног / укупног АКТ нормализованог на укупни АКТ. Приказани резултати испитивања представљају три независна експеримента. Траке грешака представљају СЕМ. * означава п <0, 05 упоређујући ЦМЛ-АГЕ са ЦМЛ-АГЕ и третманом једињења и # означава п <0, 001 упоређујући само носач ЦМЛ-АГЕ са средством без серума (СФМ). Изнад сваке западне мрље, С = медијум без серума и Ц = ЦМЛ-АГЕ; бројеви изнад мрља означавају сложен број.

Слика пуне величине

Утицај једињења 1–13 на миграцију ћелија глатких мишићних мишића стимулисаних РАГЕ лигандом

Затим смо тестирали ефекте тринаест једињења олова на сузбијање РАГЕ лиганд посредоване ћелијске миграције. Да би се ово постигло, аортни СМЦ-и су узгајани до ушћа у плоче третиране ћелијском културом, а затим су подвргнуте "рањавању" користећи једну вертикалну огреботину у средини сваког лежишта са врхом п200 пипете. Одмах након рањавања, монопласти су претходно третирани са тест једињењима 1–13 у трајању од 1, 5 сата. Једињења су затим уклоњена из моно-слоја и замењена свежим медијумом који садржи РАГЕ лиганд ЦМЛ-АГЕ (10 µг / мл). Прво смо проучавали ефекте једињења у мишјим аортним СМЦс. У поређењу са третманом ових ћелија медијумом без серума, третман РАГЕ лигандом ЦМЛ-АГЕ резултирао је знатним повећањем израслина на површини (µм 2 ); п <0, 001. Претходна обрада са свим једињењима, 1–13, резултирала је статистички значајним сузбијањем повећаног пораста СМЦ посредованог ЦМЛ-АГЕ-ом (слика 4а и додатна слика С3а).

Image

Миграција ћелија после инкубације са једињењима 1–13 процењена је у мишјој СМЦ ( а, ц ) и хуманој СМЦ ( б ) миграцији. СМЦ су узгајане до ушћа и преко ноћи су гладиле серум. Следећег јутра уклоњен је медијум без серума и додата су једињења 1–13 (1 µМ). Одмах након додавања једињења, вишеслојни слој је рањен помоћу п200 врха пипете и остављен је да се инкубира 1, 5 х. После ове инкубације, уклоњена су једињења и током 7 х додан је свежи медијум који садржи РАГЕ лиганд, ЦМЛ-АГЕ (10 μг / мл) ( а, б ) или општи ефектор, ПДГФ-ББ (10 нг / мл) ( ц ). . Све слике су мерене на Т0 и Т7 х и израчуната је површина пораста ефективних миграционих ћелија. Свако једињење је тестирано у три независна лежишта и сваки бунар је фотографиран на 3 одвојена места за укупно 9 слика коришћених за процену урастања подручја. Траке грешака представљају СЕМ. * означава п <0, 05 упоређујући ЦМЛ-АГЕ са ЦМЛ-АГЕ и третманом једињења и # указује на п <0, 001 поредећи носач ЦМЛ-АГЕ са средством без серума (СФМ).

Слика пуне величине

Затим смо тестирали ефекте једињења 1–13 на миграцију СМЦ аорте код човјека. Извршене су аналогне студије онима изведеним у мишјим СМЦ-има. Као што је приказано на слици 4б, примећено је значајно повећање површине израслог након третмана РАГЕ лигандом ЦМЛ-АГЕ лигандом у односу на медијум без серума; п <0, 001. Претходна обрада хуманих СМЦ са свим једињењима, 1–13, резултирала је значајним смањењем повећаног пораста површине посредоване ЦМЛ-АГЕ у односу на носилац; п <0, 05 (Сл. 4б).

Утицај једињења 1–13 на миграцију ћелија глатких мишићина стимулисан не-РАГЕ лигандом, ПГДФ-ББ

Даље, било је неопходно тестирати ефекте једињења на биолошка дејства не-РАГЕ лиганда. Као што је горе речено, за разлику од лечења РАГЕ лигандом С100Б, у присуству мутираног Р5 / К6 у РАГЕ цитоплазматском домену, ПДГФ-ББ је стимулисао значајну миграцију и пролиферацију мишјих СМЦ 24 . Да бисмо се позабавили овим концептом са новоидентификованим инхибиторима малих молекула РАГЕ интеракције цитоплазматских домена са ДИАПХ1, тестирали смо ефекте једињења 1–13 на миграцију СМЦ-а, стимулиране ПДГФ-ББ. Као што је приказано на слици 4ц и допунској слици С3б, третман једињењима 1–13 (1 µМ) није имао супресивни ефекат на миграцију мишјег СМЦ-а стимулисаног ПДГФ-ББ. Узето заједно, ови подаци показују да код СМЦс мали молекули 1–13 показују селективност у инхибицији ћелијске миграције индукованој РАГЕ лигандом ЦМЛ-АГЕ лигандом, али не као одговор на стимулус лиганда који није РАГЕ, ПДГФ-ББ.

Утицај једињења 1–13 на РАГЕ лиганд-посредовану стимулацију упале у ендотелним ћелијама и ћелијама сличним ТХП1 макрофагама

Поред снажних ефеката на васкуларну миграцију, РАГЕ лиганди су кључни посредници упале у таквим окружењима као што су атеросклероза, аутоимуност, дијабетичке компликације и у централном нервном систему 17, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 . Тако смо тестирали ефекте једињења 1–13 на РАГЕ лиганд-посредовану упалну стимулацију у ендотелним ћелијама и ћелијама сличним макрофагама.

Прво смо тестирали ефекте РАГЕ лиганда ЦМЛ-АГЕ у примарним ендотелним ћелијама аорте мишје (МАЕЦ). Третман са ЦМЛ-АГЕ (10 µг / мл) резултирао је 25-пута и 45-пута порастом транскрипта мРНА за цитокине Тнфа и Ил6 у поређењу са носачем, СФМ (Сл. 5а, б, респективно). Да бисмо проценили ефекте једињења, претходно смо третирали МАЕЦ током 1, 5 х једињењима 1–13 (1 µМ). Претходна обрада са свих тринаест једињења, 1–13, резултирала је значајним сузбијањем регулације Тнфа посредоване ЦМЛ-АГЕ (Сл. 5а). Даље, претходна обрада са једињењима 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 и 13 резултирала је значајним сузбијањем регулације Ил6 посредоване ЦМЛ-АГЕ (Сл. 5б).

Image

Примарне ендотелне ћелије аорте мишје ( а, б ) или хумане ТХП1 ћелије ( ц, д ) подвргнуте су 1, 5 х инкубацији са једињењима 1–13 (1 µМ) праћено стимулацијом ЦМЛ-АГЕ (10 µг / мл) током 6 х . Затим су ћелије сакупљене и извршена је експресија гена упалних маркера Тнфα и Ил6, нормализованих на β-актин ( а, б ) или 18с рРНА ( ц, д ). Тестови су изведени у три примерка и резултати су репрезентативни за три независна експеримента. Траке грешака представљају СЕМ. * означава п <0, 05 упоређујући ЦМЛ-АГЕ са ЦМЛ-АГЕ и третман једињења # означава п <0, 001 упоређујући ЦМЛ-АГЕ са СФМ средством (СФМ).

Слика пуне величине

Затим смо тестирали ефекте ЦМЛ-АГЕ у људским ћелијама сличним ТХП1 на макрофагу на повећање регулације упалних медијатора. У поређењу са носачем, СФМ, ЦМЛ-АГЕ је стимулисао 2, 2-пута и 82-пута повећање мРНА транскрипата за цитокине Тнфа и Ил6 (Слика 5ц, д, респективно). Аналогно експериментима у МАЕЦ-у, ћелије ТХП1 су претходно третиране 1, 5 х једињењима 1–13 (1 µМ) пре додавања РАГЕ лиганда. Претходна обрада са свих тринаест једињења резултирала је значајном супресијом регулације ТНФа посредоване ЦМЛ-АГЕ (Сл. 5ц). Третман са једињењем 13 осим једињења 13 резултирао је значајном супресијом регулације ИЛ6 -стимулисаног ЦМЛ-АГЕ- ом (Слика 5д).

Узето заједно, ови подаци показују да инхибитори мале молекуле цтРАГЕ интеракције са ДИАПХ1 сузбијају упале посредоване РАГЕ лигандом у ендотелним ћелијама и ћелијама сличним ТХП1 макрофагама.

Утицај једињења на РАГЕ лиганд-посредовану стимулацију упале ин виво

Даље, било је неопходно тестирати способност тринаест једињења да ин виво блокирају РАГЕ лиганд посредовану упалу . У нашем претходном раду користили смо антитела на РАГЕ да дефинитивно илуструјемо да је инфузија дивљег дијабетичког мишева дивљег типа са АГЕс регулисаном Ил6 у васкуларним ткивима, путем РАГЕ 41 . Да бисмо тестирали овај концепт у овој студији, третирали смо мишеве дивљег типа са ЦМЛ-АГЕ (150 μг) интраперитонеалном ињекцијом након третмана са четири дозе једињења 1–13 (5 мг / кг по дози, 12 х размака). Тридесет минута након четврте дозе једињења, мишевима је убризган ЦМЛ-АГЕ и жртвовано 4 сата касније. Бубрежно ткиво је узето и подвргнуто квантитативном ПЦР у реалном времену за детекцију транскрипата који кодирају упалне посреднике. ЦМЛ-АГЕ је резултирао значајно повећаним транскриптима мРНА за Тнфа и лл6; п <0, 001 (Сл. 6а, б). Претходна обрада са једињењима 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12 и 13 резултирала је значајним сузбијањем регулације Тнфа мРНА посредоване ЦМЛ-АГЕ; п <0, 05 (Сл. 6а); и предобрада са свим једињењима 1–13 резултирала је значајном супресијом Ил6 мРНА насупрот носачу у бубрегу након ињекције РАГЕ лиганда, ЦМЛ-АГЕ; п <0, 05 (Сл. 6б).

Image

( а, б ) Мишеви Ц57БЛ / 6Ј подвргнути су интраперитонеалној примени четири дозе једињења 1–13 (5 мг / кг сваких 12 х) или једнаке количине вехикла (ПБС). Тридесет минута након коначне ињекције, мишевима је убризган ЦМЛ-АГЕ (150 μг) интраперитонеалном администрацијом. Четири сата касније, мишеви су жртвовани и извучен је бубрег. Квантитативни ПЦР у реалном времену извршен је за детекцију Тнфа ( а ) и Ил6 ( б ). ( ц ) Процена једињења о функционалном опоравку срца код дијабетеса. Ц57БЛ / 6 мишевима је дијабетичар типа 1 са стрептозотоцином. Након средњег распона нелечене хипергликемије од 37 до 45 дана, мишеви су жртвовани и срца су брзо пронађена ради процене ефикасности једињења 1–13 (1 µМ) или носача, ДМСО, на притиску развијеном у левом вентрикулу (ЛВДП) после исхемије. Сва срца су била подвргнута 30 минута глобалне исхемије, након чега је уследило 60 минута реперфузије. Испитна једињења су уведена 10 минута пре почетка исхемије и настављена током протокола реперфузије. У ( а – ц ), Н = 5–6 мишева по групи. Траке грешака представљају СЕМ. У ( а - ц ), * означава п <0, 05 у односу на одговарајућу контролу, а у ( а, б ), # означава п <0, 001 упоређујући третман ЦМЛ-АГЕ и ПБС.

Слика пуне величине

Утицај једињења на исхемију / реперфузијску повреду у дијабетичком срцу

Коначно, тестирали смо ефекте ових једињења у окружењима у којима се РАГЕ лиганди природно накупљају, посебно на дијабетичком срцу. Заиста, наш претходни рад је повезао пут РАГЕ са повредама срца дијабетичара; Даље, идентификовали смо да сама исхемија / реперфузија ствара РАГЕ лиганде 42, 43, 44 . Да бисмо тестирали овај концепт са нашим новоидентификованим малим молекулама, направили смо мишеве дивљег типа дијабетичаре стрептозотоцином. После средњег распона од 37 до 45 дана одржаване, не лечене хипергликемије, срца су враћена и ек виво су подвргнута исхемији / реперфузији. Добро је утврђено да у овом окружењу дијабетичка срца имају веће повреде у поређењу са не-дијабетичким срцима 45 . У нашим експериментима, инфузирали смо носач (ДМСО) насупрот једињењима 1–13 (крајња концентрација, 1 µМ) почевши десет минута пре почетка исхемије и наставили током периода исхемије / реперфузије од 1 х. На крају реперфузије, измерили смо развијени притисак леве коморе (ЛВДП) у срцима, кључну меру функционалног опоравка после повреде. Као што је приказано на слици 6ц, у поређењу са носачем ДМСО, у коме смо приметили 36% функционални опоравак, третман једињењима 3, 7, 9 и 11 резултирао је статистички значајно вишим ЛВДП-ом, 55, 57, 56, 57 и 66%, респективно; п <0, 05 Ни у једном случају ниједно од једињења није значајно смањило опоравак ЛВДП-а. Треба напоменути да нису примећене разлике у нивоима глукозе или телесне тежине међу групама (допунска табела С3).

Дискусија

Упркос опсежним доказима да РАГЕ-зависна модулација ћелијских својстава зависи од стимулације трансдукције сигнала, непосредни механизми који су били у основи РАГЕ сигнализације тек су недавно откривени. Отуда, откриће да је цтРАГЕ везан ДИАПХ1 и да је ДИАПХ1 потребан за ефекте стимулације РАГЕ лиганда у васкуларним и имуним ћелијама поставило је сцену за откривање потпуно нове класе антагониста пута РАГЕ. У тренутној студији, да резимирам; урадили смо тест повезивања високе пропусности да бисмо прегледали библиотеку мале молекуле са 58 000 једињења за идентификацију инхибитора интеракције цтРАГЕ са ДИАПХ1. Кроз низ одговора на дозу, НМР спектроскопијом и експериментима са титрацијом флуоресценције, идентификовали смо тринаест „хит“ једињења која су показала нм афинитет везања за цтРАГЕ и који су ометали комплекс цтРАГЕ-ДИАПХ1. Ин витро, ек виво и ин виво студије, ова једињења су показала инхибиторне ефекте на трансдукцију РАГЕ сигнала, ћелијску миграцију, експресију упалних гена и узроковану исхемијом поремећаја рада срца у изолованом перфузираном дијабетичком срцу. Нарочито, места која се преклапају преко једињења на цтРАГЕ могу подвући разлике у њиховој способности да интерферирају са функцијом РАГЕ (Сл. 1д, е). Иако су претходне студије сугерисале да се цтРАГЕ може везати за различите интрацелуларне ефекторске молекуле, као што је канцера повезана са екстрацелуларном киназом (ЕРК) или протеин-адаптер интерлеукин 1 рецептора (ТИР) 46, 47, без инхибитора интеракције ових интрацелуларних мета са цтРАГЕ још увек нису показали ин виво доказе супресије ћелијске стимулације посредоване РАГЕ лигандом, као што је овде илустровано. Недавни извештај описао је стварање пептида инхибитора цтРАГЕ; међутим, ефикасност пептида проучена је само у контексту сузбијања трансдукције сигнала ин витро анализама 48 .

Претходне студије су закључиле да цтРАГЕ носи унутрашњу флексибилност 24, 49, чиме се подвлачи структурна разноликост која је примећена међу тринаест једињења малих молекула идентификованих из библиотеке 58.000 једињења. Наши резултати сада потврђују идеју да флексибилни делови протеина могу послужити као валидна терапијска мета 50 . Примјетно је да су међу тих тринаест једињења структурне сличности неких од њих довеле до њиховог сврставања у различите „оловне серије“ насупрот јединственим структурно јединственим „синглетон“ цтРАГЕ-ДИАПХ1 инхибиторима.

Вероватно је да ће рањивост у једињењима која су идентификована у оригиналној библиотеци захтевати ублажавање у будућим студијама, као што су побољшање растворљивости, пропустљивости, стабилности, плазме и метаболичке стабилности и ин виво полу-живот, као и смањење потенцијалних токсичности услед непознатог одвајања. циљне активности. Иако нису примећене очигледне токсичности на ћелијским моделима или ин виво код ћелија или животиња које су третиране једињењем малог молекула 1–13, могуће је да ће дуготрајно давање изазвати могуће нежељене ефекте. У овом контексту, такође је могуће да обавезе у растворљивости и пропустљивости, нарочито ограничене ефикасности за нека једињења ин витро и ин виво. Будући правци који се активно одвијају укључују ригорозно унапређивање односа у структури активности хемијски различитих група како би се оптимизирали ефикасност и физичке карактеристике једињења потребних за лечење.

Циљање интеракција цтРАГЕ-ДИАПХ1 укључује развој ППИ-а. За разлику од различитих ППИ инхибитора заснованих на пептиду, код којих имуногеност и протеолитичка дигестија средстава могу представљати значајну препреку 51, посебно у упаљеним болесним срединама, садашњи приступ који је овде предложен користи једињења малих молекула као претпостављене инхибиторе интеракције цтРАГЕ са ДИАПХ1. Заправо, Схенг и његове колеге недавно су прегледали стање на овом пољу 52 и истакли бројна недавна клиничка испитивања, која су открила употребљивост инхибитора ППИ малих молекула у циљању рака или очних поремећаја. У тим успешним примерима, мали молекули ППИ инхибитори имају упоредиви афинитет према природним протеинима везивима.

Образложење за блокаду преноса РАГЕ сигнала подржано је радом на разним предклиничким моделима болести као што су дијабетес и његове компликације, Алзхеимерова болест 53, 54, кардиоваскуларна болест 42, 44, 55, 56, имуно / упални поремећаји 57, 58 и рак 59, 60, као примери. РАГЕ лиганди се накупљају у овим условима и стога њихов допринос патогенези ћелијске дисфункције и оштећења ткива код ових болести може у коначници бити ублажен модулацијом РАГЕ сигнализације.

На крају, напомињемо да су терапеутске могућности у вези с патобиологијом РАГЕ-а привукле значајну пажњу у научној заједници. Поред стратегија које циљају директни антагонизам РАГЕ блокадом везања лиганда на РГЕ екстрацелуларни домен типа В, као што су азелирагон (у фази 3 клиничка испитивања) 61 и ФПС-ЗМ1 27, могу се добити и други приступи, попут растворљивих молекула типа РАГЕ бити од користи. У овом другом случају се постулира да се применом растворљивих (и) РАГЕ секвестра РАГЕ лиганда, спречавајући тако лиганди у интеракцији са ћелијским површинским рецептором 38, 62 . Међутим, мора се приметити да као што је рецептор промискуитетан, тако су и лиганди. Могућност да сРАГЕ модулира адаптивне функције подскупине ових РАГЕ лиганда у свом везању за различите корисне рецепторе ћелијске површине, треба да се размотри у будућим студијама. Без обзира на ова разматрања, постоје докази који сугеришу накупљање сРАГЕ у плазми / серуму хуманог субјекта, ако не и терапијским деловима, заиста могу бити корисни биомаркери РАГЕ активности и станичне узнемирености 63, 64 . Степен до којег инхибиција трансдукције РАГЕ сигнала, као што је овде постављени приступ, као и комбиноване стратегије за ове РАГЕ приступе, остаје да се утврди и даље је предмет активних, текућих истрага.

Укратко, изводљивост циљања трансације РАГЕ сигнала сведочи следећим разматрањима: прво, наши објављени подаци указују на то да је површина интеракције РАГЕ са ДИАПХ1 мала, мања од 200 А2, и да је стога циљна стратегија малог молекула; друго , упркос упозорењима у погледу растворљивости, пермеабилности, стабилности и полуживота, многа од тринаест једињења идентификованих у оригиналној библиотеци, која су показала нм афинитет према цтРАГЕ, показала су ефикасност у блокирању РАГЕ лиганда, али не и РАГЕ-неовисних стимулиса- посредована функција. Закључујемо да ова идентификована једињења имају значајан потенцијал као скеле за дрогу за даљи развој у лечењу поремећаја повезаних са РАГЕ.

Методе

Тест пробира високе пропусности

Антитела ДИАПХ1 (Санта Цруз Биотецхнологи, Даллас ТКС), 62, 5 нг / бунар, припремљено је као разблаживање 1: 160 у 0, 1М На2Ц03 пХ = 9, 6; крајња запремина, 0, 05 мл, и нанесено на јажице плоча од 384 јажице 16 сати на 4 ° Ц. Плоче су испране ПБС-ом, а затим је блокирано 1, 5 сати говеђег серумског албумина (БСА) (3%) (0, 1 мл / удубљење) на собној температури. Следило је испирање са ПБС и додавање хуманог ћелијског лизата ХеЛа (извор ДИАПХ1), 10 µг / бунар, током 3 сата на собној температури. Бунарке су испране ПБС-ом, а затим су третиране 2 х тест тест малим молекулима Цхембридге-ове библиотеке ДИВЕРСет Цт488 (крајња концентрација, 10 µМ) и ГФП-цтРАГЕ (крајња концентрација, 64, 5 µМ) током 2 сата на собној температури. Испитна једињења су додата из оригиналних библиотечких плочица коришћењем ЈАНУС Аутоматизоване радне станице (Перкин Елмер, Валтхам, МА). Везање ГФП-цтРАГЕ на ДИАПХ1 одређено је у ЕнВисион Мултилабел Реадер-у (Перкин Елмер, Валтхам, МА) и резултати су нормализовани како је описано у Додатној табели С1. Сва испирања плоча извршена су коришћењем Модел Елк405 (Био Тек, Винооски, ВТ).

Експерименти с титрацијом флуоресценције

Експерименти са флуоресценцијом нативног триптофана изведени су коришћењем флуоријског спектрофлуорометра Хориба Јобин Ивон Ивон. 97 једињења из библиотеке која су прошла ЕЛИСА скрининг коришћена су у експериментима са флуоресцентном титрацијом. 1 мМ једињења из библиотеке је растворено у 10 мМ фосфатном пуферу [пХ 7.0] и 50% ДМСО. цтРАГЕ је био бактеријски експримиран и пречишћен како је описано 24 . 10 нМ раствор цтРАГЕ појединачно је титран од 0, 1 нМ-100 µМ са једињењима у 100 µЛ 10 мМ фосфатног пуфера [пХ 7, 0] и 5% ДМСО. Таласне дужине побуде и емисије биле су 280 нм и 352 нм. Константе дисоцијације, Кд, процењене су из промена интензитета највеће флуоресценције као функције концентрације слободног једињења коришћењем софтвера Присм 5 (ГрапхПад). Подаци су одговарали једначини, (Ф - Ф 0 ) / Ф мак = [једињење] / (К д + [једињење]) где је Ф интензитет флуоресценције у датој концентрацији једињења, Ф 0 је интензитет флуоресценције у слепој слици, а Ф мак је максимални интензитет флуоресценције.

НМР спектроскопија

НМР експерименти су изведени на Брукер Аванце ИИИ спектрометрима опремљеним криопрондом, који раде на 1 Х фреквенцијама од 500 МХз и 700 МХз. 97 једињења из библиотеке која су прошла тест ЕЛИСА коришћена су у НМР експериментима. НМР узорци су садржали 50 μМ реп [ У- 15 Н] РАГЕ и 10 μМ библиотечког једињења у 10 мМ фосфатном пуферу [пХ 7, 0] и 5% д6 -ДМСО. Сви спектри су сакупљени на 298 К, ​​што је дало висококвалитетне НМР спектре [ У- 15 Н] цтРАГЕ 24 . Користили смо Ватергате верзију 1 Х { 15 Н} едитираног хетеронуклеарног једносмерног квантног кохеренција (ХСКЦ) експеримента 65, снимљеног са 64 прелазних рачунара као 512 × 64 сложених тачака у димензијама протона и азота, аподизираних квадратом прозора косинуса и звона функција и испуњена нула на 1024 × 128 бодова пре Фоуриерове трансформације. Одговарајуће ширине прекривања биле су 12 и 35 ппм у димензијама 1 Х и 15 Н, респективно. Спектри су обрађени помоћу програма ТОПСПИН 2.1 (Брукер, Инц), а програм ЦАРА 66 коришћен је за спектралну анализу. Хемијске смене [ У- 15 Н] цтРАГЕ су додељене 24 . Да доделимо [ У- 15 Н] РАГЕ репних врхова који су променили положај услед сложених формирања, претпоставили смо минималне промене хемијског померања 67, израчунато као ΔΩ = ((ΔΩ ХН ) 2 + (0.25 * ΔΩ Н ) 2 ) 1/2, где Ω НХ и Ω Н представљају амидне хемијске смене водоника и азота. Промене вршног интензитета израчунате су као: (И / И реф ) без - (И / И реф ) комплекса, где сам индивидуални вршни интензитет, а реф је максимални интензитет глутамина од 7, 45 ппм и 112, 5 ппм у протону и димензије азота, односно које се не померају током титрације.

Вестерн блоттинг

Укупни протеински екстракти су припремљени из примарних ћелија глатких мишића аорте мишје користећи пуфер ћелије за лизу (Целл Сигналинг Тецхнологи, Беверли, МА). Једнаке количине протеина (30 µг / узорак) подвргнуте су СДС-ПАГЕ (4–12%) након чега је уследио електрофоретски пренос на нитроцелулозне мембране. Неспецифично везивање блокирано је 1 х инкубацијом мембрана са БСА (5%). Блот је инкубиран са једним од следећих антитела као примарно антитело за реакцију: анти-фосфо-ЕРК1 / 2 (П-ЕРК1 / 2) ИгГ, анти-тотал-ЕРК1 / 2 (Т-ЕРК1 / 2) ИгГ, анти-фосфо-АКТ (П-АКТ) ИгГ и анти-тотал-АКТ (Т-АКТ) ИгГ (Целл Сигналинг Тецхнологи). Свако примарно антитело је коришћено у разблажењу од 1: 1, 000 током ноћи на 4 ° Ц према упутствима произвођача. Секундарна антитела везана за хрен пероксидазу (1: 2, 500; Амерсхам Биосциенцес) коришћена су за идентификовање места везања сваког примарног антитела.

Ћелијска култура и ин витро испитивања на узгојеним СМЦ

Мишични васкуларни СМЦ култивисани су из аорте мушких мишева старих 10 недеља користећи модификацију поступка Траво и Баррет 68 . СМЦ су узгајане према протоколу експланта у складу са институционалним смерницама. Мишичне аортне васкуларне СМТ дивљег типа изоловане су и коришћене између пасажа 8 до 12. Ћелије глатких мишића аорте аорте купљене су из Америчке колекције култура типова (АТЦЦ, Манассас, ВА) и узгајане у складу са методама које препоручује АТЦЦ. Мишеви примарног аортног ендотелног ћелија у мишића били су од мишева дивљег типа Ц57БЛ / 6Ј старијих од 6-8 недеља (Јацксон Лабораториес, Бар Харбор МЕ) и коришћени су у пасусу 10 69 . ТХП-1 ћелије су добијене из америчке колекције типичних ткива (АТЦЦ, Манассас ВА) и коришћене су према упутствима произвођача.

Квантитативни ПЦР у реалном времену

Укупна РНА је екстрахована из ћелија и ткива коришћењем РНеаси липидног комплета (Киаген, Хилден, Немачка). цДНА је синтетизована са МултиСцрибе реверзном транскриптазом (Апплиед Биосистемс, Фостер Цити, ЦА). Квантитативна ПЦР у реалном времену изведена је методом ТакМан (50 ° Ц током 2 мин, 95 ° Ц 10 мин и 40 циклуса од 95 ° Ц током 15 с и 60 ° Ц током 1 мин) са прелиминарним сетима прајмера (Примењено Биосистеми). Релативно обиље транскрипта нормализовано је према експресији 18С рРНА (за људске ћелије) или β-актина (за мишје ћелије и ткива) коришћењем ΔΔЦт методе. У допунској табели С4 наведени су специфични прајмери ​​који су коришћени у наведеним студијама.

Миграција мишићних ћелија

Миграција као одговор на РАГЕ лиганд ЦМЛ-АГЕ (ЦМЛ, 10 μг / мл) или општи ефектор, а не РАГЕ лиганд, ПДГФ-ББ, 10 нг / мл (Р&Д системи, Миннеаполис, МН, УСА) је процењена са рана тест. Ћелије су узгајане до ушћа у плоче са 12 јажица и гладовале су преко ноћи. Следећег јутра уклоњен је медијум без серума и додата су једињења 1–13. Одмах након додавања једињења, вишеслојни слој је рањен помоћу п200 врха пипете и једињењима је остављено да се инкубирају 1, 5 х. Након ове инкубације, сва једињења су уклоњена и током 7 х додан је свежи медијум који садржи РАГЕ лиганд или општи ефектор, ПДГФ-ББ. Ћелије су одржаване на 37 ° Ц и 5% Ц02. Слике су добијене на Т0 и Т7. Свака слика је измерена и израчуната је површина у којој се формирају ефективне миграционе ћелије.

Студије на животињама

Све поступке са животињама одобрили су институционални одбори за заштиту животиња и употребу животиња с Универзитета Цолумбиа и њујоршки универзитет и спровели их у складу са смерницама Националног института за здравствену заштиту животиња. Специфични експерименти на мишевима описани су у наставку.

Изоловано перфузирано срце и мерење срчане функције

Мушки мишеви Ц57БЛ / 6, узраста од 8 до 12 недеља, набављени су у лабораторији Јацксон и дијабетичаре 55 мг / кг интраперитонеалним путем стрептозотоцина (СТЗ) (Сигма Алдрицх, Ст. Лоуис МО) дневно у свежем цитратном пуферу ( 0, 05 мол / л; пХ 4, 5) током 5 узастопних дана. Контролни мишеви су сами примили цитратни пуфер. Мишеви који показују глукозу у серуму ≥250 мг / дл сматрани су дијабетичарима. Животиње су жртвоване у дијабетесу у просеку од 37 до 45 дана. Експерименти су изведени користећи изоволумски препарат у облику миша као што смо претходно објавили 70, 71 . Након што је постигнута дубока анестезија, срца су брзо изрезана, стављена у ледени хладни Кребс-Хенселеит пуфер и затим ретроградно перфузирана модификованим Кребс-Хенселеит пуфером који садржи (у мМ) НаЦл 118, КЦл 4, 7, ЦаЦл 2 2, 5, МгЦл 2 1, 2, НаХЦО 3 25, глукоза 5, палмитат 0, 4, албумин говеђег серума 0, 4 и 70 мУ / Л инсулина, на 37 ° Ц, у режиму без рециркулације кроз аорту. Перфусат је уравнотежен са мешавином 95% О2 -5% ЦО2, која је одржавала перфусат ПО2> 600 мм Хг. Притисак развијен левим вентрикуларима (ЛВДП) мерен је помоћу балона од латекса у левој комори и континуирано је праћен на АДИ диктафону. Сва срца миша подвргнута су 30 минута основног праћења, након чега следи 30 минута исхемије без протока и 60 минута реперфузије (И / Р). Испитна једињења су уведена 10 минута пре почетка исхемије и настављена током протокола реперфузије. Имајте на уму да су након потврђивања дијабетеса мишеви насумично додељени групи за лечење. Допунска табела С3 приказује нивое глукозе у крви, телесну тежину и дане дијабетеса за све мишеве у додељеном комбинованом третману у односу на групе носилаца.

Инфузија ЦМЛ-АГЕ ин виво и ефекти једињења 1–13

Мушки, дивљи тип Ц57БЛ / 6Ј мишеви су купљени од Јацксон Лабораториес. У узрасту од 8 недеља, мишеви су претходно лечени са 4 дозе једињења 1–13, 5 мг / кг, интраперитонеалном применом два пута дневно, укупно два дана и четири укупне дозе. Контролни третман састојао се од ДМСО разблаженог у ПБС. Тридесет минута након последње дозе, интраперитонеални начин убризган је ЦМЛ-АГЕ (150 μг). 4 сата касније, мишеви су жртвовани и брзо је пронађено бубрежно ткиво за припрему мРНА и обављање квантитативног ПЦР у реалном времену за следеће транскрипте мРНА, Тнфа и Ил6.

Статистичка анализа

Сви подаци су изражени као средња вредност ± СЕМ. Статистички значај анализиран је непарним теста с двоструким репом користећи ГрапхПад Присм верзије 6.0ф за МацОС Кс, ГрапхПад Софтваре, Ла Јолла ЦА. п вредности <0, 05 су сматране статистички значајним.

Додатне Информације

Како цитирати овај чланак : Маниграссо, МБ ет ал. Инхибиција мале молекуле трансформације сигнала РАГЕ-ДИАПХ1 стимулиране лигандом. Сци. Реп. 6, 22450; дои: 10.1038 / среп22450 (2016).

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Додатне информације

Коментари

Подношењем коментара пристајете да се придржавате наших Услова и Смерница заједнице. Ако нађете нешто злоупотребно или то није у складу са нашим условима или смерницама, означите то као непримерено.