Структурна основа моћне унакрсне неутрализације протутијела на вирус зика-денга | природа

Структурна основа моћне унакрсне неутрализације протутијела на вирус зика-денга | природа

Anonim

Субјекти

  • Протеинске вакцине
  • Рендгенска кристалографија
  • Ерратум на овај чланак објављен је 14. септембра 2016

Апстрактан

Зика вирус је припадник рода Флавивирус који није био повезан са тешком болешћу код људи све до недавних епидемија, када је био повезан са микроцефалијом код новорођенчади у Бразилу и Гуиллаин-Барр синдромом код одраслих у Француској Полинезији. Зика вирус је повезан са вирусом денге, а овде извештавамо да подскупина антитела која циљају конформациони епитоп изолованих од пацијената са вирусом денге такође потенцијално неутралише Зика вирус. Кристална структура два од ових антитела у комплексу са протеином овојнице Зика вируса открива детаље сачуваног епитопа, који је такође место интеракције димера овојнице овојнице са протеином прекурсорске мембране (прМ) током сазревања вируса. Поређење имунокомплекса вируса Зика и денге даје водство за рационални, епитопски фокусиран дизајн универзалне вакцине способне да ствара снажна унакрсна неутрализујућа антитела да се истовремено заштите и од Зика и од инфекције вирусом денге.

Главни

Зика вирус (ЗИКВ) је обложени вирус који преноси артропод који припада роду Флавивирус у породици Флавивиридае , а који такође укључује патогене жуте грознице код људи, денге, западног Нила и вируса енцефалитиса који преносе крпељ 1 . Флавивируси имају два структурална гликопротеина, прМ и Е (за протеинске мембране и протеине овојнице), који формирају хетеродимер у ендоплазматском ретикулуу (ЕР) заражене ћелије и усмеравају пупољке шиљастих незрелих вириона у лумен ЕР. Те честице пролазе кроз ћелијски секреторни пут, током којег транс- Голги резидент протеазе фурин цепа прМ. Ова обрада је потребна за инфективност и резултира губитком великог фрагмента прМ и реорганизацијом Е на површини вириона. Зреле честице имају глатку димензију, са 90 Е димера, организованих икосаедарском симетријом, у облику „јагодице“ 2, 3 .

За тродимензионалне структуре криоелектронске микроскопије (крио-ЕМ) зрелих ЗИКВ честица недавно је објављено да се приближавају атомској резолуцији (3, 8 А) 4, 5, показујући да вирус у основи има исту организацију као и остали флавивируси познате структуре, попут вируса денге (ДЕНВ) 3 и вируса Западног Нила 6, 7 . Е протеин је дугачак око 500 аминокиселина, са 400 Н-терминалних остатака који творе ектодомену у основи пресавијених у β-листове са три домена, именована И, ИИ и ИИИ, поредани у низу са доменом И у центру. Очувана фузијска петља налази се на удаљеном крају штапа у домену ИИ, сахрањеног на интерфејсу Е димера. На крају Ц, ектодомену Е прати „стабљика“, која садржи две α-хелике које леже равно на вирусној мембрани (петељке) које се повезују са два Ц-терминална трансмембрана-α-хелицес. Главна одлика ЗИКВ вириона је уметање унутар гликозилиране петље Е ('150' петље), која стрши из површине зрелог вириона 4, 5 .

Флавивируси су груписани у серокомплексе на основу испитивања унакрсне неутрализације са поликлонским имунолошким серумима 8 . Е протеин је главна мета неутрализације антитела, а такође је и вирусни фусоген; цепање прМ омогућава Е да одговори на ендосомални пХ подвргавањем конформацијске промене великих размера која катализује фузију мембране и ослобађа вирусни геном у цитотосол. Губитак фрагмента прекурсора прМ омогућава Е протеину да варира из његовог чврстог паковања на површини вириона, привременим излагањем иначе укопаним површинама. Једна површина изложена овим 'дисањем' је епитоп фузијске петље (ФЛЕ), који је доминантно унакрсно реактивно антигено место 9 . Иако антитела на овом месту могу да се заштите механизмима посредованим комплементима, као што је приказано на моделу миша за вирус Западног Нила 10, они се слабо неутралишу и доводе до побољшања зависног од антитела 11, 12, 13, 14, 15, погоршавајући патогенезу Флавивируса. и компликовање развоја сигурних и ефикасних вакцина.

Недавно смо пријавили функционалну и структурну карактеризацију панела антитела изолованих од пацијената са денга болешћу 13, 16 . Већина ових антитела циља ФЛЕ, али друга циља квартарно место лако доступно на изложеној површини Е протеина на вириону, на интерфејсу између две Е подјединице у димеру. Ова широко неутрализирајућа антитела (бнАбс), названа ЕДЕ за Е-димер епитоп, потенцијално неутралишу сва четири ДЕНВ серотипа. Њихово везно место чува се преко серотипа, јер је такође место интеракције прМ са Е димерима током транспорта незрелих честица вируса кроз Голгијев апарат ћелије. Постојале су две подгрупе ЕДЕ антитела, за које је карактеристичан диференцијални захтев за гликозилацијом на петљи од 150 за везивање. ЕДЕ1 бнАбс се боље везује у одсуству гликана, док се ЕДЕ2 бнАбс боље везује када је гликан присутан.

У овом истраживању показујемо да ЕДЕ бнАбс неутралише ЗИКВ једнако снажно колико и неутралишу ДЕНВ. Такође налазимо да ФЛЕ антитела, која неутралишу ДЕНВ, иако не тако моћно као ЕДЕ бнАбс, не неутралишу ЗИКВ у концентрацијама до 1 µМ упркос високом афинитету за рекомбинантни протеин ЗИКВ Е. Надаље описујемо кристалне структуре димера протеина ЗИКВ Е сами и у комплексу са ЕДЕ1 Ц8 и ЕДЕ2 А11, идентификујући њихове везивне детерминанте.

ЗИКВ – ДЕНВ супер серогрупа

Филогенетске анализе главних патогених флавивируса људског порекла користећи аминокиселинске секвенце вирусне РНА полимеразе НС5 указују на групирање ЗИКВ-а са групом енцефалитских вируса који преносе комарци. Кластерирање је другачије када се узму у обзир аминокиселинске секвенце протеина Е, при чему се ЗИКВ грана са ДЕНВ групом (Сл. 1а). Ако се групирање секвенци прошири на антигену површину Е, антитела која умрежавају са неколико ДЕНВ серотипа такође би требало да се вежу за ЗИКВ Е. Да бисмо тестирали ову хипотезу, користили смо биопластну интерферометрију да проучимо својства везивања слабо неутралишујућих, унакрсно реактивних ФЛЕ антитела и снажно неутралишујући ЕДЕ антитела за рекомбинантни, растворљиви ЗИКВ Е ектодомен (ЗИКВ сЕ) произведен у ћелијама инсеката (види Методе). ФЛЕ антитело (П6Б10) веже се готово 10 пута јаче него ЕДЕ1 Ц8 (вредности привидне константе дисоцијације ( К д ) од 1, 5 нМ наспрам 9 нМ) и готово 1000 пута су чвршће од ЕДЕ2 А11 (слика 1б и проширени подаци Сл. 1а). У складу са њиховим афинитетима, могли бисмо изоловати комплекс ЗИКВ сЕ са Ц8 Фаб кроматографијом за искључивање величине, али не и А11 Фаб (проширени подаци Сл. 1б).

Image

а, Филогенетска стабла главних хуманих патогених флавивируса заснованих на аминокиселинским секвенцама протеина Е (лево) и полимеразног протеина НС5 (десно). Вектори артропода разликују се бојом позадине. ЈЕВ, јапански енцефалитис; МВЕВ, вирус енцефалитиса у долини Мурраи; ПОВВ, Повассан вирус; СЛЕВ, вирус енцефалитиса у Саинт Лоуису; ТБЕВ, вирус енцефалитиса са крпељима; ИФВ, вирус жуте грознице; ВНВ, вирус западног Нила. б, реактивност ЗИКВ сЕ са људским рекомбинантним антителом целе дужине ФЛЕ П6Б10, ЕДЕ1 Ц8 и ЕДЕ2 А11. Лева, везујућа својства праћена су биопластном интерферометријом (БЛИ) на Октет-Ред (ФортеБио). Нормализоване вредности одзива, изражене као део заузетости места везања, графички су приказане у односу на концентрације ЗИКВ сЕ димера приказане на логаритамској скали. Линије означавају прилазе глобалне криве који се користе за вредновање Кд (видети проширене податке, Сл. 1а за линеарни распон концентрација који приказују погодне вредности засићења зависне од концентрације). Нормализоване вредности одзива изведене су из појединачних сензорских програма који показују својства везивања за ЕДЕ1 Ц8 измерена у различитим ЗИКВ сЕ концентрацијама.

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Тестови неутрализације у станицама бубрега афричког зеленог мајмуна (Веро) користећи ове и остале чланове три подгрупа антитела, показали су да антитела ЕДЕ1 снажно неутрализирају ЗИКВ, док су антитела ЕДЕ2 бар за један лог мање јача. Упркос свом јаком афинитету, П6Б10 није неутрализовао ЗИКВ у коришћеном распону концентрација, нити једно од другог тестирана ФЛЕ антитела (Сл. 2). ЕДЕ1 бнАбс је најбоље неутрализовао афрички сок ЗИКВ ХД78788, са половином максималне инхибиторне концентрације (ИЦ50) од око 0, 1 нМ. Овај сој током година прилагођен је ћелијској култури и пасиран је у мозак дојиља, а недостаје му Е гликозилације. ИЦ50 против соја ПФ13, изолованог у Француској Полинезији 2013. године и у којем је протеин Е гликозилиран на положају 154, био је у наномоларном распону и упоређиван са или нижим од оног у односу на четири серотипа ДЕНВ (Табела 1). ЕДЕ2 бнАбс није показао разлику у неутрализацији два соја, што сугерише да присуство Н154 гликана у протеину ЗИКВ Е не појачава интеракцију.

Image

Резултати представљају просек ± сем четири независна експеримента обављена у троструком примерку за ПФ13 и у дупликату за сојеве ХД78788. Два соја ЗИКВ су у светлим бојама, плавој и црвеној, респективно. Подаци о неутрализацији за четири ДЕНВ серотипа (испрекидане линије у бледо боји) преузети су из реф. 13, и овде су дате за поређење. Одговарајуће ИЦ50 вредности дате су у Табели 1. Имајте на уму да је коришћени сој ДЕНВ-4 био природни изолат на коме недостаје место гликозилације Н153 (Н - ).

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Табела пуне величине

ЗИКВ – ЕДЕ бнАбс имуни комплекси

Кристализирали смо невезано ЗИКВ сЕ и комплексе ЗИКВ сЕ са ЕДЕ1 Ц8 и ЕДЕ2 А11 са једноланчаним Фв (сцФв) и Фаб фрагментима (Табела 1 проширених података). У структури невезаног ЗИКВ сЕ наручује се 150 петља, за разлику од неглиликолиране 150 петље у недавно утврђеној структури протеина који се ствара у бактеријама и поново се поново ин витро 17 . За разлику од протеина који се излучује у станицама инсеката, а који је димер (Проширени подаци, слика 1б), реположени протеин је мономерни у раствору, што сугерише да гликан може помоћи у структури петље и подстаћи сЕ димеризацију.

Антитела препознају квартарни епитоп у ЗИКВ сЕ димеру на исти начин као што препознају ДЕНВ серотип 2 (ДЕНВ-2) сЕ димер описан раније 16 . Остаци аминокиселина који учествују у контактима, и за ЗИКВ и за ДЕНВ-2 структуре, приказани су у проширеним подацима Слика 2. Као што се и очекивало, образац је врло сличан, са неколико разлика истакнутих црвеним оквирима у Ектендед Дата Фиг. 2б. Оба епитопа у сЕ димеру су заузета у случају комплекса са Ц8 (Сл. 3а), док је у случају А11 заузет само један (Сл. 4а). Испитивање кристалне околине показало је да се други Фаб не може усидрити на овом положају без сударања са суседним комплексима у кристалу. Ово запажање показује да је раст кристала одабран за уградњу сЕ димера са једном Фаб везом, што је олакшано ниским афинитетом А11.

Image

а, укупни поглед на комплекс, са сЕ делом обојеним по доменима (И, ИИ и ИИИ у црвену, жуту и ​​плаву боју); антитела у сивој и тамно зеленој боји за лагане и тешке ланце, респективно. ЦДР-и су обојени (Х1, светло плава; Х2, песак; Х3, ружичаста; Л1, светло сива; Л2, магента; Л3, наранџаста). Уложак показује поређење са одговарајућим комплексом ДЕНВ-2. Ради јасноће, променљиви регион фрагмента Ц8 Фаб комплекса ДЕНВ-2 сЕ-Ц8 је нанесен на Ц8 сцФв у комплексу са ЗИКВ сЕ да би нацртао Фаб оси и боље показао углове прикључења. б, Зум интеракције ЗИКВ сЕ-Ц8 како би се показало препознавање б- нити. Водикове везе приказане су као испрекидане линије, а имобилисани молекули воде као црвене сфере. ц, Исто подручје на комплексу ДЕНВ-2 сЕ – Ц8 Фаб. Имајте на уму да Н67 гликан на ДЕНВ такође делује са антителом. д, отисак ЕДЕ1 Ц8 приказан је на ЗИКВ сЕ димеру приказаном на површинској репрезентацији (гледајући ван вириона) обојеном према очувању површински изложених аминокиселина. Атоми из главних и сачуваних бочних ланаца су наранџасти, врло слични бочни ланци су жути, а сви остали су бели. е, ф, Отисци стопала ЕДЕ1 Ц8 на површинском приказу ЗИКВ сЕ ( е ) и ДЕНВ-2 сЕ ( ф ) приказани су љубичастом бојом. ФЛ, фузијска петља. Два протомера сЕ у димеру су светла и тамно сива. Означене су одговарајуће антигене сЕ регије. Имајте на уму да је више ограничена интерактивна површина у ЗИКВ сЕ димеру него у ДЕНВ-2, на пример, Н67 гликан није присутан у ЗИКВ сЕ.

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Image

Кодирање у боји је као на слици 3. а, укупни приказ комплекса, са само једним Фаб-ом везаним за сЕ димер, захваљујући кристалном паковању. Испрекидана елипса представља положај несталог А11 Фаб-а. Уметак упоређује угао везивања за сЕ димер у ЗИКВ и у ДЕНВ-2. б, ц, Интеракције на ланцу б у ЗИКВ-у (лево) и у ДЕНВ-2 (десно). Обратите пажњу на различити угао б- ланца у односу на антитело (антитело је у потпуно истој оријентацији на оба панела). д, е, зумирање гликана на петљи од 150 за ЗИКВ сЕ ( д ) и за ДЕНВ-2 сЕ ( е ), са бројевима остатака шећера описаним у кључу. ЦДР Х3 хелик је предалеко да би вршио интеракције са гликаном, као што је случај у структури ДЕНВ-2 (види проширене податке, слике 2б и 5б).

Слика пуне величине

  • Преузмите ПоверПоинт слајд

Прикључак бнАбс на ЗИКВ сЕ под различитим угловима од оних на ДЕНВ-2 сЕ (види уметање на сликама 3а и 4а). У случају комплекса Ц8, разлика у пристајању резултат је углавном измењене закривљености сЕ димера. Примјећујемо да је конформација ЗИКВ сЕ у комплексу са антитијелима врло слична оној коју прихвата на вирусној честици, са отприлике 1, 5 А коријенским средњим одступањем (рмсд) за 790 Цα атома (види Табела 2 проширене податке). Овде невезани ЗИКВ сЕ кристализован показује удаљенију конформацију (2, 5 А рмсд у поређењу са вирионом ЗИКВ Е и било ком комплексом сЕ антитела), што сугерише да антитела стабилишу конформацију блиску оној на вирусној честици. Супротно томе, исте поређења учињена за ДЕНВ-2 сЕ, сама или у комплексу са бнАбс, резултирају рмсд вредностима 5–7 А у односу на Е конформацију на ДЕНВ вириону посматрану од стране црио-ЕМ 3 . За поређење, суперпозиција ектодомаина вириона Е из ЗИКВ 5 и ДЕНВ-2 (реф. 3) резултира сличном 1, 5 р рмсд вредности, што указује да су они представљени отприлике на исти начин, али да је ДЕНВ сЕ више деформабилан у решење. Ова попустљивост може одражавати конформацијско дисање за које је пријављено ДЕНВ Е 18 . Уместо тога, ЗИКВ сЕ остаје у сличној конформацији у одсуству интеракције са основним α-хеликалима стабљике и са М протеином (мембрански усидрен остатак прМ након фуриновог цепања) на вириону, у складу са већом стабилношћу недавно описане ЗИКВ честице 4 .

ЕДЕ1 Ц8 комплекс

Укупна покопана површина ЕДЕ1 Ц8 у комплексу са ЗИКВ сЕ износи око 900 А2, у поређењу са око 1300 А 2 у комплексу ДЕНВ-2 сЕ (Табела 3 проширених података). На слици 3д приказана је очуваност епитопа, а на слици 3е и ф упоређује се отисак Ц8 на ЗИКВ и ДЕНВ-2 сЕ. ДЕНВ-специфични гликон на положају Н67, који је наручен у ДЕНВ-2 сЕ структури (Сл. 3ц), представља око две трећине укупне разлике у површини отиска. Гликан Н67 у интеракцији је с оквирном регијом 2 тешког ланца (ФРХ2), а његово одсуство у ЗИКВ сЕ показује да ти контакти нису неопходни за везивање. Кључни скуп интеракција који се одржава усредсређен је на β-низ б домена ИИ, при чему бочни ланци из региона који одређују комплементарност (ЦДРс) Х2, Х3 и Л3 препознају све расположиве доноре водоничне везе (карбонила главног ланца) и акцепторе ( карбонили главних ланаца) бдц β-ивице (Сл. 3б, ц). Поред тога, главни ланац фузијске петље (који садржи неколико глицинских остатака) и дисулфидна веза између Цис74 и Цис105 су уоквирени ароматским бочним ланцима ЦДР-а Л1 и Л3 (видети такође проширене податке Сл. 3). Остаци из ова два ЦДР-а такође препознају строго очуване бочне ланце фузијске петље (Арг99) или оближње остатке (Глн77).

Преко интерфејса димера, као и у комплексу са ДЕНВ-2, петља од 150 је делимично неуредна, без детекције густине за гликан Н154 (Сл. 3а и проширени подаци Сл. 3д). Као што је приказано на проширеним подацима Сл. 3, остаци у интеракцији на димералном сучељу су различити, што одражава ограничену заштиту секвенци у овим регионима протеина Е: у комплексу ДЕНВ-2 сЕ ови контакти су са остацима из β-нити А и Б домена ИИИ, али у ЗИКВ углавном укључују Лис373 из β ланца Е који комуницирају са ЦДРс Л1 и Л2, путем мреже директних или воде посредованих водоничних веза (Проширени подаци Сл. 3б, ц). Слично томе, неколико набијених остатака у домену И и из оближње кл петље домена ИИ преко интерфејса, доприносе везању и интеракцији са ЦДР-овима тешког ланца Х2 и Х3 (проширени подаци Сл. 3е, ф). Све поларне интеракције између Ц8 и ЗИКВ сЕ наведене су у проширеним табелама података 4 и 5, а електростатичка површина епитопа приказана је на проширеним подацима Сл. 4, леви панел. Укратко, ова запажања идентификују сачувани скуп контаката са б струком и фузијском петљом у домену ИИ као главне одреднице везивања Ц8, са додатним контактима преко интерфејса димера - или из Н67 гликона у ДЕНВ - даљем стабилизацији, али не одређује интеракцију.

ЕДЕ2 А11 комплекс

Проширени подаци Сл. 4 упоређују отисак Ц8 и А11 на ЗИКВ сЕ, заједно са површинским електростатичким потенцијалом комплекса, који показује снажну основну закрпу на сЕ у Ц8 комплексу због поремећаја 150 петље. Као што је приказано у проширеним подацима Сл. 5, Ц8 би се сукобио са гликаном да је петља остала на месту, као што је то био случај у комплексу са ДЕНВ-2 сЕ 16 . У комплексу А11, 150 петља остаје у истој конформацији као у крио-ЕМ структурама вириона (проширени подаци Сл. 5а) и у рендгенској структури гликозилираног невезаног сЕ, који је овде пријављен. У комплексу ДЕНВ-2 сЕ-А11, гликон се препознаје по α-хелику у дугој петљи ЦДР Х3 (Сл. 4е). Разлика у дужини у 150 петљи Е у ЗИКВ-у у поређењу са ДЕНВ-ом помера положај гликана за око 6–7 А, тако да не може извршити исте интеракције са ЦДР Х3 α-хелик (слика 4д, е и проширени подаци Сл. 5б). Као последица тога, антитело А11 пристаје под другачијим углом на ЗИКВ сЕ него на ДЕНВ-2 сЕ, чак рачунајући и разлику у закривљености сЕ димера (слика 4а, инсет). Контакти дуж б низа су сачувани (Сл. 4б, ц). У поређењу са Ц8, лан б се препознаје само по половини његове дужине (остаци 71 и 73), док Ц8 препознаје све време, од остатка 68 (или од 67 у ДЕНВ).

Дискусија

Наши резултати идентификују структурне детаље квартарног епитопа који обезбеђује претходно непризнату везу моћне унакрсне неутрализације између вируса Зика и денга, и на тај начин идентификују антигени кластер Флавивируса изван традиционалних серокомплекса. Ова веза дефинише супер серогрупу на основу снажне унакрсне неутрализације кроз сачувани епитоп који није препознат помоћу поликлонског серума 8 . Овај налаз на тај начин уводи могућност развоја универзалне вакцине која штити од вируса из ове групе.

Дизајн вакцине против вируса денге кочи се хетерогеношћу ДЕНВ честица и потребом коришћења поливалентних формула за имунизацију против сва четири серотипа 19, 20 . Једна од карактеристика ДЕНВ-а је да он подвргава некомплетном цепљењу принова фурином прМ у многим типовима ћелија, што ствара хетерогене честице мозаика са незрелим шиљастим фластером на једној страни и глатком зрелом регионом на супротној страни 21 . Ове честице су заразне, јер се могу стопити са ћелијском мембраном кроз глатку, зрелу страну. Пошто је ФЛЕ изложен у незрелим регионима 22, већина одговора антитела код пацијената заражених ДЕНВ-ом је усмерена против њега 23 . Та унакрсна реактивна антитела прекривају честице на незрелој страни 22, али се неутралишу само слабо, јер могу везати зрелу страну тек када Е протеин „дише“ 24, 25, 26 . Недавно објављена структура мономерних ЗИКВ сЕ у комплексу са ФЛЕ-специфичним моноклонским антитијелом миша ниске неутралишуће активности заиста показује да би његово место везања било укривљено у димерни Е протеин на зрелим инфективним вирионима 17 . Запажање да П6Б10 и друга ФЛЕ антитела још увек неутралишу ДЕНВ 13 сугерише да Е у зрелим закрпама на ДЕНВ троши више времена у конформацијама које откривају ФЛЕ него Е у тим закрпама на ЗИКВ. Овај закључак је у складу са већом термичком стабилношћу ЗИКВ-а који је недавно известен 4 .

Наши резултати сугеришу да је епитоп који циља ЕДЕ1 бнАбс боље погодан за развијање вакцине фокусиране на епитопе против вируса у супер серогрупи ЗИКВ / ДЕНВ него ФЛЕ, која индукује антитела која јако неутралишу и снажно повећавају инфекцију 12, 13, 14 . ЕДЕ1 је такође прикладнији од сродног ЕДЕ2 епитопа: иако је за ЕДЕ1 бнАбс потребан Е димер за везање, стварне детерминанти везивања су усредсређене на б прамен и на високо очуване елементе фузијске петље изложене Е-димеру, што показује поређење између њиховог везивања на ДЕНВ-2 и ЗИКВ сЕ. Чињеница да се ЕДЕ2 бнАбс у великој мери ослањају на њихове контактне тачке на суседној подјединици - на променљивој 150 петљи у којој гликозилација није увек присутна - недостатак је, што показује и њихов слаби афинитет (слика 1) и снажна индукција антитела. -зависно побољшање 12 .

Циљање б- ланца и елемената изложености Е-димеру фузијске петље изгледа као снажна алтернатива мулти-имуногеним приступима против ДЕНВ кластера који су имали ограничен успех у клиничким испитивањима 27 . Како ланац Е протеинског полипептида не приказује нити убацивања нити брисања у региону б ланца за било који медицински релевантан Флавивирус, овај регион представља низак ризик од индукције мутација бекства, највероватније јер је такође место интеракције са прМ током сазревања вируса. Коначно, у непосреднијој примени, наша студија такође указује да би антитела ЕДЕ1, која можда носе мутацију 'ЛАЛА' 28 ако се желе избећи ефекторске функције, могла бити корисна за имунолошку профилаксу за труднице са ризиком од заразе ЗИКВ инфекцијом.

Методе

Нису кориштене статистичке методе за одређивање величине узорка. Експерименти нису били насумични и истражитељи нису били заслепљени распоређивањем током експеримената и процене исхода.

Рекомбинантна производња ЗИКВ сЕ протеина

Рекомбинантни Зика вирус сЕ протеин (сој Х / ПФ / 2013, ГенБанк приступни број КЈ776791) произведен је са тандем стреп-тагом у Дросопхила Екпрессион Систем (Инвитроген) као што је претходно описано 29, 30 . Хемијски синтетизовани фрагмент ДНК (ГенеАрт) који садржи Зика сЕ секвенцу (аминокиселине 1-408) је клониран у експресијски вектор пТ389 (реф. 31) који кодира извозну сигналну секвенцу БИП, место цепања ентерокиназе и стреп-ознаку. Ћелије Дросопхила Сцхнеидер 2 (С2) су стабилно трансфициране користећи бластицидин за селекцију. Експресија протеина је индукована додатком ЦуСО4, а супернатанти су сакупљени 7-10 дана након индукције. Антигени су пречишћени афинитетном хроматографијом са Стрептацтин колонама (ИБА) према упутствима произвођача. Завршни корак филтрације гела за пречишћавање користио је Супердек повећани степен 200 10/300 ГЛ, уравнотежен у 50 мМ Трис, пХ 8, 500 мМ НаЦл.

Производња фрагмената за везивање антигена (Фаб) и сцФв бнАбс

Фрагменти бнАб су клонирани у плазмиде ради експресије као Фаб 32 и сцФв 33 у ћелијама Дросопхила С2. Конструкти садрже тандем стреп-ознаку спојену на Ц крају (само тешког ланца у случају Фаб-а) за афинитетно пречишћавање. Протокол пречишћавања укључује афинитетну колону Стрептактина праћену гел филтрацијом као што је горе описано.

Експресија хуманих моноклонских анти-ДЕНВ Е антитела

Потпуна ИгГ антитела су произведена у ћелијама 293Т (поклон Ц. Лее), које нису биле контаминиране микоплазмом тестираним помоћу КитР за откривање Мицопласма ПЦР (Сигма МП0035). Те ћелије су кофефициране плазмидима који садрже тешки и лаки ланац имуноглобулина Г1, као што је претходно описано 13 .

Формирање и изолација имуног комплекса

Пречишћени ЗИКВ сЕ протеин је помешан са Фаб А11 или сцФв Ц8 (у приближно двоструком моларном сувишку) у стандардном пуферу (500 мМ НаЦл, Трис 50 мМ, пХ 8.0). Запремина је доведена на 0, 5 мл центрифугирањем у одсеку Виваспин 10 кДа; после 30-минутне инкубације на 4 ° Ц, комплекс је одвојен од вишка Фаб или сцФв хроматографијом за искључивање величине за ЗИКВ сЕ и сцФв Ц8. За ЗИКВ сЕ и Фаб А11, у кроматографији за искључивање величине није се могло видети очигледно комплексно стварање; стога је за кристализацију директно коришћен раствор који садржи сЕ у концентрацији од 1, 5 мг мл -1 и Фаб А11 у концентрацији од 3 мг мл -1 (што одговара моларном односу ~ 1: 2 антиген: антитело). У свим случајевима, пуфер је измењен у 150 мМ НаЦл, 15 мМ Трис, пХ 8, ради испитивања кристализације. Концентрације протеина коришћене за кристализацију, утврђене мерењем апсорпције на 280 нм и коришћењем коефицијента истискивања процењених из аминокиселинских секвенса, наведене су у Табели 1 проширених података.

Тестови везивања интерферометрије за биопласте у реалном времену

Интеракције прочишћеног протеина ЗИКВ Е са ИгГ ФЛЕ П6Б10, ИгГ ЕДЕ1 Ц8, ИгГ ЕДЕ2 А11 и контролним ИгГ 28Ц (вирусом против грипа) праћени су у реалном времену помоћу био-слојне интерферометрије Оцтет-Ред384 уређаја (Палл ФортеБио ). Биосензори за хватање ИгГ Фц заробљавања (Палл ФортеБио) су напуњени 10 мин при брзини трешања од 1000 о / мин коришћењем антитела на 5 μг мл -1 у испитиваном пуферу (ПБС плус 0, 2 мг мл -1 БСА и између 0, 01%). Невезана антитела су испрана током 1 мин у пуферу за испитивање. Сензори који су оптерећени ИгГ су затим инкубирани током 15 мин при 1200 обртаја у одсуству и присуству двоструко серијски разређених концентрација протеина ЗИКВ сЕ у пуферу за анализу. Моларне концентрације израчунате су за сЕ протеин у димерном облику. За антитела ФЛЕ П6Б10, ЕДЕ1 Ц8 и ЕДЕ2 А11 коришћени су следећи распони концентрација ЗИКВ сЕ: 0, 78–50 нМ, 3, 125–200 нМ и 50–3, 200 нМ. Референтни експерименти везивања изведени су паралелно на сензорима оптерећеним контролним ИгГ 28Ц. Дисоцијација формираних комплекса је затим праћена током 10 минута потапањем сензора у само пуфер за испитивање. Радна температура је одржавана на 25 ° Ц. Подаци у реалном времену анализирани су коришћењем Сцруббер 2.0 (Биологиц Софтваре) и Биаевалуације 4.1 (ГЕ Хеалтхцаре). Специфични сигнали су добијени двоструким референцирањем, односно одузимањем неспецифичних сигнала мерених на неспецифичним сензорима оптерећеним ИгГ и сигналима пуфера на специфичним ИгГ оптерећеним сензорима. Профили асоцијације и дисоцијације, као и устаљени сигнал у односу на кривуље концентрације, постављени су уз претпоставку модела 1: 1 везивања.

Одређивање кристализације и Кс-зрака

Услови кристализације и крио-хлађења за прикупљање дифракционих података наведени су у Табели проширених података 1. Кристализација је изведена у седећим капи од 400 нл. Капи су формиране мешањем једнаких количина раствора протеина и резервоара у Греинер плочама са 96 јажица, коришћењем роба Москуито и надгледаног Роцк-Имагер-ом. Кристали су оптимизовани помоћу роботизованих уређаја за израду матрикса и комараца на 400 нл седећим или висећим капијима или ручно у плочицама са 24 јажице користећи 2–3 µл висеће капи.

Због јаке анизотропије кристала (види резултате за анизотропију у Табели 1 проширених података), важан број кристала тестиран је на неколико линија снопа код различитих синхротрона (СОЛЕИЛ, Ст Аубин, Француска; ЕСРФ, Гренобле, Француска; СЛС, Виллиген, Швајцарска). Кристали који имају мање анизотропних података дифракције коришћени су за одређивање структура. Скупови података су индексирани, интегрисани, скалирани и спојени помоћу КСДС 34 и АИМЛЕСС 35 . Прелиминарни модел ЗИКВ сЕ протеина изграђен је из структуре ДЕНВ-2 сЕ (4УТА) користећи сервер хомологног моделирајућег сервера СВИСС-МОДЕЛ 36 . Структуре комплекса су затим одређене молекуларном заменом са ПХАСЕР-ом 37 помоћу модела претраживања наведених у Табели проширених података 1. АИМЛЕСС и ПХАСЕР програми кориштени су у пакету ЦЦП4 38 .

Програми ДЕБИЕ и СТАРАНИСО које је развио Глобал Пхасинг Лтд примењени су на податке скалиране са АИМЛЕСС без примјене ограничења резолуције, користећи СТАРАНИСО сервер (//старанисо.глобалпхасинг.орг/). Ови програми врше анизотропни пресек података спојених интензитета на основу анализе локалног И / σ ( И ), израчунавају Баиесове процене амплитуда структуре, узимајући у обзир њихово анизотропно испадање и примењују анизотропну корекцију података. Ове исправљене анизотропне амплитуде су затим коришћене за даље прецизирање структура помоћу БУСТЕР / ТНТ 39 . Имајте на уму да табела 1 проширених података приказује статистику усавршавања у односу на све скупове рефлексија одсечених на најбољој високој резолуцији дуж оси х , к или л .

Модели су затим ручно исправљени и комплетирани коришћењем ЦООТ 40 и дорадјени помоћу БУСТЕР / ТНТ против амплитуда исправљених за анизотропију. Пречишћења су ограничена коришћењем некристалографске симетрије. Рафиниране структуре имају следеће коначне вредности Р / Р (у%): ЗИКВ сЕ – ЕДЕ1 Ц8 сцФв (19.5 / 22.1), ЗИКВ сЕ – ЕДЕ2 А11 Фаб (22.3 / 23.7) и невезано ЗИКВ сЕ (20.8 / 23.6) (види Табелу проширених података 1).

Анализа атомских модела и илустрација

Сваки комплекс је анализиран са ЦЦП4 пакетом програма и поларни контакти израчунате су са ПИСА вебсајтом 41 . За интермолекуларне интеракције приказане на продуженим подацима Слика 2 и 3 и Проширене табеле података 4 и 5, коришћене су максималне пресечне раздаљине 4 А и 4, 75 А за поларне и ван дер Ваалсове контакте. Вишеструка поравнања секвенци су израчуната коришћењем Цлустал В и Цлустал Кс верзије 2 (реф. 42) на ЕБИ серверу 43 . Слике које илуструју структурне моделе припремљене су помоћу ЕСПрипт 44 и ПиМОЛ Молецулар Грапхицс Систем, верзије 1.5.0.4 (Сцхродингер) (//пимол.соурцефорге.нет).

Филогена стабла

Максимална вероватноћа филогенетских стабала изведена је коришћењем 12 репрезентативних секвенци аминокиселина протеина овојнице Флавивирус Е или РНА полимеразом НС5, коришћењем ЛГ модела доступног у ПхиМЛ 45 и комбинације промене грана СПР + ННИ. Вриједности почетног покретања израчунате су из 100 реплика покретања. Дрвећа су визуализована помоћу Фигтрее (//трее.био.ед.ац.ук/софтваре/фигтрее/). Приступни кодови низова који се користе у стаблу: Зика вирус (ЗИКВ, КЈ776791, сој Х-ПФ-2013_Френцх_Полинесиа); серотип вируса денге 1 (ДЕНВ-1, НЦ_001477); серотип 2 денга вируса (ДЕНВ-2, НЦ_001474); денга вирус серотип 3 (ДЕНВ-3, НЦ_001475); денга вирус серотип 4 (ДЕНВ-4, НЦ_002640); Вирус вируса енцефалитиса у Саинт Лоуису (СЛЕВ, НЦ_007580); Јапански вирус енцефалитиса (ЈЕВ, НЦ_001437; вирус енцефалитиса долине Мурраи (МВЕВ, НЦ_000943); вирус западног Нила (ВНВ, НЦ_001563); вирус жуте грознице (ИФВ, НЦ_002031); вирус енцефалитиса који се преноси крпељем (ТБЕВ, НЦ_001672) и вирус Повассан (ПОВВ, НЦ_003687).

Залихе вируса

Афрички сој Зика ХД78788 је добијен из колекције Институт Пастеур, а азијски сој Зика ПФ13, изолован од пацијента током избијања ЗИКВ-а у Француској Полинезији 2013. године, добијен је из конзорцијума ДЕНФРЕЕ (ФП7 / 2007-2013). Станице вируса су припремљене из супернатанта инфицираних Ц6 / 36 ћелија (АТЦЦ ЦРЛ-1660), разјашњених центрифугирањем на 3.000 г на 4 ° Ц и титрованих на Веро ћелијама (АТЦЦ ЦРЛ-1586) тестом формирања фокуса. Залихе су чуване на -80 ° Ц до употребе. Све ћелијске линије нису биле контаминиране микоплазмом.

Тестови неутрализације

Неутрализација вируса помоћу тестираних хуманих антитела процењена је коришћењем теста неутрализације редукције фокуса (ФРНТ). Око 100 јединица које формирају фокус из залиха вируса инкубирано је серијским разблаживањем антитела током 1 х на 37 ° Ц. Смеша је затим додата Веро ћелијама, а жаришта су остављена да се развијају у присуству 1.5% метилцелулозе 2 дана. Фоци су затим обојени након фиксације са 4% формалдехида употребом антитела анти-Е 4Г2 (АТЦЦ ХБ-112) и секундарног антитела повезаног са мишевим хромом пероксидазом (ХРП) (ТхермоФисхер 31430). Фокуси су визуелизовани обојењем диаминобензидином (ДАБ) (Сигма Д5905) и плоче су бројене коришћењем ИммуноСпот С6 анализатора (Целлулар Тецхнологи Лимитед, ЦТЛ). Кривуље неутрализације и 50% ФРНТ вредности израчунати су нелинеарном регресијском анализом користећи Присм 6, ГрапхПад софтвер.

Приступања

Примарни приступи

Банка података о протеинима

  • 5ЛБС
  • 5ЛБС 3д виев
  • 5ЛБВ
  • 3д приказ 5ЛБВ
  • 5ЛЦВ
  • 5ЛЦВ 3д виев

Наведени приступи

ГенБанк / ЕМБЛ / ДДБЈ

  • КЈ776791

Депозити података

Атомске координате и амплитуде фактора структуре депоноване су у Банци података о протеинима (ПДБ) под приступним бројевима 5ЛБС (за комплекс ЗИКВ сЕ – ЕДЕ1 Ц8 сцФв), 5ЛЦВ (за комплекс ЗИКВ сЕ – ЕДЕ2) и 5ЛБВ (за А11 Фаб и невезани ЗИКВ сЕ).

Проширени подаци

Проширене бројке података

  1. 1.

    Везање антитела за рекомбинантни протеин ЗИКВ.

  2. 2

    Остаци укључени у интеракције бнАб-антигена.

  3. 3.

    Детаљи о ЕДЕ1 Ц8 бнАб контакту преко димера сучеља.

  4. 4.

    Површински електростатички потенцијал на приказу имунокомплекса над отвореном књигом.

  5. 5.

    Детаљи интеракције А11 са гликаном на 150 петљи.

Проширене табеле података

  1. 1.

    Услови кристализације, прикупљање података и усавршавање статистика

  2. 2

    Рмсд вредности између сЕ димера у различитим структурама ЗИКВ и ДЕНВ-2

  3. 3.

    Покопане површине и комплементарност површине у ЗИКВ сЕ димер – ЕДЕ комплексима и у ДЕНВ-2 сЕ димер – ЕДЕ комплексима

  4. 4.

    Поларне и сол-мост интеракције за ЗИКВ сЕ – ЕДЕ2 А11 Фаб, ДЕНВ-2 сЕ – ЕДЕ2 А11 Фаб, ЗИКВ сЕ – ЕДЕ1 Ц8 сцФв и ДЕНВ-2 сЕ – ЕДЕ1 Ц8 Фаб

  5. 5.

    Поларне и сол-мост интеракције за ЗИКВ сЕ – ЕДЕ2 А11 Фаб, ДЕНВ-2 сЕ – ЕДЕ2 А11 Фаб, ЗИКВ сЕ – ЕДЕ1 Ц8 сцФв и ДЕНВ-2 сЕ – ЕДЕ1 Ц8 Фаб

Коментари

Подношењем коментара пристајете да се придржавате наших Услова и Смерница заједнице. Ако нађете нешто злоупотребно или то није у складу са нашим условима или смерницама, означите то као непримерено.