Толц игра кључну улогу у имунолошкој заштити коју пружају целиће-целијске вакцине едвардсиелла тарда | научни извештаји

Толц игра кључну улогу у имунолошкој заштити коју пружају целиће-целијске вакцине едвардсиелла тарда | научни извештаји

Anonim

Субјекти

  • Бактеријска адхезија
  • Морска микробиологија

Апстрактан

Иако вакцине развијене из живих организама имају бољу ефикасност од оних развијених из мртвих организама, механизми који стоје на основи ове диференцијалне ефикасности остају неистражени. У овом истраживању комбиновали смо субимунопротеомију са имунолошким изазовима да бисмо истражили деловање протеома спољне мембране у имунолошкој заштити коју пружају четири целиће вакцине Едвардсиелла тарда припремљене различитим третманима и да идентификујемо заштитне имуноггене који играју кључну улогу у томе имуна заштита. Идентификовано је тринаест места која представљају пет протеина спољне мембране и један цитоплазматски протеин, а утврђено је да је њихова бројност измењена у односу на имуно-заштитне способности четири вакцине. Међу овим протеинима, нађени су ТолЦ и ОмпА као кључни имуногени који дају први и други највиши степен заштите. Откривен је ТолЦ у две ефикасне вакцине (жива и инактивирана-30-Ф). Укупни антисерум и анти-ОмпА титри су већи за две ефикасне вакцине него за две неефикасне вакцине (инактивирани-80-Ф и инактивирани-100). Даљи докази показали су да живе и инактивиране-30-Ф вакцине показују јаче способности да индуцирају диференцијацију ЦД8 + и ЦД4 + Т од осталих двеју вакцинисаних вакцина. Наши резултати показују да се протеом спољне мембране драматично мења после различитих третмана, што доприноси ефикасности целовитих ћелија.

Увод

Вакцине су најефикаснија стратегија за контролу заразних болести изазваних патогенима 1, 2 . Врста вакцине се може разликовати на основу метода припреме, од којих су целовите ћелије биле најраније развијене и тренутно су у широкој употреби 3 . Постоје две врсте целих бактеријских вакцина: жива вакцина и инактивирана вакцина. Неактивиране вакцине садрже неколико подврста, категорисаних према методи припреме вакцине 4 . У већини случајева већа имуна заштита откривена је живим вакцинама него код инактивираних ћелија или са вакцинама припремљеним на нижим температурама у поређењу с вишим температурама 5, 6 . Снажна имуна заштита изазвана живим вакцинама приписује се могућности да живе вакцине могу опонашати природну инфекцију, укључујући излучене протеине, и тако природно евоцирати пуни имуни одговор домаћина 7, 8 . Ова хипотеза делимично објашњава различите имуно-заштитне способности различитих врста вакцина, али у ствари не даје одговоре о томе како инактивиране вакцине добијене из истих ћелија али третиране различитим методама доводе до индукције диференцијалне имуне заштите. С обзиром да бактеријски протеини могу да стимулишу или инхибирају имунолошке реакције домаћина 9, 10, ми смо закључили да целиће ћелије подстичу имунитет домаћина стављајући све површинске протеине у контакт са имунолошким системом домаћина, а не са једним површинским протеином; према томе, резултирајући имунитет потиче од имуних одговора стимулисаних од свих површинских протеина, без обзира да ли стимулишу или инхибирају заштитни имунитет. Разјашњење механизама који су укључени у имунолошку стимулацију вакцинама целих ћелија може побољшати наше разумевање начина на који домаћин реагује на целицну вакцину и олакшава идентификацију ефикасних заштитних имуногена унутар протеома.

Недавни напредак у биотехнологији сада омогућава дубоко разумевање механизама вакцине у контексту развоја вакцине, посебно коришћење транскриптомијских и протеомских методологија 11, 12, 13 . Имунопротеомија заснована на комбинацији 2-ДЕ протеомика и Вестерн блот-а представља ефикасно средство за идентификацију имуногена 12, 13 . Идентификација имуногена је посебно важна за целовиту ћелију вакцине, јер садржи много протеина. Међутим, студије о механизмима на којима стоји имунска заштита као одговор на целиће ћелије нису доступне.

Едвардсиелла тарда је унутарћелијски патоген који рибама узрокује тешке економске губитке. У неким ситуацијама вакцине су економичније и ефикасније од антибиотика; антибиотици су ефикасни за управљање бактеријским инфекцијама, али могу резултирати производњом бактерија резистентних на антибиотике 14, 15 . Недавно су истражене целоцеличне Е. тарда вакцине, а студије су показале да су ћелије убијене формалином неефикасне у заштити од Е. тарда инфекције, док је жива атенуирана стратегија вакцине ефикаснија 16, 17 . Међутим, механизми који стоје на основи ове диференцијалне заштите углавном су непознати. Овде показујемо да је, када су ћелије Е. тарда биле подвргнуте диференцијалном третману, протеом спољне мембране значајно измењен, укључујући ТолЦ, имуноген који је кључан за успостављање ефикасног имуног одговора. Нађено је да су ови измењени протеоми повезани са различитом имунолошком заштитном способношћу.

Резултати

Диференцијална имунолошка заштита коју садрже четири врсте бактеријских целичних ћелија

Да би се истражио механизам који стоји у основи концепта да живе вакцине дају бољу ефикасност заштите, коришћене су четири методе за припрему вакцина, што доводи до стварања живих, инактивираних-30-Ф, инактивираних-80-Ф и инактивираних-100 вакцина. Мишевима је изазвана постимунизација Е. тарда ЕИБ202 овим вакцинама. Различите вакцине су показале значајно различите нивое заштите. Стопе заштите биле су 50%, 35%, 20% и 10% за живе, инактивиране-30-Ф, инактивиране-80-Ф и инактивиране-100 вакцине, док су контролни мишеви доживели кумулативну стопу смрти од 100% ( Табела 1). Било је значајних разлика у заштитним стопама између живих или инактивираних-30-Ф и инактивираних-80-Ф или инактивираних-100 вакцина. Ови подаци показују да се заштитна способност одређује методом припреме вакцине, а живе бактерије су показале најјачу заштитну способност.

Табела пуне величине

Идентификација имуногена помоћу имунопротеомије

На основу горњих резултата, претпоставили смо да висока температура може денатурирати протеине спољне мембране и на тај начин променити њихову имуногеност да би покренуо имуни одговор. За испитивање имунолошког одговора миша на протеине спољне мембране у четири вакцине коришћени су 2-ДЕ базични протеомици и имунопротеомици. Прво смо успоставили 2-ДЕ профил и идентификовали 45 протеинских места (Сл. 1 и Табела С1), од којих су 37 (82%) протеини на спољној мембрани, 5 (11%) су цитоплазматски протеини и 3 (7%) су протеини непознате локације (Сл. 1Б). Обиље ових протеина увелико је измењено у групама вакцина. ОмпФ2 (тачка 4), ОмпА (тачка 6) и ЕТАЕ_1826 (тачка 13) су три протеина са највећим обиљем (Сл. 1А). Неколико протеина је имало више од једне тачке, нпр. ОмпА је имала 12 места, што указује на пост-транслационе модификације 18 .

Image

( А ) 2-ДЕ мапа за протеине спољне мембране Е. тарда . ( Б ) Картонска табла која показује локације идентификованих протеина у 2-ДЕ гелу. ( Ц – Ф ) Имунопротеомици коришћењем антисера припремљени после имунизације живим бактеријама ( Ц ), инактивираним-30-Ф ( Д ), инактивираним-80-Ф ( Е ) и инактивираним-100 ( Ф ) бактеријама. ( Г ) Запремина и омјер мрља од 2-ДЕ гела и 2-ДЕ Вестерн блот. Запремина флека добијених бојењем Цоомассие сјајно плавом бојом у 2-ДЕ гелу (горња), бојењем са ДАБ за имунопротеомију (средња) и однос између горњег и средњег (доњег). Бројеви 1–13 представљају тачке. 1, ГроЕЛ, 2, ТолЦ, 3 и 4, ОмпФ2, 5–9, ОмпА, 10, ЕТАЕ_2675, 11 и 12, ОмпА, 13, ЕТАЕ_1826. 1-4 означавају различите антисере припремљене од мишева имунизираних живим бактеријама (1), инактивираног-30-Ф (2), инактивираног-80-Ф (3) и инактивираних-100 (4) вакцина.

Слика пуне величине

Затим смо примењивали имунопротеомију да карактеришемо протеинске тачке препознате од мишјих анти-серума (Сл. 1Ц-Ф), који су припремљени одвојено од пет мишева који су сваки вакцинисани са четири вакцине. Укупно је идентификовано 13 тачака које представљају 6 протеина, укључујући ГроЕЛ (тачка 1), ТолЦ (тачка 2), ОмпФ2 (тачке 3, 4), ЕТАЕ_2675 (тачка 10), ЕТАЕ_1826 (тачка 13) и ОмпА (тачке 5, 6 7, 8, 9, 11, 12). Сви позитивни протеини, осим ГроЕЛ-а, били су протеини спољне мембране. Серуми произведени различитим вакцинама различито су реаговали на ове тачке. Конкретно, 12, 8, 9 и 9 тачака које представљају 5, 2, 3 и 3 протеине откривене су у живо (Сл. 1Ц), инактивирани-30-Ф (Сл. 1Д), инактивирани-80-Ф (Сл. 1Е ) и инактивиране-100 (Сл. 1Ф) вакцине, респективно. Ти протеини су били ГроЕЛ, ТолЦ, ОмпФ2, ОмпА и ЕТАЕ_2675 у живим бактеријама, ТолЦ и ОмпА у инактивираним-30-Ф бактеријама, и ОмпФ2, ОмпА и ЕТАЕ_1826 код инактивираних-80-Ф и инактивираних-100 бактерија. Ови резултати показују да су међу четири вакцине откривени различити одговори антитела.

Занимљиво је да су ТолЦ препознали само два анти-серума генерисана против живих и инактивираних-30-Ф вакцина. ОмпА је откривен у све четири вакцине. Међутим, нисмо успели да откријемо ОмпФ2 у инактивираном-30-Ф након неколико поновљених покушаја, што указује на губитак ОмпФ2 током припреме. Стога би ТолЦ могао бити кључни протеин за стварање заштитног имунитета. Поред тога, у складу са нашим претходним извештајима, ово истраживање је такође показало да волуменски проценат протеинске тачке у 2-ДЕ није у складу са интензитетом бојења у 2-ДЕ Вестерн блотингу 12, 13 . Једнако је важно, ова студија је даље открила да су различите протеинске флеке за исти протеин показале различит интензитет бојења приликом реакције са истим антисерумом. На пример, неколико ОмпА тачака са диференцијалним обиљем није створило сличне омјере у својој способности да се вежу за исто антитело, што сугерише ефекте поликлоналних антитела и модификације ОмпА на везивање. Генерално, снажније обојење и већи омјер тачака 5–9 (ОмпА) детектирани су код живих и инактивираних-30-Ф вакцина него код инактивираних-80-Ф и инактивираних-100 вакцина (Сл. 1Г). Поред тога, ЕТАЕ_2675 је протеин спољне мембране који је препознат само у серумима генерисаним против инактивираних-80-Ф и инактивираних-100 вакцина.

Заштитна способност имуногена спољашње мембране

Даље смо истражили заштитне способности ТолЦ, ОмпА и ЕТАЕ_2675 користећи активну имунизацију у мишјем моделу. Резултати активне имунизације показали су да су стопе заштите ТолЦ, ОмпА и ЕТАЕ_2675 60, 8%, 45, 1% и 2%, респективно (Табела 2), што указује да су ТолЦ и ОмпА добри заштитни имуногенови. ОмпА је конзервирани протеин спољне мембране у грам-негативним бактеријама и ефикасан имуноген против бактеријских инфекција 12, 13, 19 . Иако је иста имуна бактерија (10 7 ћелија / миш) коришћена за имунизацију са све четири вакцине, резултирајући интензитет је био драматично различит код Вестерн блот-а. Процена интензитета резултирала је рангирањем вакцина: живе, инактивиране-30-Ф, инактивиране-80-Ф и инактивиране-100; титри произведени овим вакцинама били су 1: 25600, 1: 6400, 1: 1600 и 1: 400, респективно (Сл. 2А). Стога се чинило да су титри повезани са додељеном имуном заштитом, мада титар антитела није еквивалентан имуној заштити 20 .

Табела пуне величине

Image

( А ) Укупни антисерови титри. М, маркер. 1–10: разблажења антисера у 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1: 800, 1: 1600, 1: 3200, 1: 6400, 1: 12800, 1: 25600 и 1: 51200. Стрелице показују три јасно позитивна појаса. ( Б ) Титри антисера подигнути против појединачно пречишћених протеина ОмпА, ТолЦ и ЕТАЕ_2675. 1–4: разблажења антисера у 1: 100, 1: 400, 1: 1600 и 1: 6400. а – д, Антисера припремљена после имунизације живим (а), инактивираним-30-Ф (б), инактивираним-80-Ф (ц) и инактивираним-100 (д) вакцинама.

Слика пуне величине

Дот-ЕЛИСА су одређивали титре анти серума за протеине спољне мембране ТолЦ, ОмпА и ЕТАЕ_2675. У складу са горе наведеним резултатима, откривена су јача обојења и виши титри три протеина у анти-серумима против живих или инактивираних-30-Ф вакцина у односу на остале две вакцине (Слика 2Б). Интересантно је да ниже обиље ОмпА у инактивираном-30-Ф може да индукује веће титре анти серума, укључујући антитела против ОмпА, него остале две инактивиране вакцине, што сугерише да протеини спољне мембране поред ОмпА играју улогу у подизању имуности одговор, укључујући регулисање стварања високих титра анти-ОмпА. Ови резултати показују да живе и инактивиране-30-Ф вакцине производе веће титре антитела против имуногених протеина спољне мембране, што је повезано са присуством других протеина спољне мембране који реагују са домаћином.

Утицај различитих препарата за вакцину на обиље протеина спољне мембране

На основу горњих резултата, закључили смо да се обиље протеина спољне мембране може изменити након различитих третмана. Да бисмо то демонстрирали, користили смо Вестерн блот испитивање да ли су протеини спољне мембране ОмпА, ЕвпБ, ТолЦ, ЕТАЕ_2675 и ЕТАЕ_0245 показали промене нивоа њихове експресије у живим, инактивираним-30-Ф и инактивираним-100 вакцинама. Инактивирана вакцина-80-Ф није укључена јер није лизирана ултразвуком упркос неколико поновљених покушаја. Резултати су показали да су ТолЦ и ЕТАЕ_2675 изгубљени у инактивираном-100. ОмпА и ЕвпБ су нижи код инактивиране вакцине-30-Ф него код осталих вакцина (Сл. 3А). Ови резултати указују на то да имуно-заштитне способности целовитих ћелија вакцина произилазе из различитих метода припреме вакцине, а те способности се могу приписати диференцијалном обиљу протеина спољне мембране.

Image

Вестерн блот-анализа за одређивање обиља протеина спољне мембране ( А ) и проточном цитометријом за одређивање процента ЦД4 + ( Б ) и ЦД8 + ( Ц ) Т ћелија. ( А ) Три ЕИБ202 вакцине. 1, Жива вакцина; 2, инактивирана-30-Ф вакцина; 3, инактивирана-100 вакцина. ( Б, Ц ) ЦД3 + Т ћелије мишева имунизованих са три вакцине. 1, ПБС контрола; 2, инактивирана-100 вакцина; 3, инактивирана-30-Ф вакцина; 4, жива вакцина. ** п <0, 01 помоћу Студент-овог Т теста.

Слика пуне величине

Затим смо користили тест проточне цитометрије да бисмо анализирали диференцијацију Т ћелија. Коришћењем флуоресцентно обележених антитела, ЦД4 + и ЦД8 + Т ћелије су бројене унутар субпопулације ЦД3 + Т ћелија. Проценат ЦД4 + Т ћелија био је значајно већи код мишева имунизованих вакцином инактивираном-30-Ф него код мишева имунизованих са друге три вакцине, док је проценат ЦД8 + Т ћелија био значајно већи код мишева имунизованих живом вакцином од мишева у остале три групе (Сл. 3Б, Ц). Резултати показују да инактивирана вакцина-30-Ф и жива вакцина изазивају диференцијацију ЦД4 + и ЦД8 + Т ћелија да изазову хуморални имунитет и ћелијски имунитет.

Утицај различитих вакцина под стресом на антибиотике на њихове заштитне способности код модела риба и миша

Да бисмо додатно поткријепили закључак да су имуно-заштитне способности цјеловитих ћелија вакцине повезане са диференцијалним обиљем протеина вањске мембране, припремили смо још три вакцине из истих ћелија ЛТБ4, али у овом случају ћелије су биле под стресом излажући их одвојено ампицилин, хлорамфеникол и цефтазидим током 1 х. Могуће је да антибиотски стрес може резултирати променама у обиљу протеина спољне мембране без обзира на мутације гена 21, 22 . За истрагу су коришћени ЛТБ4 уместо ћелија ЕИБ202 како би се осигурало да наши налази нису ограничени на ћелије ЕИБ202. Наш претходни тест показао је да ЛТБ4 поседује протеине спољне мембране као и ЕИБ202. Од четири протеина која је детектирала Вестерн блоттингом, три протеина (ОмпА је био изузетак) показале су значајне разлике међу три вакцине, међу којима је ТолЦ имао највеће богатство у вакцини припремљеној излагањем хлорамфениколу (Слика 4). Даљњим истраживањем имуне заштите утврђено је да је за вакцину под стресом хлорамфеникол откривена значајно већа заштитна способност у односу на контролну вакцину код модела риба и миша, док између две друге вакцине и контроле није било значајне разлике (Табела 3). Када је Е. тарда ЕИБ202 изазвала рибу, неке су животиње угинуле, углавном 24–48 х после изазова. Риба Морибунд показала је типичне симптоме инфекције Е. тарда , укључујући упалу коже са депигментацијом и крварењем на површини репа. Штавише, инфекција је потврђена детекцијом Е. тарда 16С рРНА у јетри умируће рибе и мишева (допунска слика 1). Резултати даље подржавају наше горе описане закључке. У међувремену, ови налази сугерирају да можемо процијенити квалитет вакцине откривањем протеина ефикасних вакцинама попут ТолЦ и анти-ОмпА, како је детаљно описано у овој студији.

Image

ЛТБ4 вакцине припремљене излагањем антибиотицима АМП (ампицилин), ЦАП (хлорамфеникол) и ЦАЗ (цефтазидим).

Слика пуне величине

Табела пуне величине

Дискусија

Иако је примећена различита имунолошка заштита коју пружају различите вакцине које су изведене из исте бактерије, али припремљене различитим третманима, 4, 23, механизми који стоје на овом феномену још увек нису познати. У овој студији смо примењивали субмунопротеомију да истражимо однос између различитих протеома спољне мембране и имуне заштите целичноћелијским бактеријским вакцинама припремљеним различитим методама, као и да идентификујемо кључне имуногене. Протеом спољне мембране је изабран јер су протеини спољне мембране, који се налазе на најудаљенијем делу бактеријских ћелија и који су први контакт између бактерија и ћелија домаћина и животне средине 24, 25, идеални циљеви за вакцине 12, 13, 26, 27, 28, 29, 30 .

Наши резултати показују да су способности имуне заштите вакцина повезане са протеомом спољне мембране, а услови лечења, попут температуре, могу да промене протеом спољне мембране, што доводи до измењене способности имуне заштите. Услови коришћени за инактивацију живих бактерија, попут формалина или температуре, могу имати потенцијалне ефекте на протеинске структуре, што резултира губитком антигених епитопа и обиљем, а заузврат утиче на стимулацију домаћина. У овом истраживању, велика количина протеина спољне мембране била је кориснија за производњу антитела. Према томе, важно је избећи смањење броја заштитних имуногена спољашње мембране током припреме вакцине. Супротно томе, ово истраживање показало је нижи ниво ОмпА, али виши ниво анти-ОмпА у инактивираном-30-Ф у поређењу са инактивираним вакцинама-80-Ф и инактивираним-100. Овај налаз указује да је способност протеина да индукује високе титре антитела повезана не само са идентитетом протеина већ и са деловањем других протеина. Утврђено је значајно различито обиље протеина и компонената између четири вакцине, а ОмпФ2 је изгубљен у инактивираној вакцини-30-Ф у овој студији. Ови резултати такође сугерирају да и други протеини поред заштитних имуногена у вакцини такође играју улогу у индукцији високих титра антитела, што би могао бити још један разлог зашто је откривена диференцијална имуна заштита међу четири вакцине Е. тарда произведене различитим третманима. Сходно томе, обиље ТолЦ и анти-ОмпА могу бити од значаја за идентификацију ефикасности ових вакцина. Откривање обиља кључних протеина током припреме вакцине може бити алтернативна метода за предвиђање ефикасности вакцине.

Наши резултати показују да се имуно-заштитне способности целовитих ћелијских вакцина приписују деловању свих протеина спољне мембране који ступају у интеракцију са имунолошким системом домаћина, а не само оних протеина који активирају имуну заштиту. Због тога, различито обиље протеина спољне мембране доприноси диференцираним способностима имуне заштите вакцина. Наши резултати истичу методу за побољшање ефикасности вакцине кроз регулисање односа између састојака вакцине.

Занимљиво је да наши резултати показују да је инактивирана вакцина-30-Ф и жива вакцина успела да индуцирају диференцијацију ЦД4 + и ЦД8 + Т ћелија. ЦД4 је ко-рецептор који помаже рецепторима Т ћелија (ТЦР) у комуникацији са ћелијом која представља антиген директном интеракцијом са молекулима МХЦ класе ИИ на површини ћелије која представља антиген. Интеракција даље посредује трансдукцију сигнала низводно преко тирозин фосфорилације, што доводи до активације Т ћелија да изазове хуморални имунитет. Цитотоксичне Т ћелије са површинским протеинима ЦД8 називају се ЦД8 + Т ћелије. Изванћелијски ИгВ сличан домен ЦД8-α делује у интеракцији са α3 делом молекуле МХЦ класе И, одржавајући Т ћелијски рецептор цитотоксичне Т ћелије и циљане ћелије уско повезаним током активирања специфичног за антиген и тиме покреће ћелијски имунитет 31, 32 .

Поред тога, од два заштитна имуногена идентификована у овој студији, претходно је пријављен имуно-заштитни антиген Е. тарда ОмпА30. Поред тога, откривена је имуно заштитна улога ОмпА и код других бактеријских врста. То може бити последица конзервативне улоге ОмпА у грам-негативним бактеријама 12, 13, 30 . Међутим, информације у вези са улогом Е. тарда ТолЦ нису доступне, иако је објављено да је објављена имуна заштита коју даје Салмонелла паратифи А ТолЦ 33 . Наши резултати добијени активном имунизацијом показују да се виши ниво заштите може открити код мишева имунизованих са ТолЦ у поређењу са ОмпА. Стога, ова студија уводи ефикасан нови имуноген за контролу инфекција изазваних Е. тарда.

Методе

Изјава о етичности

Сав рад је обављен у строгој складу са препорукама у Водичу за негу и употребу лабораторијских животиња Националног института за здравље. Протокол је одобрио Одбор за институционалну његу и употребу животиња са Универзитета Сун Иат-сен (Број за сигурност добробити животиња: И6).

Бактеријски сојеви и животиње

Бактеријски сојеви Е. тарда ЕИБ202 и ЛТБ4 коришћени у овој студији добијени су од професора Иуанкин Зханг-а, са Универзитета за науку и технологију у Источној Кини, и професора Ксиаохуа Зханг, са кинеског универзитета за океан. Два бактеријска соја пријављена су у многим истраживањима из нашег лабораторија и других лабораторија 18, 34 . Комплетна секвенца генома ЕИБ202 објављена је 2009. 18 . Сојеви су узгајани у соју са сондом (ТСБ) на 30 ° Ц и сакупљани на 1, 0 ОД 600 . СПФ Кунминг мишеви су добијени из Животињског центра Универзитета Сун Иат-сен и храњени су стерилном водом и сувом храном за пелете. Тилапије су купљене од узгајачке базе Гуангзхоу Тилапиас; рибе су биле дужине 5 ± 0, 5 цм и телесне тежине 1, 8 ± 0, 2 г и аклиматизоване су у резервоарима (80 × 75 × 90 цм). Животиње су биле храњене комерцијалном пелетираном храном два пута дневно. После аклиматизације у трајању од једне недеље, доказано је да рибе не садрже врсте Е. тарда путем микробиолошких и ПЦР детекција. Животиње су затим насумично подељене у неколико група ради имунизације.

Припрема вакцине и активна имунизација

За припрему вакцине и имунизацију, ЕИБ202 ћелије са ОД 1, 0 сакупљане су центрифугирањем на 4.000 г током 15 минута и три пута испране физиолошким раствором. Добијене ћелије су суспендоване у стерилном физиолошком раствору као жива вакцина Е. тарда или затим инкубиране на различитим температурама (30 ° Ц плус 0, 5% формалина, 80 ° Ц плус 0, 5% формалина или 100 ° Ц) да би се произвео инактивирани-30-Ф, инактивиране-80-Ф и инактивиране-100 вакцине, респективно. Бројање плоча је извршено ради испитивања бактеријске стерилности у три инактивиране вакцине. Инактивиране ћелије (10 7 ћелија) и живе бактерије (10 7 ЦФУ) примењене су мишевима интраперитонеалном ињекцијом. Након две ињекције у интервалу од 7 дана, мишеве је изазвао ЕИБ202 у 5 × 10 8 ЦФУ и пратио их свакодневно током 15 дана. За бактеријске изазове после имунизације, мишевима су убризгане рекомбинантне ОмпА, ЕвпБ, ТолЦ, ЕТАЕ_2675 или ЕТАЕ_0245 са Фреундовим комплетним адјувантом и појачане Фреундовим непотпуним адјувантом у размаку од 7 дана са 100 µг по мишу по ињекцији. Контролна група је убризгана физиолошком отопином пуферираном фосфатом (ПБС) која садржи једнаке количине Фреундова потпуног или непотпуног адјуванса. 7 дана након потисне имунизације, мишеви су изазвани са ЕИБ202 у 5 × 108 ЦФУ и свакодневно су је посматрали током 15 дана. Три умирућа мишева из сваке групе изабрани су насумично да би се изоловала јетра за употребу у ПЦР анализи 16С рРНА.

Е. тарда ЛТБ4 вакцине припремљене излагањем антибиотицима

ЛТБ4 ћелије у ОД 600 од 1, 0 су сакупљене и испране три пута физиолошким раствором. Ћелије су одвојено изложене 8-пута мањим инхибиторним концентрацијама (МИЦ) антибиотика (100 µг / мЛ ампицилина, 8 µг / мЛ хлорамфеникола и 1 µг / мЛ цефтазидима) на 30 ° Ц током 1 х. Резултирајуће бактерије су сакупљене и подељене у два дела. Један је коришћен за Вестерн блот откривање обиља протеина спољне мембране, а други је инактивиран са 0, 5% формалина у трајању од 90 мин на 30 ° Ц за имунизацију миша како је горе описано. После имунизације два пута, мишеви су изазвани са Е. тарда ЕИБ202 у 4.5 × 108 ЦФУ. У међувремену, тилапије су имунизоване са 8.0 × 10 3 ЦФУ ћелија ЛТБ4 два пута у размаку од десет дана, а затим су изазване са Е. тарда ЕИБ202 у 8 × 10 4 ЦФУ. Ове животиње су посматране свакодневно у току 15 дана. Експеримент је поновљен три пута за Вестерн блоттинг и два пута за изазив после имунизације. Три умиреле рибе из сваке групе изабране су насумично да би се изоловала јетра за употребу у ПЦР анализи 16С рРНА.

Детекција 16С рРНА

Стандардни ПЦР коришћен је за амплификацију 16С рРНА гена мишје крви пре инфекције, јетре после инфекције, и јетре рибе пре и после инфекције. Пар прајмера за ген 16 сРНА дизајниран је са смислом прајмер 5 '-АГАГТТТГАТЦЦТГГЦТЦА-3' и антисенс пример 5'-ГГТТАЦЦТТГТТАЦГАЦТТ-3 '. ПЦР је почео са 4 мин на 94 ° Ц, затим 33 циклуса са 30 с на 94 ° Ц, 30 с на 57 ° Ц, 90 с на 72 ° Ц, и коначно продужење за 10 мин на 72 ° Ц. Добијене ПЦР производе секвенцирали су БГИ, Схензхен, Гуангдонг, а затим су упоређени са матичним сојем Е. тарда за валидацију инфективног патогена.

Изолација протеина спољне мембране

Протеини спољне мембране су одвојени са лаурил саркозинатом као што је претходно описано 35 . Укратко, бактеријске ћелије су сакупљене центрифугирањем на 4.000 г током 15 минута на 4 ° Ц. Добијене ћелије су испране у 40 мл стерилног физиолошког раствора (0, 15 М НаЦл) три пута и затим поново суспендоване у 5 мл 50 мМ Трис-Цл пХ 7, 2. Ове ћелије су прекинуте испрекиданим ултразвучним третманом. Непрекинуте ћелије и станични остаци су уклоњени центрифугирањем на 5000 г током 20 минута. Супернатанти су сакупљени и даље центрифугирани на 100 000 г током 1 х на 4 ° Ц. Талог је растворен у 2% (В / В) натријум-лаурил саркозината на собној температури током 30 мин и поново је центрифугиран. Сакупљени пелети су поново суспендовани у 50 мМ Трис-Цл и чувани на -80 ° Ц. Концентрације ових протеина у коначној припреми одређене су Брадфорд методом.

2-ДЕ засновани протеомици и имунопротеомици

2-ДЕ засновани протеомици и имунопротеоми су изведени као што је претходно описано 12, 13, 21 . Укратко, пре него што се изврши 2-ДЕ, узорци су третирани ТЦА-ацетоном. Након рехидратације преко ноћи, 200 µг протеина спољне мембране у 200 µЛ рехидрацијског пуфера стављено је на линеарне 11-цм имобилисане пХ градијентне траке са пХ 3–10 (ИПГ траке, БиоРад, САД). ИПГ траке су концентрисане у ИПГфору на 20 ° Ц и 60 кВх коришћењем система Мултипхор ИИ (Амерсхам). После редукције и алкилације помоћу ДТТ и ИАА, ИПГ траке су пренете у електрофорезу друге димензије користећи 12% акриламидне гелове. Гелови су обојени Цоомассие Блуе-Р250 и скенирани на АГФА скенеру са белом светлошћу. Узорци гела су међусобно усклађени визуелним поређењем користећи 2-Д софтвер Мелание 5.0. Диференцијално експримирани протеини изрезани су из 2-Д гелова, дигестирани су трипсином и примењени за МАЛДИ-ТОФ / МС анализу (Рефлек ИИИ МАЛДИ-ТОФ систем, Брукер). МС пикови су одабрани између 800 и 3.000 Далтона и филтрирани са односом сигнал-шум већим од 15 и да се искључе масе добијене аутолизом трипсина. Протеини са ниским поуздањем су даље идентификовани коришћењем МАЛДИ ТОФ / ТОФ. За МС / МС спектар, изабрано је 5 најобилнијих јона прекурсора по узорку за наредну фрагментацију, а по иону претходника је акумулирано 1000–1200 Да ласерских снимака. Критеријум за избор прекурсора био је минимални С / Н од 50. Све МАЛДИ анализе су рађене са системом за контролу нејасне логичке повратне спреге (Рефлек ИИИ МАЛДИ-ТОФ систем, Брукер), опремљеним каснијом екстракцијом јона. Подаци о МС и МС / МС су интерпретирани и обрађени користећи Флеканалисис 3.0 (Брукер Далтоницс), а затим су добијени МС и МС / МС спектри по тачки комбиновани и предати МАСЦОТ претраживачу (В2.3, Матрик Сциенце, Лондон, Уједињено Краљевство) компаније Биотоолс 3.1 (Брукер Далтоницс) и тражио је са следећим параметрима: НЦБИ у СвиссПрот (//ввв.матриксциенце.цом), једно пропуштено место цепања, карбамидометил као фиксна модификација цистеина и оксидација метионина као променљиве модификације, МС толеранција од 100 ппм и МС / МС толеранција од 0.6 Да. Познати контаминантни јони (кератин) су искључени. За резултате МАСЦОТ протеина коришћен је праг нивоа поузданости од 95%. Протеини су идентификовани МАСЦОТ оценом већим од 78 за отисак масе пептидном масом и јонским резултатом већим од 49 за МС / МС анализу. Остали критеријуми за идентификацију укључују најмање 8% покривеност секвенци за МС и најмање два пептида за МС / МС. Сваки узорак имао је 3 биолошка понављања. Локације субцелијских протеина позициониране су с програмом ПСОРТб верзија 2.0.4 (//ввв.псорт.орг/псортб/). За имунопротеомску анализу, протеини у геловима су пренети на НЦ мембране, инкубирани са примарним и секундарним антителом и реаговали са ДАБ супстратом док се није појавила оптимална боја. Примарна антитела су припремљена имунизирањем мишева живим (живим), инактивираним на 30 ° Ц током 24 х плус 0, 5% формалина (инактивирани-30-Ф), на 80 ° Ц током 90 мин плус 0, 5% формалина (инактивиран-80 -Ф) и на 100 ° Ц током 1 х (инактивирано-100) вакцине. Секундарно антитело, зечји анти-миш-ИгГ-ХРП, комерцијално је добивено од Босон Биотецх. Цо., Лтд, Ксиамен, Кина. Експеримент је поновљен три пута.

Клонирање гена и прочишћавање протеина

A pair of primers for the tolC gene were designed based on the EIB202 genomic sequence (sense, 5′ GGG GGATCC ATGAAGAAACTGCTCCC 3′; antisense, 5′ CCC AAGCTT TTAGCGTACGCCGCCGCC 3′), while primer sequences for the four genes ompA , evpB , ETAE_0245 and ETAE_2675 were available in our previous report 19 . Standard PCR and molecular biology protocols were utilized to amplify the genes using EIB202 genomic DNA as a template. The PCR fragment was directionally cloned into the plasmid pET-32a and then expressed in E. coli BL21. The recombinant plasmid was detected by restriction enzyme analysis and sequencing. Sequencing was carried out by BGI, Shenzhen, China. The recombinant proteins were purified by affinity chromatography on Ni-NTA Super flow resin (Qiagen) according to the manufacturer's instructions. The concentration of proteins was determined by the Bradford method. The purified recombinant proteins, OmpA, EvpB, TolC, ETAE_2675, and ETAE_0245, were used for antiserum preparation (Guangzhou Chengxue Biotech. Corp. China).

Western blotting and Dot-ELISA

To detect protein abundance, the prepared vaccines were used for the extraction of outer membrane proteins as described above. These outer membrane proteins were separated by SDS-PAGE, transferred to NC membranes and then incubated with antiserum prepared from the live vaccine. To detect antiserum titers, outer membrane proteins of the live vaccine were used as antigens and were recognized by antisera separately against the live vaccine, inactivated-30-F, inactivated-80-F and inactivated-100 bacteria. Western blotting was carried out with a routine procedure as described above for immunoproteomics. Експеримент је поновљен три пута.

For dot ELISA, 0.5 μg of recombinant OmpA, TolC and ETAE_2675 were separately dotted onto an NC membrane. After blocking with 5% skim milk, the membranes were recognized separately by four mouse antisera raised against the four vaccines at dilutions of 1:100, 1:400, 1:1600 and 1:6400. After incubating with a secondary antibody, rabbit anti-mouse IgG-HRP, the membranes were reacted with DAB substrate until spots appeared. Експеримент је поновљен три пута.

Flow cytometry analyses of T cells

Mice were immunized using live, inactivated-30-F and inactivated-100 vaccines and boosted at an interval of one week for tested groups, and PBS was used as a control. After the second immunization, heparin anticoagulant blood was collected for flow cytometry analysis. Two milliliters of red cell lysis solution was added and incubated for 10 min. Cell debris was removed by centrifugation at 1, 500 rpm for 5 min. FITC-conjugated anti-CD3 mAb, PE-conjugated anti-CD4 mAb and APC-conjugated anti-CD8 mAb (BD Biosciences) were added into each 100-μL fresh sample and incubated for 15 min in the dark. After washing with 2 mL of PBS, the cells were resuspended in 400 μL of PBS and analyzed by flow cytometry analysis. Експеримент је поновљен три пута.

Статистичка анализа

Chi-square tests and Student's T tests were performed with SPSS software version 11.5 (SPSS Inc.) to determine statistical significance. Significant differences were considered present at *P < 0.05 and **P < 0.01.

Додатне Информације

How to cite this article : Wang, C. et al . TolC plays a crucial role in immune protection conferred by Edwardsiella tarda whole-cell vaccines. Сци. Rep. 6, 29488; doi: 10.1038/srep29488 (2016).

Додатне информације

Ворд документи

  1. 1.

    Додатне информације

Коментари

Подношењем коментара пристајете да се придржавате наших Услова и Смерница заједнице. Ако нађете нешто злоупотребно или то није у складу са нашим условима или смерницама, означите то као непримерено.