Подешавање ил-2 сигнализације адп-рибозилацијом цд25 | научни извештаји

Подешавање ил-2 сигнализације адп-рибозилацијом цд25 | научни извештаји

Anonim

Субјекти

  • Интерлеукинс
  • Медицинско истраживање

Апстрактан

Контрола имунолошке толеранције и хомеостазе ослањају се на Фокп3 + ЦД4 + ЦД25 + регулаторне Т ћелије (Трегс) које конститутивно изражавају рецептор високог афинитета за Интерлеукин-2, ЦД25. Треге размножавају као одговор на ињекције комплекса ИЛ-2 / анти-ИЛ-2 антитела или мале дозе ИЛ-2. Међутим, мало се зна о ендогеним механизмима који регулишу осетљивост ЦД25 на сигнализацију од стране ИЛ-2. Овде смо показали да је ЦД25 АДП-рибозилиран у Арг35 на месту везања за ИЛ-2 помоћу екто-АДП-рибосилтрансферазе АРТЦ2.2, екто-ензима који је повезан са токсиком. АДП-рибозилација инхибира везивање ИЛ-2 помоћу ЦД25, фосфорилацију изазвану ИЛ-2- СТАТ5 и ћелијску пролиферацију која зависи од ИЛ-2. Наше истраживање разјашњава још увек непризнати механизам за подешавање ИЛ-2 сигнализације. Овај ново пронађени механизам може да спречи Трегове на месту упале и на тај начин омогући снажнији одговор активираних Т ћелија ефектора.

Увод

Интерлеукин 2 (ИЛ-2) активира више имунолошких ћелија, али чврсти докази указују на то да је његова примарна функција подржати стварање и опстанак Трегова који инхибирају имунолошке одговоре и спречавају аутоимуне болести 1, 2, 3, 4 . ИЛ-2 сигнали путем ћелијских површинских рецептора високог и ниског афинитета 5, 6, 7 . ЦД25, α-ланац ИЛ-2 рецептора, конститутивно је повезан са липидним сплавовима 8 . Састављање хетеротримерног комплекса рецептора високог афинитета започиње везањем ИЛ-2 на ЦД25, након чега следи регрутовање ЦД122 и ЦД132. У недостатку ЦД25, β и γ ланци формирају рецептор са 10-100 пута нижим афинитетом за ИЛ-2 9 . Овај рецептор ниског афинитета се изражава наивним Т ћелијама, меморијским ЦД8 + Т ћелијама и НК ћелијама. Оба рецептора сигнализирају фосфорилацијом СТАТ5 (претварач сигнала и активатор транскрипције 5) 10, 11, 12 . Кристална структура ИЛ-2 у комплексу са његовим рецептором открила је остатке ЦД25 који су укључени у везивање ИЛ-2 6, 7, укључујући истакнути аргентински дублет (Р35Р36) (Допунска слика Сл. 1а, б).

Т-ћелијске подгрупе различито се модулишу сигнализацијом ИЛ-2, у зависности од концентрације ИЛ-2 и од експресије подјединица рецептора ИЛ-2. ЦД25 се конститутивно изражава Трегсом, а ИЛ-2 сигнализација кроз ЦД25 је пресудна за стварање, преживљавање и функцију ових ћелија 1, 2, 3, 13, 14, 15 . Ефикасном потрошњом ИЛ-2, Трегс може да одузме суседне Т ћелије овог цитокина 16, 17 . Недавна истраживања показују да ин виво лечење са малим дозама ИЛ-2 или са ИЛ-2 у комплексу са анти-ИЛ-2 антителом може сузбити имуно посредоване болести индукујући експанзију Трегс 17, 18, 19, 20, 21 , 22 . ИЛ-2 специфична антитела могу продужити полуживот серума ИЛ-2 инхибирањем бубрежне филтрације цитокина 23 мале молекуларне тежине. Интригантно, различити комплекси протутијела за ИЛ-2 / анти-ИЛ-2 изазивају различите реакције ин виво , у зависности од епитопа ИЛ-2 везаног за одређено антитело: ИЛ-2 миша у комплексу са мАб (моноклонално антитело) ЈЕС6-1А12 или хумани ИЛ-2 у комплексу са мАб 5344 индукује преференцијално ширење Трегс-а, док мишји ИЛ-2 у комплексу са мАб С4Б6 или хумани ИЛ-2 у комплексу са мАб-602 индукује преференцијално ширење ЦД8 + цитотоксичних Т ћелија и НК ћелија 23, 24, 25, 26, 27, 28 . Ови налази постављају питање да ли постоје ендогени механизми који би на сличан начин могли да модулирају ИЛ-2 сигнализацију ин виво .

АДП-рибозилација која зависи од НАД + једна је од посттранслационих модификација која регулише функције протеина 29, 30 . НАД + (никотинамид аденин динуклеотид) се ослобађа из ћелија током упале и делује као сигнални молекул који упозорава имуне ћелије на места оштећења ткива 31, 32, 33, 34 . АДП-рибосилтрансфераза АРТЦ2.2 везана за токсине је ензим усидрен ГПИ-ом изражен на ћелијској мембрани наивних Т ћелија и Фокп3 + ЦД4 + ЦД25 + регулаторних Т ћелија (Трегс) 35, 36, 37 . АРТЦ2.2 преноси АДП-рибозну јединицу из НАД + на остатке аргинина других мембранских протеина повезаних са сплавом 35, 38 . На пример, АДП-рибозилација јонског канала П2Кс7 на Р125 индукује гетирање јонског канала 38 . АДП-рибозилација ћелијских површинских протеина може се надзирати ауторадиографијом или имунотестима заснованим на антителу (допунска слика, слика 1ц, д).

Овде откривамо АДП-рибозилацију ЦД25 као нови механизам који контролише ИЛ-2 сигнализацију након излагања Трегса ванћелијским НАД + . Користећи пречишћавање афинитета АДП-рибозилираних ћелијских површинских протеина и масеном спектрометријом, идентификовали смо ЦД25 као главни циљ АРТЦ2.2. Показујемо да катализирано АРТЦ2.2, АДП-рибозилација ЦД25 зависне од НАД + инхибира ИЛ-2 везање, ИЛ-2-индуковану фосфорилацију СТАТ5 и ИЛ-2 зависну ћелијску пролиферацију. Предлажемо да АДП-рибозилација ЦД25 пружа ендогени механизам за подешавање ИЛ-2 сигнализације као одговор на НАД + ослобођен од повређених ћелија током упале и оштећења ткива. Инхибирањем стварања ИЛ-2 рецептора високог афинитета, природно експримираног регулаторним Т ћелијама, овај механизам може омогућити преференцијално ширење активираних ефекторских Т ћелија у инфламаторним окружењима.

Резултати

Идентификација ЦД25 као главног циља АРТЦ2.2

ИАЦ-1 ћелијска линија лимфома конститутивно изражава АРТЦ2.2 и ЦД25 (Сл. 1а). Инкубација ових ћелија са 32 П-НАД + резултирала је обележавањем неколико опсега, укључујући истакнуту траку од 50 кД (Сл. 1б, трака 1, стрелица). Слични резултати су добијени када је етано-НАД + коришћен као супстрат (Сл. 1д, трака 1, стрелица). Пречишћавање афинитета етено-АДП-рибозилираних протеина из ИАЦ-1 ћелијских лизата (Сл. 1ц, д) праћено анализама масне спектрометрије (Сл. 1е) идентификовало је протеин у овом појасу као ЦД25. Анализе имунопреципитације са антитијелима специфичним за ЦД25 провериле су идентитет протеина у овом истакнутом опсегу од 50 кД као ЦД25, тј. Овај се осиромашио из лизата ћелија и опоравио у имунопреципитату (слика 1б, упоредите траке 1, 2 и 4) .

Image

(а) ИАЦ-1 ћелије су обојене мАбс-коњугованим флуорохромом специфичним за АРТЦ2.2 и ЦД25 и анализиране проточном цитометријом. (б) ИАЦ-1 ћелије су инкубиране са 32 П-НАД + . Ћелијски лизати су подвргнути имунопреципитацији, протеини су величином фракционирани помоћу СДС-ПАГЕ, а уграђена радиоактивност је откривена ауторадиографијом. Стазе 1, 2: ћелијски лизати пре и после таложења ЦД25; трака 3: контролисање падавина са протеином Г, трака 4: таложење са анти-ЦД25 (ПЦ61). (ц – е) ИАЦ-1 ћелије су инкубиране са етхено-НАД + . Етено-АДП-рибозилирани протеини су пречишћени из ћелијског лизата користећи афинитетну колону са мАб 1Г4 специфичним за етено-аденозин. Везани протеини су елуирани у четири фракције са етно-аденосином. Протеини у ћелијском лизату (линија 1), проток колоне (линија 2), испирање (трака 3), и елуати (траке 4–7), величином су фракционисани помоћу СДС-ПАГЕ. Укупни протеин је визуелно приказан Цоомассие бојењем (ц), етно-АДП-рибозилирани протеини су визуализовани паралелном анализом имуноблота са мАб 1Г4 (д). Опсег 50 кД у траци 5 (панел ц) је изрезан из гела и подвргнут варењу трипсина и масеној спектрометрији наноспреја. МАЛДИ-ТОФ спектар фрагментираног триптоптичког пептида од 1892, 9 кД (е). Кутија са бројевима означава масе појединих врхова пептида, бројеви изнад заграда показују разлике у маси између суседних врхова пептида. Секвенција аминокиселина Н-терминалног пептида ЦД25 приказана је на врху са бројевима који одговарају маси одговарајућих пептидних фрагмената. Резултати су репрезентативни за три независна експеримента.

Слика пуне величине

АРТЦ2.2 АДП-рибозилати ЦД25 на Р35 на месту везивања ИЛ-2

3Д структура људског ИЛ-2 у комплексу са његовим хетеротримерним рецептором открива да је свих осам остатака аргинина у видљивом делу ванћелијског домена ЦД25 локализовано на површини протеина и на тај начин је потенцијално доступно за АДП-рибозилацију (допунска Сл. 1б, Сл. 2а). Да бисмо тестирали који од ових аргинина може бити АДП-рибозилилиран помоћу АРТЦ2.2, појединачно смо сваки од аргининских остатака супституисали лизином помоћу месту-усмерене мутагенезе. Поред тога, купили смо синтетичку цДНА конструкцију ЦД25, у којој је свих 11 аргинина супституисано лизином (РаллК). У овом конструкту, сваки лизин смо супституирали аргинином, стварајући варијанте ЦД25 које носе само један остатак аргинина. Сваки мутант је кофефициран у ХЕК (хумани ембрионални бубрег) ћелије заједно са АРТЦ2.2. 40 х након трансфекције, нивои експресије ћелијске површине су процењени проточном цитометријом применом мТЦ-а специфичних за АРТЦ2.2 и ЦД25 (допунска слика 2). Паралелни аликвоти ћелија инкубирани су са 32 П-обележеним НАД + . Радиоактивно обележавање ЦД25 и осталих ћелијских површинских протеина процењено је СДС-ПАГЕ ауторадиографијом (Сл. 2б, ц).

Image

(а) Шематски дијаграм 11 остатака аргинина у ванћелијским доменима хуманог ЦД25. Бројеви одговарају положају унутар секвенце аминокиселина нативног протеина, тј. Након уклањања сигналног пептида. Исјечене линије означавају остатке који нису видљиви у 3Д-структури ИЛ-2 рецептора сложене са ИЛ-2 (2ерј). ТМД: трансмембрански домен. (б, ц) ХЕК ћелије су кофефициране експресијским векторима за АРТЦ2.2 или или не-АДП-рибозилирани контролни антиген (цо), дивљи тип ЦД25 (ВТ) или ЦД25 варијанте. Анализирани мутанти ЦД25 укључују појединачне Р> К мутанте ( Б ), синтетичку конструкцију у којој су сви остаци аргинина у ванћелијском домену замењени лизином (РаллК), и варијанте РаллК које носе појединачне К> Р назад мутације (ц). 48 сати након трансфекције, ћелије су инкубиране са 32 П-НАД + . Радиоактивно обележени протеини откривени су СДС-ПАГЕ ауторадиографијом. Резултати су репрезентативни за четири независна експеримента. Бројеви показују релативни интензитет означавања појединих опсега (значи од четири понављања).

Слика пуне величине

Резултати су открили да су сви појединачни Р> К мутанти ЦД25 и даље служили као мета за АРТЦ2.2, сугеришући да је ЦД25 АДП-рибозилилиран на више места (Сл. 2б). Слични резултати су добијени за миша ЦД25 (допунска слика 3). Ово подсећа на претходне извештаје о АДП-рибозилацији П2Кс7 и дефензину 1, који су АДП-рибозилилирани у више од једног аргинина 38, 39 . РаллК, мутант у којем су сви аргинини замењени лизином, није уградио ниједну радио-ознаку (Сл. 2ц, трака 1) упркос робусној експресији на ћелијској површини (Допунска слика 2). Ово откриће потврђује да је АДП-рибозилација ЦД25 помоћу АРТЦ2.2 специфична за аргинин. Четири РаллК реверзијска мутаната која носе један остатак аргинина радио-обележена су АРТЦ2.2, што указује да та места у принципу могу служити као места АДП-рибозилације за АРТЦ2.2 (Сл. 2ц, Р32, Р35, Р67, Р140) . Три од ових остатака (Р32, Р35, Р140) су сачувани у мишјем ЦД25 (допунска слика 4). Четврти остатак (Р67) смештен је у везиву између два суши домена који није видљив у 3Д структури. Јаче означавање реверзног Р67 указује да је овај остатак приступачнији за АРТЦ2.2 од осталих ревертаната. Р35 је део дупликата аргинина (Р35 / Р36), као и примарна места АДП-рибозилације на П2Кс7 и дефензина 1 38, 39 . Р35 се налази унутар ИЛ-2 везујућег интерфејса (допунска слика 1), Р32 и Р140 су смештени на ивицама првог и другог суши домена, односно Р67 се налази на флексибилном повезивачу између две суши домене, што је није видљиво у 3Д-структури комплекса рецептора ИЛ-2 (допунска слика 4).

АДП-рибозилација инхибира везивање мАб 7Д4, али не и мАб ПЦ61

АДП-рибозилација резултира везањем кабастог остатка и даје локалну промену набоја (од позитивно наелектрисаног аргинина до негативно наелектрисаног АДП-рибосиларгинина) 40 . Стога је замисливо да АДП-рибозилација ЦД25 на или близу места везивања антитела може да омета везивање антитела. Да бисмо се позабавили овим питањем, инкубирали смо мишје спленоците у одсуству или присуству НАД + након чега је уследило обојење са ЦД25-специфичним мАбс ПЦ61 и 7Д4 (Сл. 3). Резултати откривају НАД + инхибицију бојења бојења од 7Д4, али мало ако је било какав ефекат НАД + на везивање ПЦ61 (Слика 3б), што указује да АДП-рибозилација утиче на епитоп препознат у 7Д4, али не и на епитоп препознат од ПЦ61.

Image

Спленоцити из ДЕРЕГ мишева инкубирани су у одсуству или присуству назначених концентрација НАД + пре бојења са мХаб-коњугираним флуорохромом усмереним против ЦД4 и ЦД25 (мАб ПЦ61 или мАб 7Д4). Гатинг је извршен на ЦД4 + ћелијама. (а) Репрезентативне тачкасте парцеле ћелија инкубиране у одсуству или присуству 12 μМ НАД + . (б) Проценти ЦД4 + ГФП + ћелија обојених анти-ЦД25 мАбс приказаним као функција концентрације додате НАД + . Резултати су репрезентативни за два независна експеримента.

Слика пуне величине

АДП-рибозилација инхибира везивање ИЛ-2 и пролиферацију ЦТЛЛ-2 ћелија зависних од ИЛ-2

Да бисмо утврдили да ли АДП-рибозилација утиче на везивање ИЛ-2 и ИЛ-2 зависне ћелијске пролиферације, окренули смо се ИЛ-2-зависној ћелијској линији ЦТЛЛ-2 (Сл. 4). За разлику од ИАЦ-1 ћелија, ЦТЛЛ-2 ћелије се не размножавају у одсуству егзогеног ИЛ-2. Штавише, за разлику од ИАЦ-1 ћелија, ЦТЛЛ-2 ћелије не експримирају АРТЦ2.2 и показују мало ако било која АРТ активност ћелијске површине (Сл. 4а, панели 2 и 3). После стабилне трансфекције са АРТЦ2.2, ЦТЛЛ-2 АРТЦ2.2 ћелије стичу способност АДП-рибозилата ћелијских површинских протеина (слика 4а, панел 6), са ЦД25 као истакнутим циљем (слика 4б). Доступност ЦТЛЛ-2 ћелија која изражава АРТ и негативне АРТЦ2.2 омогућава директну процену ефеката АДП-рибозилације на ћелијске функције, нпр. Упоређивањем одговора ЦТЛЛ-2 АРТЦ2.2 и родитељске ЦТЛЛ-2 ћелије на ванћелијске. НАД + .

Image

(а) Родитељске и трансфектиране ЦТЛЛ-2 ћелије које нису заражене од стране АРТЦ2.2 инкубиране су етхено-НАД + и обојене мАбс-коњугованим флуорохромом, специфичним за ЦД25, АРТЦ2.2, и етно-аденосином и анализиране проточном цитометријом. (б) ЦТЛЛ-2 АРТЦ2.2 ћелије су инкубиране са 32 П-НАД + и ћелијски лизати су подвргнути имунопреципитацији са анти-ЦД25 и СДС-ПАГЕ ауторадиографијом као на слици 1б. Стазе 1, 2: лизати пре и после таложења ЦД25, трака 3: контролисање падавина са протеином Г, трака 4: таложење са анти-ЦД25. (ц) ЦТЛЛ-2 и ЦТЛЛ-2 АРТЦ2.2 ћелије су претходно инкубиране у одсуству или присуству НАД + или необележених ИЛ-2. Ћелије су затим инкубиране са биотинилираним ИЛ-2 пре додатка стрептавидина коњугованог са флуорохромом и анализе проточном цитометријом. (д) ЦТЛЛ-2 и ЦТЛЛ-2 АРТЦ2.2 ћелије су посејане у плочу са културом од 24 јажице (3 × 10 4 / отвор ) и инкубиране током четири дана у медијуму који садржи назначене концентрације ИЛ-2. Средња вредност која недостаје или садржи НАД + додавана је сваких 12 сати. Број ћелија процењен је проточном цитометријом уз помоћ Труцоунт перлица (БД). Резултати су репрезентативни за два независна експеримента.

Слика пуне величине

Да би се проценило да ли АДП-рибозилација ЦД25 утиче на везивање ИЛ-2, ЦТЛЛ-2 и ЦТЛЛ-2 АРТЦ2.2 ћелије су се инкубирали током 15 минута са биотинилираним ИЛ-2 у одсуству или присуству необележених ИЛ-2 или НАД + . Везање биотинилираног ИЛ-2 је затим процењено са АПЦ-коњугираним стрептавидином (слика 4ц). Резултати показују да пре-инкубација са НАД + инхибира везивање ИЛ-2 са ЦТЛЛ-2 АРТЦ2.2 ћелијама, али не и родитељским ЦТЛЛ-2 ћелијама (сиви засјењени хистограми). Супротно томе, контролне анализе изведене пре-инкубацијом ћелија са необележеним ИЛ-2 блокираним везањем биотинилираног ИЛ-2 од стране обе, ЦТЛЛ-2 АРТЦ2.2 и родитељске ЦТЛЛ-2 ћелије (слика 4ц, испрекидани хистограми).

Да би се проценило да ли АДП-рибозилација утиче на пролиферацију ћелија зависних од ИЛ-2, ЦТЛЛ-2 и ЦТЛЛ-2 АРТЦ2.2 ћелије су испражњене од ИЛ-2 испирањем са ПБС, а потом инкубацијом током 6 сати у медијуму без ИЛ-2 . Затим су ћелије посејане у плоче са 24 јажице у медијуму који садржи серијска разблажења ИЛ-2 и ћелије су култивисане даље у одсуству или присуству НАД + током 3, 5 дана. Број ћелија је процењен проточном цитометријом користећи Труцоунт куглице (Сл. 4д). Резултати показују да НАД + не утиче на пролиферацију родитељских ћелија ЦТЛЛ-2 док значајно смањује пролиферацију ћелија ЦТЛЛ-2 АРТЦ2.2 у малим и средњим дозама ИЛ-2 (испод 5 нг / мл). Ови резултати сугеришу да АДП-рибозилација ћелијских површинских протеина интерферира са везањем ИЛ-2 и са ИЛ-2 сигнализацијом.

АДП-рибозилација инхибира ИЛ-2-индуковану фосфорилацију СТАТ5

Познато је да везање ИЛ-2 покреће пут трансдукције сигнала што резултира активирањем СТАТ5 фосфорилацијом. Потоње се може визуелно приказати проточном цитометријом са мАб 47 специфичним за пСТАТ5 (Сл. 5). Да би се проценило да ли АДП-рибозилација интерферира са ИЛ-2-индукованом фосфорилацијом СТАТ5, ЦТЛЛ-2 и ЦТЛЛ-2 АРТЦ2.2 ћелије су третиране НАД + и потом анализиране ФАЦС-ом за фосфорилацију изазване ИЛ-2 СТАТ5 ( Сл. 5а). Резултати показују да третман ванћелијским НАД + инхибира ИЛ-2-индуцирану фосфорилацију СТАТ5 у случају ЦТЛЛ-2 АРТЦ2.2 ћелија (Сл. 5а, панел 2, засјењени хистограм), али не и родитељске ЦТЛЛ-2 ћелије (Сл. 5а, панел 1). Превенција АРПТ2-катализоване АДП-рибозилације ћелијских површинских протеина са АРТЦ2.2-блокирајућим нанотелом с + 16а 41 потпуно је спречила инхибицију СТАТ5 фосфорилације у ЦТЛЛ-2 АРТЦ2.2 ћелијама у присуству НАД + (Слика 5б, панел 2), потврђујући да ефекат НАД + на СТАТ5 фосфорилацију зависи од АРТЦ2.2 катализоване АДП-рибозилације.

Image

(а) ЦТЛЛ-2 и ЦТЛЛ-2 АРТЦ2.2 ћелије су претходно инкубиране у одсуству или присуству НАД + пре стимулације ИЛ-2 током 15 мин. Ћелије су фиксиране и обојене антителом коњугованим са флуорохромом против фосфорилираног СТАТ5 (пСТАТ5). Контролне ћелије су инкубиране без НАД + или ИЛ-2. (б) ЦТЛЛ-2 и ЦТЛЛ-2 АРТЦ2.2 ћелије су претходно инкубиране са нанотилом који блокира АРТЦ2.2 с + 16а (нб) пре додавања НАД + и стимулације са ИЛ-2. (ц) Трегови су сортирани ФАЦС из мишјих дивљих врста ДЕРЕГ и инкубирани у одсуству или присуству НАД + пре стимулације ИЛ-2 и бојења за пСТАТ5. Резултати су репрезентативни за два независна експеримента.

Слика пуне величине

Фокп3 + Трегс који природно постоје и конститутивно изражавају ЦД25 и АРТЦ2.2 37 . ДЕРЕГ-трансгени мишеви експримирају фузијски протеин дифтеријског токсина и ГФП под контролом фокп3 промотора, омогућавајући визуализацију живих Трегс проточном цитометријом 42 . Доступност АРТЦ2 - / - ДЕРЕГ мишева 37 омогућава директно оцењивање ефекта НП + -зависне АДП-рибозилације на Трегс, нпр. Упоређивањем одговора Трегс из АРТЦ2 - / - и дивљих врста ДЕРЕГ мишева са ванћелијским НАД + (Слика 5ц и додатна слика 5). Третирање ФАЦС сортираних Трегова са екстрацелуларним НАД + инхибираним ИЛ-2-индукованом фосфорилацијом СТАТ5 (Сл. 5ц). Слично томе, третман несортираних спленоцита НАД + инхибира фосфорилацију СТАТ5 у ћелијама дивљих врста, али не и у АРТЦ2 - / - Трегс (допунска слика 5а-ц). Претходно смо показали да АДП-рибозилација индукује стварање гена П2Кс7 јонског канала, што резултира приливом калцијума и екстернализацијом фосфатидилсерина 38 . Да бисмо утврдили да ли је инхибиција фосфорилације СТАТ5 изазваног ИЛ-2 посредована П2Кс7, анализирали смо ефекте ванћелијског НАД + такође на ћелије из П2Кс7 - / - (АРТЦ2 + / + ) ДЕРЕГ мишева (допунска слика 5е) . Резултати показују да третман НАД + инхибира СТАТ5 фоспорилацију такође у пречишћеним Треговима из П2Кс7 - / - (АРТЦ2 + / + мишева), што указује да је овај ефекат независан од активирања П2Кс7.

Дискусија

Овде приказани резултати идентификују ЦД25, α ланац рецептора интерлеукин-2, као главни циљ АДП-рибозилације ектозимом АРТЦ2.2 повезаним са токсином (Слика 1) и пружају увид у улогу АДП- рибозилација ЦД25. Тестови АДП-рибозилације у ћелијама ХЕК-а ко-трансфицираним са АРТЦ2.2 и ЦД25 мутантима идентификовали су Р35 на аргентинском дуплу Р35Р36 као циљно место за АДП-рибозилацију (Слика 2). Ово подсећа на мишји П2Кс7 и хумани дефензин 1, који обојица садрже двоструке аргинине као примарна места АДП-рибозилације, али су додатно АДП-рибозилилирани на осталим остацима аргинина 38, 39 . Р35 је локализован у ИЛ-2 везивајућем региону (допунске слике 1д, 4) 7, 43 . С обзиром да АДП-рибозилација резултира везањем гломазног остатка, претварањем позитивно наелектрисаног аргинина у негативно наелектрисани АДП-рибосиларгинин, није изненађујуће да АДП-рибозилација у овом остатку омета везивање ИЛ-2 (слика 4ц) . Доследно, АДП-рибозилација ЦД25 инхибира ИЛ-2-индуковану фосфорилацију СТАТ5 (Сл. 5а, ц), као и ИЛ-2-зависну ћелијску пролиферацију (Сл. 4ф). Треба напоменути да АДП-рибозилација ЦД25 блокира везивање мАб 7Д4 (Сл. 3), антитела које се обично користи за сортирање Трегс-а уз помоћ зрнца. С обзиром да се ендогени НАД + може ослободити током манипулације ћелија 37, 44, нехотице АДП-рибозилација ЦД25 пре бојења са 7Д4 може да омета сортирање Трегс-а подржано зрнцима. Заиста, АДП-рибозилација посредована НАД + може објаснити пријављене потешкоће за пречишћавање Трегс са ЦД38ко мишева коришћењем сортирања потпомогнутог зрнца 45, јер недостатак НАД-хидролазе у главној ћелијској површини код ових мишева изазива излагање ћелија вишим нивоима ванћелијских НАД + 37, 46 . Недавно смо описали једноставно средство за спречавање ненамерног АДП-рибозилације ћелијских површинских протеина током припреме ћелија из слезине или јетре, тј. Системску ињекцију нанотела које блокира АРТЦ2.2, десет минута пре жртвовања мишева 47 .

Слика 6 илуструје модел по коме АДП-рибозилација ЦД25 обезбеђује регулаторни механизам за подешавање сигнала ИЛ-2, тј. Од сигнализације високог афинитета зависног од ЦД25 до сигнализације независног ниског афинитета ЦД25 преко ЦД122 / ЦД132. У не-инфламаторном окружењу, где је концентрација изванстаничне НАД + ниска, потрошња Трегсове изванстаничне ИЛ-2 лишила би других Т ћелија и НК ћелија ИЛ-2 (Сл. 6а) 48 . Слично томе, системске ињекције ниских доза ИЛ-2 могу резултирати преференцијалном експанзијом Трегс 17, 19, 20, 21, 49 . У инфламаторном окружењу, где стресиране и оштећене ћелије ослобађају велике количине НАД + у изванстанично одељење 44, 50, АДП-рибозилација ЦД25 би преусмерила сигнализацију ИЛ-2 из Трегс-а у НК ћелије и ЦД8 + цитотоксичне Т ћелије (Сл. 6б). Овај механизам подешавања ИЛ-2 сигнализације може да опонаша одређена ИЛ-2 антитела која се користе ин виво (Сл. 6ц), тј. Системске ињекције мишјег ИЛ-2 у комплексу са мАбс С4Б6 или ЈЕС6-5ХА или људским ИЛ-2 у комплекс са Маб-602 узрокују преференцијално ширење НК ћелија и цитотоксичне Т ћелије 22, 24, 27 . Поред Трегова који конститутивно изражавају ЦД25, ЦД25 је такође регулисан активираним Т ћелијама након активирања ТЦР (Т ћелијског рецептора) 51 (допунска слика 6). Будући да активирање ТЦР индукује пропадање металопротеазе АРТЦ2.2, активиране Т ћелије су отпорне на АДП-рибозилацију површинских протеина ћелије 52 . Према томе, АДП-рибозилација ЦД25 може бити регулаторни механизам специфичан за Трег. Откривање да неки Трегови изгледају неизређени третманом НАД + (Сл. 5Ц, Допунска слика 5) могу бити последица слабије експресије АРТЦ2.2 или ЦД25 или због диференцијалне локализације ових антигена у плазма мембрани, нпр. Изнутра / споља липидни сплавови 8, 35 . Будуће студије би требале да се позабаве потенцијалним разликама различитих субпопулација Трегова у њиховој осетљивости на регулацију ИЛ-2 посредовану НАД + посредством НАД + .

Image

(а) Трегови конститутивно изражавају високе нивое ЦД25 док ЦД8 + Т ћелије и НК ћелије изражавају само β и γ ланце ИЛ-2 рецептора (ЦД132, ЦД122). У не-упалном окружењу, Трегс конзумира ИЛ-2 због већег афинитета ЦД25 у поређењу са ЦД122 / ЦД132, чиме је ускраћен суседне ЦД8 ћелије и НК ћелије овог цитокина. (б) У инфламаторном окружењу, тј. после ослобађања НАД + из оштећених ћелија, АДП-рибозилација ЦД25 (плави кругови) преусмерава ИЛ-2 из рецептора високог афинитета у β и γ ланце ниског афинитета, омогућавајући ефикасно ширење ЦД8 ћелије и НК ћелије. (ц) Системска ињекција ИЛ-2 у комплексу са антителима која спречавају везивање ИЛ-2 на ЦД25 слично резултира у преференцијалној експанзији ћелија ЦД8 и НК ћелија.

Слика пуне величине

Укратко, овде смо описали претходно непознати механизам за подешавање сигнала помоћу ИЛ-2 помоћу АДП-рибозилације ЦД25. Деловање овог механизма ин виво вероватно зависи од контекста у којем су Т ћелије изложене НАД + . Према томе, на местима где се НАД + ослобађа у великим количинама из оштећених ћелија, као што је током литске вирусне инфекције, АДП-рибозилација ЦД25 на Трегс погодује пролиферацији и функцији ЦД8 + ефекторских Т ћелија, побољшавајући тако искорјењивање патогена. Супротно томе, у здравим ткивима, где је мало ако се ослободи било који НАД +, функција Трег не би била инхибирана АДП-рибозилацијом, омогућавајући ИЛ-2 посредовано ширење Трегс-а и ефикасно сузбијање потенцијално ауто-реактивних Т ћелија.

Методе

Мишеви и ћелије

АРТЦ2 - / - мишеви 53 и П2Кс7 - / - мишеви 54 су враћени у Ц57БЛ / 6 ВТ и ДЕРЕГ мишеве 42 на Ц57БЛ / 6 позадини током 12 генерација и одржавани су под специфичним условима без патогена у централном животињском објекту УКЕ . Сви експерименти су изведени према државним смерницама уз одобрење локалног институционалног регулаторног одбора (матични бројеви ОРГ153 и А10а). ИАЦ-1 лимфомске ћелије, љубазно обезбедјене од Јиргена Лохлера, Хеинрицх Петте Институте, Хамбург, Немачка, узгајане су у РПМИ-1640 уз додатак 10% ФЦС, 2 мМ глутамина, 2 мМ натријум-пирувата. ИЛ-2 зависна ћелијска линија ЦТЛЛ-2, љубазно обезбеђена од Марц Палларди, ИНСЕРМ У 461, Цхатенаи-Малабри, Француска, одржавана је у комплетном медијуму допуњеном 10 нг / мл хуманог рекомбинантног ИЛ-2 (10000 У / мл, Роцхе) и 0, 0001% 2-меркаптоетанола. ЦТЛЛ-2 ћелије су стабилно трансфициране експресијским конструктом за АРТЦ2.2 (пМЕ.ЦД8ЛФ-АРТЦ2.2) 55 . Трегови су сортирани ФАЦС као ГФП + ћелије из примарних ћелија слезене ДЕРЕГ мишева на 4 ° Ц. Алтернативно, након лизе еритроцита са Ацк лизерским пуфером (Био Вхиттакер) и исцрпљености Б-ћелија са овчјим анти-мишјим ИгГ (Инвитроген) коњугованим са Динабеад-ом, Трегс је позитивно изабран сортирањем магнетним ћелијама помоћу ПЕ коњугованог анти-ЦД25 (7Д4) и магнетна зрнца коњугована анти-ПЕ антитела према упутствима произвођача (Милтении Биотец). Чистоћа Трегс-а праћена је проточном цитометријом и била је> 90%.

Проточна цитометрија

МАбс коњуговани са флуорохромом коришћени су против мишјег ЦД25 (ПЦ61, 7Д4) хуманог ЦД25 (М-А251), ЦД4 (ГК1.5), АРТЦ2.2 (Ника102), етено-аденозина (1Г4) и пСТАТ5 (47). Обојене ћелије су анализиране помоћу ФАЦС Цанто ИИ (БД) и ФловЈо софтвера (ТриСтар).

Мутагенеза и ћелијска трансфекција усмјерена на локације

Кодирајуће регије за миша и хумани ЦД25 су ПЦР-амплификоване из ИАЦ-1 лимфомских ћелија и од ЦонА-стимулисаних ПБЛс, и клониране у пЦМВ-Спорт6 вектор (Инвитроген). Остаци аргинина супституисани су лизином користећи мутагенезу усмерену на локацију. Синтетичка цДНА која кодира ЦД25 у којој су сви остаци аргинина у ванћелијском домену замењени лизином, купљена је од Генеарт (Инвитроген) и клонирана у пЦМВ-Спорт6. Конструкти експресије (2 μг на 106 станица) су трансфицирани у ЦТЛЛ-2 ћелије електропорацијом и у ХЕК ћелије помоћу јетПЕИ трансфекцијског реагенса (Полиплус).

Пречишћавање етено-АДП-рибозилираних протеина и масна спектрометрија

ИАЦ-1 ћелије (10 9 ћелија у 10 мл) инкубирају се током 15 минута на РТ са 10 µМ етхено-НАД + (Сигма) и исперу два пута у ПБС пре лизе у 1% Тритон-Кс 100 током 20 минута на 4 ° Ц . Ћелијски лизати су разјашњени центрифугирањем велике брзине (20 мин 15.000 г) пре проласка кроз афинитетну колону од 1 мл која садржи мАб 1Г4 имобилизован на Амино-Линк Матрик (Пиерце). Колона је обилно испрана са 1% Тритон Кс-100 и ПБС, везани протеини су елуирани са 1 мМ етано-аденозина у ПБС / 0, 1% Тритон-Кс-100. Елуирани протеини су величином фракционирани помоћу СДС-ПАГЕ. Протеини су обојени плавом бојом Цоомассие и видљиви тракови су исечени. Паралелни гел је избрисан на ПВДФ мембрану и подвргнут је Вестерн-Блот анализама са мАб 1Г4 специфичним за етено-аденозин и анти-мишјим ИгГ-коњугираним пероксидазом. Из гела се изрезује истакнути 50 кД опсег. Након редукције дисулфидних веза са ДТТ (10 мМ, 56 ° Ц, 30 мин) и модификације цистеина јодацетамидом (55 мМ, РТ, 20 мин), протеини су подвргнути дигестији у гелу са трипсином (5 нг / μл у 50 мМ НХ4 ХЦО 3, 37 ° Ц, 16 х). Пептиди су екстраховани са 50% ацетонитрила / 5% мравље киселине, осушени у вакуум концентратору, поново растворени у 5% метанол / 5% мравље киселине, десалинисани на Ц18 μЗипТип (Миллипоре), елуирани са 1 μл 60% метанола / 5% мравље киселине, и анализирана нано-електроспремском масном спектрометријом у КТОФ ИИ инструменту (Мицромасс). МС / МС спектри добијени фрагментацијом изазваном колизијом након ручног избора прекурсора процењени су и ручно и Масцот МС / МС алгоритмом претраживања верзије 2.2 (Матрик Сциенцес, Лондон, Велика Британија).

Тестови радио-АДП-рибозилације

ХЕК ћелије су пролазно кофефициране са АРТЦ2.2 (1 µг / 106 6 ћелија) и ЦД25 (2 µг / 106 ћелија) у раствору и постављене паралелно аликвотима на плоче са 6 јажица пре-обложене поли-Л-лизином . 48 х након трансфекције једна аликвота је коришћена за праћење ефикасности трансфекције помоћу ФАЦС анализа помоћу мАбс усмерених против АРТЦ2.2 и ЦД25. Лепљене ћелије друге аликвоте нежно су испране претходно загрејаним Кс виво медијумом без серума (Био Вхиттакер) и затим инкубиране у Кс виво медијуму без серума који садржи 32 П-НАД + (2, 5 µЦи, 0, 4 µМ) током 20 мин на 37 ° Ц. Ћелије су нежно испране претходно загрејаним Кс виво медијумом, а затим лизиране у ПБС, 1% Тритон-Кс100, 1 мМ АЕБСФ (Сигма) током 20 минута на 4 ° Ц. Нерастворљиви материјал је гранулиран брзином центрифугирања великом брзином (15 мин 13.000 г), а солубилизовани протеини мембране су фракционирани по величини на префабрисаним СДС-ПАГЕ геловима (Инвитроген) (1 × 10 5 ћелијских еквивалената / стаза). Протеини су откривени Цоомассие бојење гелова. За откривање радиоактивно обележених протеина гели су изложени рендгенском филму на -80 ° Ц током 6 х-6д.

Имунопреципитација ЦД25

ЦД25-специфични мАб ПЦ61 је коњугован са зрнцима амино везе према упутствима произвођача (Пиерце). После инкубације са ћелијским лизатима 60 мин на 4 ° Ц, куглице су испране са ПБС, 1% Тритон-Кс 100. Узорци су затим инкубирани на 70 ° Ц током 15 мин, а матрикс је пелетиран центрифугирањем. Протеини елуирани из матрице анализирани су СДС-ПАГЕ ауторадиографијом као што је горе описано.

Тест ћелије пролиферације

Да би се испразниле ћелије ЦТЛЛ-2 из ИЛ-2, ћелије су испране два пута и инкубиране 6 х у медијуму за културу без ИЛ-2. Ћелије су посејане у плочу са 24 јажице (3 × 104 ћелије по лежишту) и култивисане у медијуму који садржи серијска разблажења ИЛ-2. Мала аликвотна средина која садржи или недостаје НАД + (крајња концентрација 100 µМ) додата се сваких 12 сати. Број ћелија одређен је после четири дана проточном цитометријом коришћењем Труцоунт ™ зрнца (БД).

СТАТ5 тест фосфорилације

Примарни спленоцити и пречишћени Трегови (1 × 105 ћелија / 100 μл) инкубирају се у одсуству или присуству 30 μМ НАД + током 15 мин на 4 ° Ц пре додавања 2, 5 У / мл мишјег ИЛ-2 (еБиосциенце) и даље инкубација 5 минута на 37 ° Ц. Ћелије су затим фиксиране у 2% ПФА током 10 минута на 37 ° Ц и 90% метанола на -20 ° Ц пре бојења са АПЦ-коњугираним антифосфо-СТАТ5 према упутствима произвођача (БД). Спленоцити су супротстављени анти-ЦД4 пре инкубације са ИЛ-2. У неким експериментима, ћелије су прединкубиране током 15 мин у присуству нанотело које блокира АРТЦ2.2 с + 16а (50 нг / мл) 41 .

Интерлеукин-2 тест везивања

1 × 10 5 ћелије инкубиране су са 5 нг биотинилираног интерлевкина-2 (Р&Д системи) или 10 нг биотинилираног инхибитора соје-трипсина у 100 μл ПБС, 0, 1% БСА у трајању од 60 минута на 4 ° Ц пре додавања 100 нг стрептавидина коњугираног АПЦ-ом. (БД). Паралелни аликвоти ћелија су претходно инкубирани са или без необележених мИЛ-2 (500 нг, еБиосциенце) или 50 µМ НАД + .

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Додатне информације

    Додатне информације

Коментари

Подношењем коментара пристајете да се придржавате наших Услова и Смерница заједнице. Ако нађете нешто злоупотребно или то није у складу са нашим условима или смерницама, означите то као непримерено.