Твеак погодује фосфат-индуцирана калцификација васкуларних ћелија глатких мишића канонским и неканонским активирањем нфκб | ћелијска смрт и болест

Твеак погодује фосфат-индуцирана калцификација васкуларних ћелија глатких мишића канонским и неканонским активирањем нфκб | ћелијска смрт и болест

Anonim

Субјекти

  • Апоптоза
  • Калцификација
  • Ћелијска сигнализација
  • НФ-каппаБ

Апстрактан

Васкуларна калцификација (ВЦ) повезана је са повећаном кардиоваскуларном смртношћу током старења, хроничном бубрежном болешћу (ЦКД), дијабетес мелитусом типа 2 (Т2ДМ) и атеросклерозом. ТНФ сличан индуктор апоптозе (ТВЕАК) недавно се појавио као нови биомаркер за дијагнозу и прогнозу кардиоваскуларних болести. За ТВЕАК везање за његов функционални рецептор Фн14 пријављено је да промовише неколико корака напредовања атеросклеротског плака. Међутим, тренутно нису доступне информације о улози ТВЕАК / Фн14 у развоју медијалне калцификације која је веома заступљена у старењу, ЦКД и Т2ДМ. Ова студија је истраживала укљученост ТВЕАК-а у калцификацију хуманих васкуларних глатких мишићних ћелија (х-ВСМЦ) ин витро . Извештавамо да ТВЕАК везивање за Фн14 промовише калцификацију х-ВСМЦ индуковану неорганским фосфатима, фаворизује х-ВСМЦс остеогену транзицију, смањује ацта2 и мих11 и повећава бмп2 мРНА и ткивно неспецифичну алкалну фосфатазу (ТНАП) и повећава активност ММП9. Блокада канонског пута НФ κ Б смањена је за 80% ТВААК прокалцифична својства и смањена остеогена транзиција, активност ТНАП и ММП9. Блокада неканонске НФ κ Б сигнализације сиРНА циљајући РелБ смањена је за 20% ТВЕАК про-калцифичне ефекте и смањила ТВЕАК-индуцирани губитак контрактилног фенотипа х-ВСМЦс и ММП9, без модулирања бмп2 мРНА или ТНАП активности. Инхибиција ЕРК1 / 2 активације инхибитором МАПК киназе није утицала на ТВЕАК про-калцифична својства. Наши резултати сугерирају да ТВЕАК / Фн14 директно фаворизује калцификацију х-ВСМЦ-а индукованих анорганским фосфатима активирањем и канонских и неканонских НФ κ Б пута. С обзиром на доступност неутралишућих анти-ТВЕАК стратегија, наша студија баца светлост на оси ТВЕАК / Фн14 као нови терапеутски циљ у превенцији ВЦ.

Главни

Васкуларна калцификација (ВЦ) карактерише накупљање калцијумових и фосфатних соли унутар кардиоваскуларног система. ВЦ се може развити у интими и медијима судова, као и у срчаним залистацима и повезан је са повећаном кардиоваскуларном смртношћу. 1 ВЦ је резултат неравнотеже између индуктора калцификације (нпр., Поремећаји минерала, упале) и инхибитора (нпр. Фетуин А, Матрик Гла протеин, пирофосфат (ППи)). 2 Повећани ниво неорганског фосфата (Пи) или Ца2 +, упала или оштећење крвожилног система доводе до остео-хондрогене претворбе ћелија глатких мишића васкула (ВСМЦ), резидентних фибробласта или интерстицијских ћелија у мировању, које новооткривају фактор транскрипције повезан са рунтом 2, ткивна неспецифична алкална фосфатаза (ТНАП) и коштани морфогенетски протеин 2 (БМП2). Ово је повезано са ослобађањем прокалцифичних матрикула везикуса и ремоделирањем ванћелијског матрикса (синтеза колагена типа И и разградња еластина). Поред тога, ово прокалцифично окружење подстиче апоптозу васкуларне ћелије и ослобађање апоптотичких тела која су у стању да изваде хидроксиапатит. 3

ВЦ је веома распрострањен у старењу, хроничној болести бубрега (ЦКД), дијабетес мелитусу типа 2 (Т2ДМ) и атеросклерози. Старење 4 и ЦКД 5 повезани су са хроничном хроничном системском упалом, а упала погоршава болести повезане са старењем, као што су атеросклероза и Т2ДМ. 6 Недавне студије пружиле су уверљиве доказе да је ВЦ повезан са инфламацијом и појачан је одређеним упалним цитокинима. Међутим, прецизни цитокини, а самим тим и терапеутски циљеви, нису адекватно окарактерисани. Конкретно, неки чланови ТНФ породичне породице потичу Пи-индуцирану ВСМЦ остеогену транзицију и накнадну калцификацију. 7 Слаби индуктор апоптозе ТНФ-а (ТВЕАК) је ТНФ супер-породични цитокин који се недавно појавио као нови биомаркер за дијагнозу и прогнозу кардиоваскуларних болести. 8 ТВЕАК везан мембраном може се обрадити фурином у растворљиву ТВЕАК (сТВЕАК). 9 ТВЕАК везање на његов молекул 14 који индукује фактор раста фибробласт-рецептор-фибробласт (Фн14) активира сигнализацију активирану митогеном протеин киназом (МАПК) и промовише НФ κ Б активацију и канонским и неканонским путевима. Као последица тога, ТВЕАК регулише ћелијску пролиферацију, миграцију, диференцијацију, смрт, упалу, фиброзу и ангиогенезу на начин зависан од типа ћелије и микро окружења. 10, 11, 12, 13

ТВЕАК се изражава нормалним и патолошким стјенкама артерија. Иако ТВЕАК може да се регулише после повреде, 15 промена његове експресије гена су обично умерене. Супротно томе, експресија Фн14 у здравој васкулатури обично је ниска или није видљива. Међутим, брзо се и високо регулише у патолошким условима, као што је описано у анеуризмама аорте и атеросклеротским плаковима каротида, осетљиви на ТВЕАК ефекте. 14, 16 Подаци са животињских модела указују да ТВЕАК / Фн14 доприноси стварању анеуризме абдоминалне аорте. 17 Поред тога, осовина ТВЕАК / Фн14 промовише неколико корака развоја атеросклеротског плака, укључујући иницирање, напредовање, дестабилизацију / руптура и накнадну тромбозу. 8 Конкретно, код АпоЕ КО мишева, лечење анти ТВЕАК-ом смањило је упалу повезану са напредовањем атеросклеротског плака, укључујући последњи корак калцификације плака. 18

Иако ови подаци сугерирају улогу ТВЕАК / Фн14 оси у патофизиологији интималне калцификације у атеросклерози, није јасно да ли је смањена атеросклеротска калцификација плака код мишева третираних анти ТВЕАК резултат нижег атеросклеротског оптерећења или директног ефекта ТВЕАК-а о интимној калцификацији. Надаље, тренутно нису доступне информације о улози ТВЕАК / Фн14 у медијалној калцификацији, као што је уочено у ЦКД-у и другим условима. Ова студија имала је за циљ да процени потенцијал ТВЕАК-а да директно промовише хумани ВСМЦ (х-ВСМЦ) калцификацију ин витро.

Резултати

Осовина ТВЕАК / Фн14 фаворизује калцификацију индуковану Пи-ом и х-ВСМЦс остеогену транзицију

Да би се истражила способност ТВЕАК-а да модулира х-ВСМЦ минерализацију, ћелије су се инкубирале 7 дана у прокалцифичним условима (3 ммол / л Пи) у комбинацији са повећањем концентрације ТВЕАК (1–200 нг / мл). У присуству 3 ммол / л Пи, ТВЕАК је значајно повећао таложење минерала на начин који зависи од концентрације, што је процењено Ализарин црвеним бојењем (Слика 1а). ТВЕАК није показао никакав ефекат на х-ВСМЦ калцификацију када Пи није додат у културни медијум (Додатна слика С1). Даљњи експерименти користили су 100 нг / мл ТВЕАК-а, јер је то била најнижа концентрација ТВЕАК-а која значајно погодује калцификацији индукованој Пи-ом, мада је примећен тренд од 1 нг / мл. На одрживост и пролиферацију х-ВСМЦ није утицао Пи или ТВЕАК (допунска слика С2). Смањење регулације Фн14 сиРНА (допунска слика С3А) умањило је ТВЕАК ефекте на Пи-индуковану калцификацију у поређењу са кодираним трансфектираним ћелијама (Слика 1б).

Image

ТВЕАК / Фн14 промовише калификацију х-ВСМЦ индуковану Пи-ом кроз активацију Фн14. ( а ) Утицај ТВЕАК-а на таложење минерала изазваним Пи (црвено бојење Ализарином). х-ВСМЦсс су култивисани 7 дана у прокалцифичним условима (3, 0 ммол / л Пи) у присуству или одсуству ТВЕАК-а (1–200 нг / мл) у медијуму који садржи 1% ФБС. Ваге: 500 μ м. * П <0, 05 и ** П <0, 01 у односу на ћелије изложене 3, 0 ммол / л Пи без ТВЕАК-а. Резултати представљају три независна експеримента изведена у три примерка. Шипке грешака представљају СЕМ ( б ) Утицај смањења регулације Фн14 на калцификацију хЕ-ВСМЦ-а индуковану ТВЕАК-ом у про-калцифичним условима (бојење Ализарином). Ваге: 500 μ м. * П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије без ТВЕАК-а. П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије изложене ТВЕАК-у. Резултати представљају три независна експеримента изведена у три примерка. Траке грешака представљају СЕМ НС, нису значајне

Слика пуне величине

Да бисмо разумели како активирање оси ТВЕАК / Фн14 промовише ин-витро индуцирану х-ВСМЦс индуковану Пи-ом, утицај ТВЕАК-а на остеогену транзицију х-ВСМЦ-а, активност ТНАП-а и активност матричне металопротеиназе (ММП) процењен је у оба не-калцифична (1.1 ммол / л Пи) и прокалцифични (3.0 ммол / л Пи) услови. Подаци добијени кРТ-ПЦР показали су да је 7-дневна изложеност 100 нг / мл ТВЕАК-а смањила за око 70% експресију контрактилних маркера ацта2 и мих11 у некалцифичним условима (слике 2а и б) и значајно појачана за око три -струко смањење оба маркера у прокалцифичном окружењу (слике 2а и б). Што се тиче х-ВСМЦс остеогене конверзије, ТВЕАК је порастао за 60% бмп2 мРНА експресију у некалцифичном стању и покренуо троструко повећање нивоа бмп2 мРНА у про-калцифичним условима (Слика 2ц). ТНАП хидролизује ППи, снажни инхибитор таложења калцијум-фосфата и на тај начин подстиче калцификацију. 19 У не-и про-калцифичним условима, 7-дневни ТВЕАК порастао је за 25% ТНАП експресије (допунска слика С4), што је резултирало повећањем за 40 и 120% ТНАП активности (Слика 2д). У васкулатури, ММП2 и ММП9 убрзавају разградњу еластина и потичу калцификацију. У нашем моделу, ТВЕАК није модулисао експресију ММП2 мРНА (слика 3а) нити његову активност (слика 3ц), већ је значајно повећао и експресију ММП9 мРНА (слика 3б), као и активност (слика 3ц) у не-калцифичним условима.

Image

ТВЕАК / Фн14 промовише х-ВСМЦс остеогену транзицију. Ефекти ТВЕАК-а (100 нг / мл, 7 дана) процењени су у не-калцифичним (Цт: 1, 1 ммол / л Пи) и про-калцифичним (Пи: 3, 0 ммол / л Пи) условима. ( а - ц ) Ефекти ТВЕАК- а на експресију ацта2 ( а ), мих11 ( б ) и бмп2 ( ц ) мРНА, процењени квантитативном реверзном транскриптазом-ПЦР. * П <0, 05, ** П <0, 01, *** П <0, 001 у односу на ћелије изложене 1, 1 ммол / л Пи без ТВЕАК-а. $ П <0, 05, $$ П <0, 01, $$$ П <0, 001 у односу на ћелије изложене 3, 0 ммол / л Пи без ТВЕАК-а. П <0, 05, кантанг П <0, 001 у односу на ћелије изложене 1, 1 ммол / л Пи са ТВЕАК. Резултати представљају најмање три независна експеримента изведена у три примерка. Ступци грешака представљају СЕМ ( д ) ефекте ТВЕАК-а на активност ТНАП-а процењену тестом ПНПП фосфатазе. * П <0, 05, ** П <0, 01 у односу на ћелије изложене 1, 1 ммол / л Пи без ТВЕАК-а. $ П <0, 05 у односу на ћелије изложене 3.0 ммол / л Пи без ТВЕАК-а. † П <0, 05 у односу на ћелије изложене 1, 1 ммол / л Пи са ТВЕАК. Резултати представљају пет независних експеримената изведених у три примјерка. Траке грешака представљају СЕМ

Слика пуне величине

Image

ТВЕАК / Фн14 промовише ММП9 али не и ММП2 активност. ( а и б ) Ефекти ТВЕАК на ммп2 ( а ) и ммп9 ( б ) мРНА експресију процењују се квантитативном реверзном транскриптазом-ПЦР. ** П <0, 01 у односу на ћелије изложене 1, 1 мМ Пи без ТВЕАК-а. $$$ П <0.001 у односу на ћелије изложене 3.0 ммол / л Пи без ТВЕАК-а. Резултати представљају најмање три независна експеримента изведена у три примерка. Ступци грешака представљају СЕМ ( ц ) Ефекти ТВЕАК-а на ММП2 и ММП9 активност у супернатантима х-ВСМЦ-а, процењени гел зимографијом. ** П <0, 01, *** П <0, 001 у односу на ћелије изложене 1, 1 мМ Пи без ТВЕАК-а. $$$ П <0.001 у односу на ћелије изложене 3.0 ммол / л Пи без ТВЕАК-а. †Кан П <0, 01 у односу на ћелије изложене 1, 1 ммол / л Пи са ТВЕАК. Резултати представљају најмање три независна експеримента изведена у три примерка. Траке грешака представљају СЕМ НС, нису значајне

Слика пуне величине

У ћелијама бубрежних тубула, макрофазима и бубрежном ткиву, ЕРК ангажовање и канонична као и неканоничка активација НФ κ Б доприносе ТВЕАК инфламаторним ефектима. 10, 12, 20, 21 Да би се идентификовали интрацелуларни путеви одговорни за ТВААК / Фн14 про-калцифичне ефекте, ТВЕАК сигнализација је блокирана коришћењем инхибитора малих молекула или сиРНА. Пошто је апоптоза кључни индуктор калцификације х-ВСМЦс, осигурали смо да концентрације инхибитора које се користе за блокирање калцификације изазване ТВЕАК х-ВСМЦс нису модулисале виталност ћелије током 7 дана третмана (допунска слика С5А).

ТВЕАК / Фн14-индуцирана МАПК активација није укључена у ТВЕАК про-калцифичне ефекте

У х-ВСМЦсс, ТВЕАК фаворизује ЕРК фосфорилацију на временски зависан начин, са врхом после 10 минута стимулације (допунска слика С6А). Трансфекција Фн14 сиРНА у потпуности је укинула ТВЕАК-индуковану ЕРК фосфорилацију у поређењу са кодираним трансфектираним ћелијама (допунска слика С6Б). Хронична изложеност 10 μ мол / л У0126, селективном инхибитору МАПК киназа МЕК1 и МЕК2, инхибира ТВЕАК-индуковану ЕРК фосфорилацију (допунска слика С6Ц), али није модулисала ТВЕАК про-калцифичне ефекте на Пи-индуковану х-ВСМЦс минерализацију у поређењу са са х-ВСМЦ који нису изложени У0126 (допунска слика С6Д).

ТВЕАК / Фн14-индуцирана канонска НФ κ Б активација погодује калцификацији х-ВСМЦ индуковане пи-ом промовишући остеогену транзицију, активност ТНАП-а и ММП9 активност

Фосфорилација и накнадна протеасомална деградација И κ Б су знак класичне активације НФ κ Б пута који олакшава ослобађање п65 (РелА) / п50 димера, који затим прелазе у језгро да модулирају експанзију про-упалне гена. Додатна фосфорилација РелА на Сер536 је неопходна за трансактивацију гена. У х-ВСМЦсс, ТВЕАК је индуцирао РелА нуклеарну транслокацију и накнадну фосфорилацију на временски зависан начин, достижући максимум 10 минута (допунске слике С7А и Ц). Експерименти губитка функције помоћу сиРНА против Фн14 укинули су ТВЕАК-ом индуцирану РелА нуклеарну транслокацију и накнадну фосфорилацију у поређењу са кодираним трансфектираним ћелијама (допунске слике С7Б и Д). Трансфекција сиРНА против РелА, која је смањена за 75% експресије РелА у х-ВСМЦсс (допунска слика С8А) и укинула РелА фосфорилацију (допунска слика С8Б), значајно смањена за 80% ТВЕАК увећање калификовања изазваног Пи у поређењу са кодираним трансфекционим ћелије (слика 4а). У прокалцифичним условима, РелА сиРНА спречена је за 60, односно 50%, ТВЕАК-индукованим смањењем експресије ацта2 и мих11 мРНА (слике 4б и ц). Интересантно је да је циљање РелА у потпуности укинуло ТВЕАК-индуковано повећање експресије бмп2 мРНА (слика 4д), ТНАП активности (слика 5а) и ММП9 мРНА експресију (слика 5б) и активност (слика 5ц) у поређењу са кодираним трансфектираним ћелијама.

Image

ТВЕАК / Фн14-индуцирана канонска НФ κ Б активација погодује калцификацији х-ВСМЦ индуковане пи-ом промовишући остеогену транзицију. х-ВСМЦсс су трансфицирани било кодираним или РелА сиРНА и изложени 7 дана или нису изложени ТВЕАК-у у прокалцифичним условима (3.0 ммол / л Пи). ( а ) Утицај смањења регулације РелА на калцификацију х-ВСМЦ индукованих ТВЕАК / Фн14 у прокалцифичним условима (3, 0 ммол / л Пи). Минерализација је мерена Ализарин црвеним бојењем. Ваге: 500µм. * П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије без ТВЕАК-а. $ П <0, 05 вс трансфектиране ћелије РелА сиРНА без ТВЕАК-а. П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије изложене ТВЕАК-у. Резултати представљају три независна експеримента изведена у три примерка. Шипке грешака представљају СЕМ ( б - д ) утицај смањења регулације РелА на ТВЕАК-индуковану модулацију експресије ацта2 ( б ), мих11 ( ц ) и бмп2 ( д ) мРНА, процењену квантитативном реверзном транскриптазом-ПЦР. * П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије без ТВЕАК-а. $ П <0, 05 вс трансфектиране ћелије РелА сиРНА без ТВЕАК-а. П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије изложене ТВЕАК-у. Резултати представљају три независна експеримента изведена у три примерка. Траке грешака представљају СЕМ НС, нису значајне

Слика пуне величине

Image

ТВЕАК / Фн14-индуцирана канонска НФ κ Б активација погодује ТНАП и ММП9 активности. х-ВСМЦсс су трансфицирани било кодираним или РелА сиРНА и изложени 7 дана или нису изложени ТВЕАК-у у прокалцифичним условима (3.0 ммол / л Пи). ( а ) Утицај смањења регулације РелА на ТВЕАК-модулацију активности ТНАП-а. Активност ТНАП-а процењена је тестом пНПП фосфатазе. * П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије без ТВЕАК-а. П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије изложене ТВЕАК-у. Шипке грешака представљају СЕМ ( б ) Утицај смањења регулације РелА на експресију мРН-индуковане ммп9, изазване ТВЕАК-ом, процењену квантитативном реверзном транскриптазом-ПЦР. * П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије без ТВЕАК-а. П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије изложене ТВЕАК-у. Резултати представљају три независна експеримента изведена у три примерка. Шипке грешака представљају СЕМ ( ц ) Утицај смањења регулације РелА на активност изазвану ТВЕАК ММП9, процењену гел-зимографијом на супернатанту ћелије. * П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије без ТВЕАК-а. П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије изложене ТВЕАК-у. Резултати представљају три независна експеримента изведена у три примерка. Траке грешака представљају СЕМ НС, нису значајне

Слика пуне величине

Не-канонска активација НФ κ Б индукована ТВЕАК / Фн14 промовише губитак х-ВСМЦ контрактилног фенотипа као и ММП9 активност, али не модулира нити бмп2 експресију нити ТНАП активност

Активација неканонског пута НФ κ Б карактерише НФ κ Б2 п100 обрада до НФ κ Б п52. Ово резултира формирањем п52 / РелБ хетеродимера са транскрипционом регулаторном активношћу. У х-ВСМЦсс, ТВЕАК је смањио п100 и повећао п52 на време зависан начин (допунска слика С9А). Међутим, као и код осталих типова ћелија, ТНФ- α није активирао неканонски НФ κ Б пут (допунска слика С10). 20 Експеримента са губитком функције помоћу сиРНА против Фн14 укинута је ТВЕАК-индукована обрада п100 у поређењу са кодираним трансфектираним ћелијама (допунска слика С9Б). Трансфекција сиРНА циљајући РелБ, која је смањена за 80% РелБ експресије (допунска слика С11А) и блокирала ТВЕАК-индуцирану експресију неканоничног НФ κ Б циљаног гена ЦЦЛ21 (допунска слика С11Б), смањена је за 20% ефекте ТВЕАК-а на Пи-индукована калцификација у поређењу са кодираним трансфектираним ћелијама (слика 6а). У прокалцифичним условима, снижавање регулације РелБ спречено је за 50 и 25%, ТВЕАК-индукованом редукцијом експресије ацта2 и мих11 мРНА (слике 6б и ц), али није модулисало ТВЕАК-индуковану регулацију бмп2 мРНА (слика 6д) или ТНАП активност (Слика 7а). Од интереса, РелБ циљање значајно је смањило ТВЕАК-индуцирану ММП9 мРНА експресију (Слика 7б) и смањило ММП9 активност (Слика 7ц).

Image

ТВЕАК / Фн14-индуцирана неканонска НФ κ Б активација промовира губитак х-ВСМЦс контрактилног фенотипа, али не модулира бмп2 експресију. х-ВСМЦсс су трансфицирани било кодираним или РелБ сиРНА и изложени 7 дана или нису изложени ТВЕАК-у у прокалцифичним условима (3.0 ммол / л Пи). ( а ) Утицај смањења регулације РелБ-а на калцификацију х-ВСМЦ-а изазвану ТВЕАК / Фн14. Минерализација је мерена Ализарин црвеним бојењем. Ваге: 500 μ м. * П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије без ТВЕАК-а. $ П <0, 05 у односу на ћелије трансфектиране сиРНА РелА и нису изложене ТВЕАК-у. П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије изложене ТВЕАК-у. Резултати представљају три независна експеримента изведена у три примерка. Шипке грешака представљају СЕМ ( б - д ) Утицај смањења регулације РелБ на ТВЕАК-индуцирану модулацију експресије ацта2 ( б ), мих11 ( ц ) и бмп2 ( д ) мРНА, процењену квантитативном реверзном транскриптазом-ПЦР. * П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије без ТВЕАК-а. $ П <0, 05 у односу на сиРНА РелБ трансфектиране ћелије без ТВЕАК-а. П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије изложене ТВЕАК-у. Резултати представљају три независна експеримента изведена у три примерка. Траке грешака представљају СЕМ НС, нису значајне

Слика пуне величине

Image

Не-канонска НФ κ Б активација изазвана ТВЕАК / Фн14 не утиче на ТНАП активност, али фаворизује ммп9 активност. х-ВСМЦсс су трансфицирани било кодираним или РелБ сиРНА и изложени 7 дана или нису изложени ТВЕАК-у у прокалцифичним условима (3.0 ммол / л Пи). ( а ) Утицај смањења регулације РелБ-а на ТВЕАК-индуковану модулацију активности ТНАП-а. Активност ТНАП-а процењена је тестом пНПП фосфатазе. ** П <0, 01 у односу на кодиране трансфициране ћелије без ТВЕАК-а. $$ П <0, 05 у односу на ћелије које су трансфициране сиРНА РелБ и нису изложене ТВЕАК-у. Шипке грешака представљају СЕМ ( б ) Утицај смањења регулације РелБ на експресију мРН-индуциране ммп9, изражене помоћу квантитативне реверзне транскриптазе-ПЦР. * П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије без ТВЕАК-а. $ П <0, 05 у односу на сиРНА РелБ трансфектиране ћелије без ТВЕАК-а. П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије изложене ТВЕАК-у. Резултати представљају три независна експеримента изведена у три примерка. Шипке грешака представљају СЕМ ( ц ) Утицај смањења регулације РелБ на активност изазвану ТВЕАК ММП9 процењеном гел зимографијом у х-ВСМЦ супернатантима. * П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије без ТВЕАК-а. П <0, 05 у односу на кодиране трансфициране ћелије изложене ТВЕАК-у. Резултати представљају три независна експеримента изведена у три примерка. Траке грешака представљају СЕМ НС, нису значајне

Слика пуне величине

ТВЕАК појачава експресију Фн14 у х-ВСМЦсс

Иако је Фн14 ингуво регулиран ин виво у ситуацијама ћелијског или ткивног стреса, механизми се слабо разумеју. Експресија Фн14 је регулисана након 7 дана излагања ТВЕАК-у, и у не-калцифичним условима (допунска слика С12А). Канонска, али не неканонска, активација НФ κ Б била је укључена у регулацију експресије Фн14 као одговор на ТВЕАК (допунска слика С12Б).

Дискусија

Главни налаз је да инфламаторни цитокин ТВЕАК директно поспешује калцификацију х-ВСМЦс кроз ангажовање Фн14 и канонске и неканонске НФ κ Б сигнализације. Хронична системска упала ниског нивоа уобичајена је код старења, Т2ДМ и ЦКД и повезује се са повећаном преваленцом, тежином и напредовањем ВЦ и повећаном смртношћу. 22, 23, 24 ТВЕАК промовише кардиоваскуларне и бубрежне повреде код експерименталних животињских модела. 25, 26, 27 Смањени нивои циркулирајућег сТВЕАК-а повезани су са коронарном артеријском болешћу, 28 систоличким затајивањем срца, 29 обољењима периферних артерија 30 и анеуризмом трбушне аорте 16 и предвиђају озбиљност атеросклерозе. 31 смањење сТВЕАК-а повезано је са брзом и високом регулацијом ТВЕАК функционалног рецептора Фн14, 14, 16 за који се мисли да појачава сТВЕАК локално деловање у кардиоваскуларним ткивима. Концентрација сТВЕАК у циркулацији је смањена у бубрежној болести крајњег стадија и Т2ДМ. 32 Међутим, виши нивои сТВЕАК пронађени су код особа са хемодијализом са тежом калцификацијом него код особа са несавесном калцификацијом 33 и виши ниво ТВЕАК повезани су с већим ризиком од смртности од свих узрока и кардиоваскуларне смртности, 34 што сугерира везу између сТВЕАК и ВЦ.

Иако је улога ТВЕАК-а у атеросклерози опсежно окарактерисана, нема података о улози ТВЕАК-а у медијалној калцификацији, што је знак ЦКД-а и Т2ДМ. Наше истраживање показало је да ТВЕАК директно фаворизира калцификацију х-ВСМЦ индукованих пи-ом ин витро и подржава улогу ТВЕАК-а у ВЦ-у, а не фаворизује атеросклерозу. ТВЕАК појачан Пи-индуцирани губитак контрактилних маркера и стицање остеогених маркера, сугеришући да ТВЕАК повећава калцификацију ин витро фаворизирајући Пи-индуцирани х-ВСМЦс остеогени прелаз. Поред тога, ТВЕАК је повећао ТНАП експресију и активност и у не-калцифичним условима. ТНАП хидролизује ППи, ВЦ инхибитор, и ствара Пи, што је неопходно за стварање хидроксиапатита. Деградирајући ППи, ТНАП промовише калцификацију, мењајући однос Пи / ППи према минерализацији. 35 Интересантно је, супротно ТНФ- а , 36 ТВЕАК није индуцирао х-ВСМЦ калцификацију у одсуству високо фосфатног медијума (допунска слика С1), иако је он индуковао остеогену транзицију, ТНАП и ММП9 активност у некалцифичном стању.

Познато је да многи про-калцифични агенси промовишу х-ВСМЦ минерализацију излучивањем про-калцифичне матрице богате колагеном типа И. У животињским моделима, ТВЕАК потиче фиброзу. 13, 37 У овом раду, 7-дневно излагање ТВЕАК-у значајно је смањило експресију колагена типа И и на нивоу мРНА и протеина (допунска слика С13), сугеришући да ТВЕАК про-калцифични ефекти не зависе од излучивања про -калцифична матрица. Ови подаци су у складу са недавним извештајем наше групе који је показао смањену експресију колагена типа И у фибробластима узгајаним ин витро у присуству ТВЕАК-а. 13 У овом раду, аутори су показали да су профибротски ефекти ТВЕАК-а уочени ин виво резултат пролиферације фибробласта изазване ТВЕАК-ом, а не синтезе колагена.

ТВЕАК везивање за Фн14 покреће регрутовање ТРАФ2 и ТРАФ5, чиме се активирају сигнални путеви, као што су МАПК и НФ κ Б. 38, 39 МАПК и НФ κ Б сигнализација, укључени у ТНФ- α- индуцирану ВСМЦ калцификацију у високо-фосфатном медијуму. 40, 41 У овом раду, ТВЕАК везивање за Фн14 индукује МАПК сигнализацију кроз фосфорилацију ЕРК. Међутим, инхибиција фосфорилације ЕРК1 / 2 није утицала на прокалцифичне ефекте ТВЕАК, подвлачећи разлике у механизмима којима ТНФ- а и ТВЕАК фаворизују ВСМЦ калцификацију. У неколико типова ћелија ТВЕАК активира и каноничну НФ κ Б сигнализацију, краткотрајни одговор који резултира нуклеарном миграцијом комплекса који садржи п65 (РелА) и дуготрајнији неканонски пут који резултира нуклеарном миграцијом НФ κ Б2 п52 / РелБ - садрже комплексе. 20, 39, 42 У нашем моделу, активирање Фн14 од стране ТВЕАК-а укључивало је и канонске и неканонске НФ κ Б стазе. Блокада канонске НФкБ активације сиРНА значајно је смањила ТВЕАК-индуцирану х-ВСМЦс остеогену транзицију и ТНАП активност, што је за 80% смањило његове прокалцифичне ефекте. Ови ефекти су слични онима ТНФ- а , који је промовисао остегену транзицију ВСМЦ и активност ТНАП-а канонском НФ κ Б активацијом. 43, 44, 45, 46 Блокирање неканоничне НФκБ стазе сиРНА значајно је смањило ТВЕАК-индуцирани губитак х-ВСМЦ контрактилног фенотипа, али није утицало на ТВЕАК-индуцирану бмп2 експресију или ТНАП активност и смањено за 20% ТВЕАК про-калцификом ефекти. С тим у вези, акције ТВЕАК разликују се од оних ТНФ- α , као и код нашег модела, као и код осталих типова ћелија, ТНФ- α не активира неканонски НФ κ Б пут (допунска слика С10). 20 Надаље, у нашем моделу Пи-индуцирана калцификација или ТВЕАК повећавање калцификације није зависила од х-ВСМЦс апоптозе. Супротно томе, пријављено је да ТНФ- а фаворизује Пи-индуцирану ВСМЦ апоптозу и накнадну калцификацију. 47 С тим у вези, Фн14 рецептору недостаје домен смрти карактеристичан за супер-породицу ТНФ рецептора. Стога се чини да се молекуларни механизми апоптозе изазване ТВЕАК-ом разликују од оних ТНФ- а .

Деградација васкуларног еластина повећава афинитет ванћелијског матрикса за калцијум, 48 олакшавајући епитактички раст хидроксиапатита дуж еластичних ламела. ММП2 и ММП9 имају кључну улогу у овом процесу, јер су мишеви ММП-2 - / - и ММП-9 - / - отпорни на разградњу еластина и калцификацију. 49 Про-инфламаторни цитокини, као што су ТНФ- α 50 и ИЛ- 1П , 51, су снажни индуктори активности ММП у кардиоваскуларном систему. У овом раду, дуготрајно излагање ТВЕАК-у погодовало је изразу и активности ММП9, али не и о ММП2. Ови резултати су у складу са недавним извештајем који показује већи поремећај еластичног слоја и повећану ММП активност у аортама од ВТ мишева него код оних са ТВЕАК - / - или Фн14 - / - мишева. 17 У нашем моделу, х-ВСМЦсс су култивисани у 2Д систему без еластина, тако да прокалцифични ефекти ТВЕАК уочени ин витро не могу бити директна последица повећане активности ММП9. Међутим, ови подаци сугерирају да ин виво сТВЕАК може повећати васкуларну ММП9 активност и тако покренути ВЦ у нормалним фосфатним условима или погоршати ВЦ изазван хиперфосфатемијом, као што је примећено код ЦКД.

У здравим ткивима је експресија Фн14 обично ниска или се не може препознати, мада се брзо и јако регулише под патолошким условима, попут инфаркта миокарда, 52 рестенозе након повреде балона 53 или атеросклерозе. 14 У ћелијама оштећених васкуларних зидова, 14, 53, 54 Фн14 се регулише цитокинима, као што су ТНФ- α , ИЛ1- β и ИФН- γ . У овој студији, експресија Фн14 је регулирана ТВЕАК-ом и у не-калцифичним условима, што би могло појачати ТВЕАК про-калцифична својства. Мало се зна што се тиче регулације експресије Фн14, а само РхоА / РОЦК пут повезан је са регулацијом Фн14 у кардиомиоцитима и х-ВСМЦ. 14, 55 По нашем првом сазнању извештавамо да канонска, али не неканонска, активација НФ κ Б поспешује експресију Фн14 у х-ВСМЦсс изложеном ТВЕАК-у.

Претходни извештај нашег тима показао је да се ТВЕАК изражава и у макрофазима и у ћелијама глатких мишића унутар каротидних атеросклеротских плакова. 14 Потврђујући ове податке, у нашем моделу ТВЕАК конститутивно изражава примарни х-ВСМЦсс (допунска слика С14А). Међутим, током процеса минерализације није модификован ни од стране Пи, ни од стране самог ТВЕАК-а (допунска слика С14Б), што сугерише да у нашем моделу ТВЕАК про-калцифични ефекти нису повезани са повећаном секрецијом аутокриног ТВЕАК-а у х-ВСМЦсс.

Поред тога, активирање НФ κ Б индуковано ТВЕАК ин виво регулише неколико цитокина умешених у регрутовање регрутовања ћелија до оштећених зидова судова, као што су МЦП-1 и РАНТЕС, 56 који могу повећати директне прокалцифичне ефекте. Поред тога, у узгојеним моноцитима, ТВЕАК повећава ХМГБ1, 21 што веже и РАГЕ и ТЛР4 за локално посредовање високе ВСМЦ калцификације изазване глукозом. 57 Тако се може размотрити ин виво допринос ТВЕАК-а индуцираног ХМГБ1 у ВЦ-у који се односи на Т2ДМ. Најзад, ТВЕАК смањује експресију Клотхо у бубрезима и мишеве са недостатком Клотхо-а. 58

Закључно, ТВЕАК / Фн14-индуцирана канонска НФ κ Б активација директно фаворизује Пи-индуцирану остеогену транзицију и ТНАП активност, промовирајући калифицирање х-ВСМЦ изазваних Пи-ом. Губитак х-ВСМЦ контрактилних маркера као последица ТВЕАК / Фн14 изазване неканонске НФ κ Б активације појачава ову појаву (Слика 8). Колико знамо, ово је први извештај о директном прокалцифичном ефекту ТВЕАК-а и о неканоничном учешћу НФ κ Б стазе на медијалну калцификацију. Поред тога, ТВЕАК регулација ММП активности и протуупална секреција цитокина, заједно са његовим протерогеним својствима чине ТВЕАК потенцијалним снажним индуктором и интимне и медиалне калцификације. С обзиром на доступност неутралишућих анти-ТВЕАК стратегија, овај рад баца светло на ТВЕАК као потенцијални нови терапеутски циљ за спречавање ВЦ. Даљње студије ин виво на патолошким животињским моделима су тренутно у разматрању како би се процениле последице неутрализације анти-ТВЕАК стратегије на ВЦ изазване уремијом.

Image

ТВЕАК / Фн14 про-калцифични ефекти на калцификацију х-ВСМЦ-а индукованих Пи-ом ин витро : шематски приказ. У прокалцифичним условима, ТВЕАК / Фн14 канонична НФ κ Б активација промовише х-ВСМЦс остеогену транзицију, коју карактерише губитак х-ВСМЦс контрактилних маркера ацта2 и мих11 и урегулација остеогеног маркера бмп2, јаког активатора ТНАП-а. Ово је повезано са повећањем активности ТНАП-а, што деградира инхибитор калцификације ППи да би се ослободио Пи који је неопходан за стварање хидроксиапатита. КАНОНИЧКА НФ κ Б индукована ТВЕАК / Фн14 такође је повећала експресију Фн14, што би могло појачати ТВААК прокалцифична својства. И канонична и неканоничка НФ κ Б активација промовисала је активност ММП9, што погодује деградацији еластина ин виво . ТВЕАК / Фн14-индуцирана неканонска НФ κ Б активација погодује губитку х-ВСМЦс контрактилног фенотипа. Супротно томе, неканонска НФ κ Б активација није модулисала ни бмп2 експресију нити ТНАП активност нити Фн14 експресију

Слика пуне величине

Материјали и методе

ВСМЦ за људе (х-ВСМЦ)

Х-ВСМЦ су изоловани из сегмената проксималних узлазних аорта без лезије модификованом експлицитном методом. 59 Узорци су добијени након операције аортног залиска. Пацијенти су дали писмену сагласност у складу са шпанским законодавством (ПРОТОЦОЛ ЕО34 / 2013). Студија је у складу са Хелсиншком декларацијом.

Тест минерализације

Минерализација х-ВСМЦсс (15000 ћелија / бунар, плочица са 24 места) индукована је 7 дана излагањем ДМЕМ-у допуњеном 1% ФБС-ом који садржи 3.0 ммол / л Пи (прокалцифично стање) или 1.1 ммол / л Пи (не -калцифично стање). Повећавајуће концентрације рекомбинантног хуманог ТВЕАК-а (1–200нг / мл, Миллипоре, Бедфорд, МА, САД) додате су медијуму за културу и процењена је индукована Пи-минерализацијом. Половина медија за културу обнављала се свака 2 дана. Детекција и квантификација талога минерала изведена је употребом бојења Ализарин Ред. Укратко, узорци су фиксирани (50% етанол 5 мин, 95% етанол 5 мин), обојени током 5 минута са Ализарин црвеним С (40 ммол / л, пХ 4.2), испрани са 50% етанолом и фотографисани. Ализарин црвени је затим растворен инкубацијом у пуферу који садржи 10 ммол / л НаХ2П03 и 10% хексадецил-пиридин-хлорид монохидрата пре очитавања на 570 нм. Када је минерализација процењена на трансфектираном х-ВСМЦсс, трансфекције су изведене 24 сата пре и 96 сати након првог излагања третману од интереса. За експерименте који користе 10 μ мол / л У0126, инхибитор се додаје свака 2 дана са свежим медијумом.

х-ВСМЦ трансфекција

х-ВСМЦ трансфектирани су сиРНА разблаженом у ОптиМЕМ (Гибцо, Царлсбад, ЦА, САД), користећи липофектамин (Инвитроген, Паислеи, УК). сиРНА која циља Фн14, РелА и РелБ (Инвитроген) коришћена је у концентрацији од 10, 50 и 20 нМ. Јастучна сиРНА (Амбион, Фостер Цити, Калифорнија, САД) послужила је као негативна контрола.

кРТ-ПЦР

Укупна РНА је екстрахована методом ТРИ реагенса (Сигма, Ст Лоуис, МО, УСА). Затим је 1 µг РНА преписана у цДНА коришћењем „Кит за повратну транскрипцију цДНА високог капацитета“ (Апплиед Биосистемс, Фостер Цити, ЦА, САД) према упутствима произвођача. Унапред развијени прајмер за ацта2, мих11, бмп2, спп1, ммп2, ммп9, тнфсф12 и ГАПДХ били су из Апплиед Биосистемс. Квантитативни ПЦР извршен је 7500 ПЦР системом у реалном времену са системом СДС Призм 7000 Систем (примењени биосистеми) и РНА експресија различитих гена је коригована за ГАПДХ.

Вестерн блоттинг

Х-ВСМЦ (60 000 ћелија / лежиште у плочама са шест јажица) су стимулисани са Пи и / или ТВЕАК. Узорци су затим хомогенизирани у пуферу за лизу (50 мМ Трис-ХЦл, 150 мМ НаЦл, 2 мМ ЕДТА, 2 мМ ЕГТА, 0, 2% Тритон Кс-100, 0, 3% НП-40, 0, 1 мМ ПМСФ и 1 μг / мл пепстатина А ) и раздвојена са 10–12% СДС-ПАГЕ под смањеним условима. Након електрофорезе, узорци су пренесени на ПВДФ мембране (Миллипоре), блокирани са 5% обраног млека у ПБС / 0, 5% в / в Твеен 20 током 1 сата, испрани ПБС / Твееном и инкубирани преко ноћи на 4 ° Ц мишјим моноклонским анти- ЕРК фосфорилиран (1: 250), поликлонални зечји анти-ЕРК2 (1/250), поликлонски зечји анти-п65 (РелА) (1/500), поликлонски зечји анти-РелБ (1/500) (Санта Цруз Биотецхнологи, Санта Цруз, Калифорнија, САД), зечји моноклонски антифосфо-НФ κ Б п65 (1: 500), поликлонски зечји анти-Фн14 (1: 1000), поликлонски зечји анти-НФ κ Б п52 / п100 (1: 1000) (ћелија Сигнализација, Данверс, МА, САД) или зечји поликлонски анти-ТНАП (1: 500) (Абцам, Цамбридге, Велика Британија). Антитела су разблажена у 5% млечном ПБС / Твеен-у. Мрље су испране са ПБС / Твеен и инкубиране са одговарајућим секундарним антителом везаним за хрен пероксидазу (1: 2000, Амерсхам, Аилесбури, Велика Британија). После испирања са ПБС / Твеен-ом, мрљице су развијене хемилуминесценсном методом (ЕЦЛ) (Амерсхам, Аилесбури, Велика Британија), а затим су се сонирале са мишјим моноклонским антителом α- тубулина (1: 2000, Сигма) или мишјим моноклонским антителом против ГАПДХ. (1: 3000, Миллипоре) следећи исти поступак и нивои експресије су исправљени због мањих разлика у оптерећењу.

Конфокална микроскопија

Х-ВСМЦ монопласти на поклопцима су фиксирани у 4% параформалдехиду током 10 минута и угашени у 100 ммол / л глицин / ПБС током додатних 10 минута. Ћелије су затим пермеализоване у 0.2% Тритон Кс-100 / ПБС током 10 минута. Неспецифично везивање блокирано је инкубацијом у 1% БСА / ПБС током 30 минута. Касније, х-ВСМЦсс су инкубирани зечјим поликлонским анти-РелА (1: 75), мишјим моноклонским анти-МИХ11 (1: 50) или зечјим поликлонским анти-ТВЕАК (1: 100) (Санта Цруз Биотецхнологи) у току 1 х, а потом са 1 х секундарног антитела ФИТЦ (1: 200, Сигма). Нуклеи су супротстављени пропидијум јодиду. Прекривачи су монтирани на стаклене микроскопске тобогане прије флуоресцентне детекције.

ТНАП активност

х-ВСМЦ (60000 ћелија / удубљење, плоче са шест јажица) гладовали су преко ноћи у 1% ДМЕМ-у допуњеном ФБС-ом пре 7-дневне изложености 1, 5 мл 1% ДМЕМ-а са додатком ФБС који садржи или не 3 ммол / л Пи и / или ТВЕАК. Све у сваких 2 дана додано је 750 μл свежег медијума. Активност ТНАП-а мерена је пНПП фосфатазним тестом (БиоАссаи Системс, Хаивард, ЦА, САД) као што је претходно описано. 60

Гел зимограпхи

Х-ВСМЦ култивисани су као и за ТНАП активност. Након 7 дана, х-ВСМЦ супернатанти су центрифугирани да се уклоне смеће и разблажени са два за процену ММП2 активности. Узорци су концентровани 10 пута са микроконконом од 10 кДа (Миллипоре) за детекцију ММП9 активности. Активност ММП-а процењена је зимограмом желатиназе у гелу (Зимогран гелови, Лифе Тецхнологиес, ​​Фостер Цити, ЦА, САД) као што је претходно описано. 17

Статистичка анализа

Резултати представљају најмање три независна експеримента изведена у трипликатима користећи ћелије изоловане од различитих давалаца. Резултати су изражени као средња вредност ± СЕМ Разлике између група процењене су коришћењем једносмерне АНОВА помоћу Тукеиевих пост-хоц тестова коришћењем програма Присм (Грапхпад, Верзија 5.0 ГрапхПад Софтваре Инц., Сан Диего, ЦА, САД). За паре параметара, подаци су анализирани непараметријским Манн-Вхитнеи тестом. П- вредност <0, 05 се сматра статистички значајном.

Додатне информације

ПДФ датотеке

  1. 1.

    Допунске цифре

Речник

БМП2

коштани морфогенетски протеин 2

ЦКД

хронична болест бубрега

Фн14

молекул 14 који индукује фактор раста фибробласта

Х-ВСМЦ

људска ћелија васкуларне глатке мишиће

МАПК

митоген-активирана протеин киназа

ММП

матрикс металопротеиназа

ППи

пирофосфат

Т2ДМ

дијабетес мелитус типа 2

ТНАП

ткивна неспецифична алкална фосфатаза

сТВЕАК

растворљиви ТВЕАК

ШТИПАЊЕ

ТНФ сличан индуктор апоптозе

ВЦ

васкуларна калцификација

Додатне информације прате овај рад на веб локацији Целл Деатх анд Дисеасе (//ввв.натуре.цом/цддис)