Употребом кластера са златом одабраним на величини на филмовима с графен оксидом да би се помогло ускладјивању крио-преноса електрона томографија | научни извештаји

Употребом кластера са златом одабраним на величини на филмовима с графен оксидом да би се помогло ускладјивању крио-преноса електрона томографија | научни извештаји

Anonim

Субјекти

  • Криоелектронска томографија
  • Дизајн, синтеза и обрада

Апстрактан

Тродимензионална реконструкција воденог објекта са наном скалом може се постићи узимањем низа преносних електронских микрографија нагнутих под различитим угловима у стакласти лед: крио-трансмисијску електронску томографију. Овде је представљена нова метода финог поравнања за нагибне серије. Златни кластери са одабраном величином од ~ 2, 7 нм (Ау 561 ± 14 ), ~ 3, 2 нм (Ау 923 ± 22 ) и ~ 4, 3 нм (Ау 2057 ± 45 ) пречника су смештени на одвојене филмове графен оксида који прекривају рупе на аморфном угљенику решетке. Након замрзавања урањања и накнадног преноса на крио-трансмисиону електронску томографију, резултирајући томограми имају одлична (де) фокусирања и поравнања током аутоматског снимања. Фино поравнање је тачно када се равномерно распоређене честице од 3, 2 нм користе као фидуцијални маркери, што је показано реконструкцијом вируса дуванског мозаика. Употреба фолије с графен-оксидом значи да фидуцијални маркери не ометају ледени узорак и да је аутоматско прикупљање доследно. Кориштење претходно депонованих кластера одабраних по величини значи да нема здруживања и корисничке концентрације. Кластери изабрани по величини су моно-дисперзни и могу се произвести у широком распону величина, укључујући пречник од 2 до 5 нм. Употреба кластера одабраних по величини на филмовима с графен оксидом представља значајан технички напредак за 3Д криоелектронску микроскопију.

Увод

Крио-трансмисиона електронска микроскопија (крио-ТЕМ) постала је прихваћен начин проучавања протеина и других макромолекуларних комплекса у њиховом родном стању. Принцип је да водене макромолекуле могу бити имобилизиране (замрзнуте) и снимљене у свом матичном стању све док се током процеса замрзавања формира стакласти лед. Танкослојни стакласти лед најчешћи је начин посматрања објеката у крио-ТЕМ-у мањим од 100 нм. Решетка узорка, обично карбонски филм са рупама, има молекул од интереса у воденом раствору који се ставља на њу, након чега се разблажује и урања у течни етан (или пропан). У рупама се формира танки слој леда сличног стаклу, тако да се молекули или интересни предмети мањи од дебљине филма могу проучавати суспендовано у свом оригиналном медијуму. За појединачне макромолекуле уобичајено је вршити анализу једноструких честица, тј. Прикупити хиљаде насумично оријентисаних честица како би се створио 3Д модел молекула (видети на пример> 1300 цитата за ЕМАН, само једна софтверска опција за реконструкцију 1 ). Међутим, ако је објект већи или има више конформација, анализа појединих честица постаје тешка или немогућа. Крио-ТЕМ томографија је корисно средство у овим случајевима, било сама, било праћено суб-томограмом у просеку 2, 3, 4, 5 . Томографија захтева да се низ слика истог предмета из различитих пројектованих углова. Те слике морају се затим поравнати пре него што се примени техника реконструкције (нпр. Пондерисана леђа). Међутим, поравнање може бити тешко постићи када је контраст низак, као што је обично случај у крио-ТЕМ-у, а место „фиксних тачака“ је тешко. Да би се олакшао овај процес, уводе се густи фидуцијални маркери који ће се користити као фиксне тачке. Обично би се ови фидуцијални маркери састојали од честица злата суспендираних у раствору који садржи предмет који се испитује. Међутим, постизање одговарајућег броја и дистрибуције честица уз избегавање хемијске интеракције са предметом који га занима или га затамњивање у томографској реконструкцији може бити проблематично (нпр. Реф. 6). Графен оксид (ГО) је кориштен као носиви филм у материјалној електронској микроскопији (нпр. Реф. 7, 8) и за анализу појединих честица 9 . Поред тога, потпорни филмови засновани на графену успешно су коришћени као крио-томографски носачи 10, међутим они су требали да подржавају протеин, а не да се навлаче преко леда. Коришћењем кластера одабраних по величини, претходно депонованих на ултра танком потпорном филму, овде представљамо нов начин добијања крио-ТЕМ томограма користећи Тобаццо Мосаиц Вирус (ТМВ) као пример.

Методе

Комерцијално припремљене (Агар Сциентифиц) мреже ТЕМ-а добивене су као супстрат. Долазе прекривени филмом графен оксида (ГО) на врху перфорираног карбонског филма (квантифоил). Златни кластери одабрани по величини генерисани су коришћењем извора магнетронског распршивања, греде кондензационог снопа 11 који је повезан са инлине, бочним селектором масе 12 током лета. Номинална резолуција масе постигнута коришћењем селектора масе била је ± 2, 4% за Ау 561 и Ау 923, и ± 2, 2% за Ау 2057, одређена коришћењем снопа Ар + јона као стандарда за калибрацију. Ау 561 ± 14, Ау 923 ± 22 и Ау 2057 ± 45 кластера из снопа су депоноване, узастопно и истом енергијом (1, 5 кеВ по кластеру), на одвојене решетке покривене ГО у високом вакууму. Просечне покривености су биле између 10 3 (за Ау 561 и Ау 923 ) и 10 2 (за Ау 2057 ) честица по квадратном микрону. Међутим, треба имати на уму да локална густина депонованих кластера може варирати на подлози, будући да је профил снопа кластера у складу са Гауссовим обликом 11 . Изабрани величине кластера Ау 923 претходно су депоновани на аморфни карбон 13 и вишеслојни графен 14 филмова са енергијама 0, 5 еВ / атом и 5, 4 еВ / атом, обе испод типичне енергије прага за фиксирање Ау кластера на угљенику (графит ) 15, 16, али они остају монодисперзни и довољно стабилни да омогућују снимање електронском микроскопијом на собној температури. Након тога су ТЕМ решетке испражњене (ЕДВАРДС АУТО 306) да би се помогло влажење. То није имало запаженог ефекта на златне гроздове.

Замрзавање урањања извршено је коришћењем ВИТРОБОТ марке ИВ (компанија ФЕИ) у течни Н2 хлађени течни етан. 4 μл ТМВ у воденом медијуму је стављено на врх решетке и остављено 10 с пре него што се размазило (1 с) и потапало. Ова метода резултирала је постављањем где су златни гроздови на једној страни ГО слоја, док је стакласт лед суспендован унутар рупа карбонске фолије на другој страни ГО филма (слика 1). Узорак решетка је затим пренесен (без загревања) у крио-држач Гатан 626 и примећен на 200 кВ у Тецнаи Т20 (компанија ФЕИ) ЛаБ 6 ТЕМ опремљена камером Еагле 4 к × 4 к (ФЕИ) помоћу уграђене ФЕИ Лов Софтвер за набавку дозе и Ксплоре 3Д Томограпхи. Слике у нагибној серији сакупљане су у интервалима од 2 ° између ± 50 ° користећи средњу вредност изложености од 1 с по микрографији. Стање фокусирања ван оси коришћено је за праћење и радило је веома ефикасно због добро распоређених и јасно видљивих златних гроздова (слика 2). Сама серија нагиба реконструисана је коришћењем софтвера ИМОД 17 . Ток електрона на 0 степени мерен је као 2, 6 ег −2−1 (дакле, 68 егА −2−1 укупно) коришћењем измерене струје на фосфоресцентном екрану, односно услови са ниском дозом правилно су примећени.

Image

Аморфни угљен са рупама прекрива електронску микроскопску мрежу бакарних мрежа. Графен оксидни филм се наноси на врх аморфног угљеника, остављајући само руке графен оксида преко отвора. Ау одабране величине (према односу масе и наелектрисања) кластери су смештени на врху ГО филма. Стаклени лед који садржи узорак може се поставити са друге стране за сликање кроз рупе.

Слика пуне величине

Image

А) Комплетно видно поље нагиба од 0 степени од стечених серија нагиба. Б) Подручје са кутијама од А) Ц) Резање реконструкције која садржи кластере и цвркутаве у графен оксиду одабране величине. Имајте на уму да нису све златне честице видљиве у једној кришки. Подручје је приближно Б). Д) Изрез из реконструкције (45 µм изнад Ц)) који показује вирус. Е) и Ф) су Ц) и Д) након примене 3Д аисотропног дифузионог филтера. Линија скале: А) 400 нм, Б – Ф) 100 нм.

Слика пуне величине

Резултати и дискусија

Прво смо анализирали да ли се мале златне честице могу посматрати и како се понашају при добијању и реконструкцији података крио-ТЕМ томографије. Кластери злата од 3, 2 нм били су јасно видљиви (слика 2) под свим угловима нагиба. Реконструкција (слика 2Ц-Ф) јасно показује ТМВ изнад ГО слоја и реконструкција се може побољшати стандардним методама филтрирања ако је потребно. Треба напоменути да се закривљеност у стаклу сличном леду формира на сличан начин са и без ГО, тј. Елипсоид унутар рупе у квантифилду, стога је у подрезу томограма видљив само подскуп златних гроздова (слика 2Ц). ГО се савија како би то омогућио, мада ако је лед на врху ГО са квантифолом испод закривљености није толико велик да се лед не може на задовољавајући начин ширити по већини рупа.

Затим смо упоредили својства депонованих кластера злата са својствима најчешће коришћених суспендованих наночестица злата (слика 3). У ту сврху реконструисан је томограм само споредних кластера Ау 2057 ± 45 (пречник ~ 4, 3 нм) подржаних на ГО филму (без додатног узорка). Овај томограм је затим упоређен са резултатима добијеним коришћењем стандардне Ау-фидуциалне методе маркирања наночестица пречника 6 ± 0, 7 нм (Томосол, Аурион НЛ) на ГО. Ширење пречника стандардних наночестица је наведено максимално са веб локације произвођача. Слика 3 приказује слику плана (ки) и реконструкције добијене коришћењем ове две различите врсте маркера. Злато одабрано по величини равномерно је распоређено по целом подручју снимања што значи да можете изабрати много маркера. Затамњена област (укључујући светлу хало) из фидуцијалних маркера у реконструкцијама мерена је профилом интензитета преко најшире тачке Кс и З (тј. Из оријентација као што су слика 3Ц и Ф) за> 25 честица Ау. Ау 2057 (слика 3Ф) је утицала на 12, 7 ± 2, 1 нм у Кс и 19, 7 ± 3, 6 нм у З. Стандардни фидуцијални маркер утицао је на 16, 7 ± 2, 7 нм у Кс и 27, 3 ± 4, 4 нм у З. Такође је примећено да Ау 2057 има приближно удвостручити атомску густину Ау 923, али са само малим повећањем пречника било је лакше константно посматрати кроз густи лед.

Image

А) је 6 нм Ау маркера на ГО са стакластим ледом на супротној страни од ГО. Б) је КСИ реконструкција оквира у А). Ц) је приказ плана КСЗ кроз испрекидану линију на Б). Д), Е) и Ф) су исти као А), Б) и Ц), али за 4.3 нм Ау. Линија скале: 100 нм у А) и Д) и 25 нм у Б), Ц), Е) и Ф).

Слика пуне величине

ГО слој значи да се томографско поравнавање може постићи коришћењем фидуцијалних маркера, а да се они не морају стављати у раствор који даје неколико предности. Фокус са ниском дозом се обично подешава у сусједној рупи од квофофола према подручју које вас занима. Употреба ГО филма са Ау групама значи да су све рупе погодне за фокусирање и да ће бити фокусиране у истој равнини као и подручје које вас занима. Корисник не зависи од тога да ли се у рупи створио добар лед или ће, као уобичајена пракса, ивице рупа користити као водич. На изложеном подручју корисник може примијенити помак према фокусу како би постигао савршен дефокусирање објеката који се сликају. Ознаке могу бити бројне и удаљене су од интереса за лед. Ово помаже да се осигура да нема интеракције са предметом који вас занима (чак и злато показује каталитичку активност на наноцрвеном нивоу 18 ). Реконструкција има маркере удаљене од занимљивог објекта тако да је објект мање затамњен, а допринос маркера лако се може уклонити са коначног томограма без ометања реконструкције. Може бити недостатак маркера који се налазе само на једној површини, у поређењу са читавим узорком, али то би делимично било занемарено закривљењем носача. У овом раду, ГО који се користио као потпорни филм, већ је био комерцијално доступан преко Куантифоил решетки, што је отприлике двоструко веће од стандардне Куантифоил решетке без ГО. Остали деривати графена (нпр. Флуорисани графен) или заиста сам графен у принципу могу бити кориштени као потпора, али открили смо да ГО равномјерно покрива цијелу мрежу и мокри је. Сам носач значи да постоји врло мало одступања од главног узорка, и ако је потребно, уклониће се из реконструкције која настаје јер су димензија и локација познати. Треперења која су се догодила у филму ГО нису опсежна. Фиксна густоћа набоја таквих носача може имати неки утицај на честице унутар прве Дебие дужине око 1 нм. Међутим, чак и ако постоји неко усклађивање, то често не би било релевантно за томографску анализу, која за разлику од анализе једноструких честица не захтева случајну оријентацију честица.

Коришћење Ау кластера изабраних по величини депонованих из снопа снопа у високом вакууму даје неке даљње предности у поређењу са маркерима влажног таложења. Не постоји агрегација честица, које често могу замаглити тачке интереса. Микроскоп може унапред одредити просечан размак и број кластера како би одговарао увећању потребном за разрешавање узорка. Величина кластера може бити одређена од стране корисника, може бити готово било које вредности, укључујући пречнике између 2 и 5 нм који је, иако је могуће, сложен за хемијско моно-дисперзију 19, 20, 21, 22 . Открили смо, у нашим условима, да је Ау 561 (пречник ~ 2, 7 нм) било тешко пратити (иако је добро реконструисан), Ау 923 (пречник ~ 3, 2 нм) било је могуће пратити, али Ау 2057 (пречник ~ 4, 3 нм) био би наш избор. Ово је, верујемо, омогућило добру равнотежу између густине и величине. Коначно, кластери су исте изабране величине и тако се неће мешати, чак ни пре томографског снимања, са било којим другим предметима од електрона који су од интереса (нпр. Имуно-обележеним златом).

Додатне информације

Датотеке слика

  1. 1.

    Додатне информације

    Томографска реконструкција ТМВ-а

Коментари

Подношењем коментара пристајете да се придржавате наших Услова и Смерница заједнице. Ако нађете нешто злоупотребно или то није у складу са нашим условима или смерницама, означите то као непримерено.