Протеин који садржи валозин регулише разградњу протеасома дна-пкцс у ћелијама глиома | ћелијска смрт и болест

Протеин који садржи валозин регулише разградњу протеасома дна-пкцс у ћелијама глиома | ћелијска смрт и болест

Anonim

Субјекти

  • Терапијска резистенција против рака
  • Рак ЦНС-а
  • Радиотерапија
  • Свеприсутност

Апстрактан

ДНА зависна протеин киназа (ДНА-ПК) има важну улогу у санирању оштећења ДНК и регулише осетљивост на ћелије глиобластома на зрачење. ВЦП (протеин који садржи валозин), протеин цхаперона који регулише разградњу протеина који зависи од убиквитина, фосфорилиран је ДНК-ПК и регрутовао га на места ломљења дволанчаних ДНК ради регулисања поправљања оштећења ДНК. Међутим, није јасно да ли је ВЦП укључен у разградњу ДНА-ПКцс (ДНК-ПК каталитичка подјединица) или да ли регулише радиосензибилност глиобластома. Наши подаци показали су да је ДНК-ПКцс био свеприсутан и везан на ВЦП. Отпад ВЦП-а резултирао је накупљањем протеина ДНА-ПКцс у ћелијама глиобластома, а инхибитор протеасома МГ132 синергирао је ово повећање. Као што се очекивало, ово повећање је подстакло ефикасност поправке ДНК у неколико ћелијских линија глиобластома; заузврат, ова појачана активност смањила је осетљивост на зрачење и продужила фракцију преживљавања глиобластома ћелија ин витро . Штавише, обустава ВЦП у ћелија глиобластома смањила је време преживљавања ксенографисаних мишева лечењем радијацијом у односу на контролне ксенографисане мишеве глиобластома. Поред тога, ВЦП протеин је такође смањен у ∼ 25% ГБМ ткива код пацијената (ВХО, астроцитом разреда ИВ), а ниво ВЦП протеина је у корелацији са преживљавањем пацијената ( Р2 = 0, 5222, П <0, 05). Ови налази показали су да ВЦП регулише разградњу ДНА-ПКцс и повећава осетљивост ћелија ГБМ на зрачење.

Главни

Протеин који садржи валозин (ВЦП), члан је ААА класе АТПаза и повезан је са различитим ћелијским активностима. 1, 2 ВЦП је обилан протеин у цитосолу и језгру, 3, 4 и физиолошки постоји као хомохексамер. Већина, ако не и сви, хексамери стварају даље комплексе са другим адаптивним протеинима, као што су п47 или Уфд1 – Нпл4, 5, 6 и прате коњугате убиквитин-протеина у протеасом кроз интеракције протеин-протеин како би се спречило стварање прекомерног мултиубиквитин ланца величине. 2 Штавише, недавни подаци показују да ВЦП такође регулише убиквитацију протеина активирањем деубиквитационог ензима Атакин-3. 7 Верује се да је ВЦП усмерен на релевантне ћелијске процесе кроз диференцијално везивање за специфичне адаптерске протеине. 8 Сваки ВЦП протомер састоји се од четири регије: Н-терминал, две АТП-азе (Д1 и Д2) и Ц-терминалне области. 1, 9 Н-терминална област поседује активности везивања за протеинске адаптере као и свеприсутне протеине. Предложено је да 1 ВЦП врши многе физиолошке ћелијске функције, попут разградње протеина посредоване системом убиквитин-протеасом. 5, 10, 11, 12, 13, 14

Занимљиво је и то да се ВЦП такође регрутује на места двоструког разбијања ДНК (ДСБс) интеракцијом са БРЦА1, п53 и РАД51, и може да регулише поправљање оштећења ДНК. 4, 15, 16 Недавно истраживање открило је да је ВЦП нови супстрат ДНК зависне протеинске киназе (ДНК-ПК) и других чланова породице ПИКК. 17 Као одговор на оштећење ДНК, ВЦП се фосфорилира на Сер 784 унутар његовог ЦООХ терминала, региона за који је показано да циља ВЦП на посебне ћелије унутар целице; ВЦП се затим акумулира на местима ДСБ са убиквитин лигазом РНФ8, убиквитинским адаптером УФД1 – НПЛ4 и ланцима убиквитина (К48-Уб) повезаним са Лис-48. 16 Фосфорилација ВЦП изазвана оштећењем ДНК и његово регрутовање на места за ДСБ сугерирају улогу ВЦП у обнављању ДНК.

ДНА-ПК је ДНА активирана серин / треонин протеин киназа сачувана у кичмењака. 18 ДНК-ПК је састављен од каталитичке подјединице (ДНК-ПКцс) и једног Ку хетеродимера, 19 и свеприсутно се експримира у готово свим ћелијама сисара. Бројна истраживања показала су да ДНК-ПК има суштинску улогу у поправљању ДСБ-а, посебно у нехомологном крајњем спајању (НХЕЈ). Штавише, ДНК-ПК не само да има критичну улогу у путу поправљања оштећења ДНК, већ укључује и друге важне физиолошке или патолошке процесе, 20 као што су осетљивост на зрачење, упални одговори и метаболичка експресија гена. 21, 22, 23 Ипак, још увек није познато како је регулисана деградација протеина ДНА и ПК и да ли ВЦП утиче на осетљивост на зрачење.

У овом истраживању истражили смо повезаност ВЦП-а са ДНК-ПКцс и утицај регулације ВЦП на радиосензибилност ћелија глиобластома. Наши подаци показали су да је ДНК-ПКцс био свеприсутан и везан на ВЦП; ВЦП оборење резултирало је накупљањем протеина ДНА-ПКцс у ћелијама глиобластома и повећањем ДНК-ПК активности, што је на крају повећало фракцију преживљавања ГБМ ћелија после ИР и скратило време преживљавања ортотопских ксенографисаних мишева.

Резултати

ВЦП је повезан са ДНК-ПК и Д1 домен ВЦП је битан за ово везивање

Према биоинформатичкој анализи, протеин ДНК-ПКцс садржи мотив који утиче на ВЦП (ВИМ), који се чува код сисара као што су људи, мајмуни, краве и вукови (слика 1а). Да би се утврдило да ли је ВЦП повезан са ДНК-ПК, изведена је ко-имунопреципитација (цо-ИП) коришћењем антитела ДНА-ПКцс у неколико ћелијских линија глиобластома; ћелија М059Ј има недостатак ДНК-ПКцс и коришћена је као негативна контрола. Вестерн блотс после ко-ИП-а показали су да се ВЦП спушта ДНК-ПКцс (слика 1б); штавише, у сагласности са нашом претходном студијом, 24 што је ћелија осетљивија, то се више ВЦП повезује са ДНК-ПК, што указује да ВЦП може бити повезан са отпорношћу на зрачење. Међутим, само зрачење не утиче значајно на везивање ВЦП са ДНК-ПКцс (подаци се не показују).

Image

ВЦП је повезан са ДНК-ПК. ( а ) Усклађивање ВИМ-а и протеинске секвенце код људи, мајмуна, крава и вукова. ( б ) ВЦП је оборен ДНК-ПКцс ИП у различитим ћелијским линијама ГБМ (ВЛ: цели-ћелијски лизати). ДНК-ПКцс-дефицитарне М059Ј ћелије су сматране негативним контролама. ( ц ) Схематски цртање скраћеног ВЦП протеина. Сви скраћенице означене су епитопом заставе (ФЛ: цела дужина). ( д ) Плазмиди који експримирају различите домене ВЦП-а одвојено су трансфектирани у ћелије 293Т (кон: празан вектор), и извршена је имунмопреципитација заставе. И ДНК-ПКцс и застава откривени су у целијским ћелијама (доњи панели, приказани као ВЛ) или заставицама ИП (горњи панели)

Слика пуне величине

Да би се даље утврдило који домен ВЦП је кључан за ово везивање, плазмиди који садрже различите ВЦП домене одвојено су трансфектирани у ћелије 293Т. Укључујући празан вектор, др Уеффинг је великодушно пружио седам плазмида, као што је приказано на шему схеме на слици 1ц. 25 Два дана након трансфекције, цели лизати из 293Т ћелија подвргнути су се Вестерн блот анализи и 1 мг укупног протеина је коришћено за ИП против заставе антитела. Вестерн блотови после ИП-а показали су да се цео дужина, изоловани Н домен и изолован Д1 домен, али не и Д2 домен, може директно везати за ДНК-ПК, а само НД1 домен фузивних протеина може да се веже са ДНК-ПК . НД2 фузиони протеини не могу се детектовати везањем са ДНК-ПК, а фузиони протеин Д1Д2 такође слаби афинитет везивања Д1 домена за ДНК-ПК. Ова запажања сугеришу да домен Д2 има негативан утицај на везивање ДНК-ПК са ВЦП, што може бити посредовано више механизама, укључујући међусобно искључивање везивања или конформационе промене.

Поред тога, целокупни ВЦП имунопреципитирани протеин ДНА-ПКцс био је мањи од имунопреципитираног изолованим Н доменом или Д1 доменом; штавише, укупни ДНК-ПКцс протеин у целокупним 293Т ћелијама које су трансфековане ВЦП такође се смањио. Ова опажања сугеришу да је смањени сигнал највјероватније посљедица смањеног укупног протеина ДНА-ПКцс и да је прекомјерна експресија ВЦП-а могла проузроковати деградацију ДНК-ПКцс. Вестерн блот за целичне лизате показао је да су сви трункати који садрже ВЦП домене подједнако прекомерно експримирани (доњи панел на слици 1д).

Деградација ДНК-ПКцс зависи од убиквитин-протеасома и регулише ВЦП

Да би се утврдило да ли деградација протеина ДНА-ПК зависи од протеасома и да ли ВЦП регулише разградњу ДНА-ПК, ВЦП је оборена схРНА посредована лентивирусом (ову шРНК је верификовала друга група 26 ) у ћелијама У251 или У87. Вестерн блотс показали су да је ДНК-ПКцс регулиран у ВЦП-обрураним ћелијама, док прекомерна експресија ВЦП смањује количину ДНК-ПКцс (слика 2а), што указује да ВЦП регулише ниво протеина ДНА-ПКцс. Што се тиче функције ВЦП, ВЦП може утицати на разградњу ДНК-ПКцс. Да би се искључила могућност да ВЦП регулише транскрипцију ДНК-ПКцс, извршена је квантитативна ПЦР (к-ПЦР) да би се проценио ниво ДНК-ПКцс мРНА. Ниво ДНК-Пкцс мРНА детектиран је у ВЦП-декадним ћелијама, контролним ћелијама и родитељским ћелијама (слика 2б). Као што се очекивало, није било значајне разлике у нивоима мРНА ДНК-ПКцс међу ВЦП обореним У87, контролним У87 или родитељским У87 ћелијама, што указује да би ВЦП могао да регулише разградњу ДНК-ПКцс уместо да модулира своју транскрипцију.

Image

ВЦП регулисала је деградацију ДНК-ПКцс и та деградација је зависила од убиквитин-протеасома. ( а ) У251 или У87 ћелије су инфициране ВЦП схРНА лентивирусима или лентивирусима експресије ВЦП. Имуноблоти су изведени против целичних ћелија лизата (Пар: матичне ћелије У251; Цонси: неспецифична РНА; ВЦПси: сиРНА специфична за ВЦП). ( б ) ПЦР у реалном времену је извршен коришћењем ДНК-ПКцс специфичног прајмера у ћелијама У251 заражених различитим лентивирусима (Пар: матичне ћелије У251); Нивои мРНА ДНК-ПКцс су у односу на ГАПДХ. ( ц ) Горњи панел: ДНА-ПКцс је имунопреципитиран, и оба ДНК-ПКцс и убиквитин су детектовани на истој мембрани (ВЛ: лизати целих ћелија). Доња плоча: ДНА-ПКцс је откривен у матичним ћелијама У251 третираним са МГ132 (125 нМ) за назначену дозу. ( д ) Родитељске ћелије У251 или ћелије У251 заражене различитим лентивирусима третиране су инхибитором протеасома МГ132 (50 μМ), а протеин ДНА-ПКцс је откривен у назначеним временским тачкама. ( е ) Родитељске ћелије У251 или ћелије заражене различитим лентивирусима третиране су хлороформом инхибитором лизосома у назначеним концентрацијама, а протеин ДНА-ПКцс је откривен 12 х након третмана

Слика пуне величине

Будући да разградња протеина од ВЦП-а зависи од убиквитин-протеасома, да би се утврдило да ли је ДНК-ПКцс убиквитиниран, ДНК-ПКцс је пречишћен путем ИП-а и потом детекцијом убиквитина. Вестерн блот показао је да се убиквитин сигнал појављивао само у ДНК-ПКцс профитираним У251 ћелијама величине ДНК-ПКцс, али не и у М059Ј ћелијама са недостатком ДНК-ПКцс или неспецифичној ИгГ траци, што указује да ДНК-ПКцс је свеприсутно (слика 2ц). Да би се утврдило да ли деградација ДНК-ПКцс зависи од система протеасома, У251 ћелије су третиране са инхибитором протеасома МГ132 (125 нМ) и сакупљене у назначеним временским тачкама (0, 12, 24, 48, 72 х) на основу полуживот протеина ДНА-ПКцс.

Подаци Вестерн блот-а показали су да је ниво протеина ДНА-ПКцс значајно порастао 24 сата након третмана МГ132; што је дуже трајало лечење, то се више накупљало ДНК-ПКцс (слика 2ц), што указује да деградација ДНК-ПКцс зависи од система убиквитин-протеасома, мада типичне размазане траке нису виђене, можда због високог молекулска маса ДНК-ПКцс (460 КД). Да би се утврдило да ли деструкција ВЦП има синергистичке ефекте на акумулацију ДНА-ПКцс са инхибицијом протеасома, контролне и ВЦП оборене У251 ћелије су третиране са МГ132 на одређено време (0, 3, 6, 12 х). Имуноблоти су показали да се ДНК-ПКцс драматично повећао у ВЦП обрушеним У251 ћелијама 3 сата након третмана МГ132 (Слика 2д). Штавише, да би се искључила могућност да ово повећање зависи од лизосома, оборене ВЦП ћелије У251 су третиране са инхибитором лизосома хлорокином у назначеној концентрацији. Вестерн блот је показао да хлорокин не утиче на акумулацију ДНА-ПКцс, чак 6 сати након третмана; за разлику од тога, хлорокин је смањио ниво протеина и ДНК-ПКцс и ВЦП (слика 2е). Укратко, наши подаци показали су да је ДНК-ПКцс регулисан и да ВЦП регулише разградњу ДНК-ПКцс кроз систем убиквитин-протеасома.

Обустава ВЦП-а појачава ДНК-ПК активност и повећава ефикасност поправљања оштећења ДНК

Да би се утврдило да ли ВЦП регулише ДНК-ПК активност као и ниво протеина ДНА-ПКцс, ендогена ДНК-ПК активност директно је процењена путем ин витро киназног теста, а индиректно мерена фосфорилацијом ендогене РПА32 (подјединица репликације 32 кДа протеин А). Иако је РПА32 различито фосфорилиран са три ПИ3К (мутатирани протеин атаксије телангиектазије, АТМ, протеин повезан са АТМ-Рад3 и ДНК-ПК) као одговор на различита средства која оштећују ДНК, ДНК-ПК је примарна киназа одговорна за камптотецин (ЦПТ) РПА32 фосфорилација; 27, 28, 29, 24, стога, фосфорилација изазвана ЦПТ-ом је још један показатељ ДНК-ПК активности.

У испитивању ин витро киназе, наши подаци показали су да се ДНК-ПК активирао јонизујућим зрачењем и да је ударање ВЦП појачало ову активацију, која је била један и по пута већа од оне у контролним ћелијама, као што је приказано на првој слици на слици 3а . Као одговор на третман ЦПТ, фосфорилација РПА32 Сер 4/8 примећена је као појава смањене покретљивости у односу на матични РПА32 опсег, а овај померени опсег је потврђен антителом специфичним за фосфорилацију. Ова ЦПТ-индукована РПА32 фосфорилација у родитељским У251 ћелијама, У251 ћелијама са ВЦП оборењем или контролном сиРНА (слика 3а) анализирана је дензитометријом помоћу ИмагеЈ софтвера (НИХ, УСА). Однос фосфорилираног РПА32 (горњи панел) и укупног РПА32 (две траке на другом панелу), што представља ДНК-ПК активност, израчунато је у свакој траци. Однос п-РПА32 у ВЦП обореној У251 ћелији био је два пута више него у контролном У251, као што је приказано на последњој слици на Слици 3а. Укупни РПА32 је порастао у ВЦП ћелијама, али узрок тога није познат.

Image

ВЦП обустава повећала је активност ДНК-ПК-а и повећала ефикасност санације оштећења ДНК. ( а ) Родитељске ћелије У87 или ћелије заражене контролним лентивирусима или ВЦП схРНА лентивирусима третиране су са 5 Ги зрачења или камптотецином (20 μМ). Испитивање ин витро киназе изведено је на ћелијама третираним зрачењем. Ћелије третиране са ЦПТ подвргнуте су имуноблоту, а сер 4/8 фосфорилација РПА32 откривена је дензитометријском анализом 2 сата након третмана (стубови представљају средњу вредност ± СД, изведена су три независна експеримента). Одређен је однос фосфор-РПА32 према укупном РПА32 и вредност је нормализована на густину β -актина. ( б ) ћелије У87 заражене контролним лентивирусима или ВЦП схРНА лентивирусима третиране су са 5 Ги зрачења; ћелије су скупљене у назначеним временским тачкама за испитивање комете, а по 100 ћелија у свакој групи мерено је за вредност ОТМ и дужину репа. ( ц ) ћелије У87 са контролним лентивирусима или ВЦП схРНА лентивируси имуностаниране су са γ -Х2АКС након примања зрачења од 2 Ги; Пребројено је 100 ћелија, а графика приказује просечни број жаришта по ћелији у назначеним временским тачкама (црвено: γ -Х2АКС; плаво: ДАПИ). (Пар: матичне ћелије У87; Цонси: неспецифична РНА; ВЦПси: сиРНА специфична за ВЦП)

Слика пуне величине

Штавише, провера ЦОМЕТ и детекција γ- Х2АКС, који представљају ниво оштећења ДНК у свакој ћелији, извршени су да би се проценила ефикасност санације оштећења ДНК. У тесту ЦОМЕТ, ћелије су зрачене ледом од 10 Ги. Третиране ћелије су сакупљене и опорављене током назначеног времена (30, 180, 360 мин), а ћелије су подвргнуте једноћелијској електрофорези у неутралним условима. Сваки пут је измерено 200 ћелија за сваку групу са 200 пута увећањем. Измерјене су дужине репа и вредности Оливе момент муљине (ОТМ) израчунате су помоћу софтвера ЦАСП на основу формуле: ОТМ = репна ДНК% × (средња вредност репа - средња вредност главе). Након 30 мин, није било значајне разлике између контролних ћелија У251 и ВЦП-ћелија. Међутим, након 3 или 6 х опоравка, дужине репа или ОТМ вредности очигледно су биле дуже или веће у контролним ћелијама У251 у поређењу с оним у ВЦП обрушеним У251 ћелијама ( П <0, 05), као што је приказано на слици 3б, што сугерира да ВЦП кноцкдовн промовише ефикасност поправљања ДНК.

Поред тога, још један маркер оштећења ДНК, γ -Х2АКС жаришта, такође је урачунат у ћелијама У251 третираним са 2 Ги зрачења (подаци са другим дозама зрачења нису приказани). Сат времена након зрачења, примећени су масивни γ -Х2АКС жаришта и у У251 контролним ћелијама и у ВЦП-ћелији, а скоро свака поједина ћелија садржавала је бројне жаришта (црвене тачкице). Шест сати након зрачења, већина контролних ћелија није имало драматичних промена у обојењу γ -Х2АКС, док су жаришта у половини ВЦП-обрушених ћелија нестала ( П <0.01) (Слика 3ц). На крају, и контролне ћелије и ВЦП оборене ћелије нису откриле жаришта после 24 сата опоравка. Сва ова запажања показују да ВЦП оборење појачава ДНК-ПК активност и повећава ефикасност поправљања оштећења ДНК.

ВЦП кноцкдовн повећава проценат преживљавања ГБМ ћелија након третмана зрачењем и скраћује опстанак ортотопских ксенографисаних мишева

Да би се утврдило да ли ВЦП регулише осетљивост на зрачење ГБМ ћелија, коришћено је ин витро клоногено испитивање и ин виво ортотопски модел миша. У клоногеном тесту сигнализиране ВЦП оборене У87 ћелије или У251 ћелије посејане су у посуде од 100 мм (свака 400 ћелија); ћелије су озрачене у назначеној дози, а затим су култивисане током две недеље. Пребројане су колоније које садрже 50 или више ћелија. ВЦП кноцкдовн повећава фракцију преживљавања и у ћелијама У251 и у У87 ћелијама. После 2 Ги зрачења, обустава ВЦП је поспешила опстанак ћелија У251 од 29, 3 до 51, 3% ( П <0, 01) и преживљавање У87 ћелија од 34, 9 до 62, 3% ( П <0, 01) (Слика 4а). У87 ћелије су биле отпорније на зрачење од У251 ћелија, што је у складу са нашим претходним истраживањем. 24 Није било значајних ефеката на преживљавање између контролне и родитељске ћелије У251 или У87. Да би се додатно потврдило да ли повећана отпорност на зрачење од ВЦП зависи од ДНК-ПК, у овом истраживању коришћени су пар ДНК-ПКцс-познатих (М059К) и дефицитарних (М059Ј) ГБМ ћелија. Наши подаци показали су да ВЦП оборење значајно побољшава преживљавање М059К ћелија са ДНК-ПК, али не и М059Ј ћелије са недостатком ДНК-ПК, показујући да отпорност на зрачење изазвана ВЦП-ом зависи од ДНК-ПК.

Image

ВЦП кноцкдовн повећао је отпорност на зрачење ћелија ГБМ. ( а ) Матичне ћелије У251, У87, М059К, М059Ј или ћелије инфициране контролним лентивирусима или ВЦП схРНА лентивирусима одвојено су посејане у посуде од 10 цм (400 ћелија по јелу), клоногени тестови су изведени након третмана зрачењем у назначеним дозама и фракција преживљавања је нормализована да би се контролисале ћелије. ( б ) Кривуља преживљавања Каплан-Мејер направљена је за ортофопске ГБМ мишеве у четири групе (* П <0, 05); повећање зрачења времена преживљавања израчунато је на основу формуле: повећање радијационог времена преживљавања = продужено време преживљавања / време преживљавања без зрачења. ( ц ) Просечна величина тумора и репрезентативне МР слике у свакој групи и репрезентативне ВЦП имунофлуоресцентне слике (црвене) на ксенографисаним одсецима глиобластома. ( д ) Корелациона анализа нивоа ВЦП протеина са преживљавањем пацијената и репрезентативне слике ВЦП имунохистохемије у парафинским пресецима код пацијената са глиобластомом. ( е ) Репрезентативне слике из сваке групе (Цон: пара-туморско ткиво)

Слика пуне величине

У ортотопском моделу миша, У87 ћелије заражене празним вирусима служиле су као контрола, а укупно је убризгано 48 мишева. Девет дана након ињекције, мишеви који носе тумор (39 мишева) насумично су подељени у две групе у складу са МРИ снимањем, укључујући ИР и не-ИР зрачење. Свака група је садржала подгрупе за контролу и рушење (10 мишева у свакој подгрупи). 6 Ги укупног зрачења примењивано је три пута у току једне недеље; распоред је описан у одељку Материјали и методе. Забиљежено је вријеме преживљавања сваког миша, а сва времена преживљавања у свакој групи анализирана су кориштењем Каплан-Меиерове методе. Наши подаци показали су да је третман зрачења продужио време преживљавања мишева у свим групама. Са зрачењем, мишеви из ВЦП-ове декларације преживели су краће време (38, 4 дана, средње време преживљавања) од мишева у контролним групама, чије време преживљавања је било 53, 8 дана (Слика 4б). Без зрачења, време преживљавања у ВЦП групи која је оборена било је нешто краће него у контролној групи. Коефицијент побољшања зрачења времена преживљавања у ВЦП групи која је обустављена био је 2, 69%, што је знатно ниже него у контролној групи (27, 1%); разлика је била статистички значајна ( П <0, 001) (Слика 4б).

На основу МРИ слике тумора 9. дана након интракранијалне ињекције, величина тумора у свакој групи се разликовала, али не и значајно, као што се види на репрезентативним сликама на средњој слици на слици 4ц. Као што смо очекивали, величине тумора у ВЦП групи која је оборена у 29. дану очигледно су биле веће од оне код истог миша 9. дана, као што је приказано на репрезентативним сликама у десном ступцу средње графике (слика 4ц). Просечне количине тумора у свакој групи су израчунате и приказане су на слици 4ц. Величине тумора су се смањиле више (28, 9%) у контролној групи него у ВЦП-групи која се срушила (6, 3%) након зрачења. Репрезентативне имуно-бојне слике флуоресцентне слике нивоа ВЦП протеина у ксенографисаном ГБМ приказане су на слици 4ц.

Да би додатно истражили експресију ВЦП и њене ефекте на радијациону осетљивост ГБМ, експресија ВЦП протеина у ГБМ пресецима код пацијената (астроцитом ИВ степена) полуквантификована је софтвером за квантитативну анализу Тиссуе ИА (Леица, Солмс, Немачка) и корелацијом са преживљавањем време је анализирано. Све дигиталне слике су нормализоване на негативну контролу. Резултати мање од 10% сматрани су '-'; бодови већи од 10% и мањи од 25% сматрани су '+'; и оцене више од 25% сматрало се „++“. Подаци су показали да је ВЦП различито изражен у ткиву ГБМ и да је ниво експресије ВЦП-а позитивно корелиран са временом преживљавања пацијената ( Р2 = 0, 5222, П <0, 05). Пацијенти који имају висок ниво ВЦП дуже би преживели лечењем зрачењем (слика 4д). Репрезентативне слике су приказане на слици 4е. То је запажање било у складу са нашим подацима о животињама.

Дискусија

Прво смо открили да је ДНК-ПКцс свеприсутан и везан на ВЦП; третман инхибитором протеасома (МГ132), али не инхибитором лизосома (хлорокин), повећао је ниво протеина ДНА-ПКцс; кноцкдовн ВЦП имао је синергистички ефекат са третманом МГ132 на акумулацију протеина ДНА-ПКцс. Као носач, ВЦП се веже за полубиквитинирани протеин и доставља га у систем протеасома ради разградње; према томе, или инхибиција протеасома или обустава ВЦП повећала је ниво протеина ДНА-ПКцс, а комбинација оба синергистички повећала ниво протеина ДНА-ПКцс. Ова опажања су показала да ВЦП регулише разградњу протеина ДНА-Пкцс, што зависи од убиквитин-протеасома. Занимљиво је да је третман МГ132 такође повећао ниво самог ВЦП протеина, што сугерише да је деградација ВЦП такође регулисана системом убиквитин-протеасом. Штавише, лечење хлорокином неочекивано је смањило ниво протеина и ДНК-ПКцс и ВЦП у ћелијама глиобластома, што указује да инхибиција лизосома може побољшати разградњу протеасома или разградњу повезану са ендоплазматским ретикулумом на компензаторски начин.

Надаље, иако се сматра да је ДНК-ПК протеин нуклеолуса, наше запажање сугерише да се ДНК-ПК, или барем његова каталитичка подјединица, такође налази у цитоплазми21 и да је ВЦП повезан с њом и регулише њену разградњу. Цо-ИП експеримент је идентификовао да се и Н-терминални домен и Д1 домен ВЦП протеина могу везати за ДНК-ПК, што је у складу са недавним налазима експеримената ко-ИП и интерферометрије на биолошком слоју користећи ВИМ пептид гп78; 30 овај закључак је такође делимично у складу са раним подацима који су показали да родопсин (П23Х) протеин делује само са п97НД1 доменом, али не и са изолованим доменом п97Н. 25 Међутим, ВЦП НД2 домен не показује везивање са ДНК-ПКцс, а Д1Д2 домен такође слаби афинитет везања Д1 домена са ДНК-ПКцс. Ови резултати показују да на ВЦП асоцијацију на циљни протеин утичу конформационе промене, које могу бити индуковане АТП везивањем / хидролизом или хијерархијским везивањем. Штавише, објављено је да једна појединачна супституција аминокиселина (Р155Х) на интерфејсу између Н-терминалног домена и суседног ААА домена (Д1) ВЦП резултира смањеним афинитетом за АДП. Иако су претходни подаци показали да је ВЦП фосфорилирао ДНА-ПК као одговор на оштећење ДНК, није јасно да ли ова фосфорилација ВЦП утиче на њено везивање са ДНК-ПК или регулише активацију ВЦП.

Поред тога, биохемијска и структурна испитивања показала су да више кофактора препознатих по ВЦП (п97) садрже регулисани домен убиквитин Кс (УБКС) присутан у породици протеина УБКС или домен НПЛ4 сличног убиквитину. 30 Поред чињенице да је ВЦП фосфорилиран на Сер 784, ДНК-ПКцс садржи и ВИМ мотив „ААКСКСР“ (слика 1а), који је сачуван код сисара и у складу је са претходним налазом. 30 Наши подаци су такође показали да је ДНК-ПКцс свеприсутан и да његова деградација зависи од убиквитин-протеасома; међутим, специфична свеприсутна места ДНА-ПКцс и одговарајућа Е3 лигаза још увек нису откривена и биће решена у нашим будућим студијама.

ДСБ је најсмртоноснија врста оштећења ДНК; ако ћелија не може да поправи ово оштећење, не поправљени ДСБ-ови могу резултирати смрћу ћелије. Као централна компонента НХЕЈ-а, ДНК-ПК контролише процес поправљања ДСБ-а и одржава стабилност генома. Измене у ДНК-ПК активностима или количинама протеина ДНА-ПКцс највероватније ће променити осетљивост ћелија на генотоксични стрес, као што је зрачење. Добро је познато да су ДНК-ПКцс - / - мишеви преосетљиви на зрачење и подвргнути апоптози зависној од АТМ-а и п53. 32, 33, 34 Међутим, подаци из ТЦГА и наше групе сугерирају да не постоји значајна разлика у нивоу протеина ДНА-ПКцс између нормалног глиалног ткива и ГБМ туморског ткива, мада је у неким случајевима имунохистохемијска анализа показала да туморске ћелије изражавају више ДНК -ПКцс него суседно нормално ткиво, 35 што може бити последица специфичности ткива.

Да би се избегли потенцијални нежељени ефекти изазвани ДНК-ПК инхибиторима, циљање ДНК-ПК регулаторних протеина који су регулисани у ћелијама глиобластома отпорним на зрачење је алтернативна стратегија за лечење радиосензибилизацијом. Претходно смо открили да протеин фосфатаза ПП6 регулише осетљивост на зрачење ГБМ ћелија преко ДНК-ПК и да обарање ПП6ц повећава време преживљавања мишева; Штавише, ПП6ц је био прекомерно изражен код 44, 7% (17 од 38 случајева) болесника са ГБМ. 21, 22, 36, 37, 24

У овој студији, оборење ВЦП не само да је узроковало нагомилавање протеина ДНА-ПКцс, већ је и повећало активност ДНА-ПК и подстакло ефикасност поправке оштећења ДНК у ћелијама ГБМ. Иако је обустава ВЦП утицала на регрутовање 53БП1 на места оштећења ДНК и чинило се да повећава радијацијску осетљивост У2ОС ћелија и нематоде, 15, 16 наши подаци показали су да је нагомилавање ДНК-ПК повећало ефикасност поправљања оштећења ДНК у ћелијама ГБМ, што би могло бити резултат путева независних од п53 и различитих ћелијских улога ВЦП у различитим типовима ћелија. 38 Наше истраживање ин виво потврдило је да кноцкдовн ВЦП смањује радиосензитивност и скраћује време преживљавања мишева у ГБМ ортотопском моделу. Клинички подаци су такође подржали овај закључак. Због тога, мали молекули који селективно циљају ВЦП протеин могу утицати на осетљивост на зрачење регулисањем нивоа протеина ДНА-ПК. Ова запажања сугеришу да су ДНК-ПК регулаторни протеини потенцијална мета за лечење радиосензибилизацијом.

Речник

ВЦП

протеин који садржи валозин

ДНК-ПК

ДНА зависна протеин киназа

ЕР

ендоплазматични ретикулум

ЕРАД

ЕР-повезана деградација протеина

ДСБ

Прекид двоструке жице ДНК

ВИМ

ВЦП мотив

НХЕЈ

нехомологно крајње спајање

АТР

АТМ-Рад3 сродни протеин

Банкомат

мутирани протеин атаксије телангиектазије

ЦПТ

камптотецин